JPH06153931A - 無血清培地 - Google Patents

無血清培地

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JPH06153931A
JPH06153931A JP20805393A JP20805393A JPH06153931A JP H06153931 A JPH06153931 A JP H06153931A JP 20805393 A JP20805393 A JP 20805393A JP 20805393 A JP20805393 A JP 20805393A JP H06153931 A JPH06153931 A JP H06153931A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 基本培地ならびに（ａ）細胞バイアビリティ
ー保護剤（ｂ）インスリンおよび（ｃ）トロンビンもし
くはトロンビンレセプター活性化因子のいずれかを含ん
でなる哺乳動物細胞のための無血清培地さらに該無血清
培地中で生物学的に活性なタンパク質を生産しうるＣＨ
Ｏ細胞系である。 【効果】 本発明により、哺乳動物細胞による生物学的
に活性な産物の生産を支持することができる無血清培地
が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えの方法によりえ
られるタンパク質のような哺乳動物細胞産物の生産を支
持することができる無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】今
日、細胞培養は種々の生物学的に活性な産物、たとえば
ウイルスワクチン、モノクローナル抗体、無抗体免疫調
節剤、ポリペプチド成長因子、ホルモン、酵素、腫瘍特
異的抗原などの生産のために広く用いられている。これ
らの生産物は、正常細胞、形質転換細胞まおよび遺伝的
に処理された細胞によって生産される。
【０００３】細胞を培養するためには、培養培地に血清
を添加することが必要である。血清は、たいていの生物
学的に活性な産物の生産のためだけでなく、すべての細
胞系の生長のための全般な栄養物として働く。血清に
は、ホルモン、成長因子、キャリアータンパク質、接着
および伸展因子、栄養物、微量元素などが含まれてい
る。培養培地には、通常約１０％以下の動物血清、たと
えば牛胎児血清（ＦＢＳ）が含まれる。
【０００４】広く使われてはいるが、血清には多くの制
約がある。血清には高濃度でおびただしいタンパク質が
含まれており、それによって、細胞の生産する少量の所
望のタンパク質が劇的に妨げられる。工程の後の方でこ
れらの血清タンパク質を生産物から分けることが必要
で、このことが工程を複雑にし、コストを増加させる。
別の制約は、バッチ間での血清の不一致のために生産物
中の種々の血清タンパク質汚染について重大な制約の懸
念が生じることである。
【０００５】近年、牛の潜状期間の長い、感染性の神経
病変であるＢＳＥ（牛海綿状脳症）の出現によって、生
物学的に活性な産物の生産に動物由来の血清を用いるこ
とについて、さらに制約への関心が高まってきた。
【０００６】ＦＢＳなどの動物の血清を用いることのさ
らなる欠点は、需要の増加により供給が不安定となり、
価格の上昇変動が起こることである。
【０００７】したがって、細胞の生長および生物学的に
活性な産物の生産を支持するための代替の培地補助剤の
開発が強く望まれている。
【０００８】哺乳動物からの組換えバイオ医薬の製造の
ための無血清培地の長所および欠点は、徹底的に見直さ
れた（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）、１９８７；バーンズ
およびサトー（Ｓａｔｏ）、１９８０；ブロード（Ｂｒ
ｏａｄ）ら、１９９１；ジェイム（Ｊａｙｍｅ）、１９
９１）。無血清培地に対する補助剤として用いられる主
な添加物のリストがバーンズ（１９８７）ならびにバー
ンズおよびサトー（１９８０）にまとめられている。
【０００９】広い範囲の細胞の種類および培養条件に用
いることができる血清添加培地とは異なり、無血清の処
方では一般に特定の範囲に限られる（バーンズら、１９
８４、サトーら、１９８２、トーブ（Ｔａｕｂ）、１９
８５、ウェイズ（Ｗｅｉｓｓ）ら、１９８０）。
【００１０】たいていの市販の無血清培地には、アルブ
ミンのようなキャリアータンパク質が含まれている。キ
ャリアータンパク質の存在は、細胞のバイアビリティー
の保護のために必要であるが、前述のような、精製工程
のためには不利である。
【００１１】ＣＨＯ細胞は、トランスフェクションなら
びに可能な診断および治療応用のための種々の外来遺伝
子産物の発現を行なう、適切な哺乳動物宿主として出現
した（ファミレッチ（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ）とフレデ
リックス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ）、１９８８、マリノ
（Ｍａｒｉｎｏ）、１９８９）。
【００１２】いくつかの市販の無血清培地はＣＨＯ細胞
の培養にも用いることができる。しかしながら、これら
には複数の不利益がある。たいていのものは小規模の実
