CN1088984A - 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 - Google Patents
一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1088984A CN1088984A CN93114630A CN93114630A CN1088984A CN 1088984 A CN1088984 A CN 1088984A CN 93114630 A CN93114630 A CN 93114630A CN 93114630 A CN93114630 A CN 93114630A CN 1088984 A CN1088984 A CN 1088984A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- progenitor cell
- cfu
- free medium
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种适合于造血祖细胞克隆培养
的无血清培养基,经多种造血祖细胞的克隆测定证
明,该培养基支持细胞生长的效果与有血清培养无明
显差异,可用于各种造血祖细胞的生物学特点和生长
调控的研究。由于使用该培养基可排除血清的干扰,
可大大提高研究工作的准确性和重复性,在进行细胞
产物的分离纯化和抗原抗体特异性免疫反应的研究
时具有独特的优点。本发明适用范围广,可用于医
学、生物学等领域。该培养基可在国内外市场上销
售,能产生较大的经济效益和社会效益。
Description
本发明涉及一种用于正常和恶性造血祖细胞半固体克隆培养的无血清培养基,也可用于其液体悬浮培养。
造血干(祖)细胞的半固体克隆培养是研究正常和恶性造血干(祖)细胞增殖、分化和成熟及其调控的不可缺少的手段。自1961年Till和Mcculloch建立CFU-S以来,目前人类各系造血祖细胞的体外半固体培养体系均已建立,并对造血机理和调控的研究发挥了巨大作用,然而迄今为止,大多数报道均采用传统的有血清培养方法,血清的成分十分复杂,至今尚未完全弄清。血清中的未知物质和可变因素往往影响研究结果的准确性和重复性,特别是现代应用高纯度基因重组生长因子进行细胞体外调控研究时,更需要一个精确度较高的细胞培养体系。排除了血清干扰的无血清培养体系就可以达到这一要求。国外很早就已开始了动物和人类细胞无血清培养法的研究,1976年Ilayashi等报道了大鼠垂体GII3细胞的无血清培养,他们用激素、生长因子和其他一些基本营养物质代替血清,此后又发展了各种无血清培养基用于培养许多不同来源的细胞,但是均为液体悬沲培养。近年来,开始将无血清培养法用于培养条件要求较高的半固体培养,如BFV-e等,但用无血清培养法培养包括正常和恶性淋巴祖细胞的研究国内外尚未见报道。
本发明的目的是研制一种适用于正常和恶性造血祖细胞,其中包括恶性B淋巴祖细胞,如非霍奇金淋巴瘤B淋巴祖细胞(NHL B细胞)在内的半固体克隆培养和长期培养的无血清培养基,并用此培养基结合现代生物学方法(如重组生长因子和基因分析)重点研究NHL B细胞的生物学特点,为研究B细胞肿瘤的发病机理和调控提供了有效方法和理论依据。
本发明是这样来实现的。以急性白血病祖细胞(CFU-ALL和CFU-ANLL)、正常人T淋巴祖细胞(TL-CFU)正常人粒单祖细胞(GM-CFU)和正常人B淋巴祖细胞(BL-CFU)为代表,建立各自的有血清半固体克隆培养,然后筛选出较为理想的适合于这些祖细胞培养的无血清培养基配方,进一步用此培养基研究恶性B淋巴祖细胞NHL B细胞的半固体克隆培养和长期培养。
我们采用的无血清培养基是以Dulbecco′s modifiedEagle′smedium(DMEM)为基础补充以国产氨基酸、维生素、无机盐及抗菌素等11种成份,制成IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium),作为基础培养基,再添加血清替代物。通过造血祖细胞测定,对多种血清替代物进行了省略试验和剂量反应试验,最后确定血清替代物的配方和最佳浓度为牛血清白蛋白(BSA)10mg/ml、人转铁蛋白(Tf)1ug/ml、胰岛素(Ins)8ug/ml、胆固醇(Chol)20ug/ml和过氧化氢酶(Cata)20ug/ml,此为SFM-1。参考国外有关文献,又设计了2种无血清培养基:SFM-2(高浓度)和SFM-3(低浓度),将这3种无血清培养基与有血清培养基(SCM)和基础培养基IMDM进行了比较,结果发现,SFM-1对上述几种祖细胞均有生长支持作用,与SCM比较无显著性差异(CP<0.05)。为了探讨无血清培养基对培养细胞形态、表型和结构的影响,我们对每次实验均进行了培养前后细胞形态学和细胞表面标志的检查,并对1例ALL和1例ALL患者进行了培养前后细胞的染色体检查,结果表明在培养前后细胞的形态学、表型均无特殊改变,2例急性白血病患者,细胞培养前后亦具有相同的染色体异常。
我们用所研制的无血清培养体系进一步进行了NHL B细胞的半固体克隆培养和长期培养的研究,结果8例B细胞型NHL病人中有7例在无血清半固体培养中形成了集落,用T、B淋巴细胞单克隆抗体,经间接免疫碱性磷酸酶法检查单个集落,证实为B细胞集落。另用1例病人的脑脊髓液及骨髓细胞,建立了长达4个月以上的无血清长期培养。发现B细胞型NIIL病人,其细胞的膜结构和激活状态存在异质性,可通过体外培养结果将病人进行分类,有助于临床诊断和治疗预后的判断。比外证实了BCGF对NHL B细胞有刺激增殖的作用,为NHL病人的治疗提供了线索。
除用于研究NHL B细胞外,还可用此培养基进行其他造血组细胞的研究。
本发明的优点在于无血清培养正常和恶性造血祖细胞的成功,将为医学、生物学以及免疫学领域的学者们所利用,对推动这些领域内科学研究的发展将起一定的作用。使用本培养基能在排除血清干扰的情况下,比较精确地研究造血祖细胞的生物学特性和生长调控,用于细胞因子的分离、纯化和调控研究,以及抗原抗体特性异免疫反应的研究等具有独特的优点。对血液病发病机理,临床诊断和治疗的研究有很大的实用价值。推而广之,也可用于其他动物细胞培养,对农业畜牧业的发展有一定作用。我们也可将此无血清培养基在国内外市场上出售,以获得直接的经济效益。
以下是实施本发明方法的具体实施例。
例一
血清替代物的配制:
1、人转铁蛋白:将人转铁蛋白溶于IMDM(90mg/ml),每mg转铁蛋白加7.4×10-9mol/L Fe3+(以溶于0.1mmol/L盐酸中的Fecl3形式,使1/3Fe2+饱和)此为贮存液,经过滤除菌后-20℃保存。
2、牛血清白蛋白:称取BSA100g使之溶于182ml三蒸馏水(或去离子水)中,置4℃过夜,次日与10g树脂珠混合,置4℃2小时,每15分钟搅拌一次,去树脂珠,再与10g树脂珠混合,先后置4℃1小时及室温1小时,去树脂珠,测BSA的容量,每15mlBSA加1.1mlDulbecco′s磷酸缓冲盐水(-Mg2+-Ca2+)10倍浓缩液,再用Dulbecco′s磷酸缓冲液盐水工作液稀释为10%BSA(W/V)。过滤除菌,-20℃保存,使用前每20mlBSA加7%NaIIco30.5ml和1.9%L-谷酰胺1.2ml。
3、脂类物质的配制:胆固醇50mg加在50ml酸性培养基中,用超声波粉碎器(2cm直径的肽探头)在0℃以最大振幅荡1小时,使之完全分散,然后将悬液先后通过1.2um和0.45um的滤膜过滤酸性培养基为不加碳酸氢钠的IMDM,PH值为5.1。
4、胰岛素及过氧化氢酶的配制:胰岛素先用少量PBS溶解,缓缓滴加0.01mol/L HCL,使之完全溶解,再用IMDM将其稀释至所需浓度。过氧化氢酶用IMDM直接溶解,配成1mg/L浓度,将上述血清替代物加入基础培养基即成无血清培养基。
为了比较血清替代物的浓度,制备了含3种不同浓度血清替代物的无血清培养基(见表1)。
表1 无血清培养基
编号 BSA(mg/ml) Tf(ug/ml) INS(ug/ml) Chol(ug/ml) Ca+a(ug/ml)
SFW-1 10 1 8 20 20
SFW-2 10 1 80 80 80
SFW-3 0.4 1 100
有血清培养基(SCM)则以IMD和10%新生牛血清(NBCS)组成。
例二:
半固体培养体系为:0.8%甲基纤维素,10%无血清PIIA-LCM,无血清培养基(SFM-1,SFM-2或SFM-3)或有血清培养基(SCM)。细胞浓度为:正常人和急性淋巴细胞白血病(ALL)外周血单个核细胞为5×105/ml(TL-CFU为1×106/ml),正常人及急性非淋巴细胞白血病(ANLL)骨髓单个核细胞为2×105/ml。对TL-CFU,需加0.25%PHA-P,BL-CFU需加葡萄球菌A蛋白50ug/ml。对CFU-ALL和BL-CFU,培养细胞在培养前需和半乳糖氧化酶(GO)10u/2×107细胞/ml一起孵育30分钟。
例三:
克隆测定:
用TL-CFU和GM-CFU测定法对下述5种培养基进行了比较,见表2。
表2 五种培养基对TL-CFU和GM-CFU支持作用的比较
TL-CFU P CM-CFU P
培养基 值 值
实验 生长 集落数 实验 生长 集落数
例数 例数 (1×105) 例数 例数 (2×104)
SFM-1 6 6 222±164 >0.05 7 5 170±154 >0.05
SFM-2 5 4 17±18 <0.01 5 3 13±21 <0.01
SFM-3 5 5 131±124 >0.05 5 4 29±23 >0.01
IMDM 5 4 16⊥18 <0.01 5 3 12⊥15 <0.01
SCM 6 6 152±141 7 5 158±179
注:P值为各组与SCM比较的结果。
SFM-1对TL-CFU和GM-CFU,以及SFM-3对TL-CFU的生长支持作用与SCM无显著性差异(P>0.05),而SFM-2和IMDM对两者的作用均比SCM差(<0.01)。SFM-1和SCM比较并无显著性差异(P>0.05),见表3。
表3 半固体培养条件下SFM-1和SCM对几种造血祖细胞生长支持作用的比较
SFM-1 SCM P
克隆测定 细胞数 值
实验 生长 集落数 实验 生长 集落数
(1×104) 例数 例数 例数 例数
TL-CFU 10 6 6 222±164 6 6 152±141 >0.05
BL-CFU 5 10 6 23±41 10 8 52±41 >0.05
CFU-ALL 5 20 20 92±85 20 12 141±101 >0.05
CFU-ANLL 2 18 13 83±57 18 13 122±121 >0.05
CM-CFU 2 7 5 170±154 7 5 158±179 >0.05
Claims (3)
1、一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基,是以DMEM为基础,补充国产氨基酸、维生素、无机盐及抗菌素等成份,制成IMDM,作为基础培养基,再添加血清替代物,构成适合于各种造血祖细胞培养的无血清培养基。
2、根据权利要求1的无血清培养基,血清替代物的配方和最佳浓度为:牛血清的蛋白(BSA)10mg/ml、人转铁蛋白(Tf)1ug/ml、胰岛素(Ins)3ug/ml、胆固醇(Chol)20ug/ml和过氧化氢酶(Cata)20ug/ml。
3、根据权利要求1的无血清培养基,细胞是以急性白血病人祖细胞(CFV-ALL和CFU-ANLL)正常人T淋巴细胞(BL-CFU)、正常人粒单祖细胞(GM-CFU)和正常人B淋巴细胞(BL-CFU)为代表,建立适合于这些祖细胞培养的培养基。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN93114630A CN1088984A (zh) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN93114630A CN1088984A (zh) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1088984A true CN1088984A (zh) | 1994-07-06 |
Family
ID=4990582
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN93114630A Pending CN1088984A (zh) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1088984A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1087778C (zh) * | 1999-03-02 | 2002-07-17 | 华东理工大学 | 杂交瘤细胞无血清培养基 |
CN1318577C (zh) * | 1999-09-28 | 2007-05-30 | 巴克斯特股份公司 | 用于无蛋白无血清培养细胞的培养基 |
CN1756837B (zh) * | 2003-03-03 | 2010-05-26 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 无动物细胞培养方法 |
CN106520668A (zh) * | 2016-12-31 | 2017-03-22 | 山东金周生物科技有限公司 | 一种蛋白无血清培养基及其制备方法 |
CN106795491A (zh) * | 2015-06-17 | 2017-05-31 | 深圳市达科为生物工程有限公司 | 一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法 |
-
1993
- 1993-11-11 CN CN93114630A patent/CN1088984A/zh active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1087778C (zh) * | 1999-03-02 | 2002-07-17 | 华东理工大学 | 杂交瘤细胞无血清培养基 |
CN1318577C (zh) * | 1999-09-28 | 2007-05-30 | 巴克斯特股份公司 | 用于无蛋白无血清培养细胞的培养基 |
CN1756837B (zh) * | 2003-03-03 | 2010-05-26 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 无动物细胞培养方法 |
CN106795491A (zh) * | 2015-06-17 | 2017-05-31 | 深圳市达科为生物工程有限公司 | 一种用于淋巴细胞培养的血清替代物及制备方法 |
CN106520668A (zh) * | 2016-12-31 | 2017-03-22 | 山东金周生物科技有限公司 | 一种蛋白无血清培养基及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rupp et al. | Specific bioactivities of monocyte-derived interleukin 1 alpha and interleukin 1 beta are similar to each other on cultured murine thymocytes and on cultured human connective tissue cells. | |
Ristow | A major factor contributing to epidermal proliferation in inflammatory skin diseases appears to be interleukin 1 or a related protein. | |
Ryser | A membrane effect of basic polymers dependent on molecular size | |
Terranova et al. | A biochemical approach to periodontal regeneration: Tetracycline treatment of dentin promotes fibroblast adhesion and growth | |
