KR102005685B1 - 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유래의 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터 및 이의 제조방법 - Google Patents

한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유래의 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 외국 유래 메르스 코로나 바이러스와 유전자 염기서열이 달라 전장 클론 제작이 어려웠던 한국 분리주 기반의 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론, 및 이의 제조 방법을 제공한다. 또한, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론에 토마토 레드 형광 단백질(tomato red florescence protein: RFP) 유전자를 추가로 삽입한 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 한국 분리주 기반의 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론은 바이러스로 복원시 감염성과 복제능을 그대로 유지하면서 세포주와 동물모델에서 치료제와 백신의 효능 평가를 위한 표준물질로 활용할 수 있고, 치료제 개발을 위한 대용량 검사법 개발에 활용할 수 있으며, 약독화 백신주 개발에 활용할 수 있다.

Description

한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유래의 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터 및 이의 제조방법{Recombinant vector of MERