DE60028989T3 - Medium für die protein- und serumfreie zellkultur - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein anspruchsgemäßes Verfahren für die proteinfreie und serumfreie Züchtung bzw. Kultivierung von Zellen.
  • Die Kultivierung von Zellen, insbesondere eukaryonte Zellen oder Säugerzellen benötigt ständig die Verwendung von speziellen Kulturmedien, welche den Zellen die Nährsubstanzen und Wachstumssubstanzen zur Verfügung stellen, die für effizientes Wachstum und für die Herstellung der gewünschten Proteine benötigt werden. Allgemein werden Serum oder Verbindungen, die von Serum abgeleitet sind (z. B. Rinderserum) als ein Bestandteil des Mediums in dieser Hinsicht verwendet.
  • Jedoch bestehen im Fall der Verwendung von Serum- oder Proteinzusatzstoffen, die von menschlichen oder tierischen Quellen abgeleitet sind, in Zellkulturen zahlreiche Probleme, insbesondere wenn das Ausgangsmaterial für die Herstellung eines medizinischen Mittels, das an Menschen verabreicht werden soll, über die Zellkulturbereitgestellt wird.
  • Im Fall von solchen Serumpräparationen variieren deshalb die Zusammensetzung und Qualität bereits von Charge zu Charge, nur aufgrund der Nichtübereinstimmung der Donor Organismen für solche Präparationen. Dies stellt ein beachtliches Problem dar, insbesondere für die Standardisierung der Zellherstellung und bei der Etablierung von Standard Wachstumsbedingungen für solche Zellen. Jedoch wird eine intensive und konstante Qualitätskontrolle des verwendeten Serummaterials in jedem Fall benötigt. Jedoch ist dies sehr zeitaufwändig und kostenintensiv, insbesondere im Fall von solchen komplexen Zusammensetzungen wie Serum.
  • Darüber hinaus enthalten solche komplexen Präparationen eine Vielzahl von Proteinen, die in einer zerstörerischen Weise wirken können, insbesondere innerhalb des Zusammenhangs des Reinigungsverfahrens für das rekombinante Protein, das aus der Zellkultur gewonnen werden soll. Dies betrifft insbesondere jene Proteine, die homolog oder ähnlich sind zu dem Protein, das gewonnen werden soll. Natürlicherweise sind diese Probleme insbesondere akut, weil das biogene Pendant in dem verwendeten Medium (z. B. Rinderprotein) zuverlässig innerhalb des Reinigungsvorgangs nur über sehr spezifische differenzielle Reinigung (z. B. mit Antikörpern, die spezifisch nur gegen das rekombinante Protein, aber nichtgegen das Rinderprotein gerichtet sind (Björck, L., J. Immunol., 1988, Vol. 140, S. 1194–1197; Nilson et al., J. Immunol. Meth., 1993, 164, S. 33–40)) entfernt werden kann.
  • Jedoch ist ein deutliches Problem in der Verwendung von Serum oder Verbindungen, die von Serum abgeleitet sind, im Kulturmedium, auch das Risiko der Kontamination durch Mycoplasmen, Viren oder BSE Mittel. In Verbindung mit Präparationen, die von menschlichem Blut abgeleitet sind, muss das Risiko der Kontamination durch Viren, wie Hepatitis oder HIV, insbesondere in diesem Zusammenhang betont werden. Im Fall von Serum- oder Serumbestandteilen, die von Rindermaterial abgeleitet sind, besteht insbesondere die Gefahr der BSE Kontamination. Zusätzlich dazu können darüber hinaus alle Serum abgeleiteten Materialien mit erkrankungsinduzierenden Mitteln, die bis jetzt unbekannt sind, kontaminiert sein.
  • Die Zugabe von Serumbestandteilen, um eine adäquate Adhäsion der Zellen an ihre Oberflächen zu garantieren und um die adäquate Herstellung der gewünschten Substanzen aus den Zellen zu garantieren, wurde, abgesehen von einigen wenigen Ausnahmen, zuvor als unentbehrlich exakt für die Kultivierung von Zellen auf festen Oberflächen erachtet. Somit war es mit dem Verfahren, das in der WO 91/09935 zum Beispiel beschrieben ist, möglich, ein Verfahren für serumfreie und proteinfreie Kultivierung von FSME Virus/Virus Antigen durch die serumfreie und proteinfreie Kultivierung von Oberflächen abhängigen permanenten Zellen, vorzugsweise Vero Zellen (siehe WO 96/15231 ) zu erreichen. Jedoch sind dies keine rekombinanten Zellen sondern vielmehr Wirtszellen, die für die Herstellung von Virus Antigen in einem lytischen Verfahren verwendet werden.
  • Im Gegensatz dazu sind die Zellen, die hauptsächlich für eine rekombinante Herstellung verwendet werden, zum Beispiel CHO-Zellen, nur in der Lage, zu einem begrenzten Ausmaß anzuheften. So binden CHO-Zellen, die durch herkömmliche Verfahren gezüchtet wurden, an sowohl glatte als auch poröse Mikroträger nur unter Serum enthaltenden Bedingungen (siehe US 4,973,616 ; Cytotechnology 9 (1992), 247–253). Wenn jedoch solche Zellen unter serumfreien Bedingungen gezüchtet werden, verlieren sie diese Eigenschaft und heften nicht an glatte Träger an, oder sie werden einfach davon ablösbar, wenn andere adhäsionsfördernde Zusätze, wie z. B. Fibronektin, Insulin oder Transferrin nicht im Medium bereitgestellt werden. Jedoch sind dies auch Proteine, die von Serum abgeleitet sind.
  • Alternativ dazu können die Zellen unter Verwendung der Suspensionskulturtechnik ebenso wie z. B. unter Verwendung des Chargen Verfahrens oder unter Verwendung einer kontinuierlichen Kulturtechnik gezüchtet werden. Die Kultivierung findet vorzugsweise unter Verwendung des Chemostat Verfahrens statt (Ozturk S. S. et al., 1996, Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., BIOT 164, Payne G. F. et al., in ”Large Scale Cell Culture Technology”, 1987, Hrsg. Lydersen B. K., Hauser Herausgeber; S. 206–212). Kattinger H. et al. (Advances Mol. Cell. Biology, 1996, 15A, 193–207) beschreiben die Langzeitkultivierung von Zellen in proteinfreiem Medium, aber diese Zellen müssen auf Trägern kultiviert werden und ermöglichen keine Alternativen wie kontinuierliche Kulturtechniken. Es wird gesagt, dass diese Zellen nur eine Langzeitstabilität zeigen, wenn sie an die Oberfläche von Trägern angeheftet sind, aufgrund von reduziertem Wachstum, und als einer Folge, einer reduzierten Nachfrage nach Wachstumsfaktoren.
  • Zusätzlich wurden bei mehreren Gelegenheiten im Stand der Technik Versuche unternommen, Zellen an proteinfreies Medium ausgehend von Serum enthaltenden Bedingungen anzupassen. Jedoch wurde im Fall von einer solchen Anpassung wiederholt gefunden, dass im Vergleich zu Serum enthaltenden Bedingungen die Ausbeute von exprimiertem Protein und die Produktivität der rekombinanten Zellen in proteinfreiem Medium nach der Anpassung merklich reduziert sind (Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 (1994), 691–658).
  • Es wurde auch gefunden, dass im Fall einer hohen Zelldichte, die Herstellung von rekombinanten Proteinen gelegentlich beachtlich begrenzt ist. Während der Versuche, die Zellen an proteinfreie oder serumfreie Medien anzupassen, wird auch wiederholt eine Instabilität mit reduziertem Wachstum der Zellen, die verwendet werden, gefunden, so dass Zellen mit reduzierter Expression hergestellt werden, oder sogar Zellen hergestellt werden, die nicht produzieren, wobei diese einen Wachstumsvorteil, relativ zu den produzierenden Zellen in proteinfreien und serumfreien Medien aufweisen, und dies führt zu der Tatsache, dass diese die produzierenden Zellen überwachsen und anschließend, am Ende, die gesamte Kultur jetzt sehr geringe Produktausbeuten bildet.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung weist deshalb ein Ziel auf, die Möglichkeiten für die proteinfreie und serumfreie Kultivierung von rekombinanten Zellen zu verbessern und Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen rekombinante Zellen effizient in einer serumfreien und proteinfreien Weise kultiviert werden können. Darüber hinaus sollte es dann nicht nur möglich sein, oberflächenabhängige Zellen zu kultivieren, sondern auch die Suspensionskultur Technik zu verwenden, wofür die Instabilität in der Produktivität der Zellen soweit als möglich unterdrückt werden muss.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es zusätzlich, die Herstellung von rekombinanten Zellen effizient zu steigern.
  • Schließlich muss in Übereinstimmung mit der Erfindung die Anpassung von rekombinanten Zellen an serumfreie und proteinfreie Medien verbessert und effizienter konfiguriert werden.
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung werden diese Ziele durch den Gegenstand des Anspruchs erreicht.
  • Überraschenderweise war es möglich zu zeigen, dass die Ziele, die oben definiert sind, durch das Kultivieren von Zellen in einem Medium erreicht werden können, gemäß Anspruch 1 das ultrafiltriertes Soja-Hydrolysat enthält, ohne die Nachteile von serumfreier Kultivierung, die im Stand der Technik beschrieben sind, tolerieren zu müssen. Wenn mit diesen Begriffen umgegangen wird, kann der Begriff Soja-Hydrolysat oder der Begriff Soja-Pepton verwendet werden, ohne dass sie unterschiedliche Bedeutungen aufweisen.
  • Das hierin beschriebene Medium enthält vorzugsweise ultrafiltriertes Soja-Hydrolysat in einer Menge von mehr als 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Mediums. In der Regel wird das Soja-Hydrolysat in dem Medium in einer Menge von 4–40% bereitgestellt.
  • Die Wahl des spezifischen ultrafiltrierten Soja-Hydrolysats ist erfindungsgemäß nicht kritisch. Eine Vielzahl von Soja Präparationen, die im Markt gefunden werden, können erfindungsgemäß verwendet werden, z. B. Peptone aus Sojamehl, enzymatisch gespalten (z. B. durch Papain), mit einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 und einem Gesamtstickstoffgehalt zwischen 9% und 9,7% und einem Aschegehalt zwischen 8 und 15%. Dies sind Peptone aus Sojabohnen in der Form, in der sie für gewöhnlich für Zellkultur durch den Fachmann verwendet werden.
  • In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Form wird eine gereinigte Präparation eines ultrafiltrierten Soja-Hydrolysats oder eine Rohfraktion davon in dem erfindungsgemäßen Medium verwendet. Verunreinigungen, die mit der effizienten Kultivierung wechselwirken könnten, werden vorzugsweisewährend dieser Reinigung entfernt, oder die Präzision des Hydrolysats wird verbessert, z. B. bezüglich des Molekulargewichts.
  • Erfindungsgemäß hat sich die Bereitstellung eines Ultrafiltrationsschrittes als besonders wertvoll in der Praxis während dieser Reinigung erwiesen; deshalb ist die Verwendung von ultrafiltriertem Soja-Hydrolysat erforderlich.
  • Die Ultrafiltration kann gemäß dem Verfahren, das umfassend im Stand der Technik beschrieben ist, verwendet werden, zum Beispiel unter Verwendung von Membranfiltern mit einer definierten Ausschlussgrenze.
  • Die Reinigung des ultrafiltrierten Soja-Peptons kann durch Gelchromatographie, z. B. durch Sephadex Chromatographie, zum Beispiel mit Sephadex G25 oder Sephadex G10 oder äquivalenten Materialien, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie oder ”reverse Phase” Chromatographie stattfinden. Dies sind Verfahren aus dem Stand der Technik, mit denen der Fachmann vertraut ist. Unter Verwendung dieses Verfahrens können jene Fraktionen ausgewählt werden, die Soja-Hydrolysat von definiertem Molekulargewicht, d. h. ≤ 1000 Dalton, vorzugsweise ≤ 500 Dalton, weiter bevorzugt ≤ 350 Dalton enthalten.
  • Deshalb umfasst die Beschreibung auch ein Verfahren zur Herstellung eines serumfreien und proteinfreien Zellkulturmediums, umfassend das Erhalten eines Soja-Hydrolysats, das Ultrafiltrieren des Soja-Hydrolysats unter Verwendung eines Ultrafiltrationsverfahrens, das Reinigen der Soja-Hydrolysat-Fraktion unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie, und das Auswählen der Soja-Hydrolysat-Fraktionen, welche aus Soja-Hydrolysat mit einem Molekulargewicht ≤ 1000 Dalton, vorzugsweise ≤ 500 Dalton, weiter bevorzugt ≤ 350 Dalton bestehen.
  • Ein besonders vorteilhaftes Soja-Hydrolysat ist durch das Merkmal gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an freien Aminosäuren von zwischen 10,3 und 15,6% oder vorzugsweise zwischen 12 und 13,5%, einen Gesamtstickstoffgehalt von zwischen 7,6 und 11,4% oder vorzugsweise zwischen 8,7 und 9,5% und einen Endotoxingehalt von < 500 U/g aufweist, und wobei mindestens 40% oder vorzugsweise mindestens 50% oder insbesondere vorzugsweise mindestens 55% davon ein Molekulargewicht von 200–500 Dalton und mindestens 10% oder vorzugsweise 15% davon ein Molekulargewicht von 500–1000 Dalton aufweisen. Am meisten bevorzugt weisen mindestens 90% des Soja-Hydrolysats ein Molekulargewicht von ≤ 500 Dalton auf.
  • Ein solches Soja-Hydrolysat ist insbesondere gut geeignet für die industrielle Herstellung von rekombinanten Proteinen, weil es aufgrund dieser speziellen Merkmale besonders leicht standardisiert werden kann und es in Routineverfahren einsetzbar ist.
  • Zusätzlich zu dem Soja-Hydrolysat kann das erfindungsgemäß verwendete Medium auch synthetische Medien aufweisen, in einer Weise, die an sich bekannt ist, wie z. B. DMEM/HAM's F12, Medium 199 oder RPMI, die ausreichend aus der Literatur bekannt sind.
  • Darüber hinaus enthält das erfindungsgemäß verwendete Medium vorzugsweise auch Aminosäuren, vorzugsweise jene, die aus der Gruppe bestehend aus L-Asparagin, L-Cystein, L-Cystin, L-Prolin, L-Tryptophan, L-Glutamin oder Gemischen davon ausgewählt ist.
  • Die folgenden Aminosäuren werden auch vorzugsweise zu dem erfindungsgemäß verwendeten Medium hinzugefügt.
  • L-Asparagin (in einer Menge von 0,001–1 g/l des Mediums, vorzugsweise 0,1–0,05 g/l, insbesondere vorzugsweise 0,015–0,03 g/l); L-Cystein (0,001–1 g/l, vorzugsweise 0,005–0,05 g/l, insbesondere vorzugsweise 0,01–0,03 g/l); L-Cystin (0,001–1 g/l, vorzugsweise 0,01–0,05 g/l, insbesondere vorzugsweise 0,015–0,03 g/L); L-Prolin (0,001–1,5 g/l, vorzugsweise 0,01–0,07 g/l, insbesondere vorzugsweise 0,02–0,05 g/l); L-Tryptophan (0,001–1 g/l, vorzugsweise 0,01–0,05 g/l, insbesondere vorzugsweise 0,015–0,03 g/l); und L-Glutamin (0,05–1 g/l, vorzugsweise 0,01–1 g/l).
  • Die oben beschriebenen Aminosäuren können zu dem erfindungsgemäß verwendeten Medium entweder einzeln oder in Kombination zugegeben werden. Die kombinierte Zugabe eines Aminosäure Gemisches, das alle der oben genannten Aminosäuren enthält, ist insbesondere bevorzugt.
  • Ein serumfreies und proteinfreies Medium wird in einer besonderen Form einer Ausführungsform verwendet, wobei dieses Medium zusätzlich eine Kombination des oben genannten Aminosäure Gemisches und des gereinigten ultrafiltrierten Soja-Peptons enthält.
  • Überraschenderweise wurde zum Beispiel gefunden, dass, um Viren oder andere Pathogene zu inaktivieren, das Medium ohne negative Wirkungen für ungefähr 5–20 min oder vorzugsweise 15 min bei 70–95°C oder vorzugsweise 85–95°C erhitzt werden kann.
  • Erfindungsgemäß kann jedes bekannte synthetische Medium in Kombination mit dem ungefilterten Soja-Hydrolysat verwendet werden. Herkömmliche synthetische Medien können anorganische Salze, Aminosäuren, Vitamine, eine Kohlenhydratquelle und Wasser enthalten. Zum Beispiel kann DMEM/HAM's F12 Medium verwendet werden. Die Konzentration von ungefiltertem Soja-Extrakt in dem Medium kann vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 g/l, insbesondere vorzugsweise 1 und 5 g/l liegen. In Übereinstimmung mit einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann ungefiltertes Soja-Pepton verwendet werden, das bezüglich seines Molekulargewichts standardisiert wurde. Das Molekulargewicht des ungefilterten Soja-Peptons ist vorzugsweise geringer als 50 kD, insbesondere vorzugsweisegeringer als 10 kD, am meisten bevorzugt geringer als 1 kD.
  • Die Zugabe von ultrafiltriertem Soja-Pepton hat sich als besonders vorteilhaft für die Produktivität von rekombinanten Zelllinien erwiesen, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht des Soja-Peptons 350 Dalton (QuestCompany) beträgt. Dies ist ein Soja-Isolat mit einem Gesamtstickstoffgehalt von ungefähr 9,5% und einem Gehalt an freien Aminosäuren von ungefähr 13%.
