FI91037C - Bioliimat solujen ja kudosten kiinnittämiseen - Google Patents

Description

91037 i

Bioliimat solujen ja kudosten kiinnittåmiseen Biolim for limning av celler och våvnader Tåmån keksinnon kohteena on bioliimaavien polyfenoliprote-iinien kåytto lisååmåån solujen, kudosten ja muiden biologisesti aktiivisten osasten kiinnittymistå erilaisiin substraatteihin. Tåsså yhteydesså "bioliima" viittaa 1 i i -maan, joka sopii yhteen elåvien kudosten, solujen ja muiden biologisesti aktiivisten osasten metabolian, kasvun tai toiminnan kanssa in vitro. Bioliimaavat polyfenolipro-teiinit perustuvat sar jaan toistuvia dekapeptideja, joilla on kaava MB, NHa

I OH OH I

ch2 I I ca2 f- (6i @ r· CH, OH OH N/ CH2 I x I I * * 1 1 1 CH, CH, X CH-R CH, X X CH-R CH, CH,

I I \ / I i \ / \ / I I I

nh,-ch-c-nh-ch-c-h-ch-c-hh-ch-c-hh-ch-c-m-ch-c-h-ch-c-nh-ch-c-mh-ch-c-mh-ch-cooh

II II II II II II II II II

ooooooooo

MA LTS PRO/HTP SKS/THR ΤΤΚ/ΒΟΡλ FSO/HTP PRO/HTP 3KR/TBR TTR/DOPA LYS

i kuten on kuvattu US-patentissa 4,585,585, jonka nimi on "Decapeptides Produced From Bioadhesive Polyphenolic Proteins”. Toistuvista dekapeptideistå muodostuvat bioliimat ovat ihanteel1isia, koska niiden on nyt havaittu teke-vån solut ja muut biologisesti aktiiviset osaset, kuten proteiinit, DNA:n, hormoonit ja antibioottit kykeneviksi 2 kiinnittymåån kåytånnol1isesti katsoen mihin tahansa substraattiin. In vitro-sovellutuksiin kuuluvat tutkimus-diagnostiikka, solutuotteiden talteenotto ja solumetaboli-an tutkimus.

Lååketieteellisen ja biokemial 1 isen tutkimuksen eras tår-keimmistå keinoista on solujen talteenotto kudoksesta niiden in vitro-yllåpitomistå ja kasvattamista vårten kudosvi1jelmån avulla. Kudosviljely on tekniikka tai mene-telmå, jolla organismeista (kasvi tai elåin) saatuja kudoksia tai soluja kasvatetaan ja/tai tuetaan niiden metaboliaa formuloidussa ravitsevassa ympåristosså. Kun solut on eristetty hajottamalla kudos varovasti, niitå inkuboidaan ravintoalustoissa, jotka kykenevåt yllåpitå-måån elintoimintoja. Muutamia poikkeuksia lukuunottamatta solujen on kiinnityttåvå substraattiin, jotta ne voisivat suorittaa normaalit metaboliatoiminnat, kasvaa ja jakaan-tua. Substraatti, joka toimii solukasvun matriisina, muodostuu kudoksessa kol1ageenista, laminiinista ja fib-ronektiinistå. In vitro tåmå substraatti on useimmiten muovia, vaikkakin joskus substituentteina kåytetåån lasia ja mikrohuokoisia selluloosasuodattimia. Kudosvi1jelmållå tuotettujen solujen kåyttotavoista ovat esimerkkejå: (1) tutkimukset, joiden kohteena on solut metabolia, parasii.ttien (so. virukset, bakteerit jne.) metabolia solussa, erilaisten solutyyppien (so. epiteliasolut, fibroplastit, immuno-komponentit solut, tymosyytit, veri-hiutaleet jne.) vuorovaikutus-metabolia, eksogeenisten tekijoiden vaikutus solumetaboliaan, solujen geneettinen koostumus (in vitro-diagnostiikka): (2) spesifisten yhdis-teiden, so. geenien, proteiinien tai muiden solukomponent-tien tuotte; ja (3) solujen uudelleensiirrostaminen, kuten ihosiirrosteet, sarveiskalvosiirrosteet, aivosiirrosteet, vesisuonisiirrosteet, ja hedelmoittåminen in vitro.

li 3 91037

Viime vuosina kollageenia, laminiinia ja fibronektiiniå on uutettu ja puhdistettu elåinkudoksista ja markkinoitu solu- ja kudosvi1jelmiå kayttåville tutkijoille soluejn kiinnityspromoottoreina. Tållaisiin tarkoituksiin on myos myyty synteettistå poly-D-lysiiniå ja poly-L-lysiiniå.

Pååasial1inen syy tåhån on, ettå substraatit, kuten muovi ja lasi ovat in vitro biologisesti inerttejå, ja usein niillå ei saada solujen tai kudoksen kiinnittymiseen riittåvåå 1iimautumista substraattiin. Yksittåisiin esi-merkkeihin, jotka havainnol1istavat huonoa kiinnittymiste-hoa, kuuluvat primååriset solueristeet, solut, jotka on siirrostettu alhaisissa tiheyksisså, ja solut, jotka on siirrostettu virtaukseltaan jatkuvissa jårjestelmisså, kuten bioreaktoreissa tai onttoputki-kasvatussysteemeisså . Lisåksi erååt substraatit, kuten erååt mikrohuokoiset suodattimen tai Teflen(R) materiaalit, joita kåytetåån ve-risuonisiirrosteisiin, eivat salli lainkaan solujen kiin-nittymistå alhaisesta pintaenergiasta johtuen.

Vaikkain kiinnittymispromoottorit ovat merkittåvåsti auttaneet kiinnittymisongelmia, erååt riittåmåttomåt seikat ovat yhtå huomionarvoisia. Ensiksikin niiden vaiku-tustapa perustuu siihen, ettå vaikkakin nåmå tekjjåt ovat fysiologisia, ne eivåt ole todella liimaavia; ne toimivat vain solujen fysikaalisena tukena ja ansana. Toiseksi niitå _ei voi helposti kåyttåå monil la erilaisilla subst-raateilla, jotka ovat erilaisia kuin tavanomaisesti kåytetåån ^oluen viljelysså (esimerkiksi polystyreeni, nit-roseliuloosa), eikå niitå voida kåyttåå yhtå tehokkaasti kaikilla solutyypeil la. Kolmanneksi useinunilla nåistå tekijoista on rekonstrituoituna noin 4 viikon pituinen såi1ymisaika -20°C:ssa. Neljånneksi nåmå tekijåt on uutet-tava biologisista låhteistå poly-D- ja poly-L-lysiiniå 1ukuunottamatta; niitå ei voi syntetisoida kaupal1isesti hyvåksyttåvi11å kustannuksilla. Viidenneksi eråillå solu- 4 jen kiinnittymispromoottorei11 a on havaittavissa mahdollinen terveysvaara, mukaan lukien esimerkiksi fibronektiinin uuttaminen ihmisverestå.

Nåmå ongelmat våltetåan kåyttåmållå bioliimaavia poly-fenoliproteiineja. Ne kiinnittyvåt hyvin moniin erilaisiin substraatteihin veden lasnåollessa eivatkå ne petå jatku-vasti kosteassa ympåristosså . Koska bioliimaava poly-fenoliproteiini on todellinen liima, se kiinnittyy nopeas-ti sekå substraatteihin ettå erilaisiin soluihin, kudok-siin ja muihin biologisesti aktiivisiin osasiin. Sitå voidaan såilyttåå 4°C:ssa våhintåån 10 kuukautta ja huo-neen låmpotilassa våhintåån 1 kuukausi sen hajoamatta tai sen toimintakyvyn heikkenemåttå. Lisåksi se voidaan synte-tisoida kiinteåfaasisen peptidisynteesin avulla tai kåyt-tåmållå geenimanipulaatiota, mikå mahdollistaa suurten måårien paremman standardisoinnin.

Herisimpukasta saatujen bioliimaavien polyfenoliproteii-nien toistuva dekapeptidirakenne on kuvattu US-patentissa 4,585,585, "Decapaptides Produced from Bioadhesive Polyphenolic Proteins". Bioliimaavien polyfenoliproteii-nien formulaatiot ja bioliimaavien polyfenoliproteiinien valmistusmenetelmåt ovat kohteena vireillå oleville pa-tenttihåkemuksillemme . Alalia tunnetaan menetelmilå, joilla valmistetaan bioliimaavia polyfenoliproteiineja (Waite & Tanzer, 1981, Science 212, 1038).

Esillå olevan keksinnon eråånå tavoitteena on siten tuo-da esiin kiinnittymistekijoinå hyodylliset valmisteet, joilla edistetåån tai lisåtåån solujen kiinnittymistehok-kuutta, kiinnittymisnopeutta ja/tai -voimakkuutta, kasvua ja spesialisoitunutta funktiota kudosviljelrnan

II

91037 5 tai ei-kudosviljelmåmateriaalien ja substraatien, mukaanlukien muovin, lasin, metallien, mikrohuokositen suodattimien (selluloosa-, nailon-, lasikuitu-, poly-esteri-, polykarbonaatti-, polyetyleenitereftalaatti ja muut synteettiset ja ei-synteettiset materiaalit, mukaanlukien muut synteettiset polymeerimateriaalit ja -tuotteet, jotka saadaan modifioimalla edella mainittuja synteettisia polymeerimateriaaleja (ja synteettisten tai alloplastisten materiaalien suhteen, joita voidaan kåyttåå kudosten tai keinoelinten siirrostamistoimenpi-teissa (esimerkiksi mekaanisen sydåmen materiaalit ja polytetrafluorietyleeni ja lahisukuiset verisuonten siirrostusmateriaalit).

Esilla olevan keksinnon toisena tavoitteena on tuoda esiin valmisteet, jotka ovat hyodyllisia kiinnitysfakto-reina edistettåessa tai lisåttåessa muiden biologisesti aktiivisten osasten, kuten proteiinien, DNA:n, hormoonien ja antibioottien kiinnittymistehokkuutta, kiinnittymisno-peutta ja/tai voimakkuutta erilaisiin substraatteihin, joista eraita on edella mainittu.

Esilla olevan keksinnon kolmantena tavoitteena on tuoda esiin substraattien valmistaminen tai kerrostaminen bioliimaavilla polyfenoliproteiineilla, ja menetelmåt, joilla tutkitaan tållaisten kerrosten tehokkuus edella mainittujen parametrien suhteen.

Tåman keksinnon edella mainitut tavoitteet ja muut tavoitteet, edut ja ominaispiirteet sadaan aikaan esilla olevan keksinnon avulla. Keksinto tuo esiin menetelmån, jolla kiinnitetåån elåviå soluja, kudoksia ja muita biologisesti aktiivisia osasia, kuten proteiineja, DNA:ta, hormooneja ja antibiootteja substraattiin.

Menetelmålle on tunnusomaista, etta t 6 (1) påållystetåån substraatti steriililla formulaatiolla, joka sisaltåå noin 35 - 100 paino-% puhdasta liimaavaa bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikko: nh2 nh2

I OB OH I

ch2 I I ch2 T2 (Oi (Oj Γ CH2 OH OH \/ CH,

I * I I * * I I I

CH, CH, X CH-R CH, X /^X CH-R CH, CH, I IW I t \ / \ / i I2 I2 —{-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C'ni

II II II II II II II II II II

OOOOOOOOOO AU LYS PRO/HYP SER/ΤΗR TYR/DOPA PRO/RYP PRO/HYP SER/THR TYR/DOPA LYS

jossa N on kokonaisluku vålillå noin 10 - noin 100, ja jolloin kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan påållyste substraatille; (3) kiinnitetåån påållyste substraatille; (4) huuhdellaan påållystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymåttomien ylimååråisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan elåviå soluja, kudoksia tai muita biologisesti aktiivisia osasia påallystetyille substraateille, jolloin mainitut osaset kiinnittyvåt påållystettyyn substraattiin. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kon-sentraatioita ja formulaatioita voidaan muuttaa riippuen substraatin tyypistå tai kulloinkin kåytetyn i il 91037 7 solun, kudoksen tai biologisesti aktiivisen osasen kiinnittymisvaatimuksista. Elaviå soluja kiinnitettaessa ympåriston on oltava ravitseva, jotta solut voisivat suorittaa normaalit solun inetaboliatoimintansa.

Esilla olevaa keksintoa on helpompi ymmårtåå seuraavien piirustusten avulla, jotka kuvaavat yksityiskohtaisesti eråstå esilla olevan keksinnon tyypillista suoritusmuotoa.

Piirustuksissa:

Kuvio 1 esittåa graafisesti esimerkisså 1 saatuja arvoja; siinå on annettu solujen arvioitu kiinnittymis-prosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 2 esittaa graafisesti esimerkisså 2 saatuja arvoja; siina on annettu solujen kiinnittymisprosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 3 esittåa graafisesti esimerkisså 3 saatuja arvoja; siinå on annettu solujen arvioitu kiinnittymisprosentti minuutteina annettua aikaa vastaan.

Kuvio 4 esittåå graafisesti esimerkisså 4 saatuja arvoja; siinå on annettu pylvåsesityksinå sekå pesåkkeiden f j lukumåårå maljaa kohti ettå solujen keskimååråinen lukumåårå pesåkettå kohti kullekin arvioidulle tekijålle.

8

Kuvio 5 on valokuva kolmesta polytetrafluorietyleeni (PTFE)-naytteesta kristallivioletilla vårjååmisen jålkeen: Nayte 1 (nåyte vasenunalla) on formulaa-tiolla 2 paållystetty PTFE. Nayte 2 (nayte keskellå) on PTFE, joka on siirrostettu soluilla mutta ei paållystetty formulaatiolla 2; nayte 3 (nayte oikealla) on PTFE, joka on paållystetty formulaatiolla 2 ja siirrostettu soluilla.

Eukaryoottisolujen kasvu ja normaali metabolia vaatii kiinnittymistå substraattiin niin, ettå solukerros ulottuu oleellisesti pinta pintaa vasten substraalilla. Soluvil- jelmåsså kåytetåån tavallisesti muovisubstraatteja ja pienemmåsså måårin lasia ja mikrohuokoisia suodattimia solujen kiinnittymistå ja kasvattamista vårten. Askettåin nåihin tarkoituksiin on kåytetty muovin asemesta fysiolo- gisia substraatteja (kollageeni, laminiini, fibronektiini, poly-D- ja poly-L-ly^iini), jotta våltettåisiin ongelmat, jotka liittyvåt solujen viljelyyn alhaisilla siirrostus- viljelyksillå, juuri eristettyjen solujen kåyttåmiseen tai substraattien kåyttåmiseen, jotka sopivat huonosti (R) kiinnittymiseen (esimerkiksi Teflon ). Bioliimaavat polyfenoliproteiinit muodostavat sopivan vaihtoehdon, koska niillå on suuri sitoutumistaipumus sekå solujen ettå erilaisten substraattien, sekå biclogisten ettå inerttien, suhteen.

Bioliimaavien polyfenoliproteiiniformulaatioiden tehokkuus sitoa soluja on arvioitu in vitro soluviljelmåå silmållå-pitåen. Testatut formulaatiot sisålsivåt (1) 95-prosentti-sesti puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, joka oli valmistettu luonnonlåhteistå ("formulaatio 1"), ja (2) 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa polyfe-noliproteiinia, joka oli valmistettu luonnonlåhteistå ("formulaatio 2").

II

91037 9

Sen jålkeen kun bioliimaavat polyfenoliproteiinit valmis-tettiin US-patentissa 4,585,585 kuvatuilla menetelmillå, nåmå formulaatiot karakterisoitiin biokemiallisesti perinpohjaisesti kåyttåmållå suuren suorituskyvyn neste-kromatografiaa, L-dopan måaran mååritysmenetelmiå, amino-happoanalyysia ja polyakryyliamidigeelielektroforeesia.

