DE69332430T2

DE69332430T2 - Serumfreies Medium für Säugetierzellen

Info

Publication number: DE69332430T2
Application number: DE69332430T
Authority: DE
Inventors: Moshe Bracha; Dina Fischer
Original assignee: Interpharm Laboratories Ltd
Current assignee: Interpharm Laboratories Ltd
Priority date: 1992-08-24
Filing date: 1993-08-24
Publication date: 2003-07-17
Anticipated expiration: 2013-08-25
Also published as: PT1045023E; EP0584788B1; ES2185618T3; EP1045023B1; DK0584788T3; PT584788E; ATE226632T1; IL102929A0; EP0584788A3; AU4487193A; ZA936192B; DK1045023T3; JPH06153931A; EP1045023A1; CA2104643C; DE69332430D1; JP4124493B2; EP0584788A2; DE69334097T2; US5641647A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein serumfreies Medium, das in der Lage ist, die Synthese der Produkte von Säugetierzellen, zum Beispiel der mittels rekombinanter Verfahren erhaltenen Proteine aufrechtzuerhalten.
Heutzutage werden Zellkulturen weithin für die Herstellung verschiedener biologisch aktiver Produkte wie virale Impfungen, Monoclonale Antikörper, Nicht-antikörperartige Immunregulatoren, Polypeptid-Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, tumorspezifische Antigene usw. verwendet. Diese Produkte werden von normalen, von transformierten und von gentechnisch veränderten Zellen erzeugt.
Zur Kultur von Zellen muß dem Kulturmedium Serum hinzugefügt werden, welches als universelles Nährmittel für das Wachstum aller Zellinien sowie für die Herstellung der meisten biologisch aktiven Produkte dient. Serum enthält Hormone, Wachstumsfaktoren, Trägerproteine, Anlagerungs- und Ausbreitungsfaktoren, Nährstoffe, Spurenelemente usw. Kulturmedium enthält gewöhnlich bis zu etwa 10% tierisches Serum, wie zum Beispiel fötales Rinderserum (FBS).
Trotz seiner häufigen Verwendung weist das Serum viele Unzulänglichkeiten auf. Es enthält hohe Spiegel zahlreicher Proteine, die die niedrigen Spiegel der gewünschten, von den Zellen hergestellten Proteine äußerst störend überlagern. Diese Serumproteine müssen im weiteren Verlauf des Herstellungsprozesses vom Zellprodukt abgetrennt werden, was den Prozeß komplizierter macht und seine Kosten erhöht. Eine weitere Unzulänglichkeit des Serums liegt in der chargenbedingten Schwankung in seiner Zusammensetzung, was zu beträchtlichen Durchführungsproblemen aufgrund der schwankenden Serumproteinkontamination des Endproduktes führt.
In jüngster Zeit hat das Auftreten von BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy), einer übertragbaren neurodegenerativen Krankheit bei Rindern mit einer langen Latenzzeit oder Inkubationsdauer, neuerlich Durchführungsprobleme bei der Verwendung tierischer Seren zur Herstellung biologisch aktiver Produkte aufgeworfen.
Eine weitere Unzulänglichkeit bei der Verwendung tierischer Seren wie etwa FBS liegt in deren unregelmäßiger Verfügbarkeit aufgrund steigender Nachfrage, die wiederum zu generell steigenden Preisen führt.
Es besteht deshalb ein dringender Bedarf für die Entwicklung eines alternativen Mediumszusatzes zur Aufrechterhaltung des Zellwachstums und zur Herstellung biologisch aktiver Produkte.
Die Vor- und Nachteile der serumfreien Kultur für die Herstellung rekombinanter Biopharmazeutika aus tierischen Zellen sind grundlich rezensiert worden (Barnes, 1987; Barnes und Sato, 1980; Broad et al., 1991; Jayme, 1991). Die Liste der wichtigsten Additive, die als Zusätze für serumfreie Medien Verwendung finden, wird bei Barnes, 1987 und bei Barnes und Sato. 1980 zusammengefaßt.
Im Gegensatz zu serumhaltigem Medium, das für ein breites Spektrum von Zelltypen und Kulturbedingungen verwendet werden kann, sind serumfreie Rezepturen im allgemeinen hochspezifisch (Barnes et al., 1984: Sato et al., 1982: Taub. 1985; Weiss et al., 1980).