  • Die Verwendung von gereinigtem, ultrafiltriertem Soja-Pepton mit einem Molekulargewicht von ≤ 500 Dalton, insbesondere vorzugsweise ≤ 350 Dalton ist besonders bevorzugt.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Medium enthält vorzugsweise auch Hilfssubstanzen, wie z. B. Puffersubstanzen, Oxidationsstabilisatoren, Stabilisatoren, um mechanischer Spannung entgegen zu wirken oder Proteasehemmer.
  • Es wird insbesondere ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung verwendet: synthetisches Minimalmedium (1–25 g/l), Soja-Pepton (0,5–50 g/l), L-Glutamin (0,05–1 g/l), NaHCO3 (0,1–10 g/l), Ascorbinsäure (0,0005–0,05 g/l), Ethanolamin (0,0005–0,05 g/l) und Na Selenit (1–15 μg/l).
  • Falls es benötigt wird, kann ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. Polypropylenglykol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 oder PLURONIC F-108) erfindungsgemäß zu dem Medium als ein entschäumendes Mittel zugegeben werden.
  • Dieses Mittel wird im Allgemeinen verwendet, um die Zellen vor den negativen Effekten der Belüftung zu schützen, weil ohne die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels die aufsteigenden und zerplatzenden Luftblasen zu einer Schädigung jener Zellen führen können, die an der Oberfläche dieser Luftblasen (”sparging”) angeordnet sind (Murhammer und Goochee, 1990, Biotechnol. Prog. 6: 142–148).
  • Die Menge des nicht ionischen oberflächenaktiven Mittels kann hier zwischen 0,05 und 10 g/l liegen, obwohl insbesondere bevorzugt die kleinste mögliche Menge zwischen 0,1 und 5 g/l liegt.
  • Zusätzlich kann das erfindungsgemäß verwendete Medium auch Cyclodextrin oder ein Derivat davon enthalten.
  • Das serumfreie und proteinfreie Medium enthält vorzugsweise einen Proteasehemmer, wie z. B. Serinproteasehemmer, die für Gewebekultur geeignet und synthetischen oder pflanzlichen Ursprungs sind.
  • Zellen, die bereits angepasst wurden, werden bevorzugt als die Zellen für die Kultivierung in dem erfindungsgemäß verwendeten Medium verwendet, d. h. Zellen, die bereits angepasst wurden, in proteinfreien und serumfreien Medien zu wachsen. Es wurde gefunden, dass nicht nur erhöhte Ausbeuten mit solchen vorangepassten Zellen erhalten werden können, sondern ihre Stabilität für die serumfreie und proteinfreie Kultivierung ist auch eindeutig durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums verbessert.
  • Jedoch wurde auch von rekombinanten Zellklonen gezeigt, dass sie erfindungsgemäß besonders wertvoll sind, wobei diese von dem Beginn für mindestens 40 Generationen und vorzugsweise mindestens 50 Generationen in serumfreien und proteinfreien Medium stabil sind und rekombinante Produkte exprimieren.
  • Solche Zellklone sind aus einer Zellkultur erhältlich, die nach der Kultivierung eines rekombinanten Originalzellklons auf einem Serum enthaltenden Medium und der erneuten Anpassung der Zellen an serumfreies und proteinfreies Medium erhalten wird.
  • Der Begriff ”Originalzellklon” kann dahingehend verstanden werden, dass er eine rekombinante Zellklontransfektante bedeutet, die nach der Transfektion der Wirtszellen mit einer rekombinanten Nukleotidsequenz ein rekombinantes Produkt in einer stabilen Weise unter Laborbedingungen exprimiert. Der Originalklon wird in einem Serum enthaltenden Medium gezüchtet, um sein Wachstum zu optimieren. Um seine Produktivität zu steigern, wird der Originalklon gegebenenfalls in der Anwesenheit eines Selektionsmittels mit Selektion auf den Selektionsmarker und/oder Amplifikationsmarker gezüchtet. Für die industrielle Herstellung im großen Maßstab wird der Originalzellklon unter Serum enthaltenden Kulturbedingungen zu einer hohen Zelldichte gezüchtet und wird anschließend an das serumfreie oder proteinfreie Medium unmittelbar vor der Herstellungsphase erneut angepasst. Die Kultivierung findet in diesem Fall vorzugsweise ohne Selektionsdruck statt.
  • Die Kultivierung des rekombinanten Originalzellklons kann von Anfang an in einem serumfreien und proteinfreien Medium stattfinden; als ein Ergebnis ist eine erneute Anpassung nicht länger notwendig. Falls notwendig kann auch ein Selektionsmittel in diesem Fall verwendet werden, und die Selektion kann auf den Selektionsmarker und/oder den Amplifikationsmarker stattfinden. Ein Verfahren hierfür ist in der EP 0 711 835 beispielhaft beschrieben.
  • Die Zellkultur, die nach der erneuten Anpassung an ein serumfreies und proteinfreies Medium erhalten wird, wird hinsichtlich jener Zellklone der Zellpopulation getestet, die Produkte in einer stabilen Weise unter serumfreien und proteinfreien Bedingungen herstellen, gegebenenfalls in der Abwesenheit von Selektionsdruck. Dies kann zum Beispiel mittels Immunfluoreszenz mit markierten spezifischen Antikörpern stattfinden, die gegen das rekombinante Polypeptid oder Protein gerichtet sind. Die Zellen, die als Produktbildner identifiziert werden, werden aus der Zellkulturisoliert und unter serumfreien und proteinfreien Bedingungen, die vorzugsweise äquivalent zu den Herstellungsbedingungen sind, erneut gezüchtet. Die Isolierung der Zellenkann dabei durch das Isolieren der Zellen und ihr Testen hinsichtlich Produktbildner stattfinden.
  • Die Zellkultur, welche die stabilen Zellen enthält, kann erneut hinsichtlich rekombinanter Klone getestet werden, und diese werden aus der Zellkulturisoliert und subkloniert. Die stabilen rekombinanten Zellklone, die unter serumfreien und proteinfreien Bedingungen erhalten werden, können anschließend weiterunter serumfreien und proteinfreien Bedingungen gezüchtet werden.
  • Die rekombinanten Zellklone oder die Zellpopulationen, die auf diese Weise in dem erfindungsgemäß verwendeten Medium hergestellt wurden, zeichnen sich insbesondere durch das Merkmal aus, dass sie für mindestens 40 Generationen, vorzugsweise für mindestens 50 Generationen und insbesondere für mehr als 60 Generationen stabil sind und ein rekombinantes Produkt exprimieren.
  • Ein Beispiel eines solchen rekombinanten stabilen Zellklons oder Zellpopulation wurde in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag unter der Nummer 98012206 bei der ECACC (UK) eingereicht.
  • Die Zellkultur, die erfindungsgemäß kultiviert werden soll, ist vorzugsweise von einer rekombinanten Säugerzelle abgeleitet. Rekombinante Säugerzellen können hier all jene Zellen sein, die Sequenzen enthalten, die ein rekombinantes Polypeptid oder Protein kodieren. Alle kontinuierlich wachsenden Zellen, die entweder adhärent oder nicht adhärent wachsen, sind in dieser Hinsicht umfasst. Rekombinante CHO-Zellen oder BHK-Zellen sind besonders bevorzugt. Rekombinante Polypeptide oder Proteine können Blutfaktoren, Wachstumsfaktoren oder andere biomedizinische relevante Produkte sein.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Zellklone verwendet, welche die kodierende Sequenz für einen rekombinanten Faktor VIII enthalten, und die in der Lage sind, diese in einer stabilen Weise über mehrere Generationen zu exprimieren. Rekombinante CHO-Zellen, die Faktor VIII, vWF und Faktor VIII exprimieren, sind in dieser Hinsicht besonders bevorzugt.
  • 30 Generationen werden benötigt, um eine Masterzellbank zu beginnen. Mindestens ungefähr 40 Generationen werden benötigt, um eine durchschnittliche Chargen Kultur in einem 1000 l Maßstab durchzuführen. Beginnend mit einem einzelnen Zellklon ist es mit dem erfindungsgemäß verwendeten Medium möglich, eine ”Masterzellbank” (engl.: master cell bank (MCB)) und eine ”Arbeitszellbank” (engl.: working cell bank (WCB)) mit ungefähr 8–10 Generationen herzustellen und somit eine Zellkultur mit bis zu 20–25 Generationen unter proteinfreien und serumfreien Bedingungen im Produktionsmaßstab (Produktionsbiomasse), wohingegen im Gegenzug einige Generationen nach dem Wachstum auf serumfreiem oder proteinfreiem Medium mit zuvorigen Zellklonen und Medien instabil werden, und als ein Ergebnis a) eine gleichförmige Zellkultur mit Produktbildnern nicht möglich ist und b) stabile Produktproduktivität über einen verlängerten Zeitraum nicht möglich ist.
  • Jedoch ist es erfindungsgemäß im Gegensatz dazu sogar möglich, erhöhte Produktproduktivität selbst im Vergleich zu dem Originalzellklon zu finden, der in Serum enthaltendem Medium kultiviert wurde.
  • Die Erfindung wird in größerem Detail durch die folgenden Beispiele unten ebenso wie die Figuren in den Zeichnungen erläutert, aber sie ist nicht darauf beschränkt.
  • 1 zeigt die Ergebnisse der Kultivierung eines rFVIII-CHO Zellklons in einem 10 l Perfusionsbioreaktor:
    • a) Faktor VIII Aktivität (Millieinheiten/ml) und die Perfusionsrate (1–5/Tag) über einen Zeitraum von 42 Tagen;
    • b) volumetrische Produktivität (Einheiten von Faktor VIII/I/Tag) in dem Perfusionsbioreaktor;
  • 2 zeigt einen Vergleich der Faktor VIII Produktivität (mU/ml) im Fall der Kultivierung, unter Verwendung des Chargen Verfahrens, von CHO-Zellen, die den rFaktor VIII exprimieren, in verschiedenen Medien. Mix 1 besteht aus serumfreiem und proteinfreiem Medium ohne Soja-Hydrolysat, aber enthält ein Aminosäuregemisch, wie in Tabelle 4 angegeben ist; Mix 2 besteht aus serumfreiem und proteinfreiem Medium mit Soja-Hydrolysat; Mix 3 besteht aus serumfreiem und proteinfreiem Medium mit Soja-Hydrolysat und einem Aminosäuregemisch, wie in Tabelle 4 angegeben ist, und Mix 4 besteht aus serumfreiem und proteinfreiem Medium mit 2,5 g/l gereinigtem, ultrafiltriertem Soja-Hydrolysat und einem Aminosäuregemisch, wie in Tabelle 4 angegeben ist. Für die Reinigung des ultrafiltrierten Soja-Hydrolysats wurde eine Sephadex® Säule verwendet.
  • 3 zeigt die Faktor VIII Produktivität (U/l) im Fall des kontinuierlichen Wachstums von CHO-Zellen, die den rFaktor VIII exprimieren, in einem serumfreien und proteinfreien Medium nach dem Beginn der Zugabe von gereinigtem ultrafiltriertem Soja-Pepton, nämlich am 6. Tag der Kultivierung; und
  • 4 zeigt BHK-Zellen, die rekombinanten Faktor II exprimieren, die in einem proteinfreien und serumfreien Medium, das Soja-Hydrolysat enthält, gezüchtet werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1:
  • Stabilität von rvWF-CHO-Zellen nach dem Wechsel von einem Serum enthaltenden Medium auf ein serumfreies und proteinfreies Medium.
  • CHO-dhfr-Zellen wurden mit den Plasmiden phAct-rvWF und pSV-dhfr kotransfiziert, und vWF exprimierende Klone wurden, wie bei Fischer et al. beschrieben, subkloniert (1994, FEBS Letters 351: 345–348). Eine Arbeitszellbank (WCB) wurde aus den Subklonen begonnen, die rvWF in einer stabilen Weise exprimierten, unter Serum enthaltenden Bedingungen, aber in der Abwesenheit von MTX, und die Zellen wurden auf einemporösen Mikroträger (Cytopore®) unter Serum enthaltenden Bedingungen immobilisiert. Der Wechsel der Zellen auf ein serumfreies und proteinfreies Medium fand statt, nachdem eine Zelldichte von 2 × 107 Zellen/ml der Matrix erreicht wurde. Die Zellen wurden weiterhin für einige Generationen unter serumfreien und proteinfreien Bedingungen kultiviert. Die Zellen wurden in einem serumfreien und proteinfreien Medium zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Immunfluoreszenz mit markierten Anti-vWF Antikörpern getestet. Die Bewertung der Stabilität der Zellen fand unter Verwendung der Arbeitszellbank vor dem Wechsel des Mediums, nach 10 Generationen und nach 60 Generationen in dem serumfreien und proteinfreien Medium statt. Während die Arbeitszellbank immer noch 100% rvWF Bildner zeigte, fiel die Herstellung von rvWF Bildnern auf ungefähr 50% nach 10 Generationen in dem serumfreien und proteinfreien Medium. Nach 60 Generationen wurden mehr als 95% der Zeilen als Nichtbildner identifiziert.
  • Beispiel 2:
  • Klonierung von stabilen rekombinanten CHO-Klonen
  • Eine Verdünnungsreihe wurde aus der Zellkultur enthaltend rvWF-CHO-Zellen in Übereinstimmung mit Beispiel 1 hergestellt (dieser stabile Zellklon, der als r-vWF-CHO F7 bezeichnet wurde, wurde in Übereinstimmung mit dem Budapester Übereinkommen bei der ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK am 22. Januar 1998 eingereicht und erhielt die Hinterlegungsnummer 98012206), die für 60 Generationen in einem serumfreien und proteinfreien Mediumkultiviert wurden, und 0,1 Zellen wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden für ungefähr 3 Wochen in DMEM/HAM's F12 ohne Serumzusätze oder Proteinzusätze und ohne Selektionsdruck kultiviert, und die Zellen wurden mit Immunfluoreszenz mit markierten Anti-vWF Antikörpern getestet. Ein Zellklon, der als positiv identifiziert wurde, wurde als der Ausgangsklon für die Herstellung einer Anzuchtzellbank verwendet. Ein Masterzellbank (MCB) wurde aus der Anzuchtzellbank in einem serumfreien und proteinfreien Medium gestartet, und einzelne Ampullen wurden zur Seite gelegt und für die weitere Herstellung einer Arbeitszellbank eingefroren. Eine Arbeitszellbank wurde in einem serumfreien und proteinfreien Medium aus einer einzigen Ampulle hergestellt. Die Zellen wurden auf porösen Mikroträgern immobilisiert und für einige Generationenunter serumfreien und proteinfreien Bedingungen weiter kultiviert. Die Zellen wurden hinsichtlich Produktivität zu verschiedenen Zeitpunkten in einem serumfreien und proteinfreien Medium mittels Immunfluoreszenz mit markierten Anti-vWF Antikörpern getestet. Die Bewertung der Stabilität der Zellen fand auf der Ebene der Arbeitszellbank und nach 10 und 60 Generationen in einem serumfreien und proteinfreien Medium statt. Ungefähr 100% der Zellen wurden als positive stabile Klone identifiziert, die rvWF, auf der Ebene der Arbeitszellbank, nach 10 Generationen und nach 60 Generationen exprimieren.
  • Beispiel 3:
  • Zellspezifische Produktivität der rekombinanten Zellklone
  • Eine definierte Anzahl von Zellen wurde an definierten Stufen während der Kultivierung der rekombinanten Zellen entnommen, und diese wurden für 24 h mit frischem Medium inkubiert. Die rvWF: Risto-CoF-Aktivität wurde in den Überstandflüssigkeiten der Zellkulturen bestimmt. Tabelle 1 zeigt, dass im Fall der erfindungsgemäßen stabilen rekombinanten Zellklone die zellspezifische Produktivität selbst nach 60 Generationen in einem serumfreien und proteinfreien Medium stabil war, und sie sogar im Vergleich zu dem Originalklon, der in einem Serum enthaltenden Medium kultiviert wurde, gesteigert war. Tabelle 1
    Zellklon Zellspezifische Produktivität der Arbeitszellen in mU rvWF/106 Zellen/Tag Zellspezifische Produktivität nach 10 Generationen in mU rvWF/106 Zellen/Tag Zellspezifische Produktivität nach 60 Generationen in mU rvWF/106 Zellen/Tag
    rvWF-CHO #808.68 Originalzellklon 55 30 < 10
    r-vWF-CHO F7*) stabiler Klon 62 65 60
    *) eingereicht am 22. Januar 1998 (ECACC (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK); Hinterlegungsnummer 98102206)
    Beispiel 4: Zusammensetzung eines synthetischen serumfreien und proteinfreien Mediums: Tabelle 2
    Komponente g/l Bevorzugte Menge (in Übereinstimmung mit unserem Wissen zur Zeit der Patentanmeldung) in g/l
    Synthetisches Minimalmedium (DMEM/HAM's F12) 1–100 11,00–12,00
    Soja-Pepton 0,5–50 2,5
    L-Glutamin 0,05–1 0,36
    Ascorbinsäure 0,0005–0,05 0,0035
    NaHCO3 0,1–10 2,00
    Ethanolamin 0,0005–0,05 0,0015
    Na-Selenit 1–15 μg/l 8,6 μg/l
    Optional: Synperonic F68 0,01–10 0,25
  • Beispiel 5:
  • Kultivierung von rFVIII-CHO-Zellen in einem proteinfreien und serumfreien Minimalmedium
  • Eine Zellkultur mit rFVIII-CHO-Zellen wurde in einem 10 l gerührten Tank mit Perfusion kultiviert. Ein Medium in Übereinstimmung mit Beispiel 4 wurde in diesem Fall verwendet. Die Zellen wurden dadurch auf einem porösen Mikroträger (Cytopore®, Pharmacia) immobilisiert und anschließend für mindestens 6 Wochen kultiviert. Die Perfusionsrate war 4 Volumenänderungen pro Tag; der pH betrug 6,9–7,2; die O2 Konzentration betrug ungefähr 20–50%, und die Temperatur betrug 37°C.
  • Die 1 zeigt die Ergebnisse der Kultivierung eines rFVIII-CHO-Zellklons in einem 10 l Perfusionsbioreaktor.
    • a) Faktor VIII Aktivität (Millieinheiten/ml) und Perfusionsrate (1–5/Tag) über einen Zeitraum von 42 Tagen.
    • b) volumetrische Produktivität (Einheiten von Faktor VIII/I/Tag) in dem Perfusionsbioreaktor.
    Tabelle 3
    Tage der Kultivierung Zellspezifische Produktivität (mU/106 Zellen/Tag) Immunfluoreszenz (% FVIII positive Zellen)
    15 702 n. a.
    21 1125 n. a.
    28 951 > 95%
    35 691 > 95%
    42 970 n. a.
  • Die Tabelle 3 zeigt die Stabilität und spezifische Produktivität der rFVIII exprimierenden Zellen. Um diese Ergebnisse zu erhalten, wurden Proben nach 15, 21, 28, 35 und 42 Tagen entnommen und anschließend bei 300 g zentrifugiert und in frischem serumfreien und proteinfreien Medium resuspendiert. Die Faktor VIII Konzentration in den Überstandflüssigkeiten der Zellkulturen und die Zellzahl wurde nach weiteren 24 h bestimmt. Die spezifische FVIII Produktivität wurde aus diesen Daten berechnet.
  • Eine stabile durchschnittliche Produktivität von 888 Millieinheiten/106 Zellen/Tag wurde erreicht. Diese stabile Produktivität wurde auch durch Immunfluoreszenz mit markierten Anti-FVIII Antikörpern nach 15, 21, 28, 35 und 42 Tagen in einem serumfreien und proteinfreien Medium bestätigt.
  • Beispiel 6:
  • Vergleich der Produktivität von rekombinanten FVIII-CHO-Zellen in einem proteinfreien und serumfreien Medium mit weiteren Mediumbestandteilen.
  • Eine Zellkultur mit rFVIII-CHO-Zellen wurde chargenweise kultiviert. In diesem Fall wurde ein Medium in Übereinstimmung mit Beispiel verwendet, zu dem die folgenden Aminosäuren zugegeben wurden: Tabelle 4
    Aminosäure mg/l Bevorzugte Menge (in Übereinstimmung mit unserem Wissen zum Zeitpunkt der Patentanmeldung) in mg/l
    L-Asparagin 1–100 20
    L-Cysteineo·HCl·H2O 1–100 15
    L-Cystin 1–100 20
    L-Prolin 1–150 35
    L-Glutamin 50–1000 240
  • Die Zellen wurden bei 37°C und pH 6,9–7,2 gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Chargen Verfahrens über Zeiträume von 24–72 h gezüchtet.
  • Die Produktivität der rekombinanten FVIII-CHO-Zellen wurde in den folgenden Mediumzusammensetzungen gemessen:
    • Mix 1: enthaltend ein serumfreies und proteinfreies Medium ohne Soja-Pepton und mit zusätzlich einem Aminosäuregemisch in Übereinstimmung mit der oben angegebenen Tabelle.
    • Mix 2: enthaltend ein serumfreies und proteinfreies Medium mit Soja-Pepton.
    • Mix 3: enthaltend ein serumfreies und proteinfreies Medium mit Soja-Pepton und mit zusätzlich einem Aminosäuregemisch in Übereinstimmung mit der oben angegebenen Tabelle.
    • Mix 4: enthaltend ein serumfreies und proteinfreies Medium und mit zusätzlich einem Aminosäuregemisch in Übereinstimmung mit der oben angegebenen Tabelle und 2,5 g/l gereinigtem, ultrafiltriertem Soja-Pepton. Die Reinigung des ultrafiltrierten Soja-Peptons fand chromatographisch über eine Sephadex® Säule statt.
  • Beispiel 7:
  • Kultivierung von rekombinanten FVIII-CHO-Zellen in einem proteinfreien und serumfreien Medium unter Verwendung des Chemostat Kulturverfahrens
  • Eine Zellkultur mit rFVIII-CHO-Zellen wurde in einem 10 l gerührten Bioreaktortank kultiviert. In diesem Fall wurde ein Medium in Übereinstimmung mit Beispiel 4, ohne Soja-Pepton mit einem Aminosäuregemisch in Übereinstimmung mit Beispiel 6 verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C und pH 6,9–7,2 gezüchtet; die Sauerstoffkonzentration betrug 20–50% Luftsättigung. Die Proben wurden alle 24 Stunden entnommen, um den Faktor VIII Titer und die Zellkonzentration in der Flüssigkeit des Überstands der Kultur zu bestimmen. Die Gesamtzellkonzentration war konstant vom 2. bis zum 14. Tag. Ultrafiltriertes Soja-Pepton wurde zu dem Medium beginnend von Tag 6 zugegeben. Die Faktor VIII Produktivität ist wie in 3 dargestellt; die Messungen fanden mittels eines CHROMOGENIX CoA FVIII:C/4 Systems statt. Die Immunfluoreszenz wurde mit markierten Anti-FVIII Antikörpern durchgeführt. Aus den Daten kann gesehen werden, dass ein deutlicher Anstieg in der Faktor VIII Produktivität und damit ein Anstieg in der volumetrischen Produktivität des Bioreaktorsystems als ein Ergebnis der Zugabe von Soja-Pepton auftrat, wohingegen dies nicht zu einem deutlichen Anstieg im Zellwachstum führte. Die Abwesenheit von Soja-Pepton in der kontinuierlichen Kultur führt zu einem deutlichen Abfall in der Faktor VIII Produktivität nach einigen Tagen, wohingegen die Zugabe von Soja-Pepton als eine Folge zu einem nahezu 10-fachen Anstieg in der Produktivität führt. Weil diese Zugabe jedoch nicht die Zellzahl erhöht, ist hierdurch klar gezeigt, dass ultrafiltriertes Soja-Pepton als eine Folge zu einem deutlichen Anstieg in der Produktivität führt, die unabhängig vom Zellwachstum ist.
