JP2507882B2 - 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法 - Google Patents
外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、外部蛋白性増殖因子を無添加の無血清培地
中で、自己増殖する哺乳動物由来の外部蛋白性増殖因子
非依存性細胞株Tr−48に関する。
中で、自己増殖する哺乳動物由来の外部蛋白性増殖因子
非依存性細胞株Tr−48に関する。
従来、動物細胞培養による各種生理活性物質生産を行
う場合、その培養は牛胎児血清などを含む血清培地を使
用しておこなわれており、培地コストが高く且つ血清成
分のコンタミ等の問題から純度の高い生理活性物質の標
品を得ることが困難であった。そこで近年、血清を添加
しなくても細胞が増殖し得る無血清培地の開発が進めら
れ、化学的組成が明確で、培養再現性が高い種々の無血
清培地が報告されている〔特開昭60−196186号公報，特
開昭62−107795号公報〕。また、細胞レベルの改良も進
み、無血清培地中で長期継代培養可能に馴化された細胞
株が報告されている〔特開昭61〜289039号公報〕。しか
しこれら無血清培地といえども、各種生理活性物質生産
を行う場合には、培養時、インスリン，トランスフェリ
ン，エピダーマルグロースファクター（EVF），ナーブ
グロースファクター（NGF），フィブロブラストグロー
スファクター（FGF），オバリアングロースファクター
（OGF），インスリンライクグロースファクター（IGF）
およびソマトメジン等の外部蛋白性増殖因子の添加を必
要とし、製造コストを引き上げる原因となっていた。
う場合、その培養は牛胎児血清などを含む血清培地を使
用しておこなわれており、培地コストが高く且つ血清成
分のコンタミ等の問題から純度の高い生理活性物質の標
品を得ることが困難であった。そこで近年、血清を添加
しなくても細胞が増殖し得る無血清培地の開発が進めら
れ、化学的組成が明確で、培養再現性が高い種々の無血
清培地が報告されている〔特開昭60−196186号公報，特
開昭62−107795号公報〕。また、細胞レベルの改良も進
み、無血清培地中で長期継代培養可能に馴化された細胞
株が報告されている〔特開昭61〜289039号公報〕。しか
しこれら無血清培地といえども、各種生理活性物質生産
を行う場合には、培養時、インスリン，トランスフェリ
ン，エピダーマルグロースファクター（EVF），ナーブ
グロースファクター（NGF），フィブロブラストグロー
スファクター（FGF），オバリアングロースファクター
（OGF），インスリンライクグロースファクター（IGF）
およびソマトメジン等の外部蛋白性増殖因子の添加を必
要とし、製造コストを引き上げる原因となっていた。
このような状況下で、発明者らはヒト−コロニー形成
刺激因子（CSF）の生産においてそれまでに使用してい
たCSF生産性を有するヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細
胞TRC−29R株より、外部蛋白性増殖因子無添加無血清培
地でCSF生産を行える細胞株TRC−29SF株を開発した（次
世代産業基盤技術シンポジウム バイオテクノロジー予
稿集,5,第155頁（1987））。
刺激因子（CSF）の生産においてそれまでに使用してい
たCSF生産性を有するヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細
胞TRC−29R株より、外部蛋白性増殖因子無添加無血清培
地でCSF生産を行える細胞株TRC−29SF株を開発した（次
世代産業基盤技術シンポジウム バイオテクノロジー予
稿集,5,第155頁（1987））。
しかし、このTRC−29SF株も十分な外部蛋白性増殖因
子無添加無血清培地での増殖性を有しているとはいえ
ず、さらに優れた細胞株の樹立が望まれていた。
子無添加無血清培地での増殖性を有しているとはいえ
ず、さらに優れた細胞株の樹立が望まれていた。
本発明者らは、上記問題点を鑑み種々研究を重ねた結
果、ヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細胞TRC−29SFにSV4
0エンハンサー遺伝子および／またはSV40プロモーター
遺伝子を該細胞株染色体中に移入し、形質転換後、分離
して、ついに、外部蛋白性増殖因子無添加の無血清培地
中で、TRC−29SF細胞より優れ、かつ十分に自己増殖性
を有する細胞株Tr−48を得ることに成功した。この株化
細胞は、現在までに外部蛋白性増殖因子を無添加の無血
清培地中で約100回の継代培養を行ったが、細胞形態、
細胞増殖性、ヒト−コロニー形成刺激因子（CSF）生産
性、世代倍加時間等継代培養間において変動が殆どな
く、その特徴的性質が安定した細胞株であることを認め
た。また該細胞株を培養することにより、外部蛋白性増
殖因子を無添加の無血清培地中で、CSFを均質な状態で
大量生産することが可能となることを見出した。更に、
該細胞株は、外部蛋白性増殖因子を添加しない安価な培
地で増殖するので、各種生理活性物質生産を目的とした
遺伝子移入のホスト細胞となることを見出した。
果、ヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細胞TRC−29SFにSV4
0エンハンサー遺伝子および／またはSV40プロモーター
遺伝子を該細胞株染色体中に移入し、形質転換後、分離
して、ついに、外部蛋白性増殖因子無添加の無血清培地
中で、TRC−29SF細胞より優れ、かつ十分に自己増殖性
を有する細胞株Tr−48を得ることに成功した。この株化
細胞は、現在までに外部蛋白性増殖因子を無添加の無血
清培地中で約100回の継代培養を行ったが、細胞形態、
細胞増殖性、ヒト−コロニー形成刺激因子（CSF）生産
性、世代倍加時間等継代培養間において変動が殆どな
く、その特徴的性質が安定した細胞株であることを認め
た。また該細胞株を培養することにより、外部蛋白性増
殖因子を無添加の無血清培地中で、CSFを均質な状態で
大量生産することが可能となることを見出した。更に、
該細胞株は、外部蛋白性増殖因子を添加しない安価な培
地で増殖するので、各種生理活性物質生産を目的とした
遺伝子移入のホスト細胞となることを見出した。
本発明はこれらの新しい知見にもとづいて完成された
ものである。
ものである。
すなわち、本発明は、ヒト腎臓癌組織由来のヒト株化
細胞TRC−29SFにSV40エンハンサー遺伝子および／また
はSV40プロモーター遺伝子を該細胞株染色体中に移入
し、形質転換後、分離して細胞株Tr−48を得ることを特
徴とする細胞株Tr−48の製造法である。
細胞TRC−29SFにSV40エンハンサー遺伝子および／また
はSV40プロモーター遺伝子を該細胞株染色体中に移入
し、形質転換後、分離して細胞株Tr−48を得ることを特
徴とする細胞株Tr−48の製造法である。
本発明において、外部蛋白性増殖因子とは、インスリ
ン，トランスフェリン，エピダーマルグロースファクタ
ー（EVF），ナーブグロースファクター（NGF），フィブ
ロブラストグロースファクター（FGF），オバリアング
ロースファクター（OGF），インスリンライクグロース
ファクター（IGF）およびソマトメジン等の各種蛋白性
増殖因子の組合わせからなるものを示すものである。
ン，トランスフェリン，エピダーマルグロースファクタ
ー（EVF），ナーブグロースファクター（NGF），フィブ
ロブラストグロースファクター（FGF），オバリアング
ロースファクター（OGF），インスリンライクグロース
ファクター（IGF）およびソマトメジン等の各種蛋白性
増殖因子の組合わせからなるものを示すものである。
本発明の細胞株Tr−48を得るに当たっては、例えば、
SV40エンハンサー遺伝子および／またはSV40プロモータ
ー遺伝子とプラスミドベクターpSV2−neo遺伝子から作
製されたプラスミドpSV2−neo−proを、TRC−29SF細胞
に導入し、染色体にSV40エンハンサー遺伝子および／ま
たはSV40プロモーター遺伝子およびneo遺伝子が移入さ
れ、薬剤耐性を有するに至った細胞株より、無血清非蛋
白性増殖因子培地での増殖性が十分であり、且つCSF生
産性を有する株を分離、選択すればよい。
SV40エンハンサー遺伝子および／またはSV40プロモータ
ー遺伝子とプラスミドベクターpSV2−neo遺伝子から作
製されたプラスミドpSV2−neo−proを、TRC−29SF細胞
に導入し、染色体にSV40エンハンサー遺伝子および／ま
たはSV40プロモーター遺伝子およびneo遺伝子が移入さ
れ、薬剤耐性を有するに至った細胞株より、無血清非蛋
白性増殖因子培地での増殖性が十分であり、且つCSF生
産性を有する株を分離、選択すればよい。
プラスミドpSV2−neo−proの作製にあたっては、プラ
スミドpSV2−dhfrを制限酵素Pvu IIとHind IIIで切断
し、342bpのSV40プロモーター・エンハンサー遺伝子を
含むDNAを単離し、これをpBR322由来のアンピシリン耐
性遺伝子および大腸菌の複製遺伝子と、動物細胞で発現
可能にしたネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド
pSV−neoを、制限酵素BamH Iで開環したものに接合閉環
することにより構築すればよい。
スミドpSV2−dhfrを制限酵素Pvu IIとHind IIIで切断
し、342bpのSV40プロモーター・エンハンサー遺伝子を
含むDNAを単離し、これをpBR322由来のアンピシリン耐
性遺伝子および大腸菌の複製遺伝子と、動物細胞で発現
可能にしたネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド
pSV−neoを、制限酵素BamH Iで開環したものに接合閉環
することにより構築すればよい。
ヒト腎癌由来細胞株TRC−29Rより分離・馴化された無
血清細胞株TRC−29SFについてより具体的に説明する
と、本発明者らが開発したヒト腎癌由来細胞株TRC−29R
〔特開昭61−126030号公報〕を原細胞株として用いた。
この株化細胞は、通常５〜20％牛胎児血清を含むRPMI−
1640培地により増殖維持されている。本発明者らは、ヒ
ト付着依存性細胞の無血清培養法の基礎的研究を行い低
分子ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地〔特開昭60−
196186号公報〕を開発した。この培地を用いて、TRC−2
9Rの継代培養を行った。その結果、継代２〜３代で増殖
性は著しく低下したが培地交換を繰り返しつつ３ヶ月以
上にわたって培養を続けた。この時の細胞の培養条件
は、５％CO2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動
物細胞培養用インキュベーター内で培養した。このよう
な培養を続けた結果、増殖性は２〜３ヶ月後から徐々に
回復する傾向がみられ、最適濃度の増殖因子を含む無血
清培地で、更に２ヶ月間継代培養を行った結果、血清培
地継代細胞の増殖性に比べて少し劣るが、ほぼ安定した
増殖性を示す無血清培養細胞株が得られた。この細胞を
無血清培養細胞株TRC−29SFと命名した。
血清細胞株TRC−29SFについてより具体的に説明する
と、本発明者らが開発したヒト腎癌由来細胞株TRC−29R
〔特開昭61−126030号公報〕を原細胞株として用いた。
この株化細胞は、通常５〜20％牛胎児血清を含むRPMI−
1640培地により増殖維持されている。本発明者らは、ヒ
ト付着依存性細胞の無血清培養法の基礎的研究を行い低
分子ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地〔特開昭60−
196186号公報〕を開発した。この培地を用いて、TRC−2
9Rの継代培養を行った。その結果、継代２〜３代で増殖
性は著しく低下したが培地交換を繰り返しつつ３ヶ月以
上にわたって培養を続けた。この時の細胞の培養条件
は、５％CO2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動
物細胞培養用インキュベーター内で培養した。このよう
な培養を続けた結果、増殖性は２〜３ヶ月後から徐々に
回復する傾向がみられ、最適濃度の増殖因子を含む無血
清培地で、更に２ヶ月間継代培養を行った結果、血清培
地継代細胞の増殖性に比べて少し劣るが、ほぼ安定した
増殖性を示す無血清培養細胞株が得られた。この細胞を
無血清培養細胞株TRC−29SFと命名した。
これら無血清培養細胞株を培養するに当たっての培地
としては、ホワイト（White）の培地、フィシャー（Fis
her）の培地、パーカー（Parker）の培地またはその改
変培地、アーレ（Earle）の培地またはその改変培地、
ウエイマスク（Waymouth）の培地、イーグル（Eagle）
の培地またはその改変培地、パック（Pack）の培地、ハ
ム（Ham）の培地とその改変培地、トロウエル（Trowel
l）の培地、マツッコイ（McCoy）の培地、ムーア（Moor
e）の培地とその改変培地、ウイリアムズ・メディウム
（William's medium）Ｅ培地などの種々の基礎培地また
は改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げられる。さ
らに例示すれば、組成公知のフィシャーの培地としては
Ｖ−614,パーカーの培地としてはM150,M635,M703,M858,
M199,CMRL−1066,CMRL−1415,アーレの培地としてはNCT
C109,NCTC135,ウエイマウスの培地としてはMB752/1,BM
E,イーグルの培地としてはMEM,ダルベッコMEM,パックの