験室での使用に適するものであり、大規模のバイオリア
クターには高価すぎる。いくつかのものは細胞の生長に
は適するが、生産培地としての役割はほとんど果さな
い。これらの培地はそれぞれその開発の目的であった特
定の系には適するであろうが、他の系には用いられない
のである。非接着性の哺乳動物細胞のためのある既知の
無血清培地（米国特許第５，０６３，１５７号明細書）
は、基本培地に加えて、トランスフェリン、インスリ
ン、ペプトン、β−Ｄ−キシロピラノース誘導体、セレ
ナイトおよび生物学的ポリアミンを含んでなる。前記の
生産に関する特許における開示は、単に特定のマウスハ
イブリドーマ細胞を培地、すなわち基本培地に加えて６
種の成分を含む培地中で培養することに関するものであ
る。いかなる他の哺乳動物細胞におけるＦＳＨ抗体以外
の生物学的に活性な産物の生産も教示されていない。
【００１３】また別の哺乳動物細胞のための無血清細胞
生長培地が、米国特許第４，４４３，５４６号明細書に
開示されている。この生長培地は、基本培地に加えて７
種の成分を含んでいる。
【００１４】ヨーロッパ特許明細書第４８１，７９１号
には、水、浸透圧調整剤、緩衝剤、エネルギー源、アミ
ノ酸、鉄源、生長因子およびその他の任意の成分を含ん
でなるＣＨＯ細胞用培養培地が開示されている。例示さ
れた２つの培地はそれぞれ１９および１７種の成分を含
んでいる。
【００１５】大規模な生産のための無血清培地の開発に
おける主な目的物は、無血清、無タンパク質（または低
タンパク質）、最少の添加物で定義されるためコストの
低い培地、培養／生産／精製の工程手順を複雑にするお
それのある成分を含まない有効な培地である。
【００１６】それでもなおタンパク質が培地に存在する
のであれば、それらの動物源から直接に単離されるので
はなく、組換えの方法によりえられたものであるのが好
ましい。
【００１７】既知の無血清培地への可能な添加物のリス
トは非常に長いが、多くのばあいにおいて、まだ正しい
組合せは見つけられていない。実際に、その必要が知ら
れるようになって１０年以上がたつのにもかかわらず、
約４０の無血清培地しか市販されていない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明によって、哺乳動
物細胞のための生産支持能を有する無血清培地は、基本
培地に最少量の添加物を含むだけでよいということが今
や明らかになった。
【００１９】本発明により、基本培地ならびに（ａ）細
胞バイアビリティー保護剤、（ｂ）インスリンおよび
（ｃ）トロンビンもしくはトロンビンレセプター活性化
因子のいずれかを含んでなる哺乳動物細胞用無血清培地
が提供される。
【００２０】トロンビンレセプター活性化因子（以下、
「ＴＲＡ」という）は、トロンビンがレセプターの元の
Ｎ末端の近辺を切断することによりレセプターを活性化
したのちにＮ末端になるレセプターの領域を含むペプチ
ドである。
【００２１】本発明の無血清培地は、哺乳動物細胞の生
物学的に活性な産物の生産を血清入りのものに匹敵する
程度に支持する。
【００２２】基本培地は、いかなる既知の培地、たとえ
ばＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０またはそれら
の混合物からなっていてよい。それらはすべて、たとえ
ばギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社、米国、またはベーリンガー
マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）社、ドイツなどから市販されている。
【００２３】細胞バイアビリティー保護剤は、ＡＤＣ−
１（バイオロジカル インダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）社、ベイト ヘメク
（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ）、イスラエル国）、タンパ
ク質加水分解物またはメチルセルロースなどを含んでい
てよい。
【００２４】用いられるインスリンおよびトロンビン
は、好ましくは組換えの方法によって調製されたもので
ある。
【００２５】タンパク質加水分解物：哺乳動物細胞培養
において生長因子としてペプチドを用いることがルツキ
ー（Ｒｕｔｓｋｙ）の総説（１９８１）に記載されてい
る。他の加水分解物としては、たとえばラクトアルブミ
ン加水分解物も、培地補助剤として用いられている（グ
レース（Ｇｒａｃｅ）、１９６２）。
【００２６】メチルセルロースは非栄養補助剤として培
養培地に加えられる。これは、培養細胞にとって有利で
あることが知られている（ヒンク（Ｈｉｍｋ）、１９９
１）。
【００２７】インスリンはすべての種類の細胞に対して
成長因子として働くことが知られており、いくつかの無
血清培地において添加剤として用いられている。
【００２８】トロンビンおよびトロンビンレセプター活
性化因子：血液凝固の役割に加えて、トロンビンは種々
の細胞と特異的なレセプターをとおして結合し、シグナ
ルを生ずることがわかった。血小板上には、少なくとも
２つのトロンビン結合サイトがある（ワークマン（Ｗｏ
ｒｋｍａｎ）、１９７７）。血小板の刺激は、凝固プロ