Golde et al. | Thyroid hormones stimulate erythropoiesis in vitro | |
FI91037B (fi) | Bioliimat solujen ja kudosten kiinnittämiseen | |
Tzeng et al. | Platelet-derived growth factor promotes human peripheral monocyte activation | |
US5441734A (en) | Metal-interferon-alpha crystals | |
Woloski et al. | Identification and partial characterization of hepatocyte-stimulating factor from leukemia cell lines: comparison with interleukin 1. | |
Perez-Polo et al. | Steroid induction of nerve growth factor synthesis in cell culture | |
AU590543B2 (en) | Purification of native colony stimulating factor-1 | |
CN101838326A (zh) | Cathelicidin ll-37及其衍生物在伤口愈合中的用途 | |
ABRASS et al. | Insulin and insulin-like growth factor I binding to cultured rat glomerular mesangial cells | |
EP0131789A2 (en) | Composition comprising purified human tumour necrosis factor in conjunction with human interferon and its use | |
US5792450A (en) | Purified human CSF-1 | |
Villee et al. | Effect of glucose and insulin on collagen secretion by human skin fibroblasts in vitro | |
Kraiem et al. | Iodide uptake and organification, tri-iodothyronine secretion, cyclic AMP accumulation and cell proliferation in an optimized system of human thyroid follicles cultured in collagen gel suspended in serum-free medium | |
CN110606871B (zh) | 一种小分子多肽rk12及其应用 | |
Barth et al. | An antibody deficiency syndrome: Selective immunoglobulin deficiency with reduced synthesis of γ and α immunoglobulin polypeptide chains | |
Foley et al. | Nutritional requirements of human leukemic cells: Cystine requirements of diploid cell lines and their heteroploid variants | |
CN1088984A (zh) | 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基 | |
Gilhar et al. | Antiproliferative effect of pentoxifylline on psoriatic and normal epidermis. In vitro and in vivo studies. | |
Constantopoulos et al. | Phagocytic activity of the leukemic cell and its response to the phagocytosis-stimulating tetrapeptide, tuftsin | |
Kikkawa et al. | Lipopolysaccharide (LPS) Stimulates the Production of Tumor Necrosis Factor (TNF)‐α and Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) by Osteoclasts (OCL) in Murine Bone Marrow Cell Culture | |
Hollenberg | Action of insulin analogues on cultured human fibroblasts reflects biological potency |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |