FI91037B - Bioliimat solujen ja kudosten kiinnittämiseen - Google Patents

Description

91037

Bioliimat solujen ja kudosten kiinnittämiseen Biolim för limning av celler och vävnader Tämän keksinnön kohteena on bioliimaavien polyfenoliprote-iinien käyttö lisäämään solujen, kudosten ja muiden biologisesti aktiivisten osasten kiinnittymistä erilaisiin substraatteihin. Tässä yhteydessä "bioliima" viittaa liimaan, joka sopii yhteen elävien kudosten, solujen ja muiden biologisesti aktiivisten osasten metabolian, kasvun tai toiminnan kanssa in vitro. Bioliimaavat polyfenolipro-teiinit perustuvat sarjaan toistuvia dekapeptidejä, joilla on kaava MB, NHa | OH OH | CH2 | | ch2 f* (Oi (o; r= CH, OH OH N/ CH2

I X I I * x I I I

CH, CH, X CH-R CH, /N X X CH-R CH, CH,

I I \ / I | \ / \ / | I I

nh,-ch-c-nh-ch-c-h-ch-c-hh-ch-c-hh-ch-c-m-ch-c-h-ch-c-nh-ch-c-mh-ch-c-mh-ch-cooh

Il II II II II II II II II

ooooooooo

MA LTS PRO/HTP SKR/THR TTR/DOPA FSO/HTP PRO/HTP 3KR/TBR TTR/DOPA LYS

/ kuten on kuvattu US-patentissa 4,585,585, jonka nimi on "Decapeptides Produced From Bioadhesive Polyphenolic Proteins”. Toistuvista dekapeptideistä muodostuvat bioliimat ovat ihanteellisia, koska niiden on nyt havaittu tekevän solut ja muut biologisesti aktiiviset osaset, kuten proteiinit, DNA:n, hormoonit ja antibioottit kykeneviksi 2 kiinnittymään käytännöllisesti katsoen mihin tahansa substraattiin. In vitro-sovellutuksiin kuuluvat tutkimus-diagnostiikka, solutuotteiden talteenotto ja solumetaboli-an tutkimus.

Lääketieteellisen ja biokemiallisen tutkimuksen eräs tärkeimmistä keinoista on solujen talteenotto kudoksesta niiden in vitro-ylläpitömistä ja kasvattamista varten kudosvi1jelmän avulla. Kudosviljely on tekniikka tai menetelmä, jolla organismeista (kasvi tai eläin) saatuja kudoksia tai soluja kasvatetaan ja/tai tuetaan niiden metaboliaa formuloidussa ravitsevassa ympäristössä. Kun solut on eristetty hajottamalla kudos varovasti, niitä inkuboidaan ravintoalustoissa, jotka kykenevät ylläpitämään elintoimintoja. Muutamia poikkeuksia lukuunottamatta solujen on kiinnityttävä substraattiin, jotta ne voisivat suorittaa normaalit metaboliatoiminnat, kasvaa ja jakaantua. Substraatti, joka toimii solukasvun matriisina, muodostuu kudoksessa kollageenista, laminiinista ja fib-ronektiinistä. In vitro tämä substraatti on useimmiten muovia, vaikkakin joskus substituentteina käytetään lasia ja mikrohuokoisia seiluloosasuodattimia. Kudosvi1jelmällä tuotettujen solujen käyttötavoista ovat esimerkkejä: (1) tutkimukset, joiden kohteena on solut metabolia, parasiittien (so. virukset, bakteerit jne.) metabolia solussa, erilaisten solutyyppien (so. epiteliasolut, fibroplastit, immuno-komponentit solut, tymosyytit, verihiutaleet jne.) vuorovaikutus-metabolia, eksogeenisten tekijöiden vaikutus soiumetaboliaan, solujen geneettinen koostumus (in vitro-diaqnostiikka): (2) spesifisten yhdisteiden, so. geenien, proteiinien tai muiden solukomponent-tien tuotte; ja (3) solujen uudelleensiirrostaminen, kuten ihosiirrosteet, sarveiskalvosiirrosteet, aivosiirrosteet, vesisuonisiirrosteet, ja hedelmöittäminen in vitro.

li 91037 3

Viime vuosina kollageenia, laminiinia ja fibronektiiniä on uutettu ja puhdistettu eläinkudoksista ja markkinoitu solu- ja kudosvi1jelmiä käyttäville tutkijoille soluejn kiinnityspromoottoreina. Tällaisiin tarkoituksiin on myös myyty synteettistä poly-D-lysiiniä ja poly-L-lysiiniä. Pääasiallinen syy tähän on, että substraatit, kuten muovi ja lasi ovat in vitro biologisesti inerttejä, ja usein niillä ei saada solujen tai kudoksen kiinnittymiseen riittävää liimautumista substraattiin. Yksittäisiin esimerkkeihin, jotka havainnollistavat huonoa kiinnittymiste-hoa, kuuluvat primääriset solueristeet, solut, jotka on siirrostettu alhaisissa tiheyksissä, ja solut, jotka on siirrostettu virtaukseltaan jatkuvissa järjestelmissä, kuten bioreaktoreissa tai onttoputki-kasvatussysteemeissä. Lisäksi eräät substraatit, kuten eräät mikrohuokoiset suodattimen tai Teflen(R) materiaalit, joita käytetään ve-risuonisiirrosteisiin, eivät salli lainkaan solujen kiinnittymistä alhaisesta pintaenergiasta johtuen.

Vaikkain kiinnittymispromoottorit ovat merkittävästi auttaneet kiinnittymisongelmia, eräät riittämättömät seikat ovat yhtä huomionarvoisia. Ensiksikin niiden vaikutustapa perustuu siihen, että vaikkakin nämä tekjjät ovat fysiologisia, ne eivät ole todella liimaavia; ne toimivat vain solujen fysikaalisena tukena ja ansana. Toiseksi niitä_ei voi helposti käyttää monilla erilaisilla substraateilla, jotka ovat erilaisia kuin tavanomaisesti käytetään ^oluen viljelyssä (esimerkiksi polystyreeni, nit-roseliuloosa), eikä niitä voida käyttää yhtä tehokkaasti kaikilla solutyypeillä. Kolmanneksi useimmilla näistä tekijöistä on rekonstrituoituna noin 4 viikon pituinen säilymisaika -20°C:ssa. Neljänneksi nämä tekijät on uutettava biologisista lähteistä poly-D- ja poly-L-lysiiniä lukuunottamatta; niitä ei voi syntetisoida kaupallisesti hyväksyttävillä kustannuksilla. Viidenneksi eräillä solu- 4 jen kiinnittymispromoottorei11 a on havaittavissa mahdollinen terveysvaara, mukaan lukien esimerkiksi fibronektiinin uuttaminen ihmisverestä.

Nämä ongelmat vältetään käyttämällä bioliimaavia poly-fenoliproteiineja. Ne kiinnittyvät hyvin moniin erilaisiin substraatteihin veden läsnäollessa eivätkä ne petä jatkuvasti kosteassa ympäristössä. Koska bioliimaava poly-fenoliproteiini on todellinen liima, se kiinnittyy nopeasti sekä substraatteihin että erilaisiin soluihin, kudoksiin ja muihin biologisesti aktiivisiin osasiin. Sitä voidaan säilyttää 4°C:ssa vähintään 10 kuukautta ja huoneen lämpötilassa vähintään 1 kuukausi sen hajoamatta tai sen toimintakyvyn heikkenemättä. Lisäksi se voidaan syntetisoida kiinteätaasisen peptidisynteesin avulla tai käyttämällä geenimanipulaatiota, mikä mahdollistaa suurten määrien paremman standardisoinnin.

Herisimpukasta saatujen bioliimaavien polyfenoliproteii-nien toistuva dekapeptidirakenne on kuvattu US-patentissa 4,585,585, "Decapaptides Produced from Bioadhesive Polyphenolic Proteins". Bioliimaavien polyfenoliproteii-nien formulaatiot ja bioliimaavien polyfenoliproteiinien valmistusmenetelmät ovat kohteena vireillä oleville pa-tenttihäkemuksillemme. Alalla tunnetaan menetelmilä, joilla valmistetaan bioliimaavia polyfenoliproteiineja (Waite & Tanzer, 1981, Science 212, 1038).

Esillä olevan keksinnön eräänä tavoitteena on siten tuoda esiin kiinnittymistekijöinä hyödylliset valmisteet, joilla edistetään tai lisätään solujen kiinnittymistehok-kuutta, kiinnittymisnopeutta ja/tai -voimakkuutta, kasvua ja spesialisoitunutta funktiota kudosviljelmän

II

91037 5 tai ei-kudosviljelmämateriaalien ja substraatien, mukaanlukien muovin, lasin, metallien, mikrohuokositen suodattimien (selluloosa-, nailon-, lasikuitu-, polyesteri-, polykarbonaatti-, polyetyleenitereftalaatti ja muut synteettiset ja ei-synteettiset materiaalit, mukaanlukien muut synteettiset polymeerimateriaalit ja -tuotteet, jotka saadaan modifioimalla edellä mainittuja synteettisiä polymeerimateriaaleja (ja synteettisten tai alloplastisten materiaalien suhteen, joita voidaan käyttää kudosten tai keinoelinten siirrostamistoimenpi-teissä (esimerkiksi mekaanisen sydämen materiaalit ja polytetrafluorietyleeni ja lähisukuiset verisuonten siirrostusmateriaalit).

Esillä olevan keksinnön toisena tavoitteena on tuoda esiin valmisteet, jotka ovat hyödyllisiä kiinnitysfakto-reina edistettäessä tai lisättäessä muiden biologisesti aktiivisten osasten, kuten proteiinien, DMA:n, hormoonien ja antibioottien kiinnittymistehokkuutta, kiinnittymisno-peutta ja/tai voimakkuutta erilaisiin substraatteihin, joista eräitä on edellä mainittu.

Esillä olevan keksinnön kolmantena tavoitteena on tuoda esiin substraattien valmistaminen tai kerrostaminen bioliimaavilla polyfenoliproteiineilla, ja menetelmät, joilla tutkitaan tällaisten kerrosten tehokkuus edellä mainittujen parametrien suhteen.

Tämän keksinnön edellä mainitut tavoitteet ja muut tavoitteet, edut ja ominaispiirteet sadaan aikaan esillä olevan keksinnön avulla. Keksintö tuo esiin menetelmän, jolla kiinnitetään eläviä soluja, kudoksia ja muita biologisesti aktiivisia osasia, kuten proteiineja, DNA:ta, hormooneja ja antibiootteja substraattiin.

Menetelmälle on tunnusomaista, että » 6 (1) päällystetään substraatti steriilillä formulaatiolla, joka sisältää noin 35 - 100 paino-% puhdasta liimaavaa bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikkö: nh2 nh2 | OB OH | ch2 I | ch2 T2 (Oi (öj Γ CH2 OH OH \/ CH,

I 1 I I 1 1 I I I

CH, CH, X CH-R CH, X /^X CH-R CH, CH, I IW I t \ / \ / i I2 I2 —HNH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-ni

Il II II II II II II II II II

OOOOOOOOOO AU LYS PRO/HYP SER/THR TYR/DOPA PRO/RTP PRO/HTP SER/THR TYR/DOPA LYS

jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100, ja jolloin kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan päällyste substraatille; (3) kiinnitetään päällyste substraatille; (4) huuhdellaan päällystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymättömien ylimääräisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan eläviä soluja, kudoksia tai muita biologisesti aktiivisia osasia päällystetyille substraateille, jolloin mainitut osaset kiinnittyvät päällystettyyn substraattiin. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kon-sentraatioita ja formulaatioita voidaan muuttaa riippuen substraatin tyypistä tai kulloinkin käytetyn il 7 91037 solun, kudoksen tai biologisesti aktiivisen osasen kiinnittymisvaatimuksista. Eläviä soluja kiinnitettäessä ympäristön on oltava ravitseva, jotta solut voisivat suorittaa normaalit solun metaboliatoimintansa.

Esillä olevaa keksintöä on helpompi ymmärtää seuraavien piirustusten avulla, jotka kuvaavat yksityiskohtaisesti erästä esillä olevan keksinnön tyypillistä suoritusmuotoa.

Piirustuksissa:

Kuvio 1 esittää graafisesti esimerkissä 1 saatuja arvoja; siinä on annettu solujen arvioitu kiinnittymis-prosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 2 esittää graafisesti esimerkissä 2 saatuja arvoja; siinä on annettu solujen kiinnittymisprosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 3 esittää graafisesti esimerkissä 3 saatuja arvoja; siinä on annettu solujen arvioitu kiinnittymisprosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 4 esittää graafisesti esimerkissä 4 saatuja arvoja; siinä on annettu pylväsesityksinä sekä pesäkkeiden f j lukumäärä maljaa kohti että solujen keskimääräinen lukumäärä pesäkettä kohti kullekin arvioidulle tekijälle.

8

Kuvio 5 on valokuva kolmesta polytetrafluorietyleeni (PTFE)-näytteestä kristallivioletilla värjäämisen jälkeen: Näyte 1 (näyte vasemmalla) on formulaa-tiolla 2 päällystetty PTFE. Näyte 2 (näyte keskellä) on PTFE, joka on siirrostettu soluilla mutta ei päällystetty formulaatiolla 2; näyte 3 (näyte oikealla) on PTFE, joka on päällystetty formulaatiolla 2 ja siirrostettu soluilla.

Eukaryoottisolujen kasvu ja normaali metabolia vaatii kiinnittymistä substraattiin niin, että solukerros ulottuu oleellisesti pinta pintaa vasten substraalilla. Soluviljelmässä käytetään tavallisesti muovisubstraatteja ja pienemmässä määrin lasia ja mikrohuokoisia suodattimia solujen kiinnittymistä ja kasvattamista varten. Äskettäin näihin tarkoituksiin on käytetty muovin asemesta fysiologisia substraatteja (kollageeni, laminiini, fibronektiini, poly-D- ja poly-L-ly^iini), jotta vältettäisiin ongelmat, jotka liittyvät solujen viljelyyn alhaisilla siirrostus-viljelyksillä, juuri eristettyjen solujen käyttämiseen tai substraattien käyttämiseen, jotka sopivat huonosti (D) kiinnittymiseen (esimerkiksi Teflon ). Bioliimaavat polyfenoliproteiinit muodostavat sopivan vaihtoehdon, koska niillä on suuri sitoutumistaipumus sekä solujen että erilaisten substraattien, sekä biologisten että inerttien, suhteen.

Bioliimaavien polyfenoliproteiiniformulaatioiden tehokkuus sitoa soluja on arvioitu in vitro soluviljelmää silmälläpitäen. Testatut formulaatiot sisälsivät (1) 95-prosentti-sesti puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, joka oli valmistettu luonnonlähteistä ("formulaatio 1"), ja (2) 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa polyfe-noliproteiinia, joka oli valmistettu luonnonlähteistä ("formulaatio 2").

Il 91037 9

Sen jälkeen kun bioliimaavat polyfenoliproteiinit valmistettiin US-patentissa 4,585,585 kuvatuilla menetelmillä, nämä formulaatiot karakterisoitiin biokemiallisesti perinpohjaisesti käyttämällä suuren suorituskyvyn neste-kromatografiaa, L-dopan määrän määritysmenetelmiä, amino-happoanalyysiä ja polyakryyliamidigeelielektroforeesia.

Taulukossa 1 on annettu tärkeimpien aminohappojen koostumus bioliimaavissa polyfenoliproteiiniformulaatioissa: TAULUKKO 1

Bioliimaavien polyfenoliproteiinien aminohappokoostumus ryhminä 1000 ryhmää kohti (1) (2) 95% biolii- 45% biolii- maava polyfe- maava polyfe- noliproteiini noliproteiini 3- hydroksiproliini 27 4,3 4- hydroksiproliini 88 33,4 proliini 79 72,5 glysiini 51 138,3 1/2 kystiini 9 7,7 L-3,4-dihydroksifenyyli- alaniini 96,5 42,3 tyrosiini 54 39,3 lysiini 175 103,9

Kollageeni muodostaa formulaatiossa 2 jäljelle jääneestä 55 %:sta. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin perusyksikkö on dekapeptidi (10 aminohapon ketju), joka toistuu kovalenttisidosten kautta samanlaisiksi dekapeptideiksi jopa 75 - 85 kertaa. Nämä uutettuun bioliimaavaan poly-fenoliproteiiniin perustuvat formulaatiot ovat kiinnitty-vyydestä arvioituna stabiileja 4°C:ssa 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa, pH 2,8 yli 10 kuukautta. Uutetut preparaatit, jotka sisältävät 40 - 50 % kollageenia, ovat stabiileja huoneen lämpötilassa 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa» pH

10 2,8, tai muovisubstraateille kuivaamisen jälkeen vähintään 2 kuukautta.

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kyky kiinnittyä voimakkaasti erilaisiin substraatteihin mahdollistaa solujen kiinnittämisen, ylläpidon ja kasvun pinnoilla, jotka tätä aikaisemmin ovat aiheuttaneet ongelmia joko koostumuksensa, käyttönsä tai kiinnitystä vaativan solun tyypin vuoksi. Substraatteja, joita on mahdollista käyttää, ovat muovi, lasi ja mikrohuokoiset suodattimet (esimerkiksi selluloosa-aineet, nailon, lasikuitu, polyesteri, polykar-bonaatti) tavanomaisessa soluviljelytutkimuksessa ja/tai solutuotteen talteenotossa bioreaktoreista, joita käytetään panosviljelmänä, tai geenimanipuloinnissa; solutuotteiden talteenottoon tarkoitetut ontelokuituputket; ja prosteet-tiset verisuonisiirrostemateriaalit, kuten polytetrafluori-

Qp \ etyleeni (Teflon ) ja lähisukuiset aineet. Useimmissa näissä pinnoissa on negatiivinen nettovaraus ja sen vuoksi niillä on taipumus sitoa tiiviisti positiivisesti nettovarautuneita materiaaleja, kuten bioliimaavia poly-fenoliproteiineja. Soluilla on negatiivinen nettovaraus ja tämän seurauksena ne hylkiintyvät lievästi käsittelemättömiltä pinnoilta ja sen sijaan kiinnittyvät biolii-maavaan polyfenoliproteiini-välivaiheeseen, jolla on positiivinen nettovaraus. Bioliimaava polyfenoliproteiini lisää kiinnittymistehokkuutta, kiinnittymisnopeutta ja kiinnittymisen voimakkuutta. Tämä jälkimmäinen parametri on kriittinen sovellutuksissa, joissa on kyse solutuotteen talteenottomenetelmistä tai solujen uudelleensiirrosta-misesta verisuonisiirrosteisiin, joihin liittyy nesteiden kulku solujen monokerrosten yli. Lisäksi solut, jotka kiinnittyvät huonosti kudoksesta eristämisen jälkeen tai solutyypistä johtuen, ja solut, jotka eivät normaalisti kiinnity, kuten verisolut ja suspensiokudosviljelmä-solut (histiosyyttilymfomat, verihiutaleet, valkoiset ja punaiset verisolut jne.) saattaisivat myös kiinnittyä il 91037 11 substraateihin- tämän välivaiheen kautta.

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kyky kiinnittyä voimakkaasti erilaisiin substraatteihin mahdollistaa lisäksi monien muiden biologisesti aktiivisten osasten, kuten DNA:n, proteiinien, hormoonien ja antibioottien kiinnittämisen.

Substraattien päällystämienn bioliimaavilla polyfenolipro- teiiniformulaatioilla ja kiinnittäminen substraatteihin suoritetaan yleisesti seuraavasti. Riippuen halutustas 2 2 loppukonsentraatiosta cm kohti substraatin cm :lie levitetään tasaisesti noin 1-2 mikrolitraa steriiliä bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jonka väkevyys on 10 - 60 ug mikrolitrassa. Saatu kalvo kuivataan nopeasti laittamalla substraatti laminaarivirtauskaapin sisälle. Kalvon kuivuttua se käsitellään huuhtelemista ja kiinnittämistä varten 35-100-prosenttisella etanolilla tai isopropanolilla ja sen jälkeen jäljelle jäänyt alkoholi ja adsorboitumattomat ylimääräiset osat positetaan käsittelemällä steriilillä kudosviljelmäalustalla.

Substraatti voidaan käyttää välittömästi tai se voidaan kuivata säilyttämistä varten. Kalvoon kiinnittyneet solut tai muut biologisesti aktiiviset osaset säädetään haluttuihin konsentraatioihin ja lisätään substraattiin seerumia sisältämättömässä tai seerumia sisältävässä alusta/ssa. Kun kysymys on solujen kiinnittämisestä, eri tavoin ajoitettujen jaksojen jälkeen soluista arvioidaan niiden kiinnittymine, kasvu tai toiminta tai solut käsitellään kokeiden, joissa solut on kiinnitettävä kudosviljelmään, määräämien tavoitteiden mukaisesti.

12

Haluttaessa voidaan toimia päinvastoin. Bioliimaava polyfenoliproteiini voidaan kiinnittää biologisesti aktiivisiin osasiin ja sen jälkeen saadut biologisesti aktiiviset osaset voidaan kiinnittää substraattiin. Tarkemmin sanottuna tämä menetelmä käsittää vaiheet, joissa: (1) dispergoidaan biologisesti aktiiviset osaset seerumittomaan liuokseen; (2) sekoitetaan steriiliä formulaatiota, joka sisältää polyfenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino_% bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikkö: NH2 HH,

I OH OH I

I I CHj Γ2 (Oi (OJ T2 1 * 1 1 x * 1 T 1 CH, CH, X CH-R CH, X X CH-R CH, CH,

I I W I I \ / \ / I I I

—f-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-OT-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C'+K

Il II II II II II II II II II 0000000000

ALA LTS FRO/HTP SER/THR TTR/DOPA PRO/EYP PRO/HTP SBR/THR TTR/DOPA L7S

jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; biologisesti aktiivisten osasten mainitun dispersion kanssa ja näin kiinnitetään bioliimaava polyfenoliproteiini biologisesti aktiivisiin osasiin; (3) otetaan talteen saadut biologisesti aktiiviset osaset; ja 91037 13 (4) kiinnitetään talteenotetut biologisesti aktiiviset osaset substraattiin.

ESIMERKKI 1

Solujen sitoutumistehokkuuden määrittäminen

Formulaatiot, jotka sisälsivät joko 95 % bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formulaatio 1) tai 45 % bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formulaatio 2), kerrostettiin tasaisesti 35 mm muovisille petrimaljoille, joilla oli 2 kudosviljelmää (9 cm ), annostuksella 50pg maljaa kohti 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa, kuivattiin nopeasti, "kiinnitettiin" ja steriloitiin huuhtelemalla 100-prosenttisella etanolilla. Sen jälkeen maljat huuhdeltiin steriilillä, kolme kertaa tislatulla vedellä.

Solut valmistettiin kiinnittymismääritystä varten seuraa-vallä tavalla. Naudan sarveiskalvoendoteelisolut käsiteltiin trypsiinillä, so. proteaasilla, joka pilkkoo solun kiinnitysproteiinit, minkä jälkeen kasvatettiin alaviljel-mänä 5 % CO^ ilmassa -37°C:ssa kostutetussa inkubaattorissa. Ylimääräinen seerumi ja alusta, jotka mahdollisesti häiritsevät trypsiinikäsittelyä, poistettiin huuhtelemalla solujen monokerrokset seerumia sisältämättömällä alustalla ja inkixboitiin 10 minuuttia 0,05 % trypsiini - 0,02 % etyleenidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA). Trypsiinin vaikutuksesta irronneet solut siirrettiin pipetillä ja sentrifugoitiin varovasti 250 x g voimalla. Saadut pelletit suspendoitiin uudelleen seerumia sisältämättömään minimialustaan (Earle'n suolat) mahdollisesti jäljelle jääneiden seerumiproteiinien ja trypsiinin poistamiseksi solupinnoilta ja jälleen sentrifugoitiin.

14

Elävien solujen määrät saatiin käyttämällä värieksluusio-testiä, jossa tyypilliset solumäärät suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 2 x 10^ solua mlrssa minimialus-taa, jossa oli 15 % naudansikiöseerumia. Solut siirros-tettiin käsittelemättömiin muovisiin kudosviljelmille tarkoitettuihin petrimaljoihin (kontrolli) ja kudosviljel-mämaljoihin, jotka oli kerrostettu bioliimaavalla poly-fenoliproteiinilla. Hetkillä 1, 2,5, 5, 12,5 ja noin 20 minuuttia valittiin sattumanvaraisesti koe- ja kontrol-limaljat kolminkertaisina kiinnittymättömien solujen määrän määrittämiseen. Kiinnittymättömät solut poistettiin maljoilta huuhtelemalla ja niiden määrä laskettiin punasolujen laskentamittarilla; kolminkertaisina laskettiin myös replikaattimäärät soluista, joita oli käytetty, mutta joita ei oltu lisätty maljoille. Tulokset laskettiin kiinnittyneiden solujen prosenttimääränä vähentämällä kultakin maljalta saatujen kiinnittymättömien solujen lukumäärä maljattujen solujen kokonaismäärästä.

Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty vertailutiedot, jotka ilmoittavat solujen kiinnittymisprosentin biolii-maaviin formulaatioihin. Nämä tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 1.

91037 15 TAULUKKO 2

Kiinnittymisvertailu muoviin ja formulaatioihin 1 ja 2

Aika (min.) Muuttuja Arvioitu kiinnittymis-% 5.0 Muovi 25

Formulaatio 1 62

Formulaatio 2 70 12,5 Muovi 76

Formulaatio 1 85

Formulaatio 2 87 20.0 Muovi 89

Formulaatio 1 97

Formulaatio 2 97

Solujen kiinnittymisen formulaatiossa 2, so. suurempi kollageenipitoisuus) havaitaan olevan jo 5 minuutin kuluessa yli 2 kertaa suuremman kuin solujen kiinnittymisen muoviin. Lisäksi solujen sitoutumiskapasiteetti bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin on kaikkina ajankohtina suurempi kuin solujen sitoutumiskapasiteetti muoviin. Vaikkakin tulokset ovat samankaltaiset formu-laatiolla 1, muut arvot viittaavat siihen, että formulaatio 2 on parempi solujen kiinnittämiskeinona ja kudosviljely-tapanal

Formulaatio 2 on hyvin stabiili pitkäaikaisessa säilytyksessä. Aminohappoanalyysin avulla testattaessa formulaa-tiolla 2 pysyivät L-dopa/proteiini-suhteet stabiileina 4 kuukautta 4°C:ssa ja -20°C:ssa; kun taas formulaatiolla 1 havaittiin jopa 25 % lasku samanlaisissa olosuhteissa (taulukko 3).

16 TAULUKKO 3

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin prosenttimäärä, joka oli jäljellä annetulla hetkellä säilytettäessä 4°C:ssa ja -20°C:ssa (määritetty amino-happoanalyysin avulla)

Formulaatio 1 Formulaatio 2 3 kuukautta 4 kuukautta 3 kuukautta 4 kuukautta 4° 97 % 76 % 100 % 98 % -20° 97 % 82 % 104 % 100 %

Koska komponenttien stabiilisuus biokemiallisella tasolla on erittäin toivottavaa kudosviljelmäsystgeemeissä, formulaation 2 pääteltiin olevan parempi, kun tarkoituksena on lisätä solujen kiinnittymistehokkuutta.

ESIMERKKI 2

Seerumin vaikutus solujen sitoutumis-voimakkuuteen ja tehokkuuteen

Kokeen tai määrityksen tavoitteista riippuen voidaan i tarvita enemmän tai vähemmän seerumia solujen kiinnittämisen aikana tai sen jälkeen. Seerumin vaikutus solujen sitoutumiseen ja sitoutumisvoimakkuuteen testattiin käyttämällä soluja alustassa, joka sisälsi 15 % naudanseerumia (FBS) tai 0,5 % naudanseerumialbumiinia (BSA). Naudanseerumi on pääasiallinen FBS:ssä löydetty proteiinikomponentti. Kiinnittymisen voimakkuus arvioitiin epäsuorasti kyvystä tai kyvyttömyydestä poistaa kiinnittyneet solut trypsii-nin avulla substraateista, joihin ne oli kiinnitetty. Naudanseerumialbumiinin käytetty konsentraatio vastasi konsentraatiossa, joka on 0,5-1-prosenttisessa FBSrssä. Kudosviljelyyn tarkoitetut petrimaljat päällystettiin bioliimaavan polyfenoliproteiinin formulaatiolla 2 esi- 17 91037 merkin 1 mukaisella tavalla. Solut siirrostettiin tripli-kaatteina muovisille ja liimalla päällystetyille petri-maljoille ja kiinnittymättömät solut poistettiin huuh-telemalla hetkillä 2,5, 5 ja 15 minuuttia. Kiinnittymättömät solut trypsiinikäsiteltiin käyttämällä 10 minuuttia 0,8 ml 0,05% trypsiini-0,02% EDTA ja siirrettiin koeputkiin, jotka sisälsivät 0,2 % naudanseerumia, millä estettiin trypsiinin vaikuttaminen edelleen soluihin.

Talteenotetut kiinnittyneet ja kiinnittymättömät solut laskettiin käyttämällä punasolujen laskentamittaria. Kiinnittyneiden solujen määrää koskevat arvot laskettiin prosentteina kultakin maljalta saatujen solujen kokonaismäärästä. Nämä arvot on koottu taulukkoon 4.

TAULUKKO 4

Seerumin vaikutus solujen talteenottoon muovista ja bioliimaavasta polyfenoliproteiinista

Aika Kiinnitty- Solujen tai- Arvioitu kiin- (min.) Muuttuja mis-% teensaamis-% nittymis-% 2,5 FBS-muovi 2 100 2 FBS-bioliima 2 85 2 BSA-muovi 6 79 26 BSA-bioliima 31 105 28 5.0 FBS-muovi 5 82 22 FBS-bioliima 49 99 50 . BSA-muovi 31 51 65 1 BSA-bioliima 28 60 56 15.0 FBS-muovi 65 83 71 FBS-bioliima 74 74 81 BSA-muovi 40 33 77 BSA-bioliima 62 39 85

Taulukon 4 arvoista voidaan havaita, että solut kiinnittyvät varhaisina ajankohtina voimakkaammin bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin kuin muoviin. Lisäksi voidaan havaita, että jos FBS alustassa korvataan naudanseerumi- 18 albumiinilla, trypsinisointikäsittelyllä saadaan soluja vähemmän talteen. Tämä havaitaan erityisesti ajankohtina, joina solut vakiinnuttavat lujan ankkuroitumisen (5 minuuttia) ja alkavat litistyä (15 minuuttia). Hetkellä 15 minuuttia talteenotto oli niinkin alhainen kuin 33 % ja 39 % naudanseerumialbumiinia muovilla ja liimalla päällystetyissä petrimaljoissa verrattuna 83 ja 74 % talteensaantiin käytettäessä vastaavasti naudaanseerumia muovi- ja liimaviljelmissä. Maljojen visuaalinen tutkiminen mikroskoopilla vahvisti nämä havainnot. Tämän tutkimuksen muut havainnot osoittavat, että tässä esimerkissä kuvattu solujen kiinnittymisen suora arviointi korreloi voimakkaasti epäsuoramittauksen kanssa, jossa lasketaan vain kiinnittymättömät solut (kts. esimerkki 1 laskemisen yksityiskohtien suhteen). Kuvio 2 havainnollistaa näitä löytöjä graafisesti.

ESIMERKKI 3

Kiinnittymättömien solujen kiinnittäminen bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin Pääosa solutyypeistä, jotka on otettu talteen kudoksesta irtoamisen jälkeen, kykenevät soluviljelmään vietynä kiinnittymään vaihtelevilla tehokkuuksilla muovisubs-traatteihin. Eräät solutyypit eivät kuitenkaan kiinnity muovisubätraatteihin. Kyky kiinnittää tällaisia soluja saattaisi olla edullista, koska näin saataisiin keino diagnostisiin ja tutkimusmäärityksiin, joissa nämä solut on immobilisoitava, ja tapa voida kiinnittää solut bioreak-torin suodattimiin solutuotteiden talteenottoa varten. Lisäksi se yksiselitteisesti osoittaisi bioliimaavan polyfenoliproteiinin mahdollisuuden toimia kudosviljel-män kiinnitystapana.

Solulinja U937 on ihmisen histiosyyttinen lymfoma, joka saatiin nesterinnasta eristetyistä pahanlaatuisista soluista. Nämä solut kasvavat suspensiossa jatkuvana RPMI 1640 kudosviljelyalustassa, joka on täydennetty 10 %:lla naudansikiöseerumia. U937-solut kiinnittyvät li 91037 19 huonosti muoviin seerumin läsnäollessa.

Kudosviljelyyn tarkoitetut petrimaljat (35 mm maljat) päällystettiin esimerkissä 1 hahmotelluilla menetelmillä bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla. U937-solut siirrettiin sentrifuugiputkiin ja preparoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Solut siirrostettiin muovisille kudosviljelymaljoille ja maljoille, jotka oli päällystetty 100 ug:lla bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (for-mulaatio 2). Kiinnittymistehokkuus arvioitiin triplikaat-teina (kts. esimerkki 1) hetkillä 5, 12,5 ja 20 minuuttia. Taulukon 5 tulokset (jotka on esitetty graafisesti kuviossa 3) osoittavat selvästi bioliimaavan polyfenoli-proteiinin vaikutuksen U937-solujen kiinnittymiseen.

Solut kiinnittyivät odotetusti huonosti kontrolleina toimiviin muovimaljoihin; mutta 5 minuutin sisällä 75 % siirrostetuista soluista oli kiinnittynyt päällystettyihin maljoihin ja 20 minuutin sisällä soluista oli kiinnittynyt 87 % päällystettyihin maljoihin.

TAULUKKO 5 U937-solujen prosentuaalinen kiinnittyminen

Aika (min.) Päällystämätön Formulaatiolla 2 pääl- _ muovi_ lystetty muovi_ 5 3 % 75 % 12,5 i 5 % 84 % 20 8 % 87 % ESIMERKKI 4

Solukasvun vertailu bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla ja kaupallisesti saatavissa olevilla solujen kiinnitys-faktoreilla

Solujen kiinnittyminen substraattiin on vain ensimmäinen 20 vaatimus solujen kasvattamiselle viljelmissä in vitro. Toinen ja ehkä tärkeämpikin vaatimus on, että solut kasvavat. Kudoksen dissosioituessa talteensaatujen solujen lukumäärä on kuitenkin usein erittäin alhainen. Solujen alhainen siirrostusmäärä voi vaikuttaa haitallisesti viljelmien vakiintumiseen, koska alhaisempi solumäärä alentaa mahdollisuutta jäädä eloon ja kiinnittyä. Tämä perustuu yksinkertaisiin matemaattisiin todennäköisyyksiin ja siihen tarpeeseen, että solujen itse on muodostettava metaboliitteja (tiheydestä riippuvia metaboliit-teja), jotka vaaditaan solujen kiinnittymiseen ja kasvuun. Kun solujen määrät ovat alhaisia, on epätodennäköisempää, että riittävästi soluja kiinnittyy, mikä itsessään on välttämätöntä solujen litistymiselle substraatille pallomaisesta muodosta. Litistymisen tapahduttua voi metabo-loituminen seurata niin, että se edelleen tekee alustan sopivaksi solujen kasvua ja jakaantumista varten.

Solujen, jotka joko eivät helposti kiinnity ja/tai joiden siirrostustiheys on alhainen, kiinnittymisen ja jakautumisen lisäämiseksi kaupallisesti on saatavissa erilaisia peptidi- ja proteiini-kiinnitysfaktoreita. Näihin kuuluvat kollageeni, laminiini, poly-D-lysiini ja fibronektiini. Kaikki nämä faktorit toimivat biologisesti inerteillä substraateilla vaihtelevissa määrin, riippuen siirroste-tusta solutyypistä. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin näiden tekijöiden kasvua alhaisilla siirrostustiheyk-sillä sallivaa tehokkuutta verrattiin siirrostamalla naudan sarveiskalvoendoteelisoluja tiheydellä 250 solua kudosviljelmään tarkoitettua petrimaljaa kohti (halkaisija 35 mm, 9,65 cm ) joko muovilla, bioliimaamalla polyfenoli-proteiinilla, kollageenilla, laminiinilla, poly-D-lysii-nillä tai fibronektiinillä. Solujen annettiin kasvaa 5 päivää, minkä jälkeen kustakin näistä muuttujasta arvioitiin pesäkkeen koot (solujen lukumäärä pesäkettä kohti) ja pesäkkeiden lukumäärä maljaa kohti värjäämällä il 91037 21 solut kristallivioletilla. Saatujen arvojen avulla määritettiin kunkin näiden faktorin vaikutus kiinnittymiseen (pesäkeiden määrä) ja kasvuun (pesäkkeiden koko).

Solut ja bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla päällystetyt maljat valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Maljojen päällystäminen muilla kiinnitysfaktoreilla suoritettiin faktoreiden valmistajien ehdottamilla menetelmillä.

Kollageeni - Kollageenilla päällystetyt maljat valmistettiin laimentamalla 1 osa kylmää (4°C) kollageenidis-periota 6 osaan kylmää 50-prosenttista metanolia. Tätä seosta sekoitettiin voimakkaasti useita minuutteja ja pipetoitiin petrimaljalle niin, että vain maljan pohja peittyi. Kollageeni poistettiin 20 sekunnin sisällä imun avulla ja kuivaamista varten malja kallistettiin ylösalaisin 30° kulmassa kantta vasten. Sen jälkeen, kun maljoja oli kuivattu niihin koskematta 1 tunti lami-naarivirtauskaapissa, maljat olivat käyttövalmiita.

Laminiini - Laminiinia saadaan 1 mg määrissä 1 ml:ssa 50 mM tris(hdyroksimetyyli)aminometaania fysiologisessa suolaliuoksessa. Sen jälkeen, kun laminiiniliuos oli hitaasti sulatettu -20°C:sta 0 - 4°C:een, petrimaljoille pipetoitiin 10 - 15 ug laminiiniliuosta 0,5 ml:ssa 0,01 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4. Maljat kuivattiin 37°C:ssii. Välittömästi maljojen kuivuttua ne ovat käyttövalmiita.

Fibronektiini - Fibronektiiniä saadaan 1 mg määrinä lyofilisoituna jauheena. Ennen käyttöä fibronektiinin annetaan tasapainoittua huoneen lämpötilaan 4°C:ssa säilyttämisen jälkeen. Jauhe rekonstituoidaan 1 ml:11a steriiliä tislattua vettä ja annetaan seistä 30 minuuttia jauheen liuentamiseksi. Jokaiseen maljaan lisätään 10 - 20 jig fibronektiini liuosta 0,5 ml:ssa ja annetaan 22 kuivua ilmassa. Malja on tämän jälkeen valmis soluilla siirrostettavaksi.

Poly-D-lysiini - Poly-D-lysiiniä saadaan 5 mg määrinä lyofilisoituna jauheena. Ennen käyttöä tämän jauheen annetaan tasapainoittua huoneen lämpötilaan 4°C:ssa säilyttämisen jälkeen. Maljat päällystetään 50 mg:11a 1 ml:ssa steriiliä tislattua vettä ja annetaan seistä huoneen lämpötilassa 5 minuuttia. Tämän jälkeen liuos imetään pois imulla ja maljat huuhdellaan kaksi kertaa 1,5 ml:11a steriiliä tislattua vettä. Jokaisen huuhtelun jälkeen neste poistetaan imulla täydellisesti. Maljat kuivataan ja käytetään välittömästi.

Kullakin faktorilla siirrostettujen solujen maljautumis-tehokkuus arvioidaan solujen kristallivioletilla värjäämisen jälkeen. Tämä saadaan aikaan huuhtelemalla pesäkkeitä sisältävät maljat ensin seerumia sisältämättömällä mediumilla ylimääräisten proteiinien poistamiseksi ja solut kiinnitetään 10 minuutin aikana 10-prosenttisella neutraalilla puskuroidulla formaliinilla. Sen jälkeen formaliini poistetaan maljoilta imun avulla ja maljoille lisätään 7 minuutiksi 0,1 % kristalliviolettia vesijohtovedessä. Välittömästi värjäämisen jälkeen kristallivioletti kaadetaan pois ja soiut huuhdellaan dekantterilasissa juoksevalla vesijohtovedellä ylimääräisen värjäysaineen poistamiseksi. Maljojen täydellisen kuivumisen jälkeen lasketaan kutakin muuttujaa vastaavat pesäkkeet duplikaatteina; samoin lasketaan solut 10 mielivaltaisesti valitussa pesäkkeessä maljaa kohti. Tästä esimerkistä saadut arvot on annettu taulukossa 6 ja esitetty graafisesti kuviossa 4 pylväsdiagrammeina. Voidaan havaita, että pesäkkeiden lukumäärä kuviossa 4 maljoilla, jotka on päällystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla (U), on yhtä hyvä vain poly-D-lysiinillä (PDL). Kaikki muut faktorit, mukaanlukien kollageeni (C), muovi (P), fibronektiini

II

91037 23 (F) ja laminiini (L), antavat verrattaessa huonoja tuloksia. Samalla tavalla pesäkkeiden keskimääräinen määrä pesäkettä kohti maljoilla, jotka on päällystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, on yhtä hyvä vain poly-D-lysii-nillä,. ja kollageenilla, muovilla, fibronektiinillä ja laminiinilla saadaan huono kasvutehokkuus. Vaikkakaan mitään merkittäviä eroja ei havaittu bioliimaavan poly-fenoliproteiinin ja poly-D-lysiinin välillä (mahdollisesti, koska kummassakin näistä molekyyleistä oli suuri määrä lysiiniä), bioliimaavan polyfenoliproteiinin käyttö kiinnitysfaktorina on kuitenkin edullisempaa substraattina johtuen sen kyvystä (1) korvata vettä, (2) kiinnittyä materiaaleihin, mukaanlukien metalliin ja aineeseen (R)

Teflon (esimerkiksi prosteettiset laitteet), (3) olla käytettävissä in vivo ja in vitro ja (4) muodostaa hyvin lujia sidoksia perustuen L-dopaan, hydroksyloituihin aminohappotähteisiin ja lysiiniaminohappotähteisiin.

TAULUKKO 6

Pesäkkeiden määrä ja koko solujen kasvettua erilaisilla kudosviljelyalustoilla

Pesäkkeitä per Solujen keskim. määrä muuttuja - päivä 5 pesäkettä kohti_

Formulaatio 2 100 147

Poly-D-lysiini 107 173

Kollageeni 27 101

Muovi 57 106

Fibronektiini 47 67

Laminiini 0 20 ESIMERKKI 5

Bioliimaavan polyproteiinin käyttö keinotekoisissa veri-suonisiirrosteissa

Polytetrafluorietyleeni (PTFE) on substraatti, jota 24 yleisesti käytetään verisuonisiirrosteisiin. Tämän materiaalin käyttöön liittyvä pääongelma on se, että veri-suonisolujen siirrostaminen PTFEtlle on erittäin vaikeaa sen suuresta hydrofobisuudesta johtuen. Monilla siirros-teillä solujen yhtenäinen monokerros sen pinnalla estäisi hyytymän muodostumisen. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin tehokkuus toimia väliteaineena, joka kiinnittää endoteeli-solut polytetrafluorietyleeniin, testattiin siirrostamalla verisuonisiirrostemateriaali bioliimaavalla polyfenoli- proteiinilla (formulaatio 2) käyttämällä sitä 200 2 ug cm kohti. Sen jälkeen annettiin 500.000 endoteelisolun kiinnittyä bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin. Solut (R) siirrostettiin myös Teflonille , jota ei oltu päällys-tetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla; ja Teflonille' , joka oli päällystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, käyttämällä kontrollina sitä, että soluja ei siirrostettu.

15 minuutin kiinnittymisajan jälkeen ylimääräiset solut huuhdeltiin verisuonisiirrostemateriaalista ja verisuonisiirrosteet kiinnitettiin formaliinilla, värjättiin kristallivioletilla ja kuivattiin esimerkin 4 mukaisesti. Tämän esimerkin tulokset on annettu kuviossa 5. Ne osoittavat, että vaikkakin jonkin verran värjäyty- (R) mistä voidaan havaita sekä Teflonilla , joka on käsitelty bioliimaayalla polyfenoliproteiinilla, ilman soluja (R) (näyte 1) että Teflonilla , jota ei ole käsitelty liimalla, mutta joka on siirrostettu soluilla (näyte 2), ylivoimaisesti suurin värjäytyminen tai solujen (R) kiinnittymienn tapahtui käsitellyllä Teflonilla , joka sisälsi endoteelisoluja (näyte 3). Bioliimaavat polyfenoliproteiinit lisäävät siten verisuonisiirros- / teiden siirrostumsita endoteelisoluilla, jolloin saadaan mekanismi, jonka avulla hyytymän muodostuminen voidaan minimoida tai poistaa verisuonisiirrosteleikkauksen jälkeen.

ti 91037 25 ESIMERKKI 6

Menetelmä, jolla uutetaan 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa polvfenoliproteiinia

Yhdistetään 300 g merisimpukan, M. edulis, jalkoja ja 900 ml neutraalisuolapuskuria, joka sisältää 1 M natrium-kloridia, 0,05 M tris(hydroksimetyyli)aminometaania (pH 7,5), 1 raM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM N-etyylimaleiini-imidiä, 0,025 M etyleenidiamiinitetra-etikkahappoa ja 1 mM kaliumsyanidia, ja 9 ml vaahdonesto-konsentraattia kaupallisessa sekoittimessa suurella nopeudella ja sekoitetaan hyvin, jolloin bioliimaava polyfenoliproteiini saostuu. Seosta sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Pelletti suspendoidaan uudelleen 900 ml:aan 5-prosenttista etikkahappoa käyttämällä suurinopeuksista sekoitinta. Bioliimaava polyfenoliproteiini pysyy supernatantissa sentrifugoitaessa 45 minuuttia nopeudella K.rpm. Supernatanttia laitetaan noin 1000 ml jäähauteeseen samalla koko ajan sekoittaen. Super-natanttiin, jota sekoitetaan, lisätään 5 ml 2M natrium-boraattia ja 95 ml 5M natriumkloridia. Tätä seosta sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Uusi super-natantti käsitellään samalla tavoin kuin edellä lisäämällä neljä kertaa niin paljon 2M natriumboraattia ja 5M natriumkloridia. Seosta sentrifugoidaan jälleen 15 minuuttia nopeudella 10 K. Pelletti suspendoidaan uudelleen seuraa-vaan seokseen: 7,5 ml 2M natriumboraatti, 50 ml 5M natrium-kloridi, 50 ml tislattu vesi, 37,5 ml 8M urea 5-prosentti-sessa etikkahapossa ja 5,6 ml väkevä etikkahappo. Seosta sekoitetaan hitaasti noin 16 tuntia. Suspensiota sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Supernatantti säästetään ja dialysoidaan (kalvojen erotusrajana mole-kyylipaino 8-12K) 5-prosenttista etikkahappoa vasten noin 16 tuntia. Aminohappoanalyysi osoittaa, että uute sisältää 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa poly- 26 fenoliproteiinia. Uutteen puhtauden määrää suoritettujen uuttojen lukumäärä. Puhtaan bioliimaavan polyfenoliproteii-nin saanto pienenee uuttojen määrän kasvaessa. Kaikki tässä kuvatut menettelyt suoritettiin 4°C:ssa.

Kromatoqraafinen jatkopuhdistus;

Nestekromatografiaa käytettäessä SE Sephadex-hartsit pidättävät polyfenoliproteiinit 5,5% guanidiinihydro-kloridissa (GuHCl) 5-prosenttisessa etikkahapossa. Sen jälkeen proteiini eluoidaan hartsista 5,5 - 20 % GuHCl-gradientilla etikkahapossa, piikkien alueet yhdistetään ja dialysoidaan GuHCl:n poistamista varten 5-prosenttista etikkahappoa vasten. Proteiinit säilyvät kaikkein stabiilimmin 4°C:ssa 5-prosenttisessa etikkahapossa. Ennen niiden käyttöä liimana, in vivo tai kosketuksessa elävien solujen kanssa bioliimaavat polyfenoliproteiinit on dialysoitava vettä vasten liuoksen pH-arvon nostamiseksi lähelle neutraalisuutta ja preparaatti on väkevöitävä välille 3 ja 10 mg/ml. Tämä suoritetaan käyttämällä ultrasuodatuskalvoa, jonka hiukkaskoko-erotusraja on 30.000 tai pienempi. Tämä ei ole tarpeen, kun bioliimaavat polyfenoliproteiinit kuivataan ennen käyttöä inertin substraatin päälle.

ESIMERKKI 7

Bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, puhtaus 45 % (formulaatio 2), immobilisoitiin hepariinia, mukopoly-sakkaridi, jolla on spesifisiä antikoagulanttiominai-suuksia, ja peroksidaasia, peroksidia hapettava proteiini-entsyymi. Tämän tarkoituksena oli osoittaa, että muitakin aineita voidaan tehokkaasti sitoa muoviesineisiin bioliimaavan polyfenoliproteiini-välivaiheen kautta.

Il 91037 27

Kummassakin tapauksessa kuivattiin muovisten kudosviljely- 2 maljojen, joiden pinta-ala oli 2 cm , päälle 7 ug biolii- 2 maavaa polyfenoliproteiinia 3,5 ug/cm loppukonsentraa-tioon. Proteiini pestiin 100-prosenttisella etanolilla ja sen jälkeen kaksi kertaa vedellä, kuten on kuvattu esimerkissä 1.

Hepariinia lisättiin maljoille viitenä eri konsentraa-tiona: 90, 60, 30, 15 ja 5 yksikköä/malja. Hepariinia kuivattiin myös käsittelemättömien muovimaljojen päälle.

Kaikki testit suoritettiin kaksinkertaisena. Irrallisesti sitoutunut hepariini poistettiin pesemällä maljat ennen käyttöä 0,1M fosfaattipuskurilla.

Hepariiniaktiivisuus määritettiin lisäämällä tuoretta ihmisverta kuhunkin maljaan 0,5 ml maljaa kohti ja inku-boimalla 23°C:ssa. Hyytymisajat määritettiin silmämääräisesti ja tallennettiin. Tulokset on annettu taulukossa 7.

TAULUKKO 7 *

Hvvtymisaika (minuuttia)

Yksikköä Mukana bioliimaava Ilman bioliimaavaa hepariini polvfenoliproteiini polyfenoliproteiinia

90 **NC NC

i

60 NC NC

30 NC 61,104 15 NC 50,29 5 NC 30,27 0 28, 29 13,11

Annetut luvut ovat kaksinkertaisia määrityksiä NC = Ei hyytymistä 24 tunnin kuluttua 28

Hepariini oli erittäin hyvin immobilisoitu muoviin käytettäessä bioliimaavaa polyfenoliproteiinia. Mitään hyytymistä ei havaittu 24 tunnissa edes hepariinin alhai-simmalla annoksella. Kaikki alle 60 yksikön annokset hyytyivät 2 tunnissa tai nopeammin maljoissa, joissa hepariini oli kiinnitetty suoraan muoviin. Korkeammilla annoksilla hepariinia sitoutuu niin paljon muoviin, että hyytymän muodostuminen estyy.

Peroksidaasi immobilisoitiin samalla tavalla: Peroksidaasia lisättiin viisi eri konsentraatiota, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,025 |ig/malja, sekä päällystämättömiin muovimaljoihin että muovimaljoihin, jotka oli päällystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla (duplikaatteina). Kuten hepariinia-kin käytettäessä poistettiin irrallisesti sitoutunut entsyymi pesemällä 0,1 M fosfaattipuskurilla.

Peroksidaasin määrityksessä lisätään substraattiseos, peroksidi ja O-fenyleenidiamiinia fosfaattipuskuroituun kyllästettyyn suolaliuokseen. Substraattiseos sisältää ml:ssa 100 ^ul peroksidia (40 μΐ 30-prosenttista peroksi-dia 50 ml:ssa vettä) ja 100 ui O-fenyleenidiamiinia (10,7 mg 8,56 ml:ssa vettä) ja 800 fil fosfaattipuskuroitua kyllästettyä suolaliuosta. Jokaiseen maljaan lisätään 1 ml. Inkuboidaan 5 minuuttia 23°C:ssa, minkä jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä 100 μΐ 4 N rikkihappoa. Määritys on kolorimetrinen aallonpituusoptimin ollessa 490 nm. Taulukossa 8 on annettu duplikaatioarvot ab-sorbanssiyksikköinä aallonpituudella 490 nm.

91037 29 TAULUKKO 8

Peroksidaasi, Mukana bioliimaava Ilman bioliimaavaa ug polyfenoliproteiini polyfenoliproteiinia 1,0 1,5, 1,3 1,4, 1,2 0,5 0,6, 0,7 0,5, 0,5 0,1 0,2, 0,2 0,05, 0,06 0,05 0,1, 0,1 0,04, 0,04 0,025 0,05, 0,05 0,04, 0,04

Kuten hepariinallakaan, ei mitään paranemista havaita korkeammissa konsentraatioissa käytettäessä bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, koska entsyymiä sitoutuu riittävästi muoviin. Merkittävä paraneminen tai talteenotto havaitaan alhaisemmissa konsentraatioissa käytettäessä bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

ESIMERKKI 8

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin on havaittu menestyksellisesti toimivan histologiassa ja sytologiassa kudosten ja solujen substraattina. Tässä esimerkissä käytettiin 45-prosenttista bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formu-laatio 2) kiinnittämään lasilevyille endoteelisoluja sisältäviä naudan Descemet-membraanivalmisteita. Kokonaiset sarveiskalvot poistettiin juuri tapetuilta naudoilta ja laitettiin joko fysiologiseen suolaliuokseen tai 10-prosenttiseen neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Sen jälkeen Descemet-membraani poistettiin varovasti vetämällä sarveiskalvon takaosasta. Kudos siirrettiin lasilevyille (esipuhdistettu 5-prosenttisella etikkahapolla) ja päällystettiin 50 ug:lla bioliimaavaa polyfenoliproteiinia. Kudospreparaatit kuivattiin sen jälkeen bioliimaavan polyfenoliproteiinin päälle huoneen lämpötilassa tai 55°C maljoille 20 minuutin aikana. Kun käytettiin formaliinilla kiinnitettyä kudosta, kudoksesta 30 poistettiin ylimääräinen formaliini huuhtelemalla kyllästetyllä suolaliuoksella ennen bioliimaavaan polyfenoli-proteiinin kiinnittämistä. Kuivaamisen jälkeen kudos-lasilevyvalmisteet käsiteltiin formaliinilla 5 minuutin ajan kudosten kiinnittämiseksi bioliimaavaan polyfenoli-proteiiniin. Tällä tavoin käsitellyt kudokset pysyivät bioliimaavaan polyfenoliproteiinin päällä viikkokausia vesiliuoksissa. Kudokset pysyivät lisäksi yhä ehjinä vielä senkin jälkeen, kun niitä oli voimakkaasti sekoitettu ravistelemalla vedessä, kyllästetyssä suolaliuoksessa, laimeassa ja 100-prosenttisessa etanolissa ja ksyleenissä. Kun bioliimaavaa polyfenoliproteiinia ei ollut mukana, kudokset eivät pysyneet kiinni lasilevyissä edes ensimmäisessä formaliinikäsittelyssä.

