RU2380412C2 - Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде - Google Patents

Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде Download PDF

Info

Publication number
RU2380412C2
RU2380412C2 RU2005123274A RU2005123274A RU2380412C2 RU 2380412 C2 RU2380412 C2 RU 2380412C2 RU 2005123274 A RU2005123274 A RU 2005123274A RU 2005123274 A RU2005123274 A RU 2005123274A RU 2380412 C2 RU2380412 C2 RU 2380412C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
medium
cells
protein
serum
free
Prior art date
Application number
RU2005123274A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2005123274A (ru
Inventor
Манфред РАЙТЕР (AT)
Манфред Райтер
Вольфганг МУНДТ (AT)
Вольфганг Мундт
Фридрих ДОРНЕР (AT)
Фридрих ДОРНЕР
Леопольд ГРИЛЛЬБЕРГЕР (AT)
Леопольд Грилльбергер
Артур МИТТЕРЕР (AT)
Артур Миттерер
Original Assignee
Бакстер Акциенгезелльшафт
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3518214&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2380412(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бакстер Акциенгезелльшафт filed Critical Бакстер Акциенгезелльшафт
Publication of RU2005123274A publication Critical patent/RU2005123274A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2380412C2 publication Critical patent/RU2380412C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Среда для культивирования клеток млекопитающего содержит синтетическую среду от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои. Причем молекулярная масса гидролизата сои составляет ≤1000 дальтон или ≤500 дальтон, или ≤350 дальтон. Способ культивирования клеток млекопитающего включает введение указанных клеток млекопитающего в среду, не содержащую белков и сыворотки, где указанная среда содержит синтетическую среду от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤1000 дальтон. Способ получения белка из культуры клеток млекопитающего включает введение клеток в указанную выше среду, причем указанные клетки экспрессируют требуемый белок; выращивание указанных клеток в указанной среде и экспрессию указанного белка, тем самым получение смеси указанных клеток и указанного белка в среде; очистку указанного белка из указанной смеси. Изобретение позволяет повысить выход клеток млекопитающего. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 4 ил.

Description

Изобретение связано со средой для культивирования клеток без белка и без сыворотки.
Культивирование клеток, особенно эукариотических клеток или клеток млекопитающих, постоянно нуждается в применении специальных культуральных сред, которые обеспечивают клетки питательными веществами и ростовыми веществами, которые необходимы для эффективного роста и для продукции требуемых белков. В этом отношении, как правило, в качестве компонента среды используют сыворотку или соединения, которые получают из сыворотки (например, бычью сыворотку).
Однако в случае применения в культурах клеток добавок сыворотки или белков, которые получают от человека или из животных источников, существуют многочисленные проблемы, особенно если с помощью культуры клеток получают исходный материал для приготовления лекарственного средства, который необходимо вводить людям.
Поэтому в случае таких препаратов сыворотки состав и качество варьируют от партии к партии уже только вследствие отличия организмов доноров для таких препаратов. Это представляет значительную проблему особенно для стандартизации продукции клеток и при установлении стандартных условий роста для таких клеток. Несмотря на это в каждом случае требуется тщательный и постоянный контроль качества материала используемой сыворотки. Однако это чрезвычайно трудоемкий и дорогостоящий процесс, особенно в случае таких сложных композиций, как сыворотка.
Кроме того, такие сложные препараты содержат множество белков, которые могут действовать разрушающим образом, особенно в связи с процессом очистки рекомбинантного белка, который необходимо выделить из культуры клеток. Особенно это относится к белкам, которые гомологичны или сходны с белком, который необходимо выделить. Естественно, указанные проблемы являются особенно острыми в связи с очисткой, поскольку используемую биогенную добавку к среде (например, бычий белок) надежно можно удалить только посредством довольно специфичной дифференциальной очистки (например, с помощью антител, которые специфично направлены только против рекомбинантного белка, но не против бычьего белка (Björck, L., J. Immunol., 1988, Vol. 140, pp. 1194-1197; Nilson et al., J. Immunol Meth., 1993, 164, pp. 33-40).
С другой стороны, определенная проблема при применении сыворотки или соединений, которые получают из сыворотки, в среде для культивирования также состоит в риске загрязнения микоплазмой, вирусами или агентами КГЭ (BSE). Что касается препаратов, которые получают из крови человека, в этой связи особенно необходимо подчеркнуть риск загрязнения вирусами, такими как вирусы гепатита или ВИЧ. В случае сыворотки или компонентов сыворотки, которые получают из материала коров, в частности, существует опасность загрязнения КГЭ. При этом все полученные из сыворотки материалы, кроме того, могут быть загрязнены возбудителями заболеваний, которые еще не известны.
За немногими исключениями, для культивирования клеток на твердых поверхностях ранее считали совершенно необходимым добавление компонентов сыворотки для того, чтобы гарантировать адекватную адгезию клеток с их поверхностями и чтобы гарантировать адекватную продукцию требуемых веществ из клеток. Так, например, с помощью способа, который описан в WO 91/09935, можно было добиться процесса культивирования вируса FSME/антигена вируса посредством культивирования поверхностно-зависимых постоянных культур клеток, предпочтительно клеток Vero без сыворотки и без белков (смотри WO 96/15231). Однако указанные клетки не являются рекомбинантными клетками, а скорее клетками-хозяевами, которые используют для получения вирусного антигена в процессе лизиса.
В отличие от этого клетки, которые преимущественно используют для получения рекомбинантов, например клетки СНО, способны к адгезии только в ограниченной степени. Таким образом, клетки СНО, которые размножали традиционными способами, связываются как с гладкими, так и с пористыми микроносителями только в условиях наличия сыворотки (смотри патент США 4973616; Cytotechnology 9 (1992), 247-253). Однако если такие клетки выращивают в условиях без сыворотки, они теряют свои свойства и не прилипают к гладким носителям, или становятся легко отделяемыми от носителей, если в среду не внесены другие стимулирующие адгезию добавки, такие, например, как фибронектин, инсулин или трансферрин. Однако указанные добавки также являются белками, которые получают из сыворотки.
Альтернативно клетки можно размножать, используя технологию суспензионной культуры, а также, например, используя периодический способ или используя технологию непрерывного культивирования. Предпочтительно имеет место культивирование с использованием способа культивирования в хемостате. (Ozturk S.S. et al., 1996, Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., BIOT 164, Payne G.F. et al., в “Large Scale Cell Culture Technology,” 1987, ed. Lydersen B.K., Hauser publishers; pp. 206-212). Kattinger H. et al. (Advance Mol. Cell. Biology, 1996, 15A, 193-207) описывают долговременное культивирование клеток в среде, не содержащей белка, но указанные клетки необходимо обязательно культивировать на носителях и не допускаются альтернативы в виде способов непрерывного культивирования. Это говорит о том, что указанные клетки проявляют долговременную стабильность только в том случае, когда они адгезированы на поверхности носителей, вследствие пониженного роста и, как следствие, сниженных требований по отношению к факторам роста.