Taulukossa 1 on annettu tårkeimpien arainohappojen koostu-mus bioliimaavissa polyfenoliproteiiniformulaatioissa: TAULUKKO 1

Bioliimaavien polyfenoliproteiinien aminohappokoostumus ryhmina 1000 ryhmåå kohti (1) (2) 95% biolii- 45% biolii- maava polyfe- maava polyfe- noliproteiini noliproteiini 3- hydroksiproliini 27 4,3 4- hydroksiproliini 88 33,4 proliini 79 72,5 glysiini 51 138,3 1/2 kystiini 9 7,7 L-3,4-dihydroksifenyyli- alaniini 96,5 42,3 tyrosiini 54 39,3 lysiini 175 103,9

Kollageeni muodostaa formulaatiossa 2 jaljelle jaaneesta 55 %:sta. Bioliiraaavan polyfenoliproteiinin perusyksikko on dekapeptidi (10 aminohapon ketju), joka toistuu kovalenttisidosten kautta samanlaisiksi dekapeptideiksi jopa 75 - 85 kertaa. Nåma uutettuun bioliimaavaan poly-fenoliproteiiniin perustuvat formulaatiot ovat kiinnitty-vyydesta arvioituna stabiileja 4°C:ssa 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa, pH 2,8 yli 10 kuu-kautta. Uutetut preparaatit, jotka sisåltåvåt 40 - 50 % kollageenia, ovat stabiileja huoneen låmpotilassa 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa» pH

10 2,8, tai muovisubstraateille kuivaamisen jålkeen vahintåan 2 kuukautta.

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kyky kiinnittya voimak-kaasti erilaisiin substraatteihin mahdollistaa solujen kiinnittåraisen, yllapidon ja kasvun pinnoilla, jotka tåtå aikaisenunin ovat aiheuttaneet ongelmia joko koostu-muksensa, kayttonsa tai kiinnitystå vaativan solun tyypin vuoksi. Substraatteja, joita on mahdollista kåyttåå, ovat muovi, lasi ja mikrohuokoiset suodattimet (esiraerkiksi selluloosa-aineet, nailon, lasikuitu, polyesteri, polykar-bonaatti) tavanoraaisessa soluviljelytutkimuksessa ja/tai solutuotteen talteenotossa bioreaktoreista, joita kåytetåån panosviljelmånå, tai geenimanipuloinnissa; solutuotteiden talteenottoon tarkoitetut ontelokuituputket; ja prosteet-tiset verisuonisiirrostemateriaalit, kuten polytetrafluori-

Qp \ etyleeni (Teflon ) ja låhisukuiset aineet. Useinunissa nåisså pinnoissa on negatiivinen nettovaraus ja sen vuoksi niillå on taipumus sitoa tiiviisti positiivisesti nettovarautuneita materiaaleja, kuten bioliimaavia poly-fenoliproteiineja. Soluilla on negatiivinen nettovaraus ja tåmån seurauksena ne hylkiintyvåt lievåsti kåsittele-måttomiltå pinnoilta ja sen sijaan kiinnittyvåt biolii-maavaan polyfenoliproteiini-vålivaiheeseen, jolla on positiivinen nettovaraus. Bioliimaava polyfenoliproteiini lisåå kiinnittymistehokkuutta, kiinnittymisnopeutta ja kiinnittynd sen voimakkuutta. Tåmå jålkiiranåinen parametri on kriittinen sovellutuksissa, joissa on kyse solutuotteen talteenottomenetelmistå tai solujen uudelleensiirrosta-misesta verisuonisiirrosteisiin, joihin liittyy nestei-den kulku solujen raonokerrosten yli. Lisaksi solut, jotka kiinnittyvåt huonosti kudoksesta eriståmisen jålkeen tai solutyypistå johtuen, ja solut, jotka eivåt normaa-listi kiinnity, kuten verisolut ja suspensiokudosviljelmå-solut (histiosyyttilymfornat, verihiutaleet, valkoiset ja punaiset verisolut jne.) saattaisivat myos kiinnittyå il 91037 11 substraateihin- taman vålivaiheen kautta.

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin kyky kiinnittya voimakkaasti erilaisiin substraatteihin mahdollistaa lisaksi monien muiden biologisesti aktiivisten osasten, kuten DNA:n, proteiinien, hormoonien ja antibioottien kiinnittamisen.

Substraattien paallystamienn bioliiraaavilla polyfenolipro- teiiniformulaatioilla ja kiinnittaminen substraatteihin suoritetaan yleisesti seuraavasti. Riippuen halutustas 2 2 loppukonsentraatiosta cm kohti substraatin cm : lie levitetaan tasaisesti noin 1-2 mikrolitraa steriiliå bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jonka våkevyys on 10 - 60 ug mikrolitrassa. Saatu kalvo kuivataan nopeasti laittamalla substraatti laminaarivirtauskaapin sisalle. Kalvon kuivuttua se kasitellåan huuhtelemista ja kiinnittamista vårten 35-100-prosenttisella etanolilla tai isopropanolilla ja sen jålkeen jåljelle jåånyt alkoholi ja adsorboitumattomat ylimaaraiset osat positetaan kåsittelemalla steriililla kudosviljelmåalustalla.

Substraatti voidaan kåyttåå vålittomasti tai se voidaan kuivata sailyttamistå vårten. Kalvoon kiinnittyneet solut tai muut biologisesti aktiiviset osaset saadetaån haluttuihin konsentraatioihin ja lisåtaan substraattiin seerumia sisaltåmattdmåsså tai seerumia sisaltavåssa alusta/ssa. Kun kysymys on solujen kiinnittamisestå, eri tavoin ajoitettujen jaksojen jalkeen soluista arvioidaan niiden kiinnittymine, kasvu tai toiminta tai solut kåsitellaån kokeiden, joissa solut on kiinni-tettåvå kudosviljelmaån, maaraåmien tavoitteiden mukai-sesti.

12

Haluttaessa voidaan toimia påinvastoin. Bioliimaava polyfenoliproteiini voidaan kiinnittaa biologisesti aktiivisiin osasiin ja sen jålkeen saadut biologisesti aktiiviset osaset voidaan kiinnittaa substraattiin. Tarkemmin sanottuna tåmå menetelma kåsittaå vaiheet, joissa: (1) dispergoidaan biologisesti aktiiviset osaset seerumittomaan liuokseen; (2) sekoitetaan steriilia formulaatiota, joka sisåltaå polyfenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino_% bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikko: NH2 HH,

I OH OH I

I I CHj Γ2 (Of (OJ T2 CHj OH OH V/ CH, I * I I * * I I 12 CH, CH, X CH-R CH, X X CH-R CH, CH, I I W I I \ / \ / i I 2 12

—f-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C'+K

II II II II II II II II II II 0000000000

MA LYS FRO/HYP SBR/THR TYR/DOPA PRO/HYP PRO/HYP SBR/THR TYR/DOPA LYS

jossa N on kokonaisluku vålillå noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmasta, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat vety ja metyyli; biologisesti aktiivisten osasten mainitun dispersion kanssa ja nain kiinnitetåån bioliimaava polyfenoliproteiini biologisesti aktiivisiin osasiin; (3) otetaan talteen saadut biologisesti aktiiviset osaset; ja 91037 13 (4) kiinnitetåån talteenotetut biologisesti aktiiviset osaset substraattiin.

ESIMERKKI 1

Solujen sitoutumistehokkuuden maårittaminen

Formulaatiot, jotka sisålsivåt joko 95 % bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formulaatio 1) tai 45 % bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formulaatio 2), kerrostettiin tasaisesti 35 mm muovisille petrimaljoille, joilla oli 2 kudosviljelmåå (9 cm ), annostuksella 50pg maljaa kohti 5-prosenttisessa (tilavuus/tilavuus) etikkahapossa, kuivattiin nopeasti, "kiinnitettiin" ja steriloitiin huuhtelemalla 100-prosenttisella etanolilla. Sen jalkeen maljat huuhdeltiin steriilillå, kolme kertaa tislatulla vedellå.

Solut valmistettiin kiinnittymismååritystå vårten seuraa-valla tavalla. Naudan sarveiskalvoendoteelisolut kåsitel-tiin trypsiinilla, so. proteaasilla, joka pilkkoo solun kiinnitysproteiinit, minka jalkeen kasvatettiin alaviljel-måna 5 % CO^ ilmassa -37°C:ssa kostutetussa inkubaattorissa. Ylimaaråinen seerumi ja alusta, jotka mahdollisesti håiritsevåt trypsiinikåsittelyå, poistettiin huuhtelemalla solujen monokerrokset seerumia sisåltåmåttomålla alustalla ja inkixboitiin 10 minuuttia 0,05 % trypsiini - 0,02 % etyleenidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA). Trypsiinin vaikutuksesta irronneet solut siirrettiin pipetilla ja sentrifugoitiin varovasti 250 x g voimalla. Saadut pelletit suspendoitiin uudelleen seerumia sisåltamattomaån minimialustaan (Earle'n suolat) mahdollisesti jaljelle jaåneiden seerumiproteiinien ja trypsiinin poistamiseksi solupinnoilta ja jalleen sentrifugoitiin.

14

Elåvien solujen mååråt saatiin kåyttåmållå vårieksluusio-testiå, jossa tyypilliset solumååråt suspendoitiin uudel-leen loppukonsentraatioon 2 x 10^ solua mlrssa minimialus-taa, jossa oli 15 % naudansikioseerumia. Solut siirros-tettiin kåsittelemåttomiin muovisiin kudosviljelmille tarkoitettuihin petrimaljoihin (kontrolli) ja kudosviljel-måmaljoihin, jotka oli kerrostettu bioliimaavalla poly-fenoliproteiinilla. Hetkilla 1, 2,5, 5, 12,5 ja noin 20 minuuttia valittiin sattumanvaraisesti koe- ja kontrol-limaljat kolminkertaisina kiinnittymåttomien solujen maaran maårittamiseen. Kiinnittymattomat solut pois-tettiin maljoilta huuhtelemalla ja niiden måarå las-kettiin punasolujen laskentamittarilla; kolminkertaisina laskettiin myos replikaattimaaråt soluista, joita oli kåytetty, mutta joita ei oltu lisatty maljoille. Tulokset laskettiin kiinnittyneiden solujen prosenttimåårånå våhentamålla kultakin maljalta saatujen kiinnittymåttomien solujen lukumåårå maljattujen solujen kokonaismååråstå.

Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty vertailutiedot, jotka ilmoittavat solujen kiinnittymisprosentin biolii-maaviin formulaatioihin. Nåmå tulokset on esitetty graafi-sesti kuviossa 1.

91037 15 TAULUKKO 2

Kiinnittymisvertailu muoviin ja formulaatioihin 1 ja 2

Aika (min.) Muuttuja Arvioitu kiinnittymis-% 5.0 Muovi 25

Formulaatio 1 62

Formulaatio 2 70 12,5 Muovi 76

Formulaatio 1 85

Formulaatio 2 87 20.0 Muovi 89

Formulaatio 1 97

Formulaatio 2 97

Solujen kiinnittymisen formulaatiossa 2, so. suurempi kollageenipitoisuus) havaitaan olevan jo 5 minuutin kuluessa yli 2 kertaa suuremman kuin solujen kiinnittymisen muoviin. Lisåksi solujen sitoutumiskapasiteetti bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin on kaikkina ajan-kohtina suurempi kuin solujen sitoutumiskapasiteetti muoviin. Vaikkakin tulokset ovat samankaltaiset formu-laatiolla 1, muut arvot viittaavat siihen, etta formulaatio 2 on parempi solujen kiinnittåmiskeinona ja kudosviljely-tapanal

Formulaatio 2 on hyvin stabiili pitkaaikaisessa sailytyk-sessa. Aminohappoanalyysin avulla testattaessa formulaa-tiolla 2 pysyivåt L-dopa/proteiini-suhteet stabiileina 4 kuukautta 4°C:ssa ja -20°C:ssa; kun taas formulaatiolla 1 havaittiin jopa 25 % lasku samanlaisissa olosuhteissa (taulukko 3).

16 TAULUKKO 3

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin prosenttimaåra, joka oli jaljellå annetulla hetkellå såilytet-taessa 4°C:ssa ja -20°C:ssa (maåritetty amino-happoanalyysin avulla)

Formulaatio 1 Formulaatio 2 3 kuukautta 4 kuukautta 3 kuukautta 4 kuukautta 4° 97 % 76 % 100 % 98 % -20° 97 % 82 % 104 % 100 %

Koska komponenttien stabiilisuus biokemiallisella tasolla on erittåin toivottavaa kudosviljelmåsystgeemeisså, formulaation 2 pååteltiin olevan parempi, kun tarkoituksena on lisåtå solujen kiinnittymistehokkuutta.

ESIMERKKI 2

Seerumin vaikutus solujen sitoutumis-voimakkuuteen ja tehokkuuteen

Kokeen tai måårityksen tavoitteista riippuen voidaan i tarvita enemraån tai våhemmån seerumia solujen kiinnittamisen aikana tai sen jålkeen. Seerumin vaikutus solujen sitoutu-miseen ja sitoutumisvoimakkuuteen testattiin kayttamallå soluja alustassa, joka sisalsi 15 % naudanseerumia (FBS) tai 0,5 % naudanseerumialbumiinia (BSA). Naudanseerumi on pååasiallinen FBS:ssa loydetty proteiinikomponentti. Kiinnittymisen voimakkuus arvioitiin epåsuorasti kyvystå tai kyvyttomyydesta poistaa kiinnittyneet solut trypsii-nin avulla substraateista, joihin ne oli kiinnitetty. Naudanseerumialbumiinin kaytetty konsentraatio vastasi konsentraatiossa, joka on 0,5-1-prosenttisessa FBSrssa. Kudosviljelyyn tarkoitetut petrimaljat paallystettiin bioliimaavan polyfenoliproteiinin formulaatiolla 2 esi- ti 17 91037 merkin 1 mukaisella tavalla. Solut siirrostettiin tripli-kaatteina muovisille ja liimalla påållystetyille petri-maljoille ja kiinnittymattomat solut poistettiin huuh-telemalla hetkilla 2,5, 5 ja 15 minuuttia. Kiinnittymattomat solut trypsiinikåsiteltiin kayttåmålla 10 minuuttia 0,8 ml 0,05% trypsiini-0,02% EDTA ja siirrettiin koe- putkiin, jotka sisålsivat 0,2 % naudanseerumia, milla estettiin trypsiinin vaikuttaminen edelleen soluihin.

Talteenotetut kiinnittyneet ja kiinnittymattomat solut laskettiin kåyttåmalla punasolujen laskentamittaria. Kiinnittyneiden solujen maaråa koskevat arvot laskettiin prosentteina kultakin maljalta saatujen solujen kokonais-måaråstå. Nåma arvot on koottu taulukkoon 4.

TAULUKKO 4

Seerumin vaikutus solujen talteenottoon muovista ja bioliimaavasta polyfenoliproteiinista

Aika Kiinnitty- Solujen tal- Arvioitu kiin- (min. ) Muuttuja mis-% teensaétmis-% nittymis-% 2,5 FBS-muovi 2 100 2 FBS-bioliima 2 85 2 BSA-muovi 6 79 26 BSA-bioliima 31 105 28 5.0 FBS-muovi 5 82 22 FBS-bioliima 49 99 50 . BSA-muovi 31 51 65 1 BSA-bioliima 28 60 56 15.0 FBS-muovi 65 83 71 FBS-bioliima 74 74 81 BSA-muovi 40 33 77 BSA-bioliima 62 39 85

Taulukon 4 arvoista voidaan havaita, etta solut kiinnit-tyvat varhaisina ajankohtina voimakkaammin bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin kuin muoviin. Lisaksi voidaan havaita, etta jos FBS alustassa korvataan naudanseerumi- 18 albumiinilla, trypsinisointikåsittelyllå saadaan soluja våhemmån talteen. Tåmå havaitaan erityisesti ajankohtina, joina solut vakiinnuttavat lujan ankkuroitumisen (5 minuuttia) ja alkavat litistyå (15 minuuttia). Hetkellå 15 minuuttia talteenotto oli niinkin alhainen kuin 33 % ja 39 % naudanseerumialbumiinia muovilla ja liimalla paallystetyissa petrimaljoissa verrattuna 83 ja 74 % talteensaantiin kåytettåesså vastaavasti naudaanseerumia muovi- ja liimaviljelmisså. Maljojen visuaalinen tutkiminen mikroskoopilla vahvisti nåmå havainnot. Tåmån tutkimuksen muut havainnot osoittavat, etta tåssa esimerkisså kuvattu solujen kiinnittymisen suora arviointi korreloi voimak-kaasti epåsuoramittauksen kanssa, jossa lasketaan vain kiinnittymåttomat solut (kts. esimerkki 1 laskemisen yksityiskohtien suhteen). Kuvio 2 havainnollistaa nåitå loytojå graafisesti.

ESIMERKKI 3

Kiinnittymåttomien solujen kiinnittåminen bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin Pååosa solutyypeistå, jotka on otettu talteen kudoksesta irtoamisen jalkeen, kykenevat soluviljelmaån vietynå kiinnittymaån vaihtelevilla tehokkuuksilla muovisubs-traatteihin. Eråat solutyypit eivat kuitenkaan kiinnity muovisub^traatteihin. Kyky kiinnittåå tållaisia soluja saattaisi olla edullista, koska nain saataisiin keino diagnostisiin ja tutkimusmåarityksiin, joissa nåmå solut on immobilisoitava, ja tapa voida kiinnittåå solut bioreak-torin suodattimiin solutuotteiden talteenottoa vårten. Lisåksi se yksiselitteisesti osoittaisi bioliimaavan polyfenoliproteiinin mahdollisuuden toimia kudosviljelman kiinnitystapana.

Solulinja U937 on ihmisen histiosyyttinen lymfoma, joka saatiin nesterinnasta eristetyistå pahanlaatuisista soluista. Nåmå solut kasvavat suspensiossa jatkuvana RPMI 1640 kudosviljelyalustassa, joka on tåydennetjty 10 %:lla naudansikioseerumia. U937-solut kiinnittyvåt li 91037 19 huonosti muoviin seerumin låsnåollessa.

Kudosviljelyyn tarkoitetut petrimaljat (35 mm maljat) påållystettiin esimerkisså 1 hahmotelluilla menetelmillå bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla. U937-solut siirret-tiin sentrifuugiputkiin ja preparoitiin esimerkisså 1 kuvatulla tavalla. Solut siirrostettiin muovisille kudosviljelymaljoille ja maljoille, jotka oli påållys-tetty 100 ug:lla bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (for-mulaatio 2). Kiinnittymistehokkuus arvioitiin triplikaat-teina (kts. esimerkki 1) hetkillå 5, 12,5 ja 20 minuuttia. Taulukon 5 tulokset (jotka on esitetty graafisesti ku-viossa 3) osoittavat selvåsti bioliimaavan polyfenoli-proteiinin vaikutuksen U937-solujen kiinnittymiseen.

Solut kiinnittyivåt odotetusti huonosti kontrolleina toimiviin muovimaljoihin; mutta 5 minuutin sisållå 75 % siirrostetuista soluista oli kiinnittynyt påållystettyihin maljoihin ja 20 minuutin sisållå soluista oli kiinnittynyt 87 % påållystettyihin maljoihin.

TAULUKKO 5 U937-solujen prosentuaalinen kiinnittyminen

Aika (min.) Påållyståmåton Formulaatiolla 2 påål- _ muovi_ lystetty muovi_ 5 3 % 75 % 12,5 i 5 % 84 % 20 8 % 87 % ESIMERKKI 4

Solukasvun vertailu bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla ja kaupallisesti saatavissa olevilla solujen kiinnitys-faktoreilla

Solujen kiinnittyminen substraattiin on vain ensimmåinen 20 vaatimus solujen kasvattamiselle viljelmissa in vitro. Toinen ja ehkå tårkeåmpikin vaatimus on, etta solut kasvavat. Kudoksen dissosioituessa talteensaatujen solujen lukumåårå on kuitenkin usein erittåin alhainen. Solujen alhainen siirrostusmååra voi vaikuttaa haitallisesti viljelmien vakiintumiseen, koska alhaisempi solumaåra alentaa mahdollisuutta jååda eloon ja kiinnittya. Tama perustuu yksinkertaisiin matemaattisiin todennakoisyyk-siin ja siihen tarpeeseen, etta solujen itse on muodos-tettava metaboliitteja (tiheydesta riippuvia metaboliit-teja), jotka vaaditaan solujen kiinnittymiseen ja kasvuun. Kun solujen måarat ovat alhaisia, on epåtodennakoisempåå, ettå riittåvåsti soluja kiinnittyy, mika itsessåån on valttamatonta solujen litistymiselle substraatille pallo-maisesta muodosta. Litistymisen tapahduttua voi metabo-loituminen seurata niin, etta se edelleen tekee alustan sopivaksi solujen kasvua ja jakaantumista vårten.

Solujen, jotka joko eivat helposti kiinnity ja/tai joiden siirrostustiheys on alhainen, kiinnittymisen ja jakautumi-sen lisååmiseksi kaupallisesti on saatavissa erilaisia peptidi- ja proteiini-kiinnitysfaktoreita. Naihin kuuluvat kollageeni, laminiini, poly-D-lysiini ja fibronektiini. Kaikki nåmå faktorit toimivat biologisesti inerteilla substraatéilla vaihtelevissa måårin, riippuen siirroste-tusta solutyypistå. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin nåiden tekijoiden kasvua alhaisilla siirrostustiheyk-silla sallivaa tehokkuutta verrattiin siirrostamalla naudan sarveiskalvoendoteelisoluja tiheydellå 250 solua kudosviljelmaan tarkoitettua petrimaljaa kohti (halkaisija 35 mm, 9,65 cm ) joko muovilla, bioliimaamalla polyfenoli-proteiinilla, kollageenilla, laminiinilla, poly-D-lysii-nillå tai fibronektiinillå. Solujen annettiin kasvaa 5 paivaå, minkå jålkeen kustakin nåista muuttujasta arvioitiin pesåkkeen koot (solujen lukumååra pesåkettå kohti) ja pesåkkeiden lukumåårå maljaa kohti vårjååmållå il 21 91037 solut kristallivioletilla. Saatujen arvojen avulla måaritettiin kunkin nåiden faktorin vaikutus kiinnittymiseen (pesåkeiden måårå) ja kasvuun (pesåkkeiden koko).

Solut ja bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla påållystetyt maljat valmistettiin esimerkisså 1 kuvatulla tavalla.

Maljojen påållyståminen muilla kiinnitysfaktoreilla suoritettiin faktoreiden valmistajien ehdottamilla menetel-millå.

Kollageeni - Kollageenilla paallystetyt maljat valmistettiin laimentamalla 1 osa kylmaa (4°C) kollageenidis-periota 6 osaan kylmaa 50-prosenttista metanolia. Tåtå seosta sekoitettiin voimakkaasti useita minuutteja ja pipetoitiin petrimaljaile niin, etta vain maljan pohja peittyi. Kollageeni poistettiin 20 sekunnin sisålla imun avulla ja kuivaamista vårten malja kallistettiin ylosalaisin 30° kulmassa kantta vasten. Sen jålkeen, kun maljoja oli kuivattu niihin koskematta 1 tunti lami-naarivirtauskaapissa, maljat olivat kåyttovalmiita.

Laminiini - Laminiinia saadaan 1 mg måårisså 1 ml:ssa 50 mM tris(hdyroksimetyyli)aminometaania fysiologisessa suolaliuoksessa. Sen jålkeen, kun laminiiniliuos oli hitaasti sulatettu -20°C:sta 0 - 4°C:een, petrimaljoille pipetoitiin 10 - 15 ug laminiiniliuosta 0,5 ml:ssa 0,01 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4. Maljat kuivattiin 37°C:ssii. Vålittomåsti maljojen kuivuttua ne ovat kåyttovalmiita.

Fibronektiini - Fibronektiiniå saadaan 1 mg måårinå lyofilisoituna jauheena. Ennen kåyttoå fibronektiinin annetaan tasapainoittua huoneen låmpotilaan 4°C:ssa såilyttåmisen jålkeen. Jauhe rekonstituoidaan 1 ml:11a steriiliå tislattua vettå ja annetaan seistå 30 minuut-tia jauheen liuentamiseksi. Jokaiseen maljaan lisåtåån 10 - 20 jig fibronektiini liuos ta 0,5 ml:ssa ja annetaan 22 kuivua ilmassa. Malja on tåmån jålkeen valmis soluilla siirrostettavaksi.

Poly-D-lysiini - Poly-D-lysiiniå saadaan 5 mg måårinå lyofilisoituna jauheena. Ennen kayttoå tåmån jauheen annetaan tasapainoittua huoneen låmpotilaan 4°C:ssa såilyttåmisen jålkeen. Maljat påallystetåan 50 mg:11a 1 ml:ssa steriiliå tislattua vettå ja annetaan seistå huoneen låmpotilassa 5 minuuttia. Tåmån jålkeen liuos imetåån pois imulla ja maljat huuhdellaan kaksi kertaa 1,5 ml:11a steriiliå tislattua vettå. Jokaisen huuhtelun jålkeen neste poistetaan imulla tåydellisesti. Maljat kuivataan ja kåytetåån vålittomåsti.

Kullakin faktorilla siirrostettujen solujen maljautumis-tehokkuus arvioidaan solujen kristallivioletilla vårjåå-misen jålkeen. Tåmå saadaan aikaan huuhtelemalla pesåkkeitå sisåltåvåt maljat ensin seerumia sisåltåmåttomållå mediu-milla ylimååråisten proteiinien poistamiseksi ja solut kiinnitetåån 10 minuutin aikana 10-prosenttisella neutraa-lilla puskuroidulla formaliinilla. Sen jålkeen formaliini poistetaan maljoilta imun avulla ja maljoille lisåtåån 7 minuutiksi 0,1 % kristalliviolettia vesijohtovedesså. Vålittomåsti vårjååmisen jålkeen kristallivioletti kaadetaan pois ja soiut huuhdellaan dekantterilasissa juoksevalla vesijohtovedellå ylimååråisen vårjåysaineen poistamiseksi. Maljojen tåydellisen kuivumisen jålkeen lasketaan kutakin muuttujaa vastaavat pesåkkeet duplikaatteina; samoin lasketaan solut 10 mielivaltaisesti valitussa pesåkkeesså maljaa kohti. Tåstå esimerkistå saadut arvot on annettu taulukossa 6 ja esitetty graafisesti kuviossa 4 pylvasdiagrammeina. Voidaan havaita, ettå pesåkkeiden lukumåårå kuviossa 4 maljoilla, jotka on påållystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla (U), on yhtå hyvå vain poly-D-lysiinillå (PDL). Kaikki muut faktorit, mukaanlukien kollageeni (C), muovi (P), fibronektiini

II

91037 23 (F) ja laminiini (L), antavat verrattaessa huonoja tuloksia.

Samalla tavalla pesåkkeiden keskiraååråinen måårå pesåkettå kohti maljoilla, jotka on påallystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, on yhta hyva vain poly-D-lysii- nilla,. ja kollageenilla, muovilla, fibronektiinillå ja laminiinilla saadaan huono kasvutehokkuus. Vaikkakaan mitåån raerkittåviå eroja ei havaittu bioliimaavan poly- fenoliproteiinin ja poly-D-lysiinin vålillå (mahdollisesti, koska kummassakin nåistå molekyyleistå oli suuri måårå lysiiniå), bioliimaavan polyfenoliproteiinin kåytto kiinnitysfaktorina on kuitenkin edullisempaa substraat- tina johtuen sen kyvystå (1) korvata vettå, (2) kiinnittya materiaaleihin, mukaanlukien metalliin ja aineeseen i R)

Teflon (esimerkiksi prosteettiset laitteet), (3) olla kaytettåvisså in vivo ja in vitro ja (4) muodostaa hyvin lujia sidoksia perustuen L-dopaan, hydroksyloitui-hin aminohappotåhteisiin ja lysiiniaminohappotahteisiin.

TAULUKKO 6

Pesåkkeiden maåra ja koko solujen kasvettua erilaisilla kudosviljelyalustoilla

Pesåkkeitå per Solujen keskim. maåra muuttuia - påivå 5 pesåkettå kohti_

Formulaatio 2 100 147

Poly-D-lysiini 107 173

Kollag^eni 27 101

Muovi 57 106

Fibronektiini 47 67

Laminiini 0 20 ESIMERKKI 5

Bioliimaavan polyproteiinin kåytto keinotekoisissa veri-suonisiirrosteissa

Polytetrafluorietyleeni (PTFE) on substraatti, jota 24 yleisesti kåytetåån verisuonisiirrosteisiin. Tåman mate- riaalin kåyttoon liittyva pååongelma on se, ettå veri- suonisolujen siirrostaminen PTFEtlle on erittåin vaikeaa sen suuresta hydrofobisuudesta johtuen. Monilla siirros- teilla solujen yhtenåinen monokerros sen pinnalla eståisi hyytymån muodostumisen. Bioliimaavan polyfenoliproteiinin tehokkuus toimia våliteaineena, joka kiinnittåå endoteeli- solut polytetrafluorietyleeniin, testattiin siirrostamalla verisuonisiirrostemateriaali bioliimaavalla polyfenoli- proteiinilla (formulaatio 2) kåyttåmållå sitå 200 2 ug cm kohti. Sen jålkeen annettiin 500.000 endoteelisolun kiinnittya bioliimaavaan polyfenoliproteiiniin. Solut (R) siirrostettiin myos Teflonille , jota ei oltu paallys-tetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla; ja Teflonille' , joka oli påållystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, kåyttåmallå kontrollina sitå, ettå soluja ei siirrostettu.

15 minuutin kiinnittymisajan jålkeen ylimååråiset solut huuhdeltiin verisuonisiirrostemateriaalista ja verisuonisiirrosteet kiinnitettiin formaliinilla, vårjåttiin kristallivioletilla ja kuivattiin esimerkin 4 mukaisesti. Tåmån esimerkin tulokset on annettu kuviossa 5. Ne osoittavat, ettå vaikkakin jonkin verran vårjåyty- (R) mistå voidaan havaita sekå Teflonilla , joka on kåsitelty bioliimaayalla polyfenoliproteiinilla, ilman soluja (R) (nåyte 1) ettå Teflonilla , jota ei ole kåsitelty liimalla, mutta joka on siirrostettu soluilla (nåyte 2), ylivoimaisesti suurin vårjåytyminen tai solujen (R) kiinnittymienn tapahtui kåsitellyllå Teflonilla , joka sisålsi endoteelisoluja (nåyte 3). Bioliimaavat polyfenoliproteiinit lisååvåt siten verisuonisiirros- / teiden siirrostumsita endoteelisoluilla, jolloin saadaan mekanismi, jonka avulla hyytymån muodostuminen voidaan minimoida tai poistaa verisuonisiirrosteleikkauksen jålkeen.

ti 91037 25 ESIMERKKI 6

Menetelma, jolla uutetaan 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa polvfenoliproteiinia

Yhdistetåån 300 g merisimpukan, M. edulis, jalkoja ja 900 ml neutraalisuolapuskuria, joka sisåltaa 1 M natrium-kloridia, 0,05 M tris(hydroksimetyyli)aminometaania (pH 7,5), 1 raM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM N-etyylimaleiini-imidiå, 0,025 M etyleenidiamiinitetra-etikkahappoa ja 1 mM kaliumsyanidia, ja 9 ml vaahdonesto-konsentraattia kaupallisessa sekoittimessa suurella nopeudella ja sekoitetaan hyvin, jolloin bioliimaava polyfenoliproteiini saostuu. Seosta sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Pelletti suspendoidaan uudelleen 900 ml:aan 5-prosenttista etikkahappoa kåyttåmållå suurinopeuksista sekoitinta. Bioliimaava polyfenoliproteiini pysyy supernatantissa sentrifugoitaessa 45 minuuttia nopeudella K.rpm. Supernatanttia laitetaan noin 1000 ml jaahauteeseen samalla koko ajan sekoittaen. Super-natéuittiin, jota sekoitetaan, lisåtåån 5 ml 2M natrium-boraattia ja 95 ml 5M natriumkloridia. Tata seosta sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Uusi super-natantti kasitellaan samalla tavoin kuin edellå lisaamalla neljå kertaa niin paljon 2M natriumboraattia ja 5M natriumkloridia. Seosta sentrifugoidaan jalleen 15 minuuttia nopeudella 10 K. Pelletti suspendoidaan uudelleen seuraa-vaan seokseen: 7,5 ml 2M natriumboraatti, 50 ml 5M natrium-kloridi, 50 ml tislattu vesi, 37,5 ml 8M urea 5-prosentti-sessa etikkahapossa ja 5,6 ml vakeva etikkahappo. Seosta sekoitetaan hitaasti noin 16 tuntia. Suspensiota sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 10 K rpm. Supernatantti saåstetaan ja dialysoidaan (kalvojen erotusrajana mole-kyylipaino 8-12K) 5-prosenttista etikkahappoa vasten noin 16 tuntia. Aminohappoanalyysi osoittaa, etta uute sisåltaa 45-prosenttisesti puhdasta bioliimaavaa poly- 26 fenoliproteiinia. Uutteen puhtauden mååråå suoritettujen uuttojen lukumåårå. Puhtaan bioliimaavan polyfenoliproteii-nin saanto pienenee uuttojen måarån kasvaessa. Kaikki tåsså kuvatut menettelyt suoritettiin 4°C:ssa.

Kromatoqraafinen jatkopuhdistus;

Nestekromatografiaa kåytettåesså SE Sephadex-hartsit pidattåvåt polyfenoliproteiinit 5,5% guanidiinihydro-kloridissa (GuHCl) 5-prosenttisessa etikkahapossa. Sen jålkeen proteiini eluoidaan hartsista 5,5 - 20 % GuHCl-gradientilla etikkahapossa, piikkien alueet yhdistetåån ja dialysoidaan GuHCl:n poistamista vårten 5-prosenttista etikkahappoa vasten. Proteiinit såilyvåt kaikkein stabii-limmin 4°C:ssa 5-prosenttisessa etikkahapossa. Ennen niiden kayttoå liimana, in vivo tai kosketuksessa elåvien solujen kanssa bioliimaavat polyfenoliproteiinit on dialysoitava vetta vasten liuoksen pH-arvon nostamiseksi lahelle neutraalisuutta ja preparaatti on våkevoitava valille 3 ja 10 mg/ml. Tåma suoritetaan kayttåmållå ultrasuodatuskalvoa, jonka hiukkaskoko-erotusraja on 30.000 tai pienempi. Tama ei ole tarpeen, kun bioliimaavat polyfenoliproteiinit kuivataan ennen kayttoa inertin substraatin paalle.

ESIMERKKI 7

Bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla, puhtaus 45 % (formulaatio 2), immobilisoitiin hepariinia, mukopoly-sakkaridi, jolla on spesifisia antikoagulanttiominai-suuksia, ja peroksidaasia, peroksidia hapettava proteiini-entsyymi. Tamån tarkoituksena oli osoittaa, ettå muitakin aineita voidaan tehokkaasti sitoa muoviesineisiin bioliimaavan polyfenoliproteiini-vålivaiheen kautta.

II

91037 27

Kummassakin tapauksessa kuivattiin muovisten kudosviljely- 2 maljojen, joiden pinta-ala oil 2 cm , påålle 7 ug biolii- 2 maavaa polyfenoliproteiinia 3,5 ug/cm loppukonsentraa-tioon. Proteiini pestiin 100-prosenttisella etanolilla ja sen jalkeen kaksi kertaa vedella, kuten on kuvattu esimerkissa 1.

Hepariinia lisattiin maljoille viitena eri konsentraa-tiona: 90, 60, 30, 15 ja 5 yksikkoa/malja. Hepariinia kuivattiin myos kasittelemåttomien muovimaljojen paålle.

Kaikki testit suoritettiin kaksinkertaisena. Irrallisesti sitoutunut hepariini poistettiin pesemalla maljat ennen kayttoå 0,1M fosfaattipuskurilla.

Hepariiniaktiivisuus maaritettiin lisaåmållå tuoretta ihmisverta kuhunkin maljaan 0,5 ml maljaa kohti ja inku-boimalla 23°C:ssa. Hyytymisajat maaritettiin silmamåårai-sesti ja tallennettiin. Tulokset on annettu taulukossa 7.

TAULUKKO 7 1t

Hyytymisaika (minuuttia)

Yksikkoa Mukana bioliimaava liman bioliimaavaa hepariini polvfenoliproteiini polyfenoliproteiinia

90 **NC NC

i

60 NC NC

30 NC 61,104 15 NC 10,29 5 NC 30,27 0 28, 29 13,11

Annetut luvut ovat kaksinkertaisia måarityksia NC = Ei hyytymista 24 tunnin kuluttua 28

Hepariini oli erittain hyvin immobilisoitu muoviin kåy-tettåesså bioliimaavaa polyfenoliproteiinia. Mitåån hyytymistå ei havaittu 24 tunnissa edes hepariinin alhai-simmalla annoksella. Kaikki alle 60 yksikon annokset hyytyivåt 2 tunnissa tai nopeammin maljoissa, joissa hepariini oli kiinnitetty suoraan muoviin. Korkeammilla annoksilla hepariinia sitoutuu niin paljon muoviin, ettå hyytyman muodostuminen estyy.

Peroksidaasi immobilisoitiin samalla tavalla: Peroksidaasia lisåttiin viisi eri konsentraatiota, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,025 |ig/malja, seka paallyståmattomiin muovimaljoihin etta muovimaljoihin, jotka oli paållystetty bioliimaavalla polyfenoliproteiinilla (duplikaatteina). Kuten hepariinia-kin kaytettaessa poistettiin irrallisesti sitoutunut entsyymi pesemallå 0,1 M fosfaattipuskurilla.

Peroksidaasin måårityksesså lisåtåån substraattiseos, peroksidi ja O-fenyleenidiamiinia fosfaattipuskuroituun kyllåstettyyn suolaliuokseen. Substraattiseos sisåltaå ml:ssa 100 ^il peroksidia (40 μΐ 30-prosenttista peroksi-dia 50 ml:ssa vetta) ja 100 ul O-fenyleenidieuniinia (10,7 mg 8,56 ml:ssa vetta) ja 800 fil fosfaattipuskuroitua kyllåstettyå suolaliuosta. Jokaiseen maljaan lisåtåån 1 ml. Inkuboidaan 5 minuuttia 23°C:ssa, minkå jålkeen reaktio pysåytetåån lisååmållå 100 μΐ 4 N rikkihappoa. Mååritys on kolorimetrinen aallonpituusoptimin ollessa 490 nm. Taulukossa 8 on annettu duplikaatioarvot ab-sorbanssiyksikkdinå aallonpituudella 490 nm.

29 91037 TAULUKKO 8

Peroksidaasi, Mukana bioliimaava Ilman bioliimaavaa ug polyfenoliproteiini polyfenoliproteiinia 1,0 1,5, 1,3 1,4, 1,2 0,5 0,6, 0,7 0,5, 0,5 0,1 0,2, 0,2 0,05, 0,06 0,05 0,1, 0,1 0,04, 0,04 0,025 0,05, 0,05 0,04, 0,04

Kuten hepariinallakaan, ei mitaan paranemista havaita korkeammissa konsentraatioissa kaytettaessa bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, koska entsyymia sitoutuu riittåvasti muoviin. Merkittava paraneminen tai talteenotto havaitaan alhaisemmissa konsentraatioissa kaytettMesså bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

ESIMERKKI 8

Bioliimaavan polyfenoliproteiinin on havaittu menestyk-sellisesti toimivan histologiassa ja sytologiassa kudosten ja solujen substraattina. Tåssa esimerkissa kaytettiin 45-prosenttista bioliimaavaa polyfenoliproteiinia (formu-laatio 2) kiinnittåmåån lasilevyille endoteelisoluja sisaltåviå naudan Descemet-membraanivalmisteita. Kokonaiset sarveiskalvot poistettiin juuri tapetui1ta naudoilta ja laitettiin joko fysiologiseen suolaliuokseen tai 10-prosenttiseen neutraaliin puskuroituun formalii-niin. Sen jalkeen Descemet-membraani poistettiin varovasti vetåmalla sarveiskalvon takaosasta. Kudos siirrettiin lasilevyille (esipuhdistettu 5-prosenttisella etikkahapolla) ja påållystettiin 50 ug:11a bioliimaavaa polyfenoliproteiinia. Kudospreparaatit kuivattiin sen jalkeen bioliimaavan polyfenoliproteiinin paålle huoneen låmpoti-lassa tai 55°C maljoille 20 minuutin aikana. Kun kaytettiin formaliinilla kiinnitettya kudosta, kudoksesta 30 poistettiin ylimååråinen formaliini huuhtelemalla kyllås-tetyllå suolaliuoksella ennen bioliiinaavaan polyfenoli-proteiinin kiinnittåmistå. Kuivaamisen jålkeen kudos-lasilevyvalmisteet kasiteltiin formaliinilla 5 minuutin ajan kudosten kiinnittåmiseksi bioliimaavaan polyfenoli-proteiiniin. Talla tavoin kåsitellyt kudokset pysyivat bioliimaavaan polyfenoliproteiinin påållå viikkokausia vesiliuoksissa. Kudokset pysyivat lisåksi yha ehjinå vielå senkin jålkeen, kun niitå oli voimakkaasti sekoi-tettu ravistelemalla vedesså, kyllåstetysså suolaliuok-sessa, laimeassa ja 100-prosenttisessa etanolissa ja ksyleenisså. Kun bioliimaavaa polyfenoliproteiinia ei ollut mukana, kudokset eivåt pysyneet kiinni lasilevyisså edes ensimmåisesså formaliinikåsittelysså.