Die meisten handelsüblichen serumfreien Medien enthalten ein Trägerprotein wie etwa Albumin. Die Gegenwart eines Trägerproteins mag zum Schutz der Lebensfähigkeit: der Zelle erforderlich sein, doch hat sie die vorstehend erwähnten Nachteile für den Reinigungsprozeß.
CHO-Zellen haben sich als geeignete Säugetier-Empfängerzellen erwiesen, die die Transfektion und Expression einer Vielzahl verschiedener fremder Genprodukte für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen ermöglichen (Familletti und Fredericks, 1988; Marino, 1989).
Für CHO-Zellkulturen ist eine Anzahl serumfreier Medien im Handel erhältlich, doch weisen diese vielfache Nachteile auf. Die meisten sind für Laboranwendungen in kleinen Mengen geeignet, aber zu teuer für die großtechnische Produktion in Bioreaktoren. Einige sind für das Zellwachstum günstig, jedoch nur schlecht als Produktionsmedium, geeignet. Jedes dieser Medien mag für das spezielle System, für das es entwickelt wurde, geeignet sein, doch für andere Systeme kann es gewöhnlich nicht eingesetzt werden.
Ein bekanntes serumfreies Kulturmedium (US-Patent 5.063.157) für nichtanhaftende Säugetierzellen enthält außer dem Grundmedium Transferrin, Insulin, ein Pepton, ein Beta-Dxylopyranosederivat, Selenit und ein biologisches Polyamin. Die einzige Offenbarung hin sichtlich der Produktion in diesem Patent betrifft die Kultur spezifischer Mäuse- Hybridomzellen in einem Medium, das außer dem Grundmedium noch sechs weitere Bestandteile enthält. Es wird, mit Ausnahme eines FSH-Antikörpers, nichts über die Herstellung eines biologisch aktiven Produktes in irgendeiner anderen Säugetierzelle ausgesagt.
Ein anderes serumfreies Zellwachstumsmedium für Säugetierzellen wird im US-Patent Nr. 4.443.546 offenbart. Dieses Wachstumsmedium enthält außer dem Grundmedium noch sieben weitere Bestandteile.
Die Beschreibung zum Europäischen Patent Nr. 481.791 offenbart ein Kulturmedium für CHO-Zellen, das Wasser, einen Osmolalitätsregulator, einen Puffer, eine Energiequelle, Aminosäuren, eine Eisenquelle, einen Wachstumsfaktor sowie weitere Komponenten nach Wahl enthält. Die zwei als Beispiel angeführten Medien enthalten 19 bzw. 17 Bestandteile.
Die Hauptziele bei der Entwicklung eines serumfreien Mediums für die großtechnische Produktion sind folgende: ein serumfreies, proteinfreies (oder schwach proteinhaltiges), definiertes Medium mit minimalen Zusätzen und somit geringen Kosten, und ein wirkungsvolles Medium, das keine Bestandteile enthält, die die Schritte des Kultivierungs-, Produktions- und Reinigungsprozesses komplizieren könnten.
Sind in dem Medium nichtsdestoweniger Proteine vorhanden, so ist es vorzuziehen, diese auf rekombinantem Weg herzustellen, anstatt sie direkt aus einer tierischen Quelle zu isolieren.
Obwohl die Liste der bekannten potentiellen Zusätze zu serumfreien Medien sehr lang ist, hat man ihre richtige Kombination in vielen Fällen noch nicht herausgefunden. Tatsächlich sind nur etwa 40 kommerzielle serumfreie Medien auf dem Markt, obwohl die Notwendigkeit dafür schon seit mehr als einem Jahrzehnt besteht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun entdeckt, daß ein serumfreies Medium für Säugetierzellen, das in der Lage ist, eine Produktion aufrechtzuerhalten, nur eine minimale Menge an Additiven zu einem Grundmedium erfordert.
Die vorliegende Erfindung liefert ein serumfreies Medium für Säugetierzellen, das ein Grundmedium sowie (a) ein Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen, (b) Insulin und (c) einen Thrombinrezeptoraktivator wie in Patentanspruch 1 definiert enthält.
Das serumfreie Medium gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung biologisch aktiver Produkte in Säugetierzellen in einem Umfang, der dem mit Serum erreichten vergleichbar ist.
Als Grundmedium kann ein beliebiges solches Medium gewählt werden, zum Beispiel DMEM, F12, RPMI 1640 oder Gemische daraus; sie sind erhältlich von Gibco, USA oder Boehringer Mannheim, Deutschland.