Кроме того, в нескольких случаях на предшествующем уровне техники были предприняты попытки адаптировать клетки в среде, не содержащей белков, начиная с условий в присутствии сыворотки. Однако в случае такой адаптации неоднократно обнаруживали, что по сравнению с условиями в присутствии сыворотки выход экспрессированного белка и продуктивность рекомбинантных клеток заметно снижена после адаптации в среде, не содержащей белков (Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 (1994), 691-658).
Также обнаружено, что при высокой плотности клеток продукция рекомбинантных белков иногда значительно ограничена. В ходе попыток адаптировать клетки к средам, не содержащим белков или сыворотки, наряду с пониженным ростом используемых клеток, также часто выявляют нестабильность, вследствие чего получают клетки с пониженной экспрессией, или даже получают не продуцирующие клетки, при этом они обладают преимуществами в росте относительно продуцирующих клеток в среде без белков и без сыворотки, и это приводит к тому факту, что данные клетки перерастают продуцирующие клетки и затем, наконец, вся культура продуцирует теперь продукт с очень низким выходом.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью данного изобретения поэтому является расширение возможностей для культивирования рекомбинантных клеток без белка и без сыворотки и предоставление средств и способов, с помощью которых можно эффективно культивировать рекомбинантные клетки способом в отсутствие сыворотки и в отсутствие белков. Кроме того, к тому же должно быть возможным не только культивирование поверхностно-зависимых клеток, но также использование способа суспензионного культивирования, в силу чего требуется подавить нестабильность в продуктивности клеток насколько это возможно.
Следующей целью данного изобретения, кроме того, является эффективное увеличение продукции рекомбинантных клеток.
Наконец, согласно изобретению, требуется усовершенствование и более эффективное формирование адаптации рекомбинантных клеток к средам, не содержащим сыворотки и не содержащим белков.
Согласно изобретению указанные задачи выполняют с помощью среды для культивирования клеток, особенно клеток млекопитающих, в отсутствие белков и в отсутствие сыворотки, характерной особенностью которой является то, что среда содержит часть гидролизата сои.
Неожиданно оказалось возможным показать, что цели, которые были определены выше, могут быть достигнуты культивированием клеток в среде, которая содержит гидролизат сои, без необходимости претерпевать недостатки культивирования без сыворотки, которые описаны в предшествующем уровне техники. Было обнаружено, что в отличие от других гидролизатов, которые известны из предшествующего уровня техники, таких, например, как гидролизаты пшеницы, гидролизаты риса или дрожжевые гидролизаты, только гидролизат сои опосредует свойства в соответствии с изобретением, и приводит, например, к значительно увеличенному выходу рекомбинантного белка-мишени. При обсуждении указанных терминов может быть использован либо термин «гидролизат сои», либо термин «соевый пептон», которые при этом не имеют разных значений.
Среда согласно изобретению предпочтительно содержит гидролизат сои в количестве более 10%, исходя из общей массы сухой среды. Как правило, в среде предусмотрено количество гидролизата сои 4-40%.
Выбор конкретного гидролизата сои не является критическим согласно изобретению. Согласно изобретению можно использовать множество препаратов сои, которые можно обнаружить на рынке, например пептоны из соевой муки, расщепленные ферментативно (например, папаином), со значением рН от 6,5 до 7,5 и общим содержанием азота от 9% до 9,7% и содержанием золы от 8 до 15%. Указанные пептоны представляют собой пептоны соевых бобов в форме, в которой их обычно использует специалист в данной области для культивирования клеток.
В соответствии с предпочтительным вариантом для среды согласно изобретению используют очищенный препарат гидролизата сои или его неочищенную фракцию. Примеси, которые могут мешать эффективному культивированию, предпочтительно удаляют в ходе указанной очистки, или повышают определенность гидролизата, например, в отношении молекулярной массы.
Согласно изобретению подтверждено, что на практике в ходе указанной очистки особенно полезно предусмотреть стадию ультрафильтрации; вследствие этого особенно предпочтительно использование в среде согласно изобретению гидролизата сои, подвергнутого ультрафильтрации.
Ультрафильтрацию можно осуществлять согласно способу, полно описанному в предшествующем уровне техники, например, с применением мембранных фильтров с определенным пределом отсечения.
Очистку подвергнутого ультрафильтрации соевого пептона можно осуществлять гель-хроматографией, например, посредством хроматографии на сефадексе, например сефадексе G25 или сефадексе G10, или эквивалентных материалах, ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией, эксклюзионной хроматографией по размеру или «обращенно-фазовой» хроматографией. Указанные способы являются способами предшествующего уровня техники, с которым специалист в данной области знаком. С использованием указанного способа можно отобрать те фракции, которые содержат гидролизат сои определенной молекулярной массы, т.е. ≤1000 дальтон, предпочтительно ≤500 дальтон, более предпочтительно ≤350 дальтон. Поэтому изобретение также включает в себя способ получения среды для культуры клеток, не содержащей сыворотки и белков, который заключается в получении гидролизата сои, ультрафильтрации указанного гидролизата сои с использованием способа ультрафильтрации, очистке фракции указанного гидролизата сои эксклюзионной хроматографией по размеру и отборе фракции гидролизата сои, состоящих из гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤1000 дальтон, предпочтительно ≤500 дальтон, более предпочтительно ≤350 дальтон.
Характерным признаком особенно предпочтительного гидролизата сои является то, что содержание свободных аминокислот в нем составляет от 10,3 до 15,6 или предпочтительно от 12 до 13,5%, общее содержание азота составляет от 7,6 до 11,4% или предпочтительно в пределах от 8,7 до 9,5%, и содержание эндотоксина <500 ед./г, и при этом, по меньшей мере, 40% или предпочтительно, по меньшей мере, 50%, или особенно предпочтительно по меньшей мере, 55% гидролизата имеет молекулярную массу 200-500 дальтон, и, по меньшей мере, 10% или предпочтительно 15% гидролизата имеет молекулярную массу 500-1000 дальтон. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% гидролизата сои имеет молекулярную массу ≤500 дальтон. Такой гидролизат сои особенно хорошо подходит для промышленного получения рекомбинантных белков, так как вследствие его особых свойств его можно особенно легко стандартизовать, и он удобен для стандартных способов.
Кроме гидролизата сои, среда согласно изобретению также может содержать синтетические среды, которые в определенной степени известны, такие, например, как DMEM/HAM F12, среда 199 или RPMI, которые в достаточной мере известны из литературы.
Кроме того, среда согласно изобретению также предпочтительно содержит аминокислоты, предпочтительно аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из L-аспарагина, L-цистеина, L-цистина, L-пролина, L-триптофана, L-глутамина или их смесей.