培地としてはN15,N16,ハムの培地としてはF7,F10,F12,
トロウエルの培地としてはT8,マッコイの培地としては
マッコイ5A,ムーアの培地としてはRPMI−1629,RPMI−16
30,RPMI−1634,RPMI−1640などの培地またはそれらの混
合培地が挙げられる。また、たとえばMEM培地、199培
地、ハム培地、RPMI−1640培地、CMRL−1066培地、NCTC
−109培地等の培地組成においては、種々のアミノ酸
類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等種々添
加調整されているので、その調整に当たっては種々の報
告に基づいて調整〔例えば「細胞培養マニュアル」第11
0頁（1982年５月），（株）講談社発行等〕してもよ
い。
としては、ホワイト（White）の培地、フィシャー（Fis
her）の培地、パーカー（Parker）の培地またはその改
変培地、アーレ（Earle）の培地またはその改変培地、
ウエイマスク（Waymouth）の培地、イーグル（Eagle）
の培地またはその改変培地、パック（Pack）の培地、ハ
ム（Ham）の培地とその改変培地、トロウエル（Trowel
l）の培地、マツッコイ（McCoy）の培地、ムーア（Moor
e）の培地とその改変培地、ウイリアムズ・メディウム
（William's medium）Ｅ培地などの種々の基礎培地また
は改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げられる。さ
らに例示すれば、組成公知のフィシャーの培地としては
Ｖ−614,パーカーの培地としてはM150,M635,M703,M858,
M199,CMRL−1066,CMRL−1415,アーレの培地としてはNCT
C109,NCTC135,ウエイマウスの培地としてはMB752/1,BM
E,イーグルの培地としてはMEM,ダルベッコMEM,パックの
培地としてはN15,N16,ハムの培地としてはF7,F10,F12,
トロウエルの培地としてはT8,マッコイの培地としては
マッコイ5A,ムーアの培地としてはRPMI−1629,RPMI−16
30,RPMI−1634,RPMI−1640などの培地またはそれらの混
合培地が挙げられる。また、たとえばMEM培地、199培
地、ハム培地、RPMI−1640培地、CMRL−1066培地、NCTC
−109培地等の培地組成においては、種々のアミノ酸
類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等種々添
加調整されているので、その調整に当たっては種々の報
告に基づいて調整〔例えば「細胞培養マニュアル」第11
0頁（1982年５月），（株）講談社発行等〕してもよ
い。
TRC−29SF細胞にプラスミドpSV2−neo−proを導入す
るにあたっては、各種遺伝子操作の手法を用いることが
できる。例えば、電気穿孔法，インジェクトスコープ
法，プリッキング法,HVJを用いる方法，リポゾーム法等
を挙げることができる。
るにあたっては、各種遺伝子操作の手法を用いることが
できる。例えば、電気穿孔法，インジェクトスコープ
法，プリッキング法,HVJを用いる方法，リポゾーム法等
を挙げることができる。
更に電気穿孔法を例にとって、より具体的に説明する
と、TRC−29SF細胞をダルベッコのリン酸緩衝液,Hanks
液等の塩類溶液で洗浄後、細胞懸濁液を得る。これに、
プラスミドpSV2−neo−proを添加後、両端に電極を持つ
チェンバー内に注入し、高電圧パルスをかける。一定時
間放置後、細胞懸濁液を培地に移し、培養を開始して形
質転換細胞を得る。
と、TRC−29SF細胞をダルベッコのリン酸緩衝液,Hanks
液等の塩類溶液で洗浄後、細胞懸濁液を得る。これに、
プラスミドpSV2−neo−proを添加後、両端に電極を持つ
チェンバー内に注入し、高電圧パルスをかける。一定時
間放置後、細胞懸濁液を培地に移し、培養を開始して形
質転換細胞を得る。
上述のようにしてpSV2−neo−proを導入された細胞か
ら、細胞株Tr−48を選択するにあたっては、以下のよう
に行えばよい。一次スクリーニングとして、ネオマイシ
ンまたはG418添加培地にて、培養を行えば良く、導入処
理した細胞を、通常の培地で一定時間培養後、上記薬剤
を含有する培養液と交換し培養を続ける。この薬剤含有
培地で生育した細胞のコロニーを分離し、薬剤耐性形質
転換細胞を得る。更に、この薬剤耐性形質転換細胞の培
地を、外部蛋白性増殖因子を含まない無血清培地に交換
し、継代培養する。この操作により、外部蛋白性増殖因
子を含まない無血清培地にて増殖性に殆ど変化の見られ
ない継代培養可能な細胞株を分離すればよい。
ら、細胞株Tr−48を選択するにあたっては、以下のよう
に行えばよい。一次スクリーニングとして、ネオマイシ
ンまたはG418添加培地にて、培養を行えば良く、導入処
理した細胞を、通常の培地で一定時間培養後、上記薬剤
を含有する培養液と交換し培養を続ける。この薬剤含有
培地で生育した細胞のコロニーを分離し、薬剤耐性形質
転換細胞を得る。更に、この薬剤耐性形質転換細胞の培
地を、外部蛋白性増殖因子を含まない無血清培地に交換
し、継代培養する。この操作により、外部蛋白性増殖因
子を含まない無血清培地にて増殖性に殆ど変化の見られ
ない継代培養可能な細胞株を分離すればよい。
上述の方法により得られた、外部蛋白性増殖因子を無
添加の無血清培地中で、高い自己増殖性を有することを
特徴とする細胞株はTr−48と命令され、具体的には以下
の特徴を有する。
添加の無血清培地中で、高い自己増殖性を有することを
特徴とする細胞株はTr−48と命令され、具体的には以下
の特徴を有する。
ａ）形態：培養細胞は、TRC−29SF同様密に接した多角
形の細胞が単層シート上に増殖して、敷石状を呈し、典
型的な上皮細胞様配列を示した。また、細胞の増殖が進
み飽和状態になると重層状に増殖する傾向が見られた。
形の細胞が単層シート上に増殖して、敷石状を呈し、典
型的な上皮細胞様配列を示した。また、細胞の増殖が進
み飽和状態になると重層状に増殖する傾向が見られた。
ｂ）染色体数：高３倍体域である染色体数74本のモーダ
ル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布モ
ード。
ル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布モ
ード。
ｃ）継代培養：無限な継代培養。
ｄ）機能的特徴：ヒト−コロニー形成刺激因子産生。
ｅ）細胞増殖性：外部蛋白性増殖因子を無添加および添
加の無血清培地中で、良く増殖する。7.5％重曹を添加
して、pH7.2に調整したRPMI−1640培地を用い、35mm径
組織培養用プラスチックディッシュ（コーニング社製）
へ2.5×104生細胞/mlの細胞浮遊液を2ml播種し、５％CO
2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動物細胞培養
用インキュベーター内で培養を行い増殖曲線を作成し
た。増殖曲線より求めた世代倍加時間は30±５時間であ
る。
加の無血清培地中で、良く増殖する。7.5％重曹を添加
して、pH7.2に調整したRPMI−1640培地を用い、35mm径
組織培養用プラスチックディッシュ（コーニング社製）
へ2.5×104生細胞/mlの細胞浮遊液を2ml播種し、５％CO
2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動物細胞培養
用インキュベーター内で培養を行い増殖曲線を作成し
た。増殖曲線より求めた世代倍加時間は30±５時間であ
る。
ｆ）保存条件：−80℃〜−190℃で凍結保存。
原細胞株TRC−29R,無血清培養細胞株TRC−29SFと、本
発明のよる外部蛋白性増殖因子を無添加の無血清培地中
で、自己増殖することを特徴とする細胞株Tr−48の比較
を第１表に示した。
発明のよる外部蛋白性増殖因子を無添加の無血清培地中
で、自己増殖することを特徴とする細胞株Tr−48の比較
を第１表に示した。
このようにTr−48は、増殖速度や、外部蛋白性増殖因
子を無添加の無血清培地での増殖能など産業的に有利な
条件を持った細胞である。
子を無添加の無血清培地での増殖能など産業的に有利な
条件を持った細胞である。
本発明に用いられる外部蛋白性増殖因子を無添加の無
血清培地は、ホワイト（White）の培地、フィシャー（F
isher）の培地、パーカー（Parker）の培地またはその
改変培地、アーレ（Earle）の培地またはその改変培
地、ウエイマスク（Waymouth）の培地、イーグル（Eagl
e）の培地またはその改変培地、パック（Pack）の培
地、ハム（Ham）の培地とその改変培地、トロウエル（T
rowell）の培地、マツッコイ（Mccoy）の培地、ムーア
（Moore）の培地とその改変培地、ウイリアムズ・メデ
ィウム（William's medium）Ｅ培地などの種々の基礎培
地または改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げられ
る。さらに例示すれば、組成公知のフィシャーの培地と
してはＶ−614,パーカーの培地としてはM150,M635,M70
3,M858,M199,CMRL−1066,CMRL−1415,アーレの培地とし
てはNCTC109,NCTC135,ウエイマウスの培地としてはMB75
2/1,BME,イーグルの培地としてはMEM,ダルベッコMEM,パ
ックの培地としてはN15,N16,ハムの培地としてはF7,F1
0,F12,トロウエルの培地としてはT8,マッコイの培地と
してはマッコイ5A,ムーアの培地としてはRPMI−1629,RP
MI−1630,RPMI−1634,RPMI−1640などの培地またはそれ
らの混合培地が挙げられる。また、たとえばMEM培地、1
99培地、ハム培地、RPMI−1640培地、CMRL−1066培地、
NCTC−109培地等の培地組成においては、種々のアミノ
酸類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等種々
添加調整されているので、その調整に当たっては種々の
報告に基づいて調整〔例えば「細胞培養マニュアル」第
110頁（1982年５月），（株）講談社発行等〕すればよ
い。代表的な外部蛋白性増殖因子を無添加の無血清培地
の例としては、重曹にてpH7.4に調整されたRPMI−1640
培地が用いられる。
血清培地は、ホワイト（White）の培地、フィシャー（F
isher）の培地、パーカー（Parker）の培地またはその
改変培地、アーレ（Earle）の培地またはその改変培
地、ウエイマスク（Waymouth）の培地、イーグル（Eagl
e）の培地またはその改変培地、パック（Pack）の培
地、ハム（Ham）の培地とその改変培地、トロウエル（T
rowell）の培地、マツッコイ（Mccoy）の培地、ムーア
（Moore）の培地とその改変培地、ウイリアムズ・メデ
ィウム（William's medium）Ｅ培地などの種々の基礎培
地または改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げられ
る。さらに例示すれば、組成公知のフィシャーの培地と
してはＶ−614,パーカーの培地としてはM150,M635,M70
3,M858,M199,CMRL−1066,CMRL−1415,アーレの培地とし
てはNCTC109,NCTC135,ウエイマウスの培地としてはMB75
2/1,BME,イーグルの培地としてはMEM,ダルベッコMEM,パ
ックの培地としてはN15,N16,ハムの培地としてはF7,F1
0,F12,トロウエルの培地としてはT8,マッコイの培地と
してはマッコイ5A,ムーアの培地としてはRPMI−1629,RP
MI−1630,RPMI−1634,RPMI−1640などの培地またはそれ
らの混合培地が挙げられる。また、たとえばMEM培地、1
99培地、ハム培地、RPMI−1640培地、CMRL−1066培地、
NCTC−109培地等の培地組成においては、種々のアミノ
酸類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等種々
添加調整されているので、その調整に当たっては種々の
報告に基づいて調整〔例えば「細胞培養マニュアル」第
110頁（1982年５月），（株）講談社発行等〕すればよ
い。代表的な外部蛋白性増殖因子を無添加の無血清培地
の例としては、重曹にてpH7.4に調整されたRPMI−1640
培地が用いられる。
本発明Tr−48は、この無血清培地において、温度37℃
で、５％CO2,95％空気，相対湿度100％の細胞培養イン
キュベーターの中で、限界なしに、継代培養が可能であ
る。比較のため、RPMI−1640を基本培地とし、インシュ
リン5mg/,EGF10mg/，トランスフェリン15mg/，低
分子ゼラチン0.1g/，葉酸10mg/，硫酸第一鉄１μM,
HEPES10mM,ペニシリンG100mg/，硫酸ジヒドロストレ
プトマイシン100mg/，重曹3g/を加えた無血清培地
において、温度37℃で、５％CO2,95％空気，相対湿度10
0％の細胞培養インキュベーターの中で培養したTRC−29
SF（図中−●−）と前記培地にて培養したTr−48（図中
−□−）の培養増殖曲線を第１図に示した。
で、５％CO2,95％空気，相対湿度100％の細胞培養イン
キュベーターの中で、限界なしに、継代培養が可能であ
る。比較のため、RPMI−1640を基本培地とし、インシュ
リン5mg/,EGF10mg/，トランスフェリン15mg/，低
分子ゼラチン0.1g/，葉酸10mg/，硫酸第一鉄１μM,
HEPES10mM,ペニシリンG100mg/，硫酸ジヒドロストレ
プトマイシン100mg/，重曹3g/を加えた無血清培地