Das Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen kann ADC-1TM (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), ein Proteinhydrolysat, Methylcellulose oder ähnliches sein.
Das verwendete Insulin wird vorzugsweise mittels rekombinanter Verfahren hergestellt.
Proteinhydrolysat: Die Verwendung von Peptiden als Wachstumsfaktoren in der Säugetierzellenkultur wurde im Überblick von Rutsky, 1981 beschrieben. Andere Hydrolysate, z. B. Lactalbuminhydrolysat werden ebenfalls als Mediumzusätze verwendet (Grace, 1962).
Methylcellulose wurde dem Kulturmedium als nichtnährender Zusatz beigegeben, da bekannt ist, daß es für Zellen in Kulturen vorteilhaft ist (Hink, 1991).
Insulin wird als Zusatz in einer Anzahl serumfreier Medien verwendet, da es als Wachstumsfaktor für alle Zelltypen bekannt ist.
Thrombin und Thrombinrezeptoraklivator: Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Blutgerinnung hat es sich gezeigt, daß Thrombin über spezifische Rezeptoren an verschiedene Zellen bindet und Signale erzeugt. An Thrombocyten gibt es wenigstens zwei Thrombin- Bindungsstellen (Workman, 1977). Die Stimulation der Thrombocyten dient als Teil des Gerinnungsprozesses. Jedoch bindet Thrombin auch mit hoher und niedriger Affinität an Endothelzellen (Awbrey, 1979; Machovich, 1982; Bauer, 1983), was zur Freisetzung von Prostacyclin (Weksler, 1.978), Aktivierung von Proteinkinase (Owen, 1981) und Hemmung der Aktivität des Plasminogenaktivators (Luskutoff, 1979) fuhrt.
In Fibroblasten stimuliert Thrombin die DNA-Synthese und die Zellteilung (Zetter et al., 1977; Glenn et al., 1980; Chen, 1981; Cunningham et al., 1979). Die Bindung des Thrombins an menschliche Fibroblasten stimuliert auch die Produktion und Freisetzung eines oberflächenassoziierten Glycoproteins, des Fibronectins (Mosher und Vaheri, 1978).
Es ist bekannt, daß Thrombin Zellen wie Thrombocyten über einen spezifischen Rezeptor aktiviert. Neuerdings haben Vu et al., 1991, den Aktivierungsmechanismus mit einer Spaltung des Rezeptors erklärt, und es wurde vorgeschlagen, daß die neugebildete N-terminale Region des Rezeptors als angelagerter Ligand fungiert. Ein synhetisches Peptid mit einer der neuen N- terminalen Region entsprechenden Sequenz kann das Thrombin bei der Aktivierung der Thrombocyten ersetzen.
Fig. 1 zeigt die Auswirkung der Zusammensetzung des Mediums auf die IL-6-Produktion in "Spinners" (Rollbehältern). In 100 ml-"spinners" wurden mittels Trägerscheiben IL-6- produzierende CHO-Zellen ausgebracht. Nach 7-tägigem Wachstum in 10% fötalem Rinderserum (FBS) wurde das Medium mit Produktionsmedium ersetzt, das entweder mit 2% FBS (* - *) oder mit ADC-1TM + Insulin 0,2 ug/ml serumfreiem Medium (SFM) (-) angereichert war. Die IL-6-Produktion wurde alle 24 Stunden bestimmt. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte aus zwei "spinners".
Fig. 2 zeigt die Wirkung von Thrombin auf die Stimulation der IL-6-Produktion in serumfreiem Medium. (SFM). Die verschiedenen Bestandteile wurden zu SFM hinzugefügt und zu IL-6-produzierenden CHO-Zellen in Schalen mit 24 Vertiefungen hinzugefügt.
Fig. 3 zeigt die Wirkung von Insulin und Thrombin auf Zellwachstum und IL-6- Produktion.
Fig. 4 zeigt die Wirkung von Insulin auf die IL-6-Produktion in 100 ml-"spinners".
Fig. 5 zeigt die Wirkung von ADC-1 und Insulin auf die IL-6-Produktion in 100 ml- "spinners".
Fig. 6 zeigt das Elutionsmuster von Thrombin aus einer Blue Sepharose-Säule, die mit handelsüblichem Thrombin (Sigma) von niedriger spezifischer Aktivität (50-100 IU/mg) geladen worden war.
Fig. 7 zeigt die SDS-PAGE-Analyse verschiedener Thrombinzubereitungen.
Fig. 8 zeigt die TBP-Produktion in 1000 ml-"spinners".
Fig. 9 zeigt die TBP-Produktion in 100 ml-"spinners" und vergleicht die Wirkung verschiedener Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen auf serumfreies Medium, das Insulin und Thrombin enthält.
Fig. 10 zeigt die TBP-Produktion in einem 1 l-Bioreaktor.
Fig. 11 zeigt die Auswirkung der Mediumszusammensetzung auf die TBP-Produktion in 100 ml-"spinners".
Fig. 12 zeigt die rIFN-β-Produktion durch CHO-Zellen in 100 ml-"spinners".
Die vorliegende Erfindung liefert ein serumfreies Medium, das zur Verwendung im Rahmen der Herstellung von Säugetierzellprodukten geeignet ist, das ein Minimum an Zusätzen enthält und einfach zuzubereiten ist - entweder durch konventionelle oder durch eine Kombination aus konventionellen und rekombinanten Verfahren.
Wie vorstehend ausgeführt, sind alle Bestandteile dieses serumfreien Mediums per se bekannt und im Handel erhältlich und damit leicht verfügbar.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das serumfreie Medium in konventioneller Weise durch einfaches Zusammenmischen der verschiedenen Komponenten mit dem Grundmedium zubereitet. So werden z. B. 20 ml ADC-1TM (1 · 50 konzentriert) zu 980 ml Grundmedium hinzugefügt. Dazu werden zwischen 0,1 ug/ml und 2 u g/ml Insulin hinzugefügt.
Insulin kann mit den üblichen rekombinanten Verfahren hergestellt werden. z. B. durch Clonieren der cDNA, Isolation der DNA-Fragmente, die die reifen, prozessierten Proteine codieren, Konstruktion von Expressionsvektoren, die zur Expression in E. coli geeignet sind und Expression.
Wie vorstehend dargelegt, kann das ADC-1TM durch ein anderes Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen, wie etwa ein Proteinhydrolysat ersetzt werden. Geeignete Hydrolysate sind z. B. Lactalbuminhydrolysat, Maisglutenhydrolysat oder ähnliche. Somit umfaßt das serumfreie Medium gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung 10 ml 10%-iges Lactalbuminhydrolysat oder 10 ml 5%-iges Maisglutenhydrolysat, die zu jeweils 900 ml Grundmedium hinzugefügt werden. Zusätzlich werden zwischen 0,1 ug/ml und 2 ug/ml Insulin dazugegeben. Maisglutenhydrolysat wird aus regulatorischen Gründen bevorzugt, da es nicht tierischen Ursprungs ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Gene zur Expression von Insulin Lind Thrombin in die Säugetierzellen eingeschleust, die zur rekombinanten Herstellung der biologisch aktiven Zellprodukte verwendet werden. Geeignete Promoter, die die Expression von Thrombin und Insulin steuern, werden mit den entsprechenden proteincodierenden Genen kotransfiziert, mit der geeigneten Konstruktion, um ihre Sekretion zu ermöglichen.
Bei den verwendeten Zellen handelt es sich um CHO-(Chinese Hamster Ovary)-Zellen, die mit verschiedenen, an einen frühen SV40-Promoter gebundenen Genen transformiert waren (Chernajovsky, 1984). Es handelte sich um die Gene, die IL-6, TBP-I und rIFN-β (rekombinantes Interferon-β) codieren, doch könnte auch jedes andere zur Expression in Säugetierzellensystemen geeignete Gen verwendet werden. Da der spezielle, für die Transfektion verwendete CHO-Mutant prolinabhängig ist, mußte dem verwendeten Grundmedium Prolin zugesetzt werden.
Wie vorstehend dargelegt, nimmt man an, daß das Thrombin seinen Rezeptor aktiviert, indem es ihn im aminoterminalen extrazellulären Bereich spaltet und damit ein neues N-Ende freilegt. Peptide verschiedener Länge, die den Sequenzen des neuen Thrombinrezeptor- N-Endes (nach der Spaltung) entsprechen, erwiesen sich als geeignet zur Verwendung im serumfreien Medium gemäß der vorliegenden Erfindung. Diese Verwendung vereinfacht die Zubereitung des serumfreien Mediums, da kurze Peptidsequenzen sich leicht entweder durch chemische oder durch rekombinante Verfahren synthetisieren lassen. Damit läßt sich auch die Verwendung handelsüblichen Thrombins vermeiden, das aufgrund seiner Herkunft von Säugetieren Zulassungsschwierigkeiten aufwerten könnte.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, die ihren Schutzbereich nicht einschränken, näher erläutert:

Beispiel 1

Zellwachstum und Produktion

Zellwachstum und Produktion liefen in folgenden Systemen:
a) In Schalen mit 24 Vertiefungen wurde je 1 ml mit 10% FBS angereichertes Medium mit Zellen beimpft (0,25 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung). Nach Bebrütung bei 37ºC über Nacht wurde das Medium entfernt und die einzellige Zellschicht (monolayer) zweimal mit serumfreiem Medium (SFM) gespült. Das Zellwachstum oder der Produktionsspiegel wurden dann in den verschiedenen Mediumszusammensetzungen über 3 bis 5 Tage verfolgt, wobei das Medium alle 24 Stunden erneuert wurde.
b) In 25 cm²-Gewebekulturkolben wurde mit 10% FBS angereichertes Medium mit Zellen beimpft (0,5 · 10&sup6; Zellen/Kolben) und 3 Tage bebrütet; anschließend wurde das Wachstumsmedium durch Produktionsmedium ersetzt.
c) In "spinners" wurde die Produktion in 100 ml- und in 1 l-"spinners" (Bellco) verfolgt. Die Zellen wurden an Mikroträger adsorbiert. Die meisten Versuche wurden mit scheibenförmigen Trägern (6 mm-Scheiben aus nichtgewebtem Polyesterstoff, der auf eine Polypropylenmembran laminiert war; Sterilin, Großbritannien). Bei einigen Versuchen wurde Biosilon (Nung, Roskilde, Dänemark) als Träger verwendet. Die Zellen wurden in mit 10% FBS angereichertes Medium aus gebracht, das nach einer Wachstumszeit von 2-3 Tagen, gegen serumfreies Produktionsmedium ausgewechselt wurde. Am Anfang der Produktionsperiode wurde das Medium alle 24 Stunden, nach ein paar Tagen alle 12 Stunden erneuert.

Beispiel 2

Zubereitung eines serumfreien Grundmediums (SFM)

IL-6-produzierende, rekombinante CHO-Zellen überleben und vermehren sich gut in mit Prolin und 2% FBS angereichertem DMEM. Die Entfernung des Serums aus dem Medium führt zum Zelltod, wenn das Serum nicht durch einen geeigneten Zusatzstoff ersetzt wird.
Wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, erhielt die Zugabe eines Mittels zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen, z. B. ADC-1TM (Biological Industries. Beit Haemek, Israel) die Zellen (nach anfänglichem Anhaften in Gegewart von FBS oder Fibronectin) bei sehr geringem Zellwachstum am Leben. Die Zellteilung kann durch Insulin stimuliert werden, und in Medium, das sowohl mit Insulin als auch ADC-1TM angereichert ist, wachsen die Zellen ebenso gut wie in mit FBS angereichertem Medium. In Abwesenheit von Serum sinkt jedoch allmählich die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von IL-6, und nach 5 Tagen ist im serumfreien Medium ihre spezifische Produktivität (ug IL-6/10&sup6; Zellen) auf die Hälfte abgesunken.
Das Nachlassen der Produktionsfähigkeit der Zellen zeigt sich sowohl in Gewebekultur- Kolben (Tabelle 1) als auch in "spinners" mit Trägerscheiben (Fig. 1). Tabelle 1 Auswirkung der Zusammensetzung des Mediums auf Zellwachstum und IL-6-Produktion
a) IL-6-produzierende CHO-Zellen wurden in 25 cm²-Kolben in 10% FBS ausgebracht (0,5 · 10&sup6; Zellen/Kolben) und 3 Tage lang bebrütet, bevor das Medium gegen Produktionsmedium ausgewechselt wurde.
b) Zellzahl und IL-6-Spiegel wurden nach 5 Tagen bestimmt, wobei das Produktionsmedium täglich erneuert wurde. Die Zeitzahl schließt nichtadsorbierte Zellen nicht mit ein, da diese beim Erneuern des Mediums weggespült wurden.