/ li

Claims (23)

91037 31

1. Menetelmä biologisesti aktiivisten osasten kiinnittämiseksi substraatille käytettäväksi in vitro. tunnettu siitä, että (1) päällystetään substraatti steriilillä formulaatiolla, joka sisältää polyfenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino-% puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikkö: nh2 nh2 | OB OH I CH2 | | CH2 ? (or (ο; Γ1 CH, OH \/ OH CHj I * I | X X | I I CH, CH, CH-R CH, Xs X CH-R CH, CH, I I \ / I I \ / \ / I I I —f-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C—K- Il II II II II II II II II II OOOOOOOOOO AU LTS PRO/HTP SBR/THR TYR/DOPA PRO/HTP PRO/HTP SKR/THR TTR/DOPA LT S jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan päällyste substraatille; (3) kiinnitetään päällyste substraatille; (4) huuhdellaan päällystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymättömien ylimääräisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan biologisesti aktiivisia osasia päällystetylle substraatille, jolloin biologisesti aktiiviset osaset kiinnittyvät päällystettyyn substraattiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu o siitä, että substraatti päällystetään subsraatin cnr kohti 0,1 - 2 plrlla formulaatiota, joka sisältää noin 10 - 60 pg/μΐ bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että päällyste kiinnitetään substraatille huuhtelemalla 32 substraatti vedettömällä, biologisesti yhteensopivalla steriloivalla mediumilla.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen etanoli.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen isopro-panoli.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylimääräisten ainesten poistamiseksi päällystetty substraatti huuhdellaan vedellä tai puskuriliuoksella.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatti on valittu ryhmästä, johon kuuluvat synteettiset polymeerimateriaalit, lasi, metallit ja mikro-huokoiset suodattimet.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatti on polytetrafluorietyleeni.

9. Menetelmä elävien solujen kiinnittämiseksi substraattiin käytettäväksi in vitro. tunnettu siitä, että (1) päällystetään substraatti steriilillä formulaatiol1 a, joka sisältää polyfenoliproteiinia, jossa on 35 - 100 paino-% puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikkö: nh2 nh2 I OH OH I CH2 I I CH2 T2 (OJ [Oj Γ2 CH, OH OH V*/ CHj I X I I * * I I I CH, CH, /^X CH-R CH, X X CH-R CH, CH, | I \ / I I \ / \ / I I I -f-NH-CH-C-HH-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-HH-CH-C-H-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C-h, n il il n n il n il u 11 OOOO OOO o o o ALA LTS PRO/HTP SRR/THR TTS/DOPA PRO/HTP PRO/HYF SIR/THR TTR/DOPA LYS il 91037 33 jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan päällyste substraatilla; (3) kiinnitetään päällyste substraatilla; (4) huuhdellaan päällystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymättömien ylimääräisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan eläviä soluja päällystetylle substraatille, jolloin solut kiinnittyvät päällystettyyn substraattiin ja suorittavat ravitsevassa ympäristössä normaaleja solun metabolia-toimintoja .

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että substraatti päällystetään substraatin cm^ kohti 0,1 - 2 ulilla formulaatiota, joka sisältää noin 10 - 60 ug/μΐ bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että päällyste kiinnitetään substraattiin huuhte-1 emalia substraatti vedettömällä biologisesti yhteensopivalla steriloivalla mediumilla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen etanoli.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen isopropanoli.

14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että ylimääräiset ainekset poistetaan huuhtelemal-la päällystetty substraatti steriilillä vesipitoisella seeru-mittomalla kudosviljelymediumilla. 34

15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että ylimääräiset ainekset poistetaan huuhtelemal-la päällystetty substraatti vedellä tai puskuriliuoksella.

16. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että elävät solut laitetaan päällystetylle substraatille seerumipitoisessa mediumissa.

17. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että elävät solut laitetaan päällystetylle substraatille seerumittomassa mediumissa.

18. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että substraatti on valittu ryhmästä, johon kuuluvat synteettiset polymeerimateriaalit, lasi, metallit ja mikrohuokoiset suodattimet.

19. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että substraatti on polytetrafluorietyleeni.

20. In vitro-soluien viljelyjärjestelmä, tunnettu siitä, että siihen kuuluvat: substraatti; sen päällä oleva päällyste steriilistä formulaatiosta, joka sisältää poly- fenoliproteiinia, jossa on 35 - 100 paino-% puhdasta biolii-maavaa polyfenoliproteiinia , jossa on toistuva dekapeptidi-yksikkö: / NH, MHj I OH OH I ch2 I I f= (öj (OI V CH, OH oh \/ CH, I x | I X x | | | CH, CH, X CH-R CH, X χ CH-R CH, CH, I I W I I \ / \ / I I I —(-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-+J, Il II II II II II II II II II o oo o ooo o o o ALA LYS PRO/HYP SER/THS TTR/DOPA PRO/HTP PRO/HTP SER/THR TTR/DOPA LYS jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon 91037 35 kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; elävät solut, jotka on kiinnitetty päällystettyyn substraattiin; ja solujen kanssa kosketuksessa oleva ravitseva medium, jolloin solut suorittavat normaaleja solun metaboliatoiminto-ja.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen solujen viljelyjärjestelmä, tunnettu siitä, että substraatti on valittu ryhmästä, johon kuluvat synteettiset polymeerimateriaalit, lasi, metallit ja mikrohuokoiset suodattimet.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen solujen viljelyjärjestelmä, tunnettu siitä, että substraatti on polytetra- fluoriety1eeni.

23. Menetelmä biologisesti aktiivisten osasten kiinnittämiseksi substraattiin käytettäväksi in vitro, tunnettu siitä, että (1) dispergoidaan biologisesti aktiiviset osaset seerumitto-maan liuokseen; (2) sekoitetaan steriiliä formulaatiota, joka sisältää poly-fenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino-% puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapep-tidiyksikkö: NHj NH2 I OH OH I CTj | 1(¾ i ·2 (Oj (OJ T2 CH, OH \/ OH CH, l * 1 I * * 1 1 1 CH, CH, CH-R CH, X X^X CH-R CH, CH, I I W I I \ / \ / | | i2 -t-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C^T, Il II II II li II II II II II oooooooooo ALA LYS PRO/HTP SER/THR TYR/DOPA PRO/HYP PRO/HYP SER/THR TYR/DOPA LYS jossa N on kokonaisluku välillä noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety ja metyyli; 36 biologisesti aktiivisten osasten mainitun dispersion kanssa, ja näin kiinnitetään bioliimaava polyfenoliproteiini biologisesti aktiivisiin osasiin; (3) otetaan talteen saadut biologisesti aktiviiset osaset; ja (4) kiinnitetään taiteenotetut biologisesti aktiiviset osaset substraattiin. f 91037 37