セスの一部として働く。しかしながら、トロンビンは内
皮細胞にも高および低新和力でもって結合し（アウブレ
イ（Ａｗｂｒｅｙ）、１９７９、マコビッチ（Ｍａｃｈ
ｏｖｉｃｈ）、１９８２；バウエル（Ｂａｖｅｒ）、１
９８３）、その結果、プロスタサイクリンが遊離され
（ウエクスラー（Ｗｅｋｓｌｅｒ）、１９７８）、プロ
テインキナーゼが活性化され（オーエン（Ｏｗｅｎ）、
１９８１）、プラスミノーゲン活性化因子の活性が阻害
される（ルスクトフ（Ｌｕｓｋｕｔｏｆｆ）、１９７
９）。
【００２９】綿維芽細胞においては、トロンビンはＤＮ
Ａ合成および細胞分裂を刺激する（ゼッター（Ｚｅｔｔ
ｅｒ）ら、１９７７、グレン（Ｇｌｅｎｎ）ら、１９８
０、チェン（Ｃｈｅｎ）１９８１；クニングハム（Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍ）ら１９７９）。トロンビンのヒト線
維芽細胞への結合は、表面結合糖タンパク質、フィブロ
ネクチンの生産および放出も刺激する（モシャー（Ｍｏ
ｓｈｅｒ）とバヘリ（Ｖａｈｅｒｉ）、１９７８）。
【００３０】トロンビンは血小板のような細胞を、特異
的なレセプターをとおして活性化することが知られてい
る。最近、ブー（Ｖｕ）ら（１９９１）によって、その
活性化の機作にはレセプターの切断が含まれることが示
唆され、新たに生じたレセプターのＮ末端領域がつなが
れたリガンドとして働くということが提案された。その
新たなＮ末端領域に対応する配列の合成ペプチドは、血
小板活性化におけるトロンビンにとって代わることがで
きる。
【００３１】
【実施例】本発明により、最少量の添加物を含み、従来
法によっても従来法と組換えの方法の組合せによっても
簡単に調製するのに役立つ、哺乳動物細胞産物の生産に
用いるのに適した無血清培地が提供される。
【００３２】前述のとおり、本発明の無血清培地の成分
はすべて、それ自体既知であり、市販されているので、
簡単に手に入れることができる。
【００３３】本発明の１つの実施態様としては、基本培
地に異なる成分を単に混合することによって従来法で無
血清培地が調製される。すなわち、たとえば２０ｍｌの
ＡＤＣ−１（１×５０濃縮）を９８０ｍｌの基本培地に
加える。これに対して０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍ
ｌの間のインスリンと０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／
ｍｌの間のトロンビンを加える。
【００３４】インスリンおよびトロンビンは通常の組換
えの方法、たとえばｃＤＮＡのクローニング、成熟プロ
セス化タンパク質をコードするＤＮＡ断片の単離、Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて発現するのに適した発現ベクターの構
築および発現によって、生産してもよい。
【００３５】前述のように、ＡＤＣ−１はタンパク質加
水分解物のような異なる細胞バイアビリティー保護剤で
置き換えることができる。適切な加水分解物は、たとえ
ばラクトアルブミン加水分解物、コーングルテン加水分
解物などである。本発明のまた別の実施態様では、無血
清培地には基本培地９００ｍｌに対して加えられる１０
％のラクトアルブミン加水分解物１０ｍｌまたは５％の
コーングルテン加水分解物１０ｍｌを含む。さらに、
０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のインスリンお
よび０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のトロン
ビンが添加される。コーングルテン加水分解物は、動物
由来でないため、制御の理由から好ましい。
【００３６】本発明のさらに別の実施態様では、インス
リンおよびトロンビンの発現のための遺伝子を、生物学
的に活性な細胞産物の組換え生産のために用いられる哺
乳動物細胞中へ挿入する。トロンビンとインスリンをコ
ードする遺伝子とともにこれらのタンパク質の発現を司
令する適切なプロモーターを、それらが分泌されること
が可能な適切な構築でもってトランスフェクトさせる。
用いられた細胞はＳＶ４０早期プロモーターに連結され
た種々の遺伝子で形質転換されたＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞である。（チャルナジョブスキー
（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ）、１９８４）。
【００３７】遺伝子はＩＬ−６、ＴＢＰ−ＩおよびｒＩ
ＦＮ−β（組換えインターフェロンβ）をコードするも
のであったが、哺乳動物細胞系における発現に好適な遺
伝子であればいかなるものを用いてもよい。トランスフ
ェクションを行なうための特定のＣＨＯ変異体はプロリ
ン依存性であるので、用いる基本培地にプロリンを添加
することが必要である。
【００３８】前記したように、トロンビンはそのレセプ
ターをアミノ末端細胞外ドメインで切断して新規のＮ末
端をさらし出させることにより活性化させると信じられ
ている。切断を受けたのちの新たなトロンビンレセプタ
ーのＮ末端配列に対応する、相異なる長さのペプチド
が、本発明の無血清培地での使用に好適であることが見
い出された。短いペプチド配列は、化学的もしくは組換
えの方法により容易に合成できるので、これを利用する
ことで無血清培地の調製が簡素化できる。また、これを
利用することで市販のトロンビンそのものを用いなくて
よくなる。市販のトロンビンは哺乳類由来であるので制
御の点で問題を引き起こすかもしれない。
【００３９】本発明は、下記の実施例により示されるが
これらに限定されるものではない。
【００４０】実施例１：細胞成長および生産 細胞生長および生産は下記の系で行なわれた。
【００４１】実験系： Ａ）２４ウェルプレート中、１０％ＦＢＳ添加培地１ｍ
ｌに細胞を０．２５×１０6 細胞／ウェルとなるよう播
種した。３７℃で一晩インキュベートしたのち、培地を
とり除き単層の細胞を無血清培地（ＳＦＭ）で２度すす
いだ。そののち細胞生長または生産のレベルを種々の培
地組成で２４時間ごとに培地変換を行ないながら３〜５
日以上のあいだモニターした。
【００４２】Ｂ）２５ｃｍ2 の組織培養フラスコ中１０
％ＦＢＳ添加培地に０．５×１０6細胞／フラスコとな
るよう播種し、生長培地を生産培地に置き換えるまで３
日間インキュベートした。
【００４３】Ｃ）スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）を用いて
生産を１００ｍｌおよび１リットルスピナー（ベルコ
（Ｂｅｌｌｃｏ）社製）中でモニターした。細胞はマイ
クロキャリアに付着させた。ほとんどの実験はディスク
キャリア（６ｍｍディスク、ポリエステルの不織布をポ
リプロピレンスクリーンに重ね合わせて構成されたもの
（ステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）社、米国）を用いて
行なった。いくつかの実験においては、キャリアとして
バイオシロン（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ）（ヌンク（Ｎｕｎ
ｃ）社、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマー
ク）を用いた。細胞を１０％ＦＢＳ添加培地中に播種
し、２〜３日間の生長期間ののち、培地を無血清の生産
培地に変えた。生産期間の初期には２４時間ごとに培地
交換を行ない、数日ののちには１２時間ごとに培地交換
を行なった。
【００４４】実施例２：基本無血清培地（ＳＦＭ）の処
方 ＩＬ−６生産組換えＣＨＯ細胞は、プロリンおよび２％
ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で生存し、よく増殖する。
培地から血清を除去すると、血清を適切な補助剤に置換
しない限り細胞死が起こる。
【００４５】表１は、細胞生長およびＩＬ−６生産に対
する培地成分の効果を示す。ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞
は、１０％ＦＢＳ培地で０．５×１０6 細胞／フラスコ
となるよう２５ｃｍ2 フラスコ中に播種し、培地を生産
培地に変えるまで３日間インキュベートした。
【００４６】細胞数およびＩＬ−６レベルは、生産培地
を毎日交換して５日間ののち、測定した。細胞数には、
培地交換により洗い去られた非付着細胞は含まれていな
い。
【００４７】表１に要約したように、細胞バイアビリテ
ィー保護剤、たとえばＡＤＣ−１（バイオロジカル イ
ンダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉｅｓ）社、バイトハエメク（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅ
ｋ）、イスラエル）は、（ＦＢＳまたはフィブロネクチ
ンの存在下で細胞が初期付着したのち）細胞増殖をほと
んど伴わずに細胞のバイアビリティーを維持した。細胞
分裂はインスリンによって刺激されうるので、ＡＤＣ−
１とインスリンの両方を添加した培地中では細胞はＦＢ
Ｓ添加培地と同様によく生長する。しかしながら、無血
清下では、細胞のＩＬ−６生産能が経時的に減少し、無
血清培地中５日後には、細胞の特定生産能（μｇ ＩＬ
−６／１０6 細胞）は半分にまで減じられた。
【００４８】細胞の生産能の減少を組織培養（ＴＣ）フ
ラスコ（表１）およびディスクキャリアを用いたスピナ
ーにおいて証明した（図１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】実施例３：生産に対するトロンビンの効
果。
【００５１】ウシトロンビン（シグマ社製）を基本ＳＦ
Ｍ（ＤＭＥＭ＋ＡＤＣ−１＋インスリン）に添加する
と、ＩＬ−６生産は大きく増強された（図２）。プロト
ロンビンは生産に影響を及ぼさなかった。しかしプロト
ロンビンを活性因子Ｘａにより切断してトロンビンを遊
離させると、生産が刺激された。生産刺激活性は、トロ
ンビン阻害剤である血清タンパク質抗トロンビンＩＶに
より阻害される（図２）。
【００５２】実施例４：生長因子の機能的寄与 インスリンもトロンビンもいずれもＣＨＯ細胞の生長を
刺激する。いずれもどちらかをＡＤＣ−１含有培地に添
加すると細胞生長は同程度となる（図３Ａ）。しかしな
がら、インスリンのみ存在下でのＩＬ−６生産はきわめ
て低く、一方トロンビンは有意に生産レベルを刺激した
（図３Ｂ）。ウェル中での短期間の実験においては（図
３）、トロンビンのみを用いた生産能は、インスリンと
トロンビンの両方をＡＤＣに添加したばあいにごくわず
か増大したにすぎなかった。しかしながらスピナー（１
００ｍｌ）中で生産をモニターすると、初期にインスリ
ン添加でも無添加でも同等であったＩＬ−６レベルが、
インスリン非存在下では９日ののちに明らかに減少した
（図４）。これらの結果よりインスリンが最適な長期間
の生産に必須であることが示唆された。
【００５３】図５に示されるように最高の生産能をうる
ためにはインスリンに加えてトロンビンおよびＡＤＣ−
１が必要である。ＡＤＣ−１またはトロンビンを除く
と、生産の４〜５日のちにＩＬ−６レベルが減少してし
まう。
【００５４】実施例５：生産のための無血清培地 組換えＣＨＯ細胞によるＩＬ−６生産を高レベルに保つ
べく見い出された培地組成物は、基本培地（ＤＭＥＭ＋
プロリン）に３つの添加物を含む： １．ＡＤＣ−１； ２．インスリン ０．２μｇ／ｍｌ； ３．トロンビン ０．０２μｇ／ｍｌ。
【００５５】各成分の最適なソースおよび可能な代替物
を知るべく分析を行なった。
【００５６】インスリン ほとんどの実験は、シグマ社製のウシインスリンを用い
て行なった。さらに別の調製物を種々のソースからえ
て、それらの潜在能力を測定するためにＡＤＣ−１とと
もに基本培地に添加した。ウシおよびヒトのいずれのイ
ンスリンも調べた。ヒトに注射するのに用いられる組換
えヒトインスリン（ノボ ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎ
ｏｒｄｉｓｋ）社、デンマーク、およびイーライ リリ
イ（ＥｌｉＬｉｌｌｙ）社、ＳＡ、スイス）は、制御上
の理由のためとくに興味の対象となるものであった。
【００５７】表２は細胞増殖およびＩＬ−６生産におよ
ぼす異なるソースからのインスリンの効果を示す。ＩＬ
−６生産ＣＨＯ細胞は、２４ウェルプレートに１×１０
6 細胞／ウェルとなるよう播種した。３日後、培地をイ
ンスリン添加または無添加のＳＦＭに変えた。さらに４
日間インキュベートしたのち細胞を計数し、ＩＬ−６レ
ベルを測定した。表２に要約したように、検査したイン
スリン群はすべてＣＨＯ細胞の生長因子として同等の活
性を有していた。同等のＩＬ−６生産レベルも観察され
た。
【００５８】
【表２】
【００５９】トロンビン 最初の実験に用いた市販のトロンビンはシグマ社製の非
常に比活性が低い（５０〜１００ＩＵ／ｍｇタンパク）
ウシトロンビンであった。ブルーセファロースカラムに
結合させて、この製剤からトロンビンを精製した。
【００６０】図６に要約したように、活性のほとんどは
１Ｍチオシアネートで溶出されたが、タンパク質の大部
分は結合しないかまたは０．３Ｍの塩で洗い出された。
【００６１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。レ
ーン１はマーカー、レーン２はトロンビン１００ＩＵ／
ｍｇ（シグマ社製）レーン３はトロンビンのブルーセフ
ァロース活性画分、レーン４はトロンビン２０００ＩＵ
／ｍｇ（シグマ社製）である。活性画分のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（図７、レーン３）で見かけの分子量３７Ｋの主た
るタンパク質のバンドが見られた。これは比活性２００
０ＩＵ／ｍｇタンパクの市販（シグマ社製）精製ウシト
ロンビンのタンパク質のバンドと類似していた（図７、
レーン４）。
【００６２】シグマ社のウシトロンビンのブルーセファ
ロースの活性画分（１．０Ｍチオシアネート）を生産の
ために１リットルスピナー中のＳＦＭへの添加物として
用いた。トロンビンは培地中０．０２μｇ／ｍｌの最終
濃度となるようにして用い、培地にはＡＤＣ−１および
インスリン（０．２μｇ／ｍｌ）も添加した。４週間以
上にわたる生産のあいだ、一貫して高レベルの生産が観
察された（図８）。
【００６３】ＡＤＣ−１ 市販のタンパク非含有補助剤（ＡＤＣ−１）はバイオロ
ジカルインダストリーズよりえられ、これの代わりにた
とえばラクトアルブミンの加水分解物（図９）もしくは
コーングルテンの加水分解物（ＣＧ）（図８）のような
タンパク質加水分解物またはメチルセルロース（ＭＣ）
（図９）を用いることができる。
【００６４】前記成分を基本培地（ＤＭＥＭ＋プロリ
ン）にインスリンおよび精製トロンビンとともに添加し
た（図８）。３つの成分を培地に加える限りにおいてす
べての組合せで生産レベルは同等であった。
【００６５】ＡＤＣ−１および種々の代替物はすべてオ
ートクレーブ可能であり、制御という点から有利であ
る。
【００６６】実施例６：無血清培地の多様性 ほとんどの実験はＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞を用いて行な
った。しかしながら、ほかの組換え産物の生産も３成分
すなわちＡＤＣ−１（または同等のもの）、インスリン
およびトロンビン添加の培地で証明された。ＣＨＯ細胞
による組換え腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＢＰ）の
