CN115161371A - 一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,包括如下步骤:(1)以牛乳酪蛋白为原料,加入40~50倍量的纯化水,使用高压均质机进行均质,得到分散均匀的溶液;(2)将溶液温度调节至48~52℃,向溶液中分别加入酪蛋白质量1%~2%的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.05%~0.1%的风味蛋白酶,在48~52℃下反应40~60min,高温灭活,浓缩,喷雾干燥,得寡肽。本发明以牛乳酪蛋白为原料,经酶解反应、膜过滤得到寡肽,活性三肽IPP和VPP含量分别为10.73%和1.92%,寡肽平均链长2.7以上,过敏原<1ppm,具有较高的ACE酶抑制活性;本发明工艺简单、酶解时间短、环保、经济。
Description
技术领域
本发明涉及寡肽制备技术领域,具体涉及一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法。
背景技术
酪蛋白(casein,CN)是牛乳在20℃、pH4.6时沉淀下来的蛋白质,呈酸性,是一种含磷的蛋白质,是牛奶中含量最为丰富、对人类营养价值最高的蛋白质。酪蛋白分子质量大约为20~25kDa,由四类遗传变种组成,为αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白,含量比为3∶0.8∶3∶1。根据四种蛋白成分的氨基酸序列分析,β-酪蛋白含有1个IPP和1个VPP,κ则只含有1个IPP。
酪蛋白是牛奶中的主要过敏原。酪蛋白之所以是过敏原,是因为人乳与牛乳酪蛋白的组成和含量不同及其成分结构上的差异。酪蛋白中αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原,β-酪蛋白是酪蛋白中过敏原性比较低的一种蛋白质。有报道称,酪蛋白水解产物的抗原性和过敏性部分取决于肽的分子量,然而又很难确定在什么限度下保证低抗原性和低过敏性。美国及欧盟国家有明确规定,如果食品中含有牛奶成分,就必须标出牛奶过敏原成分。
酪蛋白水解物具有ACE酶抑制活性,能够阻断血管紧张素II的生成,同时抑制缓激肽的降解,促使具有扩张血管作用的缓激肽生成。由于蛋白质、酶种类及酶解条件的不同,所得产物的氨基酸组成和结构差别很大,酶解产物成分非常复杂,且酶解过程中产生了很多相对分子质量相近的肽段。
专利CN100398661C公开了一种酪蛋白水解物,其制备方法是酪蛋白经过酶解,获得的酪蛋白水解物包括Xaa Pro及Xaa Pro Pro,平均链长为2.1或以下,其具有ACE抑制活性或降血压作用,但该专利酶解时间长,不经济环保,制得的寡肽中的活性三肽IPP和VPP含量较低,过敏原含量较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷,提供一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法。本发明以牛乳酪蛋白为原料,经酶解反应、膜过滤得到寡肽,活性三肽IPP(异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)和VPP(缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸)含量分别为10.73%和1.92%,寡肽平均链长2.7以上,过敏原<1ppm,具有较高的ACE酶抑制活性;本发明工艺简单、酶解时间短、环保、经济。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,包括如下步骤:
(1)以牛乳酪蛋白为原料,加入40~50倍量的纯化水,使用高压均质机进行均质,压力1000bar~1100bar,得到分散均匀的溶液;
(2)将溶液温度调节至48~52℃,向溶液中分别加入酪蛋白质量1%~2%的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.05%~0.1%的风味蛋白酶,在48~52℃下反应40~60min,高温灭活,浓缩,喷雾干燥,得寡肽。
优选地,所述步骤(1)中,所述压力为1060bar。
优选地,所述步骤(1)中,使用高压均质机进行均质时循环2次。
优选地,所述步骤(2)中,将溶液温度调节至50℃。
优选地,所述步骤(2)中,向溶液中分别加入酪蛋白质量1.5%的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.1%的风味蛋白酶。
优选地,所述步骤(2)中,在50℃下反应50min。
优选地,所述步骤(2)中,在100℃下高温灭活15min。
一种寡肽,采用如上所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法制备得到。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明以牛乳酪蛋白为原料,经酶解反应、膜过滤得到寡肽,经液相分析,活性三肽IPP含量为10.73%,VPP含量为1.92%,寡肽平均链长2.7以上,过敏原<1ppm,制备得到的寡肽具有较高的ACE酶抑制活性及低过敏原的特点;
(2)本发明工艺简单,酶解时间短,节能环保,高效易于操作,产品安全无过敏原,可添加到普通食品中。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的寡肽的HPLC图谱;
图2为本发明VPP标准品的HPLC图谱;
图3为本发明IPP标准品的HPLC图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容,下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解,这些实施例仅用于对本发明进一步说明,而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明所述的内容后,该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
取100g牛乳酪蛋白作为原料,加入5000ml的纯化水,通过高压均质机进行均质(压力1060bar),循环2次,得到分散均匀的溶液;
将溶液温度调节至50℃,向溶液中加入组合酶,即脯氨酸内切酶和风味蛋白酶,其中脯氨酸内切酶的质量是酪蛋白质量的1.5%,风味蛋白酶的质量是酪蛋白质量的0.1%,在50℃下搅拌反应50min,在100℃下高温灭活15min,浓缩后喷雾干燥,得寡肽。
经液相法检测寡肽中的IPP和VPP的含量(本实施例制得的寡肽的HPLC图谱见图1),测定寡肽平均链长,用ELISA(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
其中,所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司;所述脯氨酸内切酶为黑曲霉的蛋白酶,来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司;所述风味蛋白酶为米曲霉的蛋白酶,来自北京索莱宝科技有限公司。
对比例1
取100g牛乳酪蛋白作为原料,加入5000ml纯化水,将溶液温度调节至50℃,向溶液中加入组合酶,即脯氨酸内切酶和风味蛋白酶,其中脯氨酸内切酶的质量是酪蛋白质量的1.5%,风味蛋白酶的质量是酪蛋白质量的0.1%,在50℃下搅拌反应50min,在100℃下高温灭活15min,浓缩后喷雾干燥,得寡肽。
经液相法检测寡肽中的IPP和VPP的含量,测定寡肽平均链长,用ELISA(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
其中,所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司;所述脯氨酸内切酶为黑曲霉的蛋白酶,来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司;所述风味蛋白酶为米曲霉的蛋白酶,来自北京索莱宝科技有限公司。
对比例2~11
取100g牛乳酪蛋白作为原料,加入5000ml的纯化水,通过高压均质机进行均质(压力1060bar),循环2次,得到分散均匀的溶液;
将溶液温度调节至50℃,分别向溶液中加入表1所述酶类,使其质量是酪蛋白质量的1.5%(或按照组合添加量添加),在50℃下搅拌反应50min,在100℃下高温灭活15min,浓缩后喷雾干燥,得寡肽。
经液相法检测寡肽中的IPP和VPP的含量,测定寡肽平均链长,用ELISA(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
其中,所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司。
表1对比例2~11添加的酶的名称及其来源
其中,表1所述脯氨酸内切酶来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司;所述木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶来自北京索莱宝科技有限公司;所述蛋白酶AP、MultifectPR、蛋白酶PAL来自杰能科生物工程有限公司。
实施例1及对比例1~11制得的寡肽的成分检测结果见表2。
表2实施例1及对比例1~11制得的寡肽的成分检测结果
注:专利1为根据现有专利号CN100398661C制备的样品
IPP和VPP含量的检测方法:
取制备的样品10mg溶于1.0ml蒸馏水,涡旋混匀,过滤,分别以1mg/ml的VPP和IPP作为标准对照(VPP标准品及IPP标准品的HPLC图谱分别见图2及图3),按照如下条件检测:
流动相A:0.1%甲酸-水;流动相B:0.1%甲酸-乙腈;
色谱柱:C18,250×4.6mm,5μm;
柱温:40℃;
吸光度:214nm,流速:1.0ml/min;
洗脱梯度:
Time/min | A/% | B/% |
0 | 95 | 5 |
15 | 90 | 10 |
30 | 50 | 50 |
35 | 50 | 50 |
40 | 95 | 5 |
55 | 95 | 5 |
计算方法:含量(%)=(A样品/A标品)×(C标品浓度/C样品浓度)×100%。
平均链长测定:
将40mg邻苯二醛溶解在1ml甲醇中,并加入100μl β-巯基乙醇;使用预先混有2.5ml 20%十二烷基硫酸钠的25ml 100mM四硼酸钠溶液,将邻苯二醛稀释至25ml,并进一步使用蒸馏水稀释至50ml以制备OPA试剂。
取酪蛋白酶水解物的粉末样品1g,溶于100ml,并于15000rpm离心10min,取出50μl上清。加入1ml已制备的OPA试剂,剧烈振荡,置于室温下5min;使用吸收光度计测定340nm的吸光度。
取酪蛋白酸水解物1g,溶于100ml,使用相同的方法进行测定以获得标准曲线,从中可判定吸光度与摩尔浓度之间的关系,根据公式计算平均链长:
平均链长=(酪蛋白酸水解物的摩尔浓度)/(酪蛋白酶水解物样品的摩尔浓度)。
表3实施例1及对比例1~11制得的寡肽的ACE酶抑制率测定结果
注:专利1为根据现有专利号CN100398661C制备的样品
ACE酶活抑制实验:
取2mL离心管,加100μL HHL(马尿酰组胺酰亮氨酸)溶液(5mmol/L)和40μL样品,充分振荡混匀,37℃孵育3min;再加入10μLACE溶液(0.1U/mL),混匀后37℃孵育30min,再加入150μL HCl(1mol/L)终止反应;再加入1.7mL乙酸乙酯,经振荡混匀后静置5min;吸取1mL乙酸乙酯至新的1.5mL离心管,离心管置于100℃金属浴中,烘干乙酸乙酯;最后加入1mL蒸馏水混匀后在228nm处测定吸光度。
空白处理组:100μL HHL溶液(5mmol/L)+40μL样品,充分振荡混匀,37℃孵育3min;再加入10μL ACE溶液(0.1U/mL)和150μLHCl(1mol/L),混匀后37℃孵育30min;后续步骤同上。
对照组:用等体积含0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)代替样品;以对照组的ACE酶活记为100%,抑制率为0%。
按照以下公式计算样品对ACE酶的抑制率(%):
抑制率(%)=(ABS对照组-ABS样品组)/ABS对照组×100%。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)以牛乳酪蛋白为原料,加入40~50倍量的纯化水,使用高压均质机进行均质,压力1000bar~1100bar,得到分散均匀的溶液;
(2)将溶液温度调节至48~52℃,向溶液中分别加入酪蛋白质量1%~2%的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.05%~0.1%的风味蛋白酶,在48~52℃下反应40~60min,高温灭活,浓缩,喷雾干燥,得寡肽。
2.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述压力为1060bar。
3.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,使用高压均质机进行均质时循环2次。
4.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,将溶液温度调节至50℃。
5.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,向溶液中分别加入酪蛋白质量1.5%的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.1%的风味蛋白酶。
6.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,在50℃下反应50min。
7.如权利要求1所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,在100℃下高温灭活15min。
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---|---|---|---|---|
CN116138431A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-05-23 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 奶酪蛋白水解肽美拉德反应风味物及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-08-05 CN CN202210939441.2A patent/CN115161371A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116138431A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-05-23 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 奶酪蛋白水解肽美拉德反应风味物及其制备方法和应用 |
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