  • Beispiel 8:
  • Vergleich der Wachstumsrate und der Produktivität von rekombinanten FVIII-CHO-Zellen in einem proteinfreien und serumfreien Medium mit verschiedenen Hydrolysaten
  • Eine rFVIII-CHO-Zellkultur wurde chargenweise kultiviert. In diesem Fall wurde ein serumfreies und proteinfreies Medium, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet, zu dem verschiedene Hydrolysate (aus Soja, Hefe, Reis und Weizen) zugegeben wurden. Ein serumfreies und proteinfreies Medium, zu dem kein Hydrolysat zugegeben wurde, wurde als die Kontrolle verwendet.
  • Die anfängliche Zelldichte betrug jeweils 0,6 × 105 und 0,4 × 106. Die Zellen wurden bei 37°C unter Verwendung des Chargen Verfahrens bei pH 6,9–7,2 kultiviert.
  • Tabelle 5: zeigt die Ergebnisse der Kultivierungsexperimente mit rFVIII-CHO-Zellen in einem serumfreien und proteinfreien Medium, zu dem Soja-Hydrolysat (ultrafiltriert) und Hefe-Hydrolysat zugegeben wurden. Die anfängliche Zelldichte betrug 0,6 × 105 Zellen. Ein serumfreies und proteinfreies Medium ohne Hydrolysatzugaben wurden als die Kontrolle verwendet. Tabelle 5
    Hydrolysat Endzelldichte (×106/ml) FVIII Titer (mU/ml) FVIII Gerinnungsaktivität (mU/ml)
    Soja 3,6 485 508
    Hefe 3,3 226 230
  • Tabelle 6: zeigt die Ergebnisse der Kultivierungsexperimente mit rFVIII-CHO-Zellen in einem serumfreien und proteinfreien Medium, zu dem Soja-Hydrolysat (ultrafiltriert), Reis-Hydrolysat und Weizen-Hydrolysat zugegeben wurden. Die anfängliche Zelldichtebetrug 0,6 × 105 Zellen. Ein serumfreies und proteinfreies Medium ohne Hydrolysatzusätze wurde als die Kontrolle verwendet. Tabelle 6
    Hydrolysat Endzelldichte (×106/ml) FVIII Titer (mU/ml) vWF-Antigen (μg/ml)
    Soja 3,7 1142 6,7
    Reis 3,0 479 3,2
    Weizen 3,4 522 3,9
    Kontrolle 3,0 406 3,1
  • Tabelle 7: zeigt die Ergebnisse der Kultivierungsexperimente mit rFVIII-CHO-Zellen in einem serumfreien und proteinfreien Medium, zu dem Soja-Hydrolysat (ultrafiltriert) und Weizen-Hydrolysat zugegeben wurden. Die anfängliche Zelldichte betrug 0,4 × 106 Zellen. Tabelle 7
    Hydrolysat Endzelldichte (×106/ml) FVIII Titer (mU/ml) FVIII-Antigen (μg/ml) vWF-Antigen (μg/ml)
    Soja 1,6 1427 166 17,2
    Weizen 1,0 1120 92 7,9
  • Beispiel 9 (Referenzbeispiel):
  • Kultivierung von BHK-Zellen in einem proteinfreien und serumfreien Medium mit Soja-Hydrolysat
  • BHK-21 (ATCC CCL 10) Zellen wurden dreimal mit den folgenden Plasmiden mittels CaPO4 Verfahren kotransfiziert: 25 μg des Plasmids pSV-FII (Fischer, B. et al., J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, S. 23737–23742), das die humane Faktor II(Prothrombin)-cDNA unter der Kontrolle eines SV40 Promotors (SV40 früher Genpromotor) enthält; 4 μg des Plasmids pSV-DHFR für Methotrexat Resistenz und 1 μg des Plasmids pUCSV-neo (Schlokat, U. et al., Biotech. Appl. Biochem., 1996, Vol. 24, S. 257–267), das G418/Neomycin Resistenzvermittelt. Stabile Zellklone wurden durch die Kultivierung in einem Medium, das 500 μg/ml G418 enthält, durch schrittweises Anheben der Methotrexat Konzentration bis zu einer Konzentration von 3 μM selektiert.
  • Die Klone, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden subkloniert und an ein proteinfreies und serumfreies Medium angepasst. Die Kultivierung fand unter Verwendung der Suspensionskulturtechnik statt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt; die BHK-Zellen, die in dem proteinfreien und serumfreien Medium mit Soja-Hydrolysat gezüchtet wurden, zeigten eine hohe und stabile Herstellungsrate von rekombinantem Faktor II.

Claims (1)

  1. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Faktor VIII aus Zellkultur, welches umfasst: Einbringen von Säugerzellen, die Sequenzen enthalten, welche rekombinanten Faktor VIII codieren, in ein proteinfreies und serumfreies Medium, welches ultrafiltriertes Soja-Hydrolysat umfasst, wobei wenigstens 40% des Soja-Hydrolysats ein Molekulargewicht von ≤ 500 Dalton haben; wobei die Zellen den rekombinanten Faktor VIII exprimieren; Heranziehen der Zellen in dem Medium und Exprimieren des rekombinanten Faktors VIII, und dadurch Erzeugen eines Gemischs der Zellen und des rekombinanten Faktors VIII in dem Medium; Reinigen des rekombinanten Faktors VIII aus dem Gemisch.
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