Beispiel 3

Auswirkung von Thrombin auf die Produktion (nur zu Vergleichszwecken)

Wurde zum serumfreien Grundmedium (DMEM + ADC-1TM + Insulin) Thrombin (Sigma) hinzugefügt, so stieg die IL-6-Produktion stark an (Fig. 2). Prothrombin hatte keine Wirkung auf die Produktion. Wenn jedoch das Prothrombin durch aktiven Faktor Xa gespalten und damit Thrombin freigesetzt wurde, so wurde die Produktion stimuliert. Die produktions stimulierende Aktivität wurde durch den Thrombininhibitor, das Serumprotein Antithrombin IV gehemmt (Fig. 2).

Beispiel 4

Der funktionelle Beitrag der Wachstumsfaktoren (zu Vergleichszwecken)

Sowohl Insulin als auch Thrombin stimulieren das Wachstum der CHO-Zellen. Das Hinzufügen des einen wie des anderen zu ADC-1TM-haltigem Medium führte zu einer ähnlichen Zellwachstumsrate (Fig. 3A). Jedoch war die IL-6-Produktion in Gegewart von Insulin allein sehr niedrig, während Thrombin die Produktion wesentlich ansteigen ließ. (Fig. 3B). In den Kurzzeitversuchen in den Schalen mit Vertiefungen (Fig. 3) führte die Zugabe von Insulin und Thrombin zum ADC-1TM nur zu einer geringfügigen Verbesserung der Produktivität gegenüber der Thrombinzugabe allein. Wurde jedoch die Produktion in "spinners" (100 ml) gemessen, fiel der IL-6-Spiegel, der anfangs mit oder ohne Insulin gleich hoch war, nach 9 Tagen deutlich ab, wenn Insulin fehlte (Fig. 4). Diese Befunde deuten darauf hin, daß Insulin für optimale Lanszeitproduktion erforderlich ist.
Zusätzlich zum Insulin sind sowohl Thrombin als auch ADC-1TM nötig, um maximale Produktion zu erreichen, wie in Fig. 5 gezeigt wird. Die. Entfernung von entweder ADC-1TM oder Thrombin führte zu einem Absinken des IL-6-Spiegels nach 4-5 Produktionstagen.

Beispiel 5

Serumfreies Produktionsmedium (zu Vergleichszwecken)

Die Mediumszusammensetzung, die sich als imstande erwies, hohe Spiegel der IL-6- Produktion durch rekombinante CHO-Zellen aufrechtzuerhalten, enthält neben dem Grundmedium (DMEM + Prolin) drei weitere Zusätze:
1. ADC-1TM
2. Insulin 0,2 ug/ml
3. Thrombin 0,02 ug/ml
Für jedes dieser Bestandteile wurde eine optimale Quelle und ein möglicher Ersatz gesucht.
Insulin: Die meisten Versuche wurden mit Rinderinsulin von der Fa. Sigma ausgeführt. Weitere Zubereitungen wurden aus verschiedenen Quellen bezogen und zusammen mit ADC-1TM dem Grundmedium hinzugefügt, um ihr Potential zu bestimmen. Es wurde sowohl Rinder- als auch menschliches Insulin untersucht. Rekombinantes menschliches Insulin, das für Injektionen beim Menschen verwendet wird (Novo Nordisk, Dänemark und Eli Lilly SA, Schweiz) war aus zulassungstechnischen Gründen von besonderem Interesse.
Wie in Tabelle 2 zusammenfassend dargestellt, hatten alle getesteten Insulinchargen eine ähnliche Aktivität als Wachstumsfaktoren für die CHO-Zellen. Es wurden auch ähnliche Spiegel der IL-6-Produktion beobachtet. Tabelle 2 Auswirkung von Insulin aus verschiedenen Quellen auf Zellwachstum und IL-6-Produktion
a) IL-6-produzierenden CHO-Zellen wurden in eine Schale mit 24 Vertiefungen ausgebracht (1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung). Nach 3 Tagen wurde das Medium gegen SFM mit oder ohne Insulin ausgewechselt. Die Zellen wurden gezählt und nach weiteren 4-tägiger Inkubation wurde der IL-6-Spiegel bestimmt.
Thrombin: Bei dem für die anfänglichen Versuche verwendeten handelsüblichen Thrombin handelte es sich um ein Rinderthrombin mit sehr niedriger spezifischer Aktivität (50- 100 IU/mg Protein), welches von der Fa. Sigma bezogen wurde. Das Thrombin wurde für diese Zubereitung durch Bindung an eine Blue-Sepharose-Säule gereinigt.
Wie in Fig. 6 zusammenfassend dargestellt, wurde der größte Teil der Aktivität in 1 M Thiocyanat eluiert, während die Mehrzahl der Proteine nicht gebunden hatten oder mit 0,3 M des Salzes eluiert wurden.
SDS-PAGE der aktiven Fraktion (Fig. 7, Reihe 3) wies eine Hauptproteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 37 K auf; ähnlich wie die Proteinbande eines handelsüblichen (Sigma), gereinigten Rinderthrombins mit einer spezifischen Aktivität von 2000 IU/mg Protein (Fig. 7, Reihe 4).
Die aktive Fraktion der Blauen Sepharose (1,0 M Thiocyanat) des Sigma-Rinderthrombins wurde als Zusatz zum SFM in 1 l-"spinners" zur Produktion verwendet. Das Thrombin wurde in einer Endkonzentration von 0,02 ug/ml in Medium verwendet, das auch noch mit ADC-1TM und Insulin (0,2 ug/ml) angereichert war. Es wurden mehr als vier Wochen lang durchgehend hohe Produktionsspiegel beobachtet (Fig. 8).
ADC-1TM: Der handelsübliche proteinfreie Mediumszusatz (ADC-1TM), der von der Fa. Biological Industries (Beit-Haemek, Israel) bezogen wurde, kann durch Proteinhydrolysate wie Lactalbuminhydrolysat (Fig. 9) oder Maisglutenhydrolysat (Fig. 8) oder Methylcellulose (Fig. 9) ersetzt werden.
Die vorstehend genannten Bestandteile wurden zusammen mit Insulin und gereinigtem Thrombin dem Grundmedium (DMEM + Prolin) hinzugefügt (Fig. 8). Der Produktionsspiegel war für alle Konbinationen ähnlich, solange dem Medium alle drei Bestandteile hinzugefügt wurden.
ADC-1TM und die verschiedenen Substitute sind alle autoklavierbar, was aus Gründen der Zulassung vorteilhaft ist.

Beispiel 6

Vielseitigkeit des serumfreien Mediums (zu Vergleichszwecken)

Die meisten Versuche wurden mit IL-6-produzierenden CHO-Zellen vorgenommen. Jedoch wurde auch die Erzeugung anderer rekombinanter Produkte in dem mit den drei Komponenten ADC (oder Äquivalent), Insulin und Thrombin angereicherten Medium demonstriert.
Die Produktion rekombinanten Bindungsproteins für den Tumornekrosefaktor (TBP) durch CHO-Zellen wurde in 100 ml-"spinners" nachgewiesen (Fig. 11). In Gegenwart der drei Komponenten ADC, Insulin und Thrombin ergab sich ein ähnlicher Produktionsspiegel wie bei den in 2% FBS produzierenden Zellen. In Abwesenheit von Thrombin ließ die Produktion nach 5 Tagen nach.
Rekombinantes. IFN-β wurde von CHO-Zellen auf Biosilon-Mikroträgern in 100 ml- "Spinners" produziert. Der Produktionsspiegel war der gleiche wie in dem mit 2% FBS angereicherten. Medium oder wie im mit ADC, Insulin und Thrombin angereicherten serumfreien Medium (Fig. 12)

Beispiel 7

Ein 14-restiges Aminosäurepeptid, das das neuen Aminosäureende des Thrombinrezeptors nachahmt, wurde auf seine Fähigkeit geprüft, das Thrombin bei der Stimulation der IL-6- Produktion zu ersetzen. Das Peptid (H-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys- Tyr-Glu-Pro-Phe-OH) wurde aus zwei Quellen bezogen. Ein hochreines Peptid (Thrombinrezeptoraktivator) kam von Bachem (Schweiz) und ein Rohpräparat wurde am Weizmann Institute of Science (Israel) synthetisiert.
Die beiden Zubereitungen als Bestandteil des SFM wurden in Schalen mit 24 Vertiefungen unter Verwendung IL-6-produzierender CHO-Zellen mit Thrombin verglichen.
Wie in Tabelle 3 zusammenfassend dargestellt, wurde die IL-6-Produktion durch die Peptide in gleichem Maß stimuliert wie durch das Thrombin. Jedoch war eine 1000 mal höhere Konzentration erforderlich, wenn Peptid verwendet wurde. Wie erwartet war das gereinigte Peptid schon bei niedrigeren Konzentrationen aktiv als das Rohpräparat. Tabelle 3A Auswirkung von Thrombinrezeptor-Aktivator auf die IL-6-Produktion
a) Rohpräparat, Weizmann Institute of Science
b) Gereinigtes Peptid. Bachem
Wie aus nachstehender Tabelle 3B ersichtlich, erhielt man mit folgenden Peptiden ähnliche Ergebnisse:
A) Thrombinrezeptor (42-55), vom Menschen
Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe
B) Thrombinrezeptor (42-47), vom Menschen
Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn
C) Thrombinrezeptor (42-55), vom Hamster
Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asn-Pro-Gly-Glu-Asn-Thr-Phe-Glu-Leu
D) Thrombinrezeptor (42-47), vom Hamster
Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asn
alle von Neosystem, Frankreich. Tabelle 3B

Beispiel 8

Um die Aktivität des Peptides unter Produktionsbedingungen zu untersuchen, wurde ein 1 l- "spinner" mit Trägerscheiben an eine CelliGen Bioreaktor-Steuereinheit angeschlossen. Er wurde mit Zellen des TBP-Clons 108-1-22-12/4 beimpft, und nach einer Wachstumsphase wurde die Produktion mit 2% FBS gestartet.
Zehn Tage später wurde das mit Serum angereicherte Produktionsmedium durch SFM ersetzt, das Maisglutenhydrolysat, Insulin und TRA enthielt. Die Produktion lief 40 Tage lang. Während eines Teils der Produktionszeit wurde TRA durch Thrombin ersetzt. Der Ersatz von Thrombin durch TRA wirkte sich auf den Produktionsspiegel nicht aus (Fig. 10).

Beispiel 9

Clonieren und Expression von Thrombin und Insulin in CHO-Zellen

Nach anfänglichem Clonieren der thrombin- und insulincodierenden cDNAs in konventioneller Weise, werden die DNA-Fragmente mit der Sequenz, die die reifen, an ein Signalpeptid gebundenen Proteine codiert, isoliert. Bei dem Signalpeptid kann es sich entweder um ihr eigenes oder aber um eines handeln, das ordnunsgemäß in CHO-Zellen sekretiert wird. Danach werden Expressionsvektoren konstruiert, die diese DNA-Fragmente, gebunden an einen Promoter für die Expression in CHO-Zellen, z. B. SV40 oder CMV enthalten.
Der Expressionsvektor wird nun in einen der für die rekombinante Produktion des gewünschten Proteins verwendeten CHO-Clone transfiziert. Hierzu wird ein zweiter Selektionstyp verwendet, z. B. Gentamycin (G418). Insulin und Thrombin werden ins serumfreie Medium sekretiert und unterstützen so die heterologe Proteinproduktion und -sekretion durch die CHO-Clone.

Literatur

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Claims

1. Serumfreies Medium für Säugerzellen, enthaltend ein Grundmedium und

(a) ein Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen;

(b) Insulin; und

(c) einen Thrombinrezeptoraktivator, der eine Region des Thrombinrezeptors umfasst, die zum N-Terminus wird, nachdem das Thrombin den Rezeptor durch Schneiden in der Nähe des nativen N-Terminus aktiviert, und der die Aminosäuresequenz

Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe,

Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn,

Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asn-Pro-Gly-Glu-Asn-Thr-Phe-Glu-Leu oder

Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asn

besitzt.

2. Medium nach Anspruch 1, wobei das Grundmedium DMEM, F12, RPMI 1640 oder Gemische davon umfasst.

3. Medium nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel zum Schutz der Lebensfähigkeit der Zellen ein Proteinhydroiysat ist.

4. Medium nach Anspruch 3, wobei das Proteinhydrolysat Lactalbuminhydrolysat oder Maisglutenhydrolysat umfasst.

5. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Insulin und/oder der Thrombinrezeptoraktivator mittels rekombinanter Verfahren hergestellt wird.

6. Medium nach Anspruch 5, wobei das Insulin und/oder der Thrombinrezeptoraktivator zusammen mit dem Säugerzellprodukt exprimiert wird.

7. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend zwischen 0,1 ug/ml und 2 ug/ml Insulin.

8. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend zwischen 1 ug/ml und 20 ug/ml Thrombinrezeptoraktivator.