生産を１００ｍｌスピナー中で調べた（図１１）。３成
分すなわちＡＤＣ−１、インスリンおよびトロンビン存
在下では生産レベルは２％ＦＢＳ中で生産している細胞
のものと同程度であった。トロンビンを添加しないと、
生産は５日後に減少した。
【００６７】組換えＩＮＦ−βを１００ｍｌスピナー中
バイオシロンマイクロキャリア上のＣＨＯ細胞により生
産した。生産レベルは２％ＦＢＳ添加培地中でもＡＤ
Ｃ、インスリンおよびトロンビンを添加した無血清培地
中でも同じであった（図１２）。
【００６８】実施例７：トロンビンレセプターの新たな
アミノ酸末端を模倣した１４残基のアミノ酸ペプチドに
ついて、ＩＬ−６生産を刺激する活性においてトロンビ
ンと置き換えることができるか否かを調べた。ペプチド
（Ｈ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ）は、２つのソースよりえた。
高度に精製したペプチド（トロンビンレセプターアクチ
ベーター）はバケム（Ｂａｃｈｅｍ）社（スイス）より
購入し、粗調製物はワイツマン インスチチュート オ
ブ サイエンス（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（イスラエル）で合成し
た。
【００６９】ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞を用いて２４ウェ
ルプレート中、ＳＦＭの成分として、両者をトロンビン
と比較した。
【００７０】表３はＩＬ−６生産に対するトロンビンレ
セプターアクチベーターの効果を示す。
【００７１】表３Ａに要約したように、ＩＬ−６生産は
前記ペプチドによりトロンビンによると同程度にまで刺
激された。しかしながら、ペプチドを用いたばあい、１
０００倍高い濃度が必要であった。期待したように精製
ペプチドは粗調製物に比して、より低い濃度で有効であ
った。
【００７２】
【表３】
【００７３】表４に示されるように、下記ペプチドを用
いても同様の結果がえられた。
【００７４】Ａ−トロンビンレセプター（４２〜５
５）、ヒト Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ Ｂ−トロンビンレセプター（４２〜４７）、ヒト Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ Ｃ−トロンビンレセプター（４２〜５５）、ハムスター Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ Ｄ−トロンビンレセプター（４２〜４７）、ハムスター Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ すべてネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）社、フラン
スより入手。
【００７５】
【表４】
【００７６】実施例８ 生産条件下でのペプチドの活性を調べるために、ディス
クキャリアを用いた１リットルスピナーをセリゲン（Ｃ
ｅｌｌｉＧｅｎ、商標）（ニュー ブルンスウィック
サイオンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ
Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ニュージャージ州、米国）バ
イオリアクターコントロールに接続した。ＴＢＰクロー
ン１０８−１−２２−１２／４の細胞を播種し、生長期
間ののち、２％ＦＢＳで生産を開始した。
【００７７】１０日後、血清添加生産培地をコーングル
テン加水分解物、インスリンおよびＴＲＡ（トロンビン
レセプター アクチベーター）を含むＳＦＭに置き換
えた。生産は４０日間継続した。生産中の一定期間ＴＲ
Ａをトロンビンに置き換えた。トロンビンをＴＲＡに置
き換えても、生産レベルに影響はなかった（図１０）。
図１０には、ＳＦＭ中でのＴＢＰ生産、トロンビンレセ
プターアクチベーターの効果を示した。
【００７８】実施例９：ＣＨＯ細胞でのトロンビンおよ
びインスリンのクローニングと発現 はじめに通常の方法でトロンビンおよびインスリンをコ
ードするｃＤＮＡをクローニングしたのち、シグナルペ
プチドと連結した成熟タンパク質をコードする配列を含
むＤＮＡ断片を単離した。シグナルペプチドはそれら自
身のものでもよいしＣＨＯ細胞において適正に分泌され
るシグナルペプチドでもよい。そののち、ＣＨＯ細胞内
での発現のためにたとえばＳＶ４０またはＣＭＶのよう
なプロモーターに連結したこれらのＤＮＡ断片を含む発
現ベクターを構築した。
【００７９】発現ベクターを所望のタンパク質の組換え
生産するのに用いられるＣＨＯクローンの１つにトラン
スフェクトし、第２のタイプの選択すなわちゲンタマイ
シン（Ｇ４１８）を用いる。インスリンとトロンビンは
無血清培地中に分泌され、ＣＨＯクローンによる異種の
タンパクの生産や分泌を支持する。
【００８０】
【発明の効果】本発明により、哺乳動物細胞による生物
学的に活性な産物の生産を支持することができる無血清
培地が提供される。本発明の無血清培地は、最少量の添
加物を含んでなるため低価格で容易に調整でき、活性産
物の生産に有用である。
【００８１】参考文献 Awbrey,B.J.,Hoak,J.C.,and Owen,W.G. Binding of hum
an thrombin to cultured human endothelial cells,J.Biol.Chem.254:4
092(1979). Barnes,D.,and Sato,G.Serum-free cell culture:A uni
fying approach. Cell 22:649-655(1980). Barnes,D.W.,Sirbasku,D.A.,and Sato,G.H. Cell cultu
re methods for molecular and cellular biology. Vols.1-4,Liss,New
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iques 5:534-542(1987). Bauer,P.I.,Machovich,R.,Aranyi,P.,Buki,K.,Csonka,
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ecombinant proteins in serum-free media. Cytotechnology 5:47-55(1991). Chen,L.B. Thrombin as a growth factor for cultured
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n endothelial cell cofactor for thrombin catalyzed activation of prot
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inity binding of thrombin to platelets.Inhibition by tetranitrometh
ane and heparin.Biochem.Biophys.Res.Commun.75:925
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d internalization of thrombin by normal and transformed chick cells. Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.74:596(1977).
【図面の簡単な説明】
【図１】スピナー中でのＩＬ−６生産に対する培地成分
の効果を示すグラフである。ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞
は、ディスクキャリアを用いた１００ｍｌスピナーに播
種した。１０％ＦＢＳ中で７日間生長させたのち、培地
を２％ＦＢＳ添加の生産培地またはＡＤＣ−１ ２０％
（ｖ／ｖ）＋インスリン０．２μｇ／ｍｌ添加無血清培
地（ＳＦＭ）に置き換えて、ＩＬ−６生産を２４時間ご
とに測定した。結果は、２つのスピナーでの平均を示し
た。
【図２】ＳＦＭ中でＩＬ−６生産刺激におよぼすトロン
ビンの効果を示すグラフである。種々の成分をＳＦＭに
添加し、２４ウェルプレート中のＩＬ−６生産ＣＨＯ細
胞に加えた。
【図３】インスリンとトロンビンの細胞生長およびＩＬ
−６生産におよぼす効果を示すグラフである。
【図４】１００ｍｌスピナー中でＩＬ−６生産におよぼ
すインスリンの効果を示すグラフである。
【図５】１００ｍｌスピナー中でＩＬ−６生産におよぼ
すＡＤＣ−１およびインスリンの効果を示すグラフであ
る。
【図６】比活性が低い（５０〜１００ＩＵ／ｍｇ）市販
のトロンビン（シグマ社製）を付したブルーセファロー
スカラムからのトロンビンの溶出パターンを示すグラフ
である。
【図７】種々のトロンビン調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析を示す。
【図８】１リットルスピナー中でのＴＢＰの生産を示す
グラフである。
【図９】インスリンとトロンビンを含有する無血清培地
への種々の細胞バイアビリティ保護剤の効果を比較する
ために１００ｍｌスピナー中でのＴＢＰ生産を示したグ
ラフである。
【図１０】１リットルバイオリアクター中でのＴＢＰ生
産を示すグラフである。
【図１１】１００ｍｌスピナー中でのＴＢＰ生産に対す
る培地成分の効果を示すグラフである。
【図１２】１００ｍｌスピナー中でのＣＨＯ細胞による
ｒＩＦＮ−βの生産を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｆ 8214−4Ｂ Ｋ 8214−4Ｂ ＺＮＡ Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基本培地ならびに（ａ）細胞バイアビリ
    ティー保護剤、（ｂ）インスリンおよび（ｃ）トロンビ
    ンもしくはトロンビンレセプター活性化因子のいずれか
    を含んでなる哺乳動物細胞のための無血清培地。
  2. 【請求項２】 基本培地がＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ
    １６４０またはそれらの混合物である請求項１記載の
    培地。
  3. 【請求項３】 細胞バイアビリティー保護剤がＡＤＣ−
    １、タンパク質加水分解物またはメチルセルロースなど
    である請求項１または２記載の培地。
  4. 【請求項４】 タンパク質加水分解物がラクトアルブミ
    ン加水分解物である請求項３記載の培地。
  5. 【請求項５】 タンパク質加水分解物がコーングルテン
    加水分解物である請求項３記載の培地。
  6. 【請求項６】 トロンビンを含む請求項１、２、３、４
    または５記載の培地。
  7. 【請求項７】 トロンビンレセプター活性化因子を含む
    請求項１、２、３、４または５記載の培地。
  8. 【請求項８】 用いられるインスリンおよび／またはト
    ロンビンおよび／またはトロンビンレセプター活性化因
    子が組換えの方法でつくられたものである請求項１、
    ２、３、４、５、６、または７記載の培地。
  9. 【請求項９】 トロンビンレセプター活性化因子が、Se
    r-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-
    Pheのアミノ酸配列を有するペプチドを含んでなるもの
    である請求項７記載の培地。
  10. 【請求項１０】 トロンビンレセプター活性化因子が、
    Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asnのアミノ酸配列を有するペプ
    チドを含んでなるものである請求項７記載の培地。
  11. 【請求項１１】 トロンビンレセプター活性化因子が、
    Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐ
    ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
    ｕ−Ｌｅｕのアミノ酸配列を有するペプチドを含んでな
    るものである請求項７記載の培地。
  12. 【請求項１２】 トロンビンレセプター活性化因子が、
    Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎのア
    ミノ酸配列を有するペプチドを含んでなるものである請
    求項７記載の培地。
  13. 【請求項１３】 インスリンおよび／またはトロンビン
    および／またはトロンビンレセプター活性化因子が哺乳
    動物細胞において所望のタンパク質とともに発現される
    ものである請求項８記載の培地。
  14. 【請求項１４】 基本培地、細胞バイアビリティー保護
    剤および０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のイン
    スリンおよび０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間
    のトロンビンを含んでなる請求項１、２、３、４、５、
    ６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の培
    地。
  15. 【請求項１５】 １μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌのト
    ロンビンレセプター活性化因子を含んでなる請求項１、
    ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ま
    たは１３記載の培地。
  16. 【請求項１６】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
    ８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載
    の無血清培地中で生物学的に活性なタンパク質を生産す
    るように適合された哺乳動物細胞系。
  17. 【請求項１７】 ＣＨＯ細胞系である請求項７記載の細
    胞系。
  18. 【請求項１８】 生物学的に活性なタンパク質をコード
    する遺伝子でトランスフェクトされ、請求項１、２、
    ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
    ３、１４または１５記載の無血清培地中で生産するよう
    に適合されたＣＨＯ細胞系。
  19. 【請求項１９】 生物学的に活性なタンパク質がインタ
    ーフェロン−βである請求項１８記載のＣＨＯ細胞系。
  20. 【請求項２０】 生物学的に活性なタンパク質がインタ
    ーロイキン−６である請求項１８記載のＣＨＯ細胞系。
  21. 【請求項２１】 生物学的に活性なタンパク質が腫瘍壊
    死因子結合タンパク質である請求項１８記載のタンパク
    質。
  22. 【請求項２２】 さらにインスリンおよび／またはトロ
    ンビンおよび／またはトロンビンレセプター活性化因子
    をコードする遺伝子でトランスフェクトされた請求項１
    ７、１８、１９、２０または２１記載の細胞系。
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