Также в среду согласно изобретению предпочтительно добавляют следующие аминокислоты: L-аспарагин (в количестве 0,001-1 г/л среды, предпочтительно 0,1-0,05 г/л, особенно предпочтительно 0,015-0,03 г/л); L-цистеин (0,001-1 г/л, предпочтительно 0,005-0,05 г/л, особенно предпочтительно 0,01-0,03 г/л); L-цистин (0,001-1 г/л, предпочтительно 0,015-0,05 г/л, особенно предпочтительно 0,015-0,03 г/л); L-пролин (0,001-1,5 г/л, предпочтительно 0,01-0,07 г/л, особенно предпочтительно 0,02-0,05 г/л); L-триптофан (0,001-1 г/л, предпочтительно 0,01-0,05 г/л, особенно предпочтительно 0,015-0,03 г/л) и L-глутамин (0,05-1 г/л, предпочтительно 0,1-1 г/л).
Указанные выше аминокислоты можно добавлять в среду согласно изобретению либо отдельно, либо в комбинации. Особенно предпочтительно комбинированное добавление смеси аминокислот, которая состоит из всех указанных выше аминокислот.
В особом варианте используют среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков, при этом указанная среда дополнительно содержит комбинацию указанной выше смеси аминокислот и очищенный подвергнутый ультрафильтрации соевый пептон.
Неожиданно было обнаружено, например, что для того, чтобы инактивировать вирусы или другие патогены, среду можно нагревать без отрицательных последствий в течение примерно 5-20 мин или предпочтительно 15 мин при 70-95°С, или предпочтительно 85-98°С.
Согласно изобретению, в комбинации с гидролизатом сои можно использовать любую известную синтетическую среду. Обычные синтетические среды могут содержать неорганические соли, аминокислоты, витамины, источник углеводов и воду. Например, можно использовать среду DMEM/HAM F12. Концентрация экстракта сои в среде предпочтительно может быть в пределах от 0,1 до 100 г/л, особенно предпочтительно от 1 до 5 г/л. Согласно особенно предпочтительному варианту, можно использовать соевый пептон, который был стандартизован в отношении его молекулярной массы. Молекулярная масса соевого пептона предпочтительно меньше 50 кД, особенно предпочтительно меньше 10 кД, наиболее предпочтительно меньше 1 кД.
Оказалось, что добавление подвергнутого ультрафильтрации соевого пептона особенно полезно для продуктивности рекомбинантных линий клеток, при этом средняя молекулярная масса соевого пептона составляет 350 дальтон (Quest Company). Это вещество, выделенное из сои, с общим содержанием азота примерно 9,5% и содержанием свободных аминокислот примерно 13%.
Особенно предпочтительно применение очищенного, ультрафильтрованного соевого пептона с молекулярной массой ≤1000 дальтон, предпочтительно ≤500 дальтон, особенно предпочтительно ≤350 дальтон.
Среда согласно изобретению предпочтительно также содержит дополнительные вещества, такие, например, как буферные вещества, стабилизаторы окисления, стабилизаторы для нейтрализации механического воздействия или ингибиторы протеаз.
Главным образом используют среду следующего состава: синтетическая минимальная среда (1-25 г/л), соевый пептон (0,5-50 г/л), L-глутамин (0,05-1 г/л), NaHCO3 (0,1-10 г/л), аскорбиновая кислота (0,0005-0,05 г/л), этаноламин (0,0005-0,05 г/л) и селенит Na (1-15 мкг/л).
При необходимости, в качестве противопенного средства согласно изобретению в среду можно добавить неионное поверхностно-активное вещество, такое, например, как полипропиленгликоль (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 или PLURONIC F-108).
Указанное средство обычно используют для того, чтобы защитить клетки от негативного воздействия аэрации, так как без добавления поверхностно-активного вещества поднимающиеся и лопающиеся пузырьки воздуха могут привести к повреждению тех клеток, которые располагаются на поверхности этих пузырьков воздуха («барботаж») (Murhammer and Goochee, 1990, Biotechnol. Prog. 6: 142-148).
При этом количество неионного поверхностно-активного вещества может в пределах от 0,05 до 10 г/л, хотя особенно предпочтительно наименьшее возможное количество от 0,1 до 5 г/л.
Кроме того, среда согласно изобретению также может содержать циклодекстрин или его производное.
Среда без сыворотки и без белков предпочтительно содержит ингибитор протеазы, такой, например, как ингибиторы сериновых протеаз, которые подходят для культуры клеток и имеют синтетическое или растительное происхождение.
В качестве клеток для культивирования в среде согласно изобретению предпочтительно используют клетки, которые уже были адаптированы, т.е. клетки, которые уже были адаптированы к росту в среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки. Было обнаружено, что с помощью таких предварительно адаптированных клеток можно не только достичь увеличенного выхода, но и стабильность их культивирования в отсутствие сыворотки и белков также явно повышена при использовании среды согласно изобретению.
Однако показано, что рекомбинантные клоны клеток особенно полезны согласно изобретению, при этом клетки стабильны от начала в течение по меньшей мере 40 генераций и предпочтительно по меньшей мере 50 генераций в бессывороточной среде в отсутствие белков, и экспрессируют рекомбинантные продукты.
Такие клоны клеток можно получить из культуры клеток, которую получают после культивирования исходного рекомбинантного клона клеток в среде, содержащей сыворотку, и повторной адаптации клеток к среде без сыворотки и без белков.
Термин «исходный клон клеток» можно понимать в значении рекомбинантного трансфицированного клона клеток, который после трансфекции клеток-хозяев рекомбинантной нуклеотидной последовательностью стабильно экспрессирует рекомбинантный продукт в лабораторных условиях. Исходный клон размножают в среде, содержащей сыворотку, для того, чтобы оптимизировать его рост. Для того чтобы увеличить его продуктивность, исходный клон размножают необязательно в присутствии селектирующего агента с отбором в отношении селектируемого маркера и/или маркера амплификации. Для крупномасштабного промышленного производства исходный клон клеток размножают в условиях культивирования в присутствии сыворотки до высокой плотности клеток, и затем его повторно адаптируют к среде без сыворотки и без белков непосредственно перед фазой продуцирования. В этом случае культивирование предпочтительно осуществляют в отсутствие давления отбора.
Культивирование рекомбинантного исходного клона можно с самого начала осуществлять в среде без сыворотки и без белков; в результате уже не требуется реадаптация. При необходимости в данном случае можно использовать селектирующий агент, и может иметь место селекция в отношении селектируемого маркера и/или маркера амплификации. Способ для этого, например, описан в EP 0 711 835.
Культуру клеток, которую получают после реадаптации в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, анализируют в отношении таких клеточных клонов популяции клеток, которые стабильно продуцируют продукты в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белков, необязательно в отсутствие давления отбора. Это можно осуществить, например, посредством иммунофлуоресценции с помощью меченых специфичных антител, которые направлены против рекомбинантного полипептида или белка. Клетки, которые идентифицируют как продуценты продуктов, выделяют из культуры клеток и повторно размножают в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белка, которые предпочтительно эквивалентны условиям продуцирования. При этом выделение клеток можно осуществлять выделением клеток и их тестированием в отношении продуцентов продуктов.