i li

Claims (23)

91037 31

1. Henetelmå biologisesti aktiivisten osasten kiinnittåmiseksi substraati11e kåytettåvåksi in vitro. tunnettu siitå, ettå (1) påål1ystetåån substraatti steriilillå formulaatiolla, joka sisåltåå polyfenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino-% puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikko: nh2 nh2 I OB OH I CH2 I I CH2 Γ* (6? (Oj ? CH, OH \/ OH CHj I * I I X X I I I CH, CH, CH-R CH, Xs X CH-R CH, CH, I I \ / I I \ / \ / I I I —f-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C—K, II II II II II II II II II II OOOOOOOOOO AU LTS PRO/HYP SBR/THR TTR/DOPA PRO/HYP PRO/HYP SKR/THR TYR/DOPA LYS jossa N on kokonaisluku vålillå noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan påållyste substraatille; (3) kiinnitetåån påållyste substraatille; (4) huuhdellaan påållystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymåttomien ylimååråisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan biologisesti aktiivisia osasia påål1ystety11e substraati11e, jolloin biologisesti aktiiviset osaset kiinnit- tyvåt påål1ystettyyn substraattiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu o siitå, ettå substraatti påållystetåån subsraatin cnr kohti 0,1 - 2 plrlla formulaatiota, joka sisåltåå noin 10 - 60 pg/μΐ bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå påållyste kiinnitetåån substraati1 le huuhtelemalla 32 substraatti vedettomål1å, biologisesti yhteensopival1a steri-loivalla mediumilla.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelma, tunnettu siitå, ettå steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen eta-nol i .

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelma, tunnettu siitå, ettå steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen isopro-panoli.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå ylimååråisten ainesten poistamiseksi påållystetty substraatti huuhdellaan vedellå tai puskuri1iuoksel1 a.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå substraatti on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat synteettiset polymeerimateriaal it, lasi, metallit ja mikro-huokoiset suodattimet.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå substraatti on polytetrafluorietyleeni.

9. Menetelmå elåvien solujen kiinnittåmiseksi substraattiin kåytettåvåksi in vitro, tunnettu siitå, ettå (1) påålly^tetåån substraatti steriilillå formulaatiol1 a, joka sisåltåå pblyfenoliproteiinia, jossa on 35 - 100 paino-% puh-dasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapeptidiyksikko: nh2 nh2 I OH OH I CH2 I I ch2 T2 (OJ [Oj Γ2 CH, OH OH CHj I X I I * * I I I CH, CH, /^X CH-R CH, X X CH-R CH, CH, I I \ / I I w \ / I I I -f-NH-CH-C-HH-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-HH-CH-C-H-CH-C-N-CH-C-HH-CH-C-HH-CH-C-NH-CH-C-h, il ii ii n ii ii ii ii u 11 OOOO OOO o o o ALA LTS PRO/HTP SXR/THR TTS/DOPA PRO/HTP PRO/HYP S1R/THR TTR/DOPA LYS ii 91037 33 jossa N on kokonaisluku vålilla noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat vety ja metyyli; (2) kuivataan påållyste substraati11 a; (3) kiinnitetåån påållyste substraatilla; (4) huuhdellaan påållystetty substraatti substraattiin lujasti kiinnittymåttomien y1imååråisten ainesten poistamiseksi; ja (5) laitetaan elåviå soluja påål1ystetyl1e substraati11e, jol-loin solut kiinnittyvåt påål1ystettyyn substraattiin ja suo-rittavat ravitsevassa ympåristosså normaaleja solun metabolia-toimintoja.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå substraatti påål1ystetåån substraatin cm^ kohti 0,1 - 2 pl:lla formulaatiota, joka sisåltåå noin 10 - 60 pg/μΐ bioliimaavaa polyfenoliproteiinia.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå påållyste kiinnitetåån substraattiin huuhte-1 emal la substraatti vedettomållå biologisesti yhteensopival1 a steriloivalla mediumilla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen etanoli.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå steriloiva medium on 30 - 100 prosenttinen isopropanoli.

14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t - t u siitå, ettå ylimååråiset ainekset poistetaan huuhtelemal-la påållystetty substraatti steriilillå vesipitoisella seeru-mittomalla kudosviljelymediumilla. 34

15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t - t u siitå, ettå ylimååråiset ainekset poistetaan huuhtelemal-la påållystetty substraatti vedellå tai puskuri1iuoksel 1 a .

16. Patentt i vaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå elåvåt solut laitetaan påål1ystety11e subs-traatille seerumipitoisessa mediumissa.

17. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå elåvåt solut laitetaan påål1ystetyl1e subs-traatille seerumittomassa mediumissa.

18. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, t u η n e t - t u siitå, ettå substraatti on valittu ryhmåstå, johon kuulu-vat synteettiset polymeerimateriaalit, lasi, metallit ja mikrohuokoiset suodattimet.

19. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, t u η n e t -t u siitå, ettå substraatti on polytetrafluorietyleeni.

20. In vitro-soluien viljelyjårjestelmå, tunnettu siitå, ettå siihen kuuluvat: substraatti; sen påållå oleva påållyste steriilistå formulaatiosta, joka sisåltåå poly- fenoliproteiinia, jossa on 35 - 100 paino-% puhdasta biolii-maavaa polyfenoliproteiinia , jossa on toistuva dekapeptidi-yksikko: / NH, MHj I OH OH I ch2 i I r· (6j (dj r ch, oh oh \/ ch2 i x I I x x I I I CH, ch, X CH-R CH, X x CH-R CH, CH, I I W I I \ / \ / I I I —(-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-+J, II II II II II II II II II II o o o o ooo o o o ALA LTS PRO/HYP SER/THR TYR/DOPA PRO/HYP PRO/HYP SER/THR TYR/DOPA LYS jossa N on kokonaisluku vålillå noin 10 - noin 100 ja jossa kukin X on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon 91037 35 kuuluvat hydroksyyli ja vety, ja jossa kukin R on toisistaan riippumatta valittu ryhmåstå, johon kuuluvat vety ja metyyli; elåvåt solut, jotka on kiinnitetty påållystettyyn substraat-tiin; ja solujen kanssa kosketuksessa oleva ravitseva medium, jolloin solut suorittavat normaaleja solun metaboliatoiminto-ja.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen solujen viljelyjårjestel-må, tunnettu siitå, ettå substraatti on valittu ryhmastå, johon kuluvat synteettiset polymeerimateriaalit, lasi, metal lit ja mikrohuokoiset suodattimet.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen solujen vi 1jelyjårjestel-må, tunnettu siitå, ettå substraatti on polytetra- fluoriety1eeni.

23. Menetelmå biologisesti aktiivisten osasten kiinnittåmisek-si substraattiin kåytettåvåksi in vitro, tunnettu siitå, ettå (1) dispergoidaan biologisesti aktiiviset osaset seerumitto-maan liuokseen; (2) sekoitetaan steriiliå formulaatiota, joka sisåltåå poly-fenoliproteiinia, jossa on noin 35 - 100 paino-% puhdasta bioliimaavaa polyfenoliproteiinia, jossa on toistuva dekapep-tidiyksikko: NHj NH2 I OH OH I CTj I 1(¾ i ·2 (oj (oj CH, OH \/ OH CH, 36 biologisesti aktiivisten osasten mainitun dispersion kanssa, ja nåin kiinnitetåån bioliimaava polyfenoliproteiini biologisesti aktiivisiin osasiin; (3) otetaan talteen saadut biologisesti aktiviiset osaset; ja (4) kiinnitetåån talteenotetut biologisesti aktiiviset osaset substraattiin. /' 91037 37