において、温度37℃で、５％CO2,95％空気，相対湿度10
0％の細胞培養インキュベーターの中で培養したTRC−29
SF（図中−●−）と前記培地にて培養したTr−48（図中
−□−）の培養増殖曲線を第１図に示した。
また、CSF産生の確認は、マウス骨髄細胞を用いたコ
ロニー形成法である仁保の方法〔「免疫実験操作法」，
日本免疫学会編,1974年，第927頁〕に従いメチルセルロ
ーズを用いる下記の方法で行った。
ロニー形成法である仁保の方法〔「免疫実験操作法」，
日本免疫学会編,1974年，第927頁〕に従いメチルセルロ
ーズを用いる下記の方法で行った。
2.2％メチルセルロース／α−MEM 1.6ml ウマ血清 0.8ml マウス骨髄細胞懸濁液／α−MEM 0.8ml 被験サンプルまたはCSF標準液 0.8ml メチルセルローズはダウ社製、α−MEMはフロー社
製、ウマ血清はギブコ社製、CSF標準液はギブコ社製（G
CT−CM）を使用した。またマウス骨髄細胞は静岡実験動
物協同組合より購入した雄７週令のICRを使用し、大腿
骨骨髄の単核球を分離し、α−MEMに懸濁して５×105/m
lに調整した。
製、ウマ血清はギブコ社製、CSF標準液はギブコ社製（G
CT−CM）を使用した。またマウス骨髄細胞は静岡実験動
物協同組合より購入した雄７週令のICRを使用し、大腿
骨骨髄の単核球を分離し、α−MEMに懸濁して５×105/m
lに調整した。
上記混合液を３枚の35mm径組織培養用プラスチックデ
ィッシュ（コーニング社製）へ細胞浮遊液を1ml播種
し、５％CO2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動
物細胞培養用インキュベーター内で７日間培養した後、
20個以上の細胞からなる細胞集団を１コロニーと見做し
て算出し、上記条件で、１コロニーを形成させるｈ−CS
F活性を１単位（Ｕ）とした。
ィッシュ（コーニング社製）へ細胞浮遊液を1ml播種
し、５％CO2,95％空気，相対湿度100％，温度37℃の動
物細胞培養用インキュベーター内で７日間培養した後、
20個以上の細胞からなる細胞集団を１コロニーと見做し
て算出し、上記条件で、１コロニーを形成させるｈ−CS
F活性を１単位（Ｕ）とした。
ｈ−CSFの活性はいずれも３枚とディッシュの平均値
で算出した。
で算出した。
本発明の細胞株を用いて、各種生理活性物質の生産を
する場合、培地への増殖因子の添加を必要とせず、かつ
良好な増殖性を有するため、培地コストを大幅に低減で
き、また生産物への外部増殖因子由来の不純物の混入が
避けられる。また本発明の細胞株は、各種生理活性物質
生産を目的とした遺伝子操作のホスト細胞として使用で
きる。
する場合、培地への増殖因子の添加を必要とせず、かつ
良好な増殖性を有するため、培地コストを大幅に低減で
き、また生産物への外部増殖因子由来の不純物の混入が
避けられる。また本発明の細胞株は、各種生理活性物質
生産を目的とした遺伝子操作のホスト細胞として使用で
きる。
以下に実施例、参考例で本発明を説明するが、これに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
参考例 １ ヒト腎癌由来細胞株TRC−29R〔特開昭61−126030号公
報記載の株〕を原細胞株として用い、低分子ゼラチンを
含むRPMI−1640無血清培地への細胞馴化を行うことによ
り、無血清培地で長期継代培養可能な細胞株を選択す
る。
報記載の株〕を原細胞株として用い、低分子ゼラチンを
含むRPMI−1640無血清培地への細胞馴化を行うことによ
り、無血清培地で長期継代培養可能な細胞株を選択す
る。
即ち、ヒト腎癌由来細胞株TRC−29Rを、前述の低分子
ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地〔0.01％（W/V）
低分子ゼラチン添加RPMI−1640培地に、細胞増殖因子で
あるインシュリン５μg/ml,プロスタグランジンE1（PGE
1）25μg/ml,エピダーマルグロースファクター（EGF）1
0ng/mlを添加した培地〕5mlを入れた25cm2小型培養フラ
スコ内に細胞数が１×105個/mlになるように接種した。
これを５％CO2,95％空気，相対湿度100％の細胞培養イ
ンキュベーター中で培養を行い、継代比1:2.5で３ヶ月
間継代培養を行い、前述の低分子ゼラチンを含むRPMI−
1640無血清培地で増殖可能な細胞株を得た。
ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地〔0.01％（W/V）
低分子ゼラチン添加RPMI−1640培地に、細胞増殖因子で
あるインシュリン５μg/ml,プロスタグランジンE1（PGE
1）25μg/ml,エピダーマルグロースファクター（EGF）1
0ng/mlを添加した培地〕5mlを入れた25cm2小型培養フラ
スコ内に細胞数が１×105個/mlになるように接種した。
これを５％CO2,95％空気，相対湿度100％の細胞培養イ
ンキュベーター中で培養を行い、継代比1:2.5で３ヶ月
間継代培養を行い、前述の低分子ゼラチンを含むRPMI−
1640無血清培地で増殖可能な細胞株を得た。
この細胞株における細胞増殖因子の最適添加量は、イ
ンシュリン3.1μg/ml,PGE110μg/ml,EGF5ng/mlであっ
た。
ンシュリン3.1μg/ml,PGE110μg/ml,EGF5ng/mlであっ
た。
更に、この細胞を遠心分離によって回収し、リン酸緩
衝液でよく洗浄して、遠心分離によって再び細胞を回収
して、得られた細胞を、別に調整した細胞増殖因子最適
添加量の低分子ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地
〔0.01％（W/V）低分子ゼラチン添加RPMI−1640培地
に、細胞増殖因子であるインシュリン3.1μg/ml,PGE110
μg/ml,EGF5ng/mlを添加した培地〕5mlを入れた25cm2小
型培養フラスコ内に細胞数が１×105個/mlになるように
接種した。これを５％CO2,95％空気，相対湿度100％の
細胞培養インキュベーター中で培養を行い、継代比1:2.
5で２ヶ月間継代培養を行った。その結果、前述の無血
清培地で安定した増殖性を示す細胞株を得、この株をTR
C−29SFと命令した。
衝液でよく洗浄して、遠心分離によって再び細胞を回収
して、得られた細胞を、別に調整した細胞増殖因子最適
添加量の低分子ゼラチンを含むRPMI−1640無血清培地
〔0.01％（W/V）低分子ゼラチン添加RPMI−1640培地
に、細胞増殖因子であるインシュリン3.1μg/ml,PGE110
μg/ml,EGF5ng/mlを添加した培地〕5mlを入れた25cm2小
型培養フラスコ内に細胞数が１×105個/mlになるように
接種した。これを５％CO2,95％空気，相対湿度100％の
細胞培養インキュベーター中で培養を行い、継代比1:2.
5で２ヶ月間継代培養を行った。その結果、前述の無血
清培地で安定した増殖性を示す細胞株を得、この株をTR
C−29SFと命令した。
実施例 １（pSV2−neo−proの構築） pBR322の大腸菌複製起点，アンピシリン耐性遺伝子部
位,SV40の初期プロモーター・エンハンサー領域および
そのプロモーター下流に配置されているキサンチン・グ
アニンリン酸転位酵素遺伝子（gpt）で構成されている
プラスミドpSV2−gptからSV40のプロモーター・エンハ
ンサー領域342bpのフラグメントを制限酵素Pvu II、Hin
d IIIにより切り出し、これをG418耐性遺伝子（neo）が
先のgptと同様の位置に挿入されているpSV2−neoの制限
酵素BamH Iサイトに正方向に挿入したプラスミドpSV2−
neo−proを構築した。即ち、pSV2−gpt（BRL社製）２μ
ｇをトリス塩酸緩衝液（pH7.5）10μに溶解し、Pvu I
I（東洋紡績社製）６単位,Hind III（東洋紡績社製）６
単位で、37℃,2時間反応せしめ、これを１％低融点アガ
ロースゲルで、150V,1時間電気泳動し、SV40のプロモー
ター・エンハンサー領域である342bpのフラグメントを
含む部位のゲルを切り出した。このゲルを65℃で溶解
し、さらに全体量と等量のトリス塩酸緩衝液飽和フェノ
ールで処理し、遠心分離により水層を分取した。この水
層に２倍容のエタノールおよび10分の１量の3M酢酸ナト
リウム溶液を加え、遠心でDNAを沈殿せしめDNAを回収
し、得られたDNAを67mMトリス塩酸緩衝液（pH8.8）,6.7
mM塩化マグネシウム,16.6mM硫酸マグネシウム,10mM2−
メルカプトエタノール,6.7mM EDTA,33μMdMTPS（Boehri
nger mannheim社製）存在下で、T4DNAポリメラーゼ（東
洋紡績社製）５単位で37℃,30分間反応せしめ、突出末
端を平滑化し、所望のDNA断片（以下、pro断片と呼ぶこ
とがある）を得た。
位,SV40の初期プロモーター・エンハンサー領域および
そのプロモーター下流に配置されているキサンチン・グ
アニンリン酸転位酵素遺伝子（gpt）で構成されている
プラスミドpSV2−gptからSV40のプロモーター・エンハ
ンサー領域342bpのフラグメントを制限酵素Pvu II、Hin
d IIIにより切り出し、これをG418耐性遺伝子（neo）が
先のgptと同様の位置に挿入されているpSV2−neoの制限
酵素BamH Iサイトに正方向に挿入したプラスミドpSV2−
neo−proを構築した。即ち、pSV2−gpt（BRL社製）２μ
ｇをトリス塩酸緩衝液（pH7.5）10μに溶解し、Pvu I
I（東洋紡績社製）６単位,Hind III（東洋紡績社製）６
単位で、37℃,2時間反応せしめ、これを１％低融点アガ
ロースゲルで、150V,1時間電気泳動し、SV40のプロモー
ター・エンハンサー領域である342bpのフラグメントを
含む部位のゲルを切り出した。このゲルを65℃で溶解
し、さらに全体量と等量のトリス塩酸緩衝液飽和フェノ
ールで処理し、遠心分離により水層を分取した。この水
層に２倍容のエタノールおよび10分の１量の3M酢酸ナト
リウム溶液を加え、遠心でDNAを沈殿せしめDNAを回収
し、得られたDNAを67mMトリス塩酸緩衝液（pH8.8）,6.7
mM塩化マグネシウム,16.6mM硫酸マグネシウム,10mM2−
メルカプトエタノール,6.7mM EDTA,33μMdMTPS（Boehri
nger mannheim社製）存在下で、T4DNAポリメラーゼ（東
洋紡績社製）５単位で37℃,30分間反応せしめ、突出末
端を平滑化し、所望のDNA断片（以下、pro断片と呼ぶこ
とがある）を得た。
同じくpSV2−neo（BRL社製）２μｇをトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）10μに溶解し、BamH I（東洋紡績社製）1
2単位で、37℃,2時間反応せしめ、これを１％低融点ア
ガロースゲルで、150V,1時間電気泳動し、4.0Kbの鎖状p
SV−neo DNAを含む部位のゲルを切り出した。このゲル
を65℃で溶解し、さらに全体量と等量のトリス塩酸緩衝
液飽和フェノールで処理し、遠心分離により水層を分取
した。この水層に２倍容のエタノールおよび10分の１量
の3M酢酸ナトリウム溶液を加え、遠心でDNAを沈殿せし
めDNAを回収し、得られたDNAを67mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.8）,6.7mM塩化マグネシウム,16.6mM硫酸マグネシ
ウム,10mM2−メルカプトエタノール,6.7mM EDTA,33μMd
MTPS（Boehringer mannheim社製）存在下で、T4DNAポリ
メラーゼ（東洋紡績社製）５単位で37℃,30分間反応せ
しめ、突出末端を平滑化し、得られたDNAを50mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）存在化で、65℃,1時間反応せし
め、５′未満をリン酸化し、水層に対し等量のフェノー
ルで抽出の後、さらに全体量と等量のクロロホルム−フ
ェノール混液（1:1）で処理し、遠心分離により水層を
分取した。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠心
でDNAを沈殿せしめDNAを回収し、所望のDNA断片（以
下、鎖状pSV2−neo断片と呼ぶことがある）を得た。上
述の操作で得られた鎖状pSV2−neo断片100ng,pro断片10
ngを66mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）,6.6mM塩化マグネ
シウム,10mMジチオスレイトール,66μMATP存在下、T4DN
Aリガーゼ（宝酒造社製）10単位で16℃,16時間反応せし
めた。
液（pH7.5）10μに溶解し、BamH I（東洋紡績社製）1
2単位で、37℃,2時間反応せしめ、これを１％低融点ア
ガロースゲルで、150V,1時間電気泳動し、4.0Kbの鎖状p
SV−neo DNAを含む部位のゲルを切り出した。このゲル
を65℃で溶解し、さらに全体量と等量のトリス塩酸緩衝
液飽和フェノールで処理し、遠心分離により水層を分取
した。この水層に２倍容のエタノールおよび10分の１量
の3M酢酸ナトリウム溶液を加え、遠心でDNAを沈殿せし
めDNAを回収し、得られたDNAを67mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.8）,6.7mM塩化マグネシウム,16.6mM硫酸マグネシ
ウム,10mM2−メルカプトエタノール,6.7mM EDTA,33μMd
MTPS（Boehringer mannheim社製）存在下で、T4DNAポリ
メラーゼ（東洋紡績社製）５単位で37℃,30分間反応せ
しめ、突出末端を平滑化し、得られたDNAを50mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）存在化で、65℃,1時間反応せし
め、５′未満をリン酸化し、水層に対し等量のフェノー
ルで抽出の後、さらに全体量と等量のクロロホルム−フ
ェノール混液（1:1）で処理し、遠心分離により水層を
分取した。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠心
でDNAを沈殿せしめDNAを回収し、所望のDNA断片（以
下、鎖状pSV2−neo断片と呼ぶことがある）を得た。上
述の操作で得られた鎖状pSV2−neo断片100ng,pro断片10
ngを66mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）,6.6mM塩化マグネ
シウム,10mMジチオスレイトール,66μMATP存在下、T4DN
Aリガーゼ（宝酒造社製）10単位で16℃,16時間反応せし
めた。
また、0.5％バクトイーストエキストラクト,2％バク
トトリプトン（以上Difco社製）,0.5％硫酸マグネシウ
ムよりなるプサイ培地100mlで培養した対数増殖期のエ
シェリヒア・コリDH1株〔ジャーナル オブ モレキュ
ラー バイオロジー（J.Mol.Biol.,557（1983）；ジェ
ネテック ストックセンター，エール大学医学部より分
与を受けた〕を遠心分離により集菌し（10000rpm.2分
間）、得られた菌を40mlを氷冷した30mM酢酸カリウム緩
衝液（pH5.8）,100mM塩化ルビジウム,10mM塩化カルシウ
ム,50mM塩化マグネシウム,15％グリセロールよりなるTf
b I液で懸濁した。０℃で５分間放置後、遠心し上清を
すて、さらに4mlの10mM MOPS緩衝液（ドータイト社
製）,10mM塩化ルビジウム,75mM塩化カルシウム,15％グ
リセロールよりなるpH6.5Tfb II液で懸濁し、０℃で15
分間放置してコンピテント細胞とした。
トトリプトン（以上Difco社製）,0.5％硫酸マグネシウ
ムよりなるプサイ培地100mlで培養した対数増殖期のエ
シェリヒア・コリDH1株〔ジャーナル オブ モレキュ
ラー バイオロジー（J.Mol.Biol.,557（1983）；ジェ
ネテック ストックセンター，エール大学医学部より分
与を受けた〕を遠心分離により集菌し（10000rpm.2分
間）、得られた菌を40mlを氷冷した30mM酢酸カリウム緩
衝液（pH5.8）,100mM塩化ルビジウム,10mM塩化カルシウ
ム,50mM塩化マグネシウム,15％グリセロールよりなるTf
b I液で懸濁した。０℃で５分間放置後、遠心し上清を
すて、さらに4mlの10mM MOPS緩衝液（ドータイト社
製）,10mM塩化ルビジウム,75mM塩化カルシウム,15％グ
リセロールよりなるpH6.5Tfb II液で懸濁し、０℃で15
分間放置してコンピテント細胞とした。
この大腸菌懸濁液100μに、前述のリガーゼ処理し
たDNA溶液10μを加え、30分間０℃で放置した。その
後プサイ培地400μを加え、37℃,60分間保温後、全量
を、２％バクトトリプトン,0.5％酵母エキス,0.5％食
塩,1.5％バクトアガー,50μg/mlアンピシリンよりなる
寒天培地上にまき、37℃で一晩培養し形質転換体を得
た。この形質転換体コロニーより12コロニーを任意に選
び、それぞれ２％バクトトリプトン,0.5％酵母エキス,
0.5％食塩,1.5％バクトアガー,50μg/mlアンピシリンよ
りなる液体培地で、37℃,1夜培養し、その後、12000rp
m,30秒間の遠心により集菌し、リゾチーム−SDS法と
〔マニアテスら（Maniatis etal）：モレキュラー ク
ローニング（Molecular Cloning）86〜94頁 コールド
スプリング ハーバー出版（Cold Spring Harbor）
（1982）〕に従いプラスミドDNAを調整取得した。
たDNA溶液10μを加え、30分間０℃で放置した。その
後プサイ培地400μを加え、37℃,60分間保温後、全量
を、２％バクトトリプトン,0.5％酵母エキス,0.5％食
塩,1.5％バクトアガー,50μg/mlアンピシリンよりなる
寒天培地上にまき、37℃で一晩培養し形質転換体を得
た。この形質転換体コロニーより12コロニーを任意に選
び、それぞれ２％バクトトリプトン,0.5％酵母エキス,
0.5％食塩,1.5％バクトアガー,50μg/mlアンピシリンよ
りなる液体培地で、37℃,1夜培養し、その後、12000rp
m,30秒間の遠心により集菌し、リゾチーム−SDS法と
〔マニアテスら（Maniatis etal）：モレキュラー ク
ローニング（Molecular Cloning）86〜94頁 コールド
スプリング ハーバー出版（Cold Spring Harbor）
（1982）〕に従いプラスミドDNAを調整取得した。
得られたそれぞれのプラスミドDNAの一部を使い、こ
のプラスミドDNAを、Pvu IIで切断し、１％アガロース
ゲルで電気泳動し、700,500,400bpのフラグメント全て
が認められ、且つAat I及びEcoR Iで切断し、１％アガ
ロースゲルで電気泳動し1.2Kbのフラグメントが認めら
れるプラスミドDNAを得、これをpSV2−neo−proと命令
した。このpSV2−neo−proは、SV40−プロモーター・エ
ンハンーサーが、pSV2−neoのBamH Iに正方向に入った
プラスミドであった。以上を、模式図として、第２図
〔図中A,B,E,H,Pは制限酵素サイトを示し、それぞれ、
A:Ada I,B:BamH I,H:Hind III,P:Pvu IIの略であり、or
i,□は大腸菌複製起点を、pro,□はSV40プロモーター・
エンハンサーを、gtp,□はキサンチン、グアニンリン酸
転位酵素遺伝子を、neo,□はG418耐性遺伝子を、Apr,■
はアンピシリン耐性遺伝子を示す〕示す。
のプラスミドDNAを、Pvu IIで切断し、１％アガロース
ゲルで電気泳動し、700,500,400bpのフラグメント全て
が認められ、且つAat I及びEcoR Iで切断し、１％アガ
ロースゲルで電気泳動し1.2Kbのフラグメントが認めら
れるプラスミドDNAを得、これをpSV2−neo−proと命令
した。このpSV2−neo−proは、SV40−プロモーター・エ
ンハンーサーが、pSV2−neoのBamH Iに正方向に入った
プラスミドであった。以上を、模式図として、第２図
〔図中A,B,E,H,Pは制限酵素サイトを示し、それぞれ、
A:Ada I,B:BamH I,H:Hind III,P:Pvu IIの略であり、or
i,□は大腸菌複製起点を、pro,□はSV40プロモーター・
エンハンサーを、gtp,□はキサンチン、グアニンリン酸
転位酵素遺伝子を、neo,□はG418耐性遺伝子を、Apr,■
はアンピシリン耐性遺伝子を示す〕示す。
実施例 ２（動物細胞の形質転換） 参考例１により得られた増殖中の細胞株TRC−29SF
を、剥離酵素〔商品名；ナガーゼ液：長瀬産業社製〕に
より剥離し、リン酸緩衝液（PBS（−））にて、４回洗
浄を行い、最終細胞密度が２×106個/mlとなるように調
整した。この懸濁液に、実施例１にて得たpSV2−neoを
最終濃度が40μg/mlとなるように添加し、５分後、両端
に電極を持つチャンバー内に注入し、高圧パルス〔パル
ス条件は、電極の間隔3mm,電圧800V,時間30μsec;細胞
融合装置FDH−01001型（米国BIOLECTRONICS社製）〕を
かける。５分間放置後、60mm径シャーレに約４×105個
つづ接種し、初期の培養液を２％牛胎児血清を含むPRMI
1640培地を用い、37℃,5％CO2,95％空気，相対湿度100
％の細胞培養インキュベーター中で48時間培養を行い、
前記２％牛胎児血清を含むPRMI1640培地に更にＧ−418
（200μg/ml）を含む培地に交換し、更に前記インキュ
ベーター中で２週間培養を行った。このようにして、Ｇ
−418含有培地で生育したコロニーをロ紙法で分離し、
形質転換細胞株90株を得た。
を、剥離酵素〔商品名；ナガーゼ液：長瀬産業社製〕に
より剥離し、リン酸緩衝液（PBS（−））にて、４回洗
浄を行い、最終細胞密度が２×106個/mlとなるように調
整した。この懸濁液に、実施例１にて得たpSV2−neoを
最終濃度が40μg/mlとなるように添加し、５分後、両端
に電極を持つチャンバー内に注入し、高圧パルス〔パル
ス条件は、電極の間隔3mm,電圧800V,時間30μsec;細胞
融合装置FDH−01001型（米国BIOLECTRONICS社製）〕を
かける。５分間放置後、60mm径シャーレに約４×105個
つづ接種し、初期の培養液を２％牛胎児血清を含むPRMI
1640培地を用い、37℃,5％CO2,95％空気，相対湿度100
％の細胞培養インキュベーター中で48時間培養を行い、
前記２％牛胎児血清を含むPRMI1640培地に更にＧ−418
（200μg/ml）を含む培地に交換し、更に前記インキュ
ベーター中で２週間培養を行った。このようにして、Ｇ
−418含有培地で生育したコロニーをロ紙法で分離し、
形質転換細胞株90株を得た。
実施例 ３（Tr−48株の分離） 実施例２で得られたＧ−418耐性形質転換体90株を、
培養液をRPMI−1640倍地のみ（外部蛋白性増殖因子を全
く含まない）を用い、37℃,5％CO2,95％空気，相対湿度
100％の細胞培養インキュベーター中にて35mm径シャー
レを用いて、継代比1:2で培養を行った。その結果、継
代数100代を経過した後も、継代可能であり、外部蛋白
性増殖因子を含まないRPMI−1640倍地で、増殖継代培養
可能な細胞株を１株取得した。更に継代培養を続け、顕
微鏡観察，細胞染色法による形態、核型の観察より、均
一な株化細胞となっていたので、この細胞を外部増殖因
子比依存性細胞株Tr−48と命名し、凍結保存した〔微工
研菌寄第9852号（FERM Ｐ−9852）。
培養液をRPMI−1640倍地のみ（外部蛋白性増殖因子を全
く含まない）を用い、37℃,5％CO2,95％空気，相対湿度
100％の細胞培養インキュベーター中にて35mm径シャー
レを用いて、継代比1:2で培養を行った。その結果、継
代数100代を経過した後も、継代可能であり、外部蛋白
性増殖因子を含まないRPMI−1640倍地で、増殖継代培養
可能な細胞株を１株取得した。更に継代培養を続け、顕
微鏡観察，細胞染色法による形態、核型の観察より、均
一な株化細胞となっていたので、この細胞を外部増殖因
子比依存性細胞株Tr−48と命名し、凍結保存した〔微工
研菌寄第9852号（FERM Ｐ−9852）。
得られたTr−48のｈ−CSF産生能は、飽和増殖時に最
大となり1ml当たり活性が、500〜1000単位に達すること
が明らかになった。
大となり1ml当たり活性が、500〜1000単位に達すること
が明らかになった。
第１図はTRC−29SFおよびTr−48の培養経過を示す増殖
グラフであり、第２図はpSV2−neo−proの構築模式図を
示すものである。
グラフであり、第２図はpSV2−neo−proの構築模式図を
示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−268177（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−4296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−141584（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−67182（ＪＰ，Ａ) 次世代産業基盤技術シンポジウム バ イオテクノロジー予稿集，Ｖｏｌ．５, Ｐ．155−166（1987）抗酸菌病研究所雑 誌，Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．１，Ｐ．211− 216（1987)
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細胞TRC−2
9SFにSV40エンハンサー遺伝子および／またはSV40プロ
モーター遺伝子を該細胞株染色体中に移入し、形質転換
後、分離して、以下の特徴を有する細胞株Tr−48を得る
ことを特徴とする細胞株Tr−48の製造法。 ａ）形態：上皮細胞様。 ｂ）染色体数：高３倍体域である染色体数74本のモーダ
ル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布モ
ード。 ｃ）継代培養：無限な継代培養。 ｄ）機能的特徴：ヒト−コロニー形成刺激因子産生。 ｅ）細胞増殖性：外部蛋白性増殖因子の無添加または添
加のいずれの無血清培地中でも、良く増殖する。世代倍
加時間は30±５時間である。 ｆ）保存条件：−80℃〜−190℃で凍結保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63032931A JP2507882B2 (ja) | 1988-02-17 | 1988-02-17 | 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63032931A JP2507882B2 (ja) | 1988-02-17 | 1988-02-17 | 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01211488A JPH01211488A (ja) | 1989-08-24 |
| JP2507882B2 true JP2507882B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=12372669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63032931A Expired - Lifetime JP2507882B2 (ja) | 1988-02-17 | 1988-02-17 | 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2507882B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL87737A (en) * | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| AT409379B (de) | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
| ES2398706T3 (es) | 2002-07-09 | 2013-03-21 | Baxter International Inc. | Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células |
| US20060094104A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Leopold Grillberger | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| ES2474573T3 (es) | 2006-01-04 | 2014-07-09 | Baxter International Inc | Medio de cultivo celular sin oligop�ptidos |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS568597B2 (ja) * | 1973-05-08 | 1981-02-24 | ||
| JPS63141584A (ja) * | 1986-12-04 | 1988-06-14 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 細胞培養用培地 |
| JPS6467182A (en) * | 1987-09-07 | 1989-03-13 | Japan Tobacco Inc | Animal syncytium strain excreting nerve growth factor and production of nerve growth factor |
-
1988
- 1988-02-17 JP JP63032931A patent/JP2507882B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 次世代産業基盤技術シンポジウムバイオテクノロジー予稿集，Ｖｏｌ．５，Ｐ．１５５−１６６（１９８７）抗酸菌病研究所雑誌，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，Ｐ．２１１−２１６（１９８７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01211488A (ja) | 1989-08-24 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |