JP2015536660A - 細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤 - Google Patents
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Abstract
Description
を含む方法も提供する。
1.酵素分解プロセス
12倍の脱イオン水を60%以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いで約90℃まで加熱し、15〜20分間その温度を保ち、次いで約55℃まで温度を低下させてタンパク質溶液を得、タンパク質溶液のpH値を7〜8に調節し、中性プロテイナーゼNEUTRASE O.D.L(Novozymes company)とアルカリ性プロテアーゼALKALINE PROTEASE CONCENTRATE(DSM company)の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質1グラム当たり約4000単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え(中性プロテイナーゼNEUTRASE O.D.Lとアルカリ性プロテアーゼALKALINE PROTEASE CONCENTRATEの両方が約2000単位の酵素レベルを有する)、温度を約55℃に保ちながら第1の酵素分解プロセスを2.5時間実施して第1の酵素加水分解産物を得、第1の酵素加水分解産物のpH値を7.5〜8.5に調節し、次いでカルボキシペプチダーゼACCELERZYME CPG(DSM company)をタンパク質1グラム当たり約2000単位の酵素レベルで第1の酵素加水分解産物に加え、温度を約50℃に保ちながら第2の酵素分解プロセスを2.5時間実施し、次いで生成した酵素加水分解産物を110〜120℃まで加熱し、酵素失活のため15〜20分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。
トウモロコシタンパク質酵素加水分解産物をディスク型セパレーターに置き、4000〜12000r/分の回転速度で遠心分離を実施して、その残りかすからトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物の液体を分離し、次いでさらなる使用のため遠心分離上清を得る。
食品産業用カチオン交換樹脂D001−FDをクロマトグラフィーカラムに充填し、カラム体積の3〜5倍の蒸留水で樹脂を洗浄し、次いで0.5〜3cm/分のリニアフローでクロマトグラフィーカラムに第2のマイクロ濾過物溶液を導入し、第2のマイクロ濾過物溶液の注入体積をクロマトグラフィーカラム体積の20〜100%に調節し、それをカラム体積の2〜5倍の蒸留水で洗浄し、次いで1〜5cm/分のリニアフローで1MのNaCl溶液を使用した溶出を実施し、溶出物を回収して精製液を得る。
100〜300ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用して5〜10%のタンパク質含量まで精製液を濃縮し、次いで蒸留水を加え、洗浄および濾過を実施して一次体積の3〜5倍に到達させ、洗浄および濾過した精製液中の無機塩含量が5%未満となるようにし、次いで20〜40%のタンパク質含量まで濃縮をさらに実施し、濃縮溶液を回収する。
トウモロコシ活性ペプチド溶液に噴霧乾燥を実施して、1.5%〜5%の含水率を有する薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末を得、ここで噴霧乾燥精製エアーの入口温度と出口温度は、それぞれ120〜180℃と65〜90℃に調節する。
従来の方法を使用して、得られたトウモロコシ活性ペプチドにおける各成分の物理化学的基本組成および分子量分布に関する分析を実施する。結果はそれぞれ表1および表2中に示す。
この実施形態は、実施形態1中に記載したのと同様に実施する。ただし、9倍の蒸留水を60%以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いで90〜95℃まで加熱し、55〜60分間その温度を保ち、次いで55〜55℃まで温度を低下させ、タンパク質溶液のpH値を7〜8に調節し、パパイン(Nanning Pangbo Biological Engineering Co.,Ltd)とブロメライン(Nanning Pangbo Biological Engineering Co.,Ltd)の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質1グラム当たり約2500単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え(この場合パパインとブロメラインは、それぞれ約1000単位と約1500単位の酵素レベルを有する)、温度を50〜55℃に保ちながら第1の酵素分解プロセスを1.5時間実施して第1の酵素加水分解産物を得、第1の酵素加水分解産物のpH値を8〜9に調節し、次いでカルボキシペプチダーゼValidase EP Conc.(DSM Company)とフレーバーザイムFLAVOURZYME 500MG(Novozyme Company)の混合によって得た化合物特異的プロテアーゼを、タンパク質1グラム当たり約3000単位の酵素レベルで第1の酵素加水分解産物に加え(カルボキシペプチダーゼACCELERZYME CPGとフレーバーザイムFLAVOURZYME 500MGの両方が約1500単位の酵素レベルを有する)、温度を50〜55℃に保ちながら第2の酵素分解プロセスを3時間実施し、次いで酵素加水分解産物を90〜100℃まで加熱し、酵素失活のため15〜20分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。最後に得る薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末は1.5%〜5%の含水率を有する。
この実施形態は、実施形態1中に記載したのと同様に実施する。ただし、10倍の蒸留水を60%以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いでそれらを95℃まで加熱し、35〜40分間その温度を保ち、次いで45〜50℃まで温度を低下させ、タンパク質溶液のpH値を7〜8に調節し、中性プロテアーゼValidase BNP−L(DSM Company)、アルカリ性プロテアーゼAlcalase 2.4L(Novozyme Company)、パパイン(Nanning Pangbo Biological Engineering Co.,Ltd)およびブロメライン(Nanning Pangbo Biological Engineering Co.,Ltd)の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質1グラム当たり約6000単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え(中性プロテアーゼValidase BNP−L、アルカリ性プロテアーゼAlcalase 2.4L、パパインおよびブロメラインは、それぞれ約2000単位、約2000単位、約1000単位および約1000単位の酵素レベルを有する)、温度を45〜50℃に保ちながら第1の酵素分解プロセスを3時間実施して第1の酵素加水分解産物を得、第1の酵素加水分解産物のpH値を約5.5に調節し、次いでフレーバーザイムMAXZPRO XF(DSM Company)をタンパク質1グラム当たり約2000単位酵素の量で第1の酵素加水分解産物に加え、温度を約55℃に保ちながら第2の酵素分解プロセスを約2.5時間実施し、次いで酵素加水分解産物を120〜130℃まで加熱し、酵素失活のため10〜15分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。最後に得る薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末は1.5%〜5%の含水率を有する。
比較実施形態1として中国特許出願No.200810084992.5中に開示された方法により得たトウモロコシオリゴペプチド粉末を採用し、この方法は以下のことを具体的に含む:
1.無血清培養培地の調製
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびMEWM/F12(体積比=1:1)培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とMEWM/F12培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれDMEM/F12培養培地溶液と混合し、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.2〜7.3に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μbの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれ、細胞密度検出に使用するとき、その各無血清培養培地において0.5g/Lの濃度を有し、抗体発現量検出に使用するときはそれぞれ6g/Lまたは10g/Lの濃度を有する。それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないDMEM/F12培養培地を採用する。
前述の実験群1〜3、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を2Lのバイオリアクターに加え、95%を超える活性があるCHO細胞を懸濁培養用にバイオリアクターに接種し、ここで培養条件は37℃、および5%二酸化炭素であり、タイミングサンプリングを行い、フローサイトメトリーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、細胞密度および抗体発現量に関する検出を実施する。結果は図2および図3中に示す。
1.無血清培養培地の調製
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびIMDM培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とIMDM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれIMDM培養培地溶液と混合し、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.2〜7.3に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれその各無血清培養培地において4g/Lの濃度を有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないIMDM培養培地を採用する。
前述の実験群1〜3、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を振とうフラスコに加え、増殖状態が良いCHO細胞を培養用に振とうフラスコに接種し、ここで培養条件は37℃、および5%二酸化炭素であり、振とうフラスコのスピードは100rpmであり、タイミングサンプリングを行い、フローサイトメトリー、AO/PI染色を使用して、細胞生存率に関する検出を実施する。結果は図4中に示す。
1.無血清培養培地の調製
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびDMEM(高グルコース)培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とDMEM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれDMEM(高グルコース)培養培地溶液と混合し、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.2〜7.3に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれその各無血清培養培地において2g/Lの濃度を有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないDMEM(高グルコース)培養培地を採用する。
前述の実験群1〜3、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を細胞培養プレートに加え、95%を超える活性があるアフリカミドリザル腎臓(Vero)細胞を培養用に細胞培養プレートに接種し、ここで培養条件は37℃、および5%二酸化炭素であり、MTTを使用して細胞密度に関する検出を実施する。結果は図5中に示す。
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびMEWM/F12(体積比=1:1)培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とMEWM/F12培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれDMEM/F12培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、次いで最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.2〜7.3に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、その各無血清培養培地における実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドの濃度は全て5g/Lであり、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたDMEM/F12培養培地を採用する。
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびMEM培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度がそれぞれ得られたペプチド溶液とMEM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれMEM培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.2〜7.3に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地において7g/Lの濃度をそれぞれ有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたMEM培養培地を採用する。
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびDMEM(低糖)培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とDMEM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれDMEM(低糖)培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.0〜7.2に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地においてそれぞれ3g/Lの濃度を有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたDMEM(低糖)培養培地を採用する。
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびMEM培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とMEM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれMEM培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.0〜7.2に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地において6.5g/Lの濃度をそれぞれ有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたMEM培養培地を採用する。
実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびDMEM(高グルコース)培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の4倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とDMEM培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれMEM培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の95%まで超純水を加え、pH値を7.0〜7.2に調節し、最終体積まで希釈し、0.22μmの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態1〜3で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態1で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地においてそれぞれ2.5g/Lの濃度を有し、それらは実験群1〜3および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたDMEM(高グルコース)培養培地を採用する。
Claims (15)
- 細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤であって、トウモロコシ活性ペプチド添加剤中、1000ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の90重量%以上を占め、オリゴペプチドがAP、SAP、PAL、VNAP、PSSQ、およびTQPGPQの1つまたは複数を少なくとも含む、トウモロコシ活性ペプチド添加剤。
- オリゴペプチドがAY、NAP、PVIN、およびAYPQの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
- トウモロコシ活性ペプチド添加剤中のエンドトキシン含量が200EU/g未満である、請求項1に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
- 非特異的プロテアーゼと特異的プロテアーゼを順に使用したコーングルテンミールに対する酵素分解を実施し、次いで分離および精製を実施することによって得られる、請求項1に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
- 非特異的プロテアーゼがパパイン、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびブロメラインの1つまたは複数から選択され、特異的プロテアーゼがカルボキシペプチダーゼとフレーバーザイムの1つまたは2つから選択される、請求項4に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
- 無血清細胞培養における請求項1から5のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用。
- 細胞がCHO細胞、Vero細胞、HEK−293細胞、BHK−21細胞、MARC−145細胞、ハイブリドーマ細胞、およびMDCK細胞の1つまたは複数から選択される、請求項6に記載の使用。
- 細胞増殖の促進、細胞生存率の改善および/または細胞産物の発現の増加における請求項1から5のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用。
- 細胞がCHO細胞、Vero細胞、HEK−293細胞、BHK−21細胞、MARC−145細胞、ハイブリドーマ細胞、およびMDCK細胞の1つまたは複数から選択される、請求項8に記載の使用。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を含む無血清培養培地であって、トウモロコシ活性ペプチド添加剤が無血清培養培地において0.01〜20g/Lの濃度を有する、無血清培養培地。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を調製する方法であって、以下のステップ:
1)非特異的プロテアーゼを使用してコーングルテンミールに対する第1の酵素分解プロセスを実施して第1の酵素加水分解産物を得;次いで特異的プロテアーゼを使用して第1の酵素加水分解産物に対する第2の酵素分解プロセスを実施してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップ;および
2)トウモロコシタンパク質酵素加水分解産物に遠心分離を実施し、次いで遠心分離上清にマイクロ濾過、カチオン交換、ナノ濾過および限外濾過を順に実施してトウモロコシ活性ペプチドを得るステップであって、ここで50〜500nmの口径を有する濾過膜によりマイクロ濾過を実施し、100〜300ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜によりナノ濾過を実施し、5000〜13000ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜により限外濾過を実施する、ステップ
を含む方法。 - 非特異的プロテアーゼが、0〜1000単位のパパイン、500〜2000単位のアルカリ性プロテアーゼ、500〜2000単位の中性プロテアーゼおよび0〜1500単位のブロメラインの2つ以上を含み、タンパク質1グラム当たり2000〜6000単位の酵素レベルを有し;特異的プロテアーゼが、500〜2000単位のカルボキシペプチダーゼと1000〜2000単位のフレーバーザイムの1つまたは2つを含み、タンパク質1グラム当たり2000〜3000単位の酵素レベルを有する、請求項11に記載の方法。
- ステップ1)が、コーングルテンミールと水を混合してタンパク質溶液を得、次いで非特異的プロテアーゼをタンパク質溶液に加えてタンパク質1グラム当たり2000〜6000単位の酵素レベルに到達させ、1.5〜4.5時間40〜60℃で第1の酵素分解プロセスを実施して第1の酵素加水分解産物を得るステップ;および次いで特異的プロテアーゼを第1の酵素加水分解産物に加えてタンパク質1グラム当たり2000〜3000単位の酵素レベルに到達させ、2〜3時間40〜60℃で第2の酵素分解プロセスを実施し、滅菌してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップ、を具体的に含む、請求項12に記載の方法。
- ステップ2)中のマイクロ濾過が、200〜500nmの口径を有する濾過膜を使用して遠心分離上清に第1のマイクロ濾過を実施して第1のマイクロ濾過物を得、次いで50〜200nmの口径を有する濾過膜を使用して第1のマイクロ濾過物に第2のマイクロ濾過を実施して第2のマイクロ濾過物を得るステップ、を具体的に含む、請求項11に記載の方法。
- ステップ2)中のナノ濾過が、カチオン交換後に100〜300ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用して5〜10%のタンパク質含量まで遠心分離上清を濃縮し、次いで洗浄および濾過して、洗浄および濾過した遠心分離上清が5%以下の無機塩含量を有するようにするステップ;ならびに次いで20〜40%のタンパク質含量まで洗浄および濾過した遠心分離上清を濃縮するステップ、を具体的に含む、請求項11に記載の方法。
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