Культуру клеток, содержащую стабильные клетки, можно снова тестировать в отношении стабильных рекомбинантных клонов, и указанные клоны выделяют из культуры клеток и субклонируют. Стабильные клоны рекомбинантных клеток, которые получают в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белков, затем можно далее размножать в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белков.
Рекомбинантные клоны клеток или популяции клеток, которые получают таким образом в среде согласно изобретению, в частности, отличаются той особенностью, что они стабильны в течение по меньшей мере 40 генераций, предпочтительно по меньшей мере в течение 50 генераций, и особенно предпочтительно - в течение более чем 60 генераций, и экспрессируют рекомбинантный продукт.
Пример такого стабильного рекомбинантного клона клеток или популяции клеток зарегистрирован согласно Будапештскому договору под номером 98012206 в ECACC (Великобритания).
Культуру клеток, которую необходимо культивировать согласно изобретению, предпочтительно получают из рекомбинантной клетки млекопитающего. При этом рекомбинантными клетками млекопитающих могут быть все клетки, которые содержат последовательности, которые кодируют рекомбинантный полипептид или белок. В рассмотрение включены все непрерывно растущие клетки, которые растут либо адгезивно, либо не адгезивно. Особенно предпочтительны рекомбинантные клетки СНО или клетки ВНК. Рекомбинантными полипептидами или белками могут быть факторы крови, факторы роста или другие продукты, имеющие отношение к биомедицине.
Согласно данному изобретению, предпочтительны клоны клеток, которые содержат кодирующую последовательность для рекомбинантного фактора крови, такого как фактор II, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, белок S, белок C, активированная форма одного из этих факторов или vWF, и которые способны стабильно их экспрессировать в течение нескольких генераций. Особенно предпочтительны в этом отношении рекомбинантные клетки СНО, которые экспрессируют vWF или полипептид с активностью vWF, фактор VIII или полипептид с активностью VIII, vWF и фактор VIII, фактор IX или фактор II.
Для того чтобы создать банк исходных клеток, необходимо 30 генераций. По меньшей мере примерно 40 генераций необходимо для того, чтобы получить среднюю партию культуры в масштабе 1000 л. В случае среды согласно данному изобретению, начиная с отдельного клона клеток, можно получить «исходный банк клеток» (MCB) и «рабочий банк клеток» (WCB) примерно через 8-10 генераций, и следовательно, культуру клеток в масштабе продуцирования (продуцирующая биомасса) в условиях отсутствия белков и отсутствия сыворотки при прохождении до 20-25 генераций, тогда как, в противоположность этому, в случае предыдущих клонов клеток и сред некоторые генерации становились нестабильными после роста в среде без сыворотки и без белков, и в результате а) не возможна однородная культура клеток с продуцентами продукта и b) не возможна стабильная продуктивность в течение длительного периода времени.
Однако согласно изобретению, напротив, можно было выявить даже повышенную продуктивность по сравнению с исходным клоном клеток, который культивировали в среде, содержащей сыворотку.
Согласно следующему аспекту данное изобретение также имеет отношение к способу культивирования клеток, особенно клеток млекопитающих, характерной особенностью которого является то, что указанные клетки вводят в среду согласно изобретению и затем культивируют в указанной среде.
Таким образом, данное изобретение также относится к применению среды согласно изобретению для культивирования рекомбинантных клеток, предпочтительно эукариотических клеток, и особенно клеток млекопитающих.
Соответственно, целью данного изобретения также является культура клеток, которая содержит среду согласно изобретению и клетки, предпочтительно эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающих.
Изобретение будет освещено более подробно посредством следующих приведенных ниже примеров, а также чертежей, но этим изобретение не ограничено.
На фиг.1 показаны результаты культивирования клона клеток rFVIII-CHO в проточном биореакторе объемом 10 л:
а) активность фактора VIII (миллиединиц/мл) и скорость перфузии (1-5/сутки) в течение 42-дневного периода;
b) продуктивность, приведенная к объему (единицы фактора VIII/л/сутки в проточном биореакторе.
На фиг.2 показано сравнение продуктивности по фактору VIII (мU/мл) в случае культивирования периодическим способом клеток СНО, которые экспрессируют r-фактор VIII, в разных средах. Смесь 1 состоит из среды, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, без гидролизата сои, но содержащей смесь аминокислот, перечисленных в таблице 4; смесь 2 состоит из среды, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, но содержащей гидролизат сои; смесь 3 состоит из среды, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, но содержащей гидролизат сои и смесь аминокислот, перечисленных в таблице 4, и смесь 4 состоит из среды, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, но содержащей 2,5 г/л очищенного ультрафильтрованного гидролизата сои и смесь аминокислот, перечисленных в таблице 4. Для очистки ультрафильтрованного гидролизата сои использовали колонку Sephadex®.
На фиг.3 показана продуктивность по фактору VIII (U/л) [т.е. ед/л] в случае непрерывного роста клеток СНО, которые экспрессируют r-фактор VIII, в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, после начала добавления очищенного ультрафильтрованного соевого пептона, а именно на 6-й день культивирования.
На фиг.4 показаны клетки ВНК, экспрессирующие рекомбинантный фактор II, которые размножали в среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки, но которая содержит гидролизат сои.
ПРИМЕРЫ
Пример 1:
Стабильность клеток rvWF-CHO после перевода из среды, содержащей сыворотку, в среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков
Клетки CHO-dhfr совместно трансфицировали плазмидами phAct-rvWF и pSV-dhfr, и клоны, экспрессирующие vWF, субклонировали, как описано Fischer et al. (1994, FEBS Letters 351: 345-348). Рабочий банк клеток (WCB) начинали c субклонов, которые стабильно экспрессировали rvWF, в условиях присутствия сыворотки, но в отсутствие MTX, и клетки иммобилизовали на пористом микроносителе (Cytopore®) в условиях наличия сыворотки. Перевод клеток в среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков, происходил после того, как плотность клеток достигала 2×107 клеток/мл матрикса. Затем клетки культивировали в течение нескольких генераций в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белков. Клетки анализировали в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков в разных временных точках посредством иммунофлуоресценции с использованием меченых антител против vWF. Оценку стабильности клеток проводили, используя рабочий банк клеток до перевода в новую среду, после 10 генераций и после 60 генераций в среде, не содержащей сыворотку и не содержащей белков. В то время как в рабочем банке клеток еще выявляют 100% продуцентов rvWF, доля продуцентов rvWF снижается примерно до 50% после 10 генераций в среде, не содержащей сыворотки и белков. После 60 генераций более 95% клеток идентифицировали как не являющиеся продуцентами.
Пример 2:
Клонирование стабильных рекомбинантных клонов СНО
Готовили серийные разведения культуры клеток, содержащей клетки rvWF-CHO согласно примеру 1 (указанный стабильный клон клеток, который назвали r-vWF-CHO F7, зарегистрирован согласно Будапештскому договору в ЕСАСС (Европейская коллекция культур клеток), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK 22 января 1998 г., и при депонировании получил номер 98012206), которые культивировали в течение 60 генераций в среде, не содержащей сыворотки и белков, и 0,1 клеток высевали в каждую лунку планшета для микротитрования. Клетки культивировали примерно в течение 3 недель в DMEM/HAM F12 без добавления сыворотки или добавок белка и без давления отбора, и клетки анализировали посредством иммунофлуоресценции с использованием меченых антител против vWF. Клон клеток, который идентифицировали как позитивный, использовали в качестве исходного клона для получения банка посевных клеток. Исходный банк клеток (MCB) получали, исходя из банка посевных клеток в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, и отбирали отдельные ампулы и замораживали для дальнейшего приготовления рабочего банка клеток. Рабочий банк клеток готовили в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, из отдельной ампулы. Клетки иммобилизовали на пористых микроносителях и затем культивировали в течение нескольких генераций в условиях отсутствия сыворотки и отсутствия белков. Клетки анализировали в отношении продуктивности в разных временных точках в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, посредством иммунофлуоресценции с использованием меченых антител против vWF. Оценку стабильности клеток осуществляли в стадии рабочего банка клеток и после 10 и 60 генераций в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков. Примерно 100% клеток идентифицировали как позитивные стабильные клоны, которые экспрессируют rvWF, в стадии рабочего банка клеток, после 10 генераций и 60 генераций.
Пример 3:
Удельная клеточная продуктивность рекомбинантных клонов клеток
В ходе культивирования рекомбинантных клеток на определенных стадиях отбирали определенное количество клеток и инкубировали их в течение 24 часов в свежей среде. В надосадочной жидкости культур клеток определяли активность rvWF: Risto-CoF. В таблице 1 показано, что в случае стабильных рекомбинантных клонов клеток согласно изобретению удельная продуктивность клеток была стабильной даже после 60 генераций в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, и даже увеличивалась по сравнению с исходным клоном, который культивировали в среде, содержащей сыворотку.
Таблица 1
Клон клеток Удельная клеточная продуктивность рабочих клеток в мU rvWF/106 клеток/день Удельная продуктивность клеток после 10 генераций в мU rvWF/106 клеток/день Удельная продуктивность клеток после 60 генераций в мU rvWF/106 клеток/день
rvWF-CHO #808.68 исходный клон клеток 55 30 <10
r-vWF-CHO F7*) стабильный клон 62 65 60
*) зарегистрирован 22 января 1998 г. (ЕСАСС (Европейская коллекция культур клеток, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK); номер депозита 98012206).
Пример 4:
Состав синтетической среды, не содержащей сыворотки и не содержащей белков
Таблица 2
Компонент г/л Предпочтительное количество (согласно данным авторов на момент подачи заявки на патент) в г/л
Синтетическая минимальная среда (DMEM/HAM F12) 1-100 11,00-12,00
Соевый пептон 0,5-50 2,5
L-глутамин 0,05-1 0,36
Аскорбиновая кислота 0,0005-0,05 0,0035
NaHCO3 0,1-10 2,00
Этаноламин 0,0005-0,05 0,0015
Селенит Na 1-15 мкг/л 8,6 мкг/л
Необязательно: Synperonic F68 0,01-10 0,25
Пример 5:
Культивирование клеток rFVIII-CHO в минимальной среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки
Культуру клеток, содержащую клетки rFVIII-CHO, культивировали в проточном сосуде с мешалкой объемом 10 л. В данном случае использовали среду согласно примеру 4. При этом клетки иммобилизовали на пористом микроносителе (Cytopore®, Pharmacia), и затем культивировали, по меньшей мере, в течение 6 недель. Скорость перфузии составляла 4 смены объема в сутки; рН был равен 6,9-7,2; концентрация О2 примерно составляла 20-50% и температура составляла 37°С.
На фиг.1 показаны результаты культивирования клона клеток rFVIII-CHO в проточном биореакторе объемом 10 л.
а) Активность фактора VIII (миллиединиц/мл) и скорость перфузии (1-5/сутки) в течение периода, равного 42 дням.
b) Продуктивность в пересчете на объем (единиц фактора VIII/л/день) в проточном реакторе.
Таблица 3
Дни культивирования Удельная продуктивность клеток (мU/106 клеток/день) Иммунофлуоресценция (% VIII-позитивных клеток)
15 702 н.д.
21 1125 н.д.
28 951 >95%
35 691 >95%
42 970 н.д.
В таблице 3 показана стабильность и удельная продуктивность клеток, экспрессирующих rFVIII. Для того чтобы получить указанные результаты, отбирали образцы через 15, 21, 28, 35 и 42 дня, и затем центрифугировали при 300 g и ресуспендировали в свежей среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков. Концентрацию фактора VIII в надосадочной жидкости культур клеток и количество клеток определяли спустя следующие 24 часа. На основе этих данных рассчитывали удельную FVIII-продуктивность.
Была достигнута стабильная средняя продуктивность 888 миллиединиц/106 клеток/день. Указанную стабильную продуктивность также подтвердили иммунофлуоресценцией с использованием меченых антител против FVIII через 15, 21, 28, 35 и 42 дня в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков.
Пример 6:
Сравнение продуктивности рекомбинантных клеток FVIII-CHO в среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки, но содержащей дополнительные компоненты среды.
Культуру клеток, содержащую клетки rFVIII-CHO, культивировали периодическим способом. В данном случае использовали среду согласно примеру 4, в которую добавили следующие аминокислоты:
Таблица 4
Аминокислоты: мг/л Предпочтительное количество (согласно данным авторов на момент подачи заявки на патент) в мг/л
L-аспарагин 1-100 20
L-цистеин·HCl·H2O 1-100 15
L-цистин 1-100 20
L-пролин 1-150 35
L-глутамин 50-1000 240
Клетки размножали при 37°С и рН 6,9-7,2. Клетки размножали, используя периодический способ в течение периодов 24-72 ч.
Продуктивность рекомбинантных клеток FVIII-CHO измеряли при следующих составах среды:
Смесь 1: содержащая среду без сыворотки и без белков, без соевого пептона, но дополнительно содержащая смесь аминокислот в соответствии с приведенной выше таблицей.
Смесь 2: содержащая среду без сыворотки и без белка, но содержащая соевый пептон.
Смесь 3: содержащая среду без сыворотки и без белков, но содержащая соевый пептон и дополнительно содержащая смесь аминокислот в соответствии с приведенной выше таблицей.
Смесь 4: содержащая среду без сыворотки и без белков, но дополнительно содержащая смесь аминокислот в соответствии с приведенной выше таблицей и 2,5 г/л очищенного ультрафильтрованного соевого пептона. Очистку ультрафильтрованного соевого пептона осуществляли хроматографически через колонку Sephadex®.
Пример 7:
Культивирование рекомбинантных клеток FVIII-CHO в среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки, с использованием способа культивирования в хемостате
Культуру клеток, содержащую клетки rFVIII-CHO, культивировали в сосуде биореактора с мешалкой объемом 10 л. В данном случае использовали среду в соответствии с примером 4 без соевого пептона, содержащую смесь аминокислот согласно примеру 6. Клетки размножали при 37°С и рН 6,9-7,2; концентрация кислорода составляла 20-50% насыщения воздуха. Образцы отбирали каждые 24 часа, для того чтобы определить титр фактора VIII и концентрацию клеток в жидком надосадке культуры. Общая концентрация клеток была постоянной со 2-го по 14-й день. Ультрафильтрованный соевый пептон добавляли в среду, начиная с 6-го дня. Продуктивность в отношении фактора VIII показана в 3; измерения проводили с помощью системы CHROMOGENIX CoA FVIII:C/4. Иммунофлуоресценцию выполняли с использованием меченых антител против FVIII. На основании данных можно видеть, что в результате добавления соевого пептона происходило явное увеличение продуктивности в отношении фактора VIII и, следовательно, увеличение в продуктивности, пересчитанной на объем системы биореактора, причем это не приводило к заметному увеличению роста клеток. Отсутствие соевого пептона в непрерывной культуре приводит к явному снижению продуктивности по фактору VIII через несколько дней, тогда как добавление соевого пептона приводит в результате к почти 10-кратному увеличению продуктивности. Однако, поскольку указанное добавление не увеличивает количество клеток, следовательно, это четко показывает, что ультрафильтрованный соевый пептон в результате приводит к явному увеличению продуктивности, которое не зависит от роста клеток.
Пример 8:
Сравнение скорости роста и продуктивности рекомбинантных клеток FVIII-CHO в среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки, но содержащей различные гидролизаты
Культуру клеток rFVIII-CHO культивировали периодическим способом. В данном случае использовали среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков, которая описана в примере 4, к которой добавляли различные гидролизаты (из сои, дрожжей, риса и пшеницы). В качестве контроля использовали среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков, в которую гидролизат не добавляли.
Исходная плотность клеток составляла 0,6×105 и 0,4×106, соответственно. Клетки культивировали при 37°С, используя периодический способ при рН 6,9-7,2.
Таблица 5: показаны результаты экспериментов по культивированию клеток rFVIII-CHO в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, в которую добавляли соевый гидролизат (нефильтрованный) и дрожжевой гидролизат. Исходная плотность клеток составляла 0,6×105 клеток. В качестве контроля использовали среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков без добавок гидролизата.
Таблица 5
Гидролизат Конечная плотность клеток (х106/мл) Титр FVIII (мU/мл) Коагулирующая активность FVIII (мU/мл)
Соя 3,6 485 508
Дрожжи 3,3 226 230
Таблица 6: показаны результаты экспериментов по культивированию клеток rFVIII-CHO в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, в которую добавляли соевый гидролизат (нефильтрованный), гидролизат риса и гидролизат пшеницы. Исходная плотность клеток составляла 0,6×105 клеток. В качестве контроля использовали среду, не содержащую сыворотки и не содержащую белков без добавок гидролизата.
Таблица 6
Гидролизат Конечная плотность клеток (×106/мл) Титр FVIII (мU/мл) vWF-антиген (мкг/мл)
Соя 3,7 1142 6,7
Рис 3,0 479 3,2
Пшеница 3,4 522 3,9
Контроль 3,0 406 3,1
Таблица 7: показаны результаты экспериментов по культивированию клеток rFVIII-CHO в среде, не содержащей сыворотки и не содержащей белков, в которую добавляли соевый гидролизат (нефильтрованный) и гидролизат пшеницы. Исходная плотность клеток составляла 0,4×106 клеток.
Таблица 7
Гидролизат Конечная плотность клеток (х106/мл) Титр FVIII (мU/мл) FVIII-антиген (мкг/мл) VWF-антиген (мкг/мл)
Соя 1,6 1427 166 17,2
Пшеница 1,0 1120 92 7,9
Пример 9:
Культивирование клеток ВНК в среде без белков и без сыворотки, содержащей соевый гидролизат.
Клетки ВНК-21 (АТСС CCL 10) совместно трансфицировали способом на основе CaPO4 три раза следующими плазмидами: 25 мкг плазмиды pSV-FII (Fischer, B. et al., J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, pp. 23737-23742), которая содержит кДНК фактора II (протромбина) человека под контролем промотора SV40 (промотор раннего гена SV40); 4 мкг плазмиды pSV-DHFR для устойчивости к метотрексату и 1 мкг плазмиды pUCSV-neo (Schlokat, U. et al., Biotech. Appl. Biochem., 1996, Vol. 24, pp. 257-267), которая опосредует устойчивость к G418/неомицину. Стабильные клоны клеток отбирали посредством культивирования в среде, которая содержала 500 мкг/мл G418, при ступенчатом возрастании концентрации метотрексата до концентрации 3 мкМ.
Полученные таким образом клоны субклонировали и адаптировали к среде, не содержащей белков и не содержащей сыворотки. Культивирование проводили, используя технологию суспензионной культуры.
Результаты можно видеть в таблице 6; клетки ВНК, которые размножали в среде без белков и без сыворотки, содержащей гидролизат сои, проявляли высокую и стабильную степень продуцирования рекомбинантного фактора II.

Claims (14)

1. Среда, не содержащая белков и не содержащая сыворотки, для культивирования клеток млекопитающего, включающая в себя синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤1000 Да.
2. Среда, не содержащая белков и не содержащая сыворотки, для культивирования клеток млекопитающего, включающая в себя синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤500 Да.
3. Среда, не содержащая белков и не содержащая сыворотки, для культивирования клеток млекопитающего, включающая в себя синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤350 Да.
4. Среда по пп.1-3, где указанная среда содержит ультрафильтрованный гидролизат сои.
5. Среда по пп.1-3, где указанная среда содержит очищенный гидролизат сои.
6. Среда по пп.1-3, где гидролизат сои имеет содержание эндотоксина <500 ед./г.
7. Среда по пп.1-3, где указанная среда также содержит аминокислоту.
8. Среда по пп.1-3, где указанная среда также содержит дополнительные вещества, выбранные из группы, состоящей из буферных веществ, стабилизаторов окисления, стабилизаторов, противодействующих механическому воздействию, и ингибиторов протеаз.
9. Среда по пп.1-3, где указанной синтетической средой является среда DMEM/HAM F12, среда 199 или RPMI.
10. Среда по пп.1-3, где указанные клетки млекопитающего выбраны из группы, состоящей из клеток СНО и клеток ВНК.
11. Среда по п.7, где указанная аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-аспарагина, L-цистеина, L-цистина, L-пролина, L-триптофана, L-глутамина или их смесей.
12. Способ культивирования клеток млекопитающего, включающий в себя введение указанных клеток млекопитающего в среду, не содержащую белков и сыворотки, где указанная среда содержит синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤1000 Да.
13. Способ по п.12, согласно которому указанные клетки млекопитающего выбраны из группы, состоящей из клеток СНО и клеток ВНК.
14. Способ получения белка из культуры клеток млекопитающего, включающий в себя введение клеток в среду, не содержащую белков и сыворотки, где указанная среда включает в себя синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои, имеющего молекулярную массу ≤1000 Да, причем указанные клетки экспрессируют требуемый белок; выращивание указанных клеток в указанной среде и экспрессию указанного белка, тем самым получение смеси указанных клеток и указанного белка в среде; очистку указанного белка из указанной смеси.
RU2005123274A 1999-09-28 2000-09-27 Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде RU2380412C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0165999A AT409379B (de) 1999-06-02 1999-09-28 Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
ATA1659/99 1999-09-28

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002111335A Division RU2266325C2 (ru) 1999-09-28 2000-09-27 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009131610/10A Division RU2536244C2 (ru) 1999-09-28 2009-08-20 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005123274A RU2005123274A (ru) 2007-01-27
RU2380412C2 true RU2380412C2 (ru) 2010-01-27

Family

ID=3518214

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002111335A RU2266325C2 (ru) 1999-09-28 2000-09-27 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки
RU2005123274A RU2380412C2 (ru) 1999-09-28 2000-09-27 Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде
RU2009131610/10A RU2536244C2 (ru) 1999-09-28 2009-08-20 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2002111335A RU2266325C2 (ru) 1999-09-28 2000-09-27 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009131610/10A RU2536244C2 (ru) 1999-09-28 2009-08-20 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030203448A1 (ru)
EP (1) EP1220893B2 (ru)
JP (6) JP5441288B2 (ru)
CN (2) CN1318577C (ru)
AT (2) AT409379B (ru)
AU (1) AU780791B2 (ru)
CA (1) CA2385299A1 (ru)
CY (1) CY1106135T1 (ru)
CZ (1) CZ305307B6 (ru)
DE (1) DE60028989T3 (ru)
DK (1) DK1220893T4 (ru)
ES (1) ES2265991T5 (ru)
HU (1) HU228210B1 (ru)
IL (4) IL148642A0 (ru)
PL (1) PL215234B1 (ru)
PT (1) PT1220893E (ru)
RU (3) RU2266325C2 (ru)
SI (1) SI1220893T1 (ru)
SK (1) SK288059B6 (ru)
TR (1) TR200200757T2 (ru)
WO (1) WO2001023527A1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
RU2644651C2 (ru) * 2010-04-26 2018-02-13 Новартис Аг Среда для культивирования клеток
RU2708919C2 (ru) * 2014-06-06 2019-12-12 Джензим Корпорейшн Способы перфузионного культивирования и их применения
RU2798069C2 (ru) * 2010-04-26 2023-06-14 Новартис Аг Улучшенная среда для культивирования клеток

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
CA2466881A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
JP3916516B2 (ja) * 2002-06-10 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 硬組織−軟組織界面再生用足場材料
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
CA2548162C (en) * 2003-12-19 2013-10-29 Wyeth Serum-free vero cell banking process
ME01218B (me) 2004-03-01 2013-06-20 Ares Trading Sa Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
CA2585547A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
FR2879214A1 (fr) * 2004-12-14 2006-06-16 Pierre Fabre Medicament Sa Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus
WO2006084826A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Novo Nordisk Health Care Ag Production of a polypeptide in a serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate
EP1862537B1 (en) * 2005-03-10 2013-05-08 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US7375188B2 (en) * 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
PL3121266T3 (pl) 2006-01-04 2020-07-13 Baxalta Incorporated Wolne od oligopeptydów pożywki do hodowli komórkowej
CA2644926A1 (en) * 2006-03-06 2007-09-13 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human thrombin and fibrinogen
SG174804A1 (ru) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
EP2500415A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
EP2084265A2 (en) * 2006-11-13 2009-08-05 Schering Corporation Method for reducing protease activity in plant hydrolysate
US20090294288A1 (en) 2006-12-11 2009-12-03 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
EP1988101A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures
KR101190605B1 (ko) 2007-06-15 2012-10-15 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
WO2009115495A1 (de) * 2008-03-19 2009-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz
WO2009127098A1 (zh) 2008-04-18 2009-10-22 上海中信国健药业有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
JP5458536B2 (ja) * 2008-09-17 2014-04-02 不二製油株式会社 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤
CA2737580A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Schering Corporation High titer antibody production
EP2356247B2 (en) * 2008-11-12 2019-05-15 Baxalta Incorporated Method of producing serum-free insulin-free factor vii
KR101737645B1 (ko) 2008-12-30 2017-05-18 박스알타 인코퍼레이티드 알킬-아민-ｎ-옥시드 (ａａｎｏｘ)를 사용하는 세포 성장 증진 방법
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
KR101574056B1 (ko) 2009-07-31 2015-12-02 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 Ａｄａｍｔｓ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지
CN102115728B (zh) * 2009-12-31 2012-09-26 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
AU2011246502B2 (en) 2010-04-26 2014-08-28 Novartis Ag Improved cell cultivation process
TWI670073B (zh) 2010-07-08 2019-09-01 美商巴克斯歐塔公司 在細胞培養物中生產重組高分子量ｖＷＦ的方法
CN101914485A (zh) * 2010-08-05 2010-12-15 乐能生物工程股份有限公司 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
KR20130101034A (ko) 2010-08-31 2013-09-12 프리슬랜드 브랜즈 비브이 진핵 세포를 위한 배양 배지
CN103154233A (zh) * 2010-10-05 2013-06-12 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN103160458A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 西南民族大学 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
JP2015509376A (ja) * 2012-03-08 2015-03-30 フリーズランド ブランズ ビー．ブイ． 真核細胞のための培養培地
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
CN104593317B (zh) * 2013-10-31 2018-05-04 中国食品发酵工业研究院 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
SG11201605146VA (en) 2013-12-30 2016-07-28 Baxalta GmbH A method of predicting a performance characteristic of a plant or yeast hydrolysate and its use
ES2909630T3 (es) 2014-06-04 2022-05-09 Amgen Inc Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero
CN104560893B (zh) * 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CN105002242A (zh) * 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
EP3328403A4 (en) * 2015-07-31 2019-04-17 Zen-Bio, Inc. EXOSOME COMPOSITIONS AND USE THEREOF FOR SOFTWARE SAVING
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
US11070703B2 (en) * 2016-07-29 2021-07-20 Robert Bosch Tool Corporation 3D printer touchscreen interface lockout
JP6258536B1 (ja) 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
SG11201912548XA (en) * 2017-07-06 2020-01-30 Regeneron Pharma Cell culture process for making a glycoprotein
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
WO2024024671A1 (ja) * 2022-07-27 2024-02-01 不二製油グループ本社株式会社 動物細胞増殖促進剤

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4443540A (en) 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
FI86885C (fi) 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
EP0217822B1 (en) 1985-02-13 1993-05-12 Scios Nova Inc. Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
ZA862768B (en) 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8608020D0 (en) 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
EP0318487B1 (en) 1986-08-04 1993-10-13 The University Of New South Wales Serum free tissue culture medium containing polymeric cell-protective agent
AU627427B2 (en) 1987-06-30 1992-08-27 Amgen, Inc. Production of kallikrein
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
JP2815613B2 (ja) 1989-03-24 1998-10-27 株式会社リコー 静電荷像現像用トナー
US5573937A (en) 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
AT393356B (de) 1989-12-22 1991-10-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
WO1991010726A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2844484B2 (ja) * 1990-02-22 1999-01-06 味の素株式会社 組換え蛋白質の生産方法
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5378612A (en) 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
DK53792D0 (da) 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
RU2057176C1 (ru) 1992-05-20 1996-03-27 Институт генетики АН Республики Молдова Питательная среда для культивирования клеток человека и животных
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
JP2766165B2 (ja) * 1993-08-02 1998-06-18 株式会社バイオポリマー・リサーチ バクテリアセルロースの製造方法
CN1088984A (zh) * 1993-11-11 1994-07-06 江西省医学科学研究所 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
JP2684521B2 (ja) 1994-08-19 1997-12-03 ハムス株式会社 ベルトループ縫付けミシンにおけるテープ折り曲げ端の形成維持方法及びその装置
WO1996007730A2 (de) 1994-09-09 1996-03-14 Renner Wolfgang A Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
ATE542891T1 (de) 1994-11-10 2012-02-15 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freier kultur
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
EP0799310A1 (en) 1994-12-16 1997-10-08 Novartis AG Production of recombinant secretory component
JP3649249B2 (ja) * 1995-02-23 2005-05-18 クエスト・インターナショナル・サービシーズ・ビー・ブイ 組織および細胞培養用ペプチド
US5741705A (en) 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
WO1996040866A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and methods of use thereof
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
ATE222064T1 (de) * 1996-04-09 2002-08-15 Du Pont Isoflavon angereichertes sojaeiweissprodukt und verfahren zur herstellung
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
DE69738806D1 (de) * 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
JPH10211488A (ja) 1997-01-28 1998-08-11 Akai Electric Co Ltd 紫外線殺菌装置
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
PT1849860E (pt) 1997-05-28 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
DK0986644T3 (da) 1997-07-23 2007-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Fremstilling af erythropoietin ved endogen genaktivering med virale promotorer
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
DK1200561T3 (da) 1999-08-05 2006-10-16 Baxter Ag Rekombinant stabil celleklon, dens fremstilling og anvendelse
PT1210411E (pt) 1999-08-25 2006-12-29 Immunex Corp Composições e métodos para cultura celular melhorada
WO2002024876A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
EP1208966A1 (en) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Manufacturing process of patio tabletop glass with broken protection
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2644651C2 (ru) * 2010-04-26 2018-02-13 Новартис Аг Среда для культивирования клеток
RU2798069C2 (ru) * 2010-04-26 2023-06-14 Новартис Аг Улучшенная среда для культивирования клеток
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
RU2708919C2 (ru) * 2014-06-06 2019-12-12 Джензим Корпорейшн Способы перфузионного культивирования и их применения
US11060058B2 (en) 2014-06-06 2021-07-13 Genzyme Corporation Perfusion culturing methods and uses thereof
US12006510B2 (en) 2014-06-06 2024-06-11 Genzyme Corporation Perfusion culturing methods and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DE60028989T3 (de) 2017-01-19
US20030203448A1 (en) 2003-10-30
IL250619B (en) 2018-04-30
PL355233A1 (en) 2004-04-05
AT409379B (de) 2002-07-25
CN101173246A (zh) 2008-05-07
JP6348521B2 (ja) 2018-06-27
ES2265991T3 (es) 2007-03-01
DK1220893T3 (da) 2006-10-23
PL215234B1 (pl) 2013-11-29
US20170002392A1 (en) 2017-01-05
SK288059B6 (sk) 2013-03-01
EP1220893B2 (en) 2016-08-31
JP2013135691A (ja) 2013-07-11
US20150072415A1 (en) 2015-03-12
JP2011135880A (ja) 2011-07-14
JP5777653B2 (ja) 2015-09-09
AU780791B2 (en) 2005-04-14
IL148642A0 (en) 2002-09-12
JP2017212977A (ja) 2017-12-07
IL250619A0 (en) 2017-06-29
JP5441288B2 (ja) 2014-03-12
US20110287482A1 (en) 2011-11-24
HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
AU7908300A (en) 2001-04-30
US8021881B2 (en) 2011-09-20
US8722406B2 (en) 2014-05-13
PT1220893E (pt) 2006-10-31
DE60028989T2 (de) 2007-01-25
JP2019030306A (ja) 2019-02-28
ES2265991T5 (es) 2017-05-03
EP1220893B1 (en) 2006-06-21
CZ20021096A3 (cs) 2003-01-15
US9982286B2 (en) 2018-05-29
US20080182297A1 (en) 2008-07-31
IL219969A (en) 2017-06-29
RU2536244C2 (ru) 2014-12-20
DK1220893T4 (en) 2016-12-05
US9441203B2 (en) 2016-09-13
SI1220893T1 (sl) 2006-12-31
CA2385299A1 (en) 2001-04-05
EP1220893A1 (en) 2002-07-10
SK4002002A3 (en) 2002-07-02
IL148642A (en) 2012-08-30
CN1318577C (zh) 2007-05-30
DE60028989D1 (de) 2006-08-03
US20160369316A1 (en) 2016-12-22
CY1106135T1 (el) 2011-06-08
TR200200757T2 (tr) 2002-09-23
JP2003510070A (ja) 2003-03-18
CZ305307B6 (cs) 2015-07-29
RU2009131610A (ru) 2011-02-27
CN101173246B (zh) 2011-03-09
IL219969A0 (en) 2012-06-28
HU228210B1 (en) 2013-01-28
RU2005123274A (ru) 2007-01-27
ATE331025T2 (de) 2006-07-15
ATA165999A (de) 2001-12-15
RU2266325C2 (ru) 2005-12-20
WO2001023527A1 (en) 2001-04-05
JP2016127839A (ja) 2016-07-14
CN1391604A (zh) 2003-01-15
JP6467459B2 (ja) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2380412C2 (ru) Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде
US7094574B2 (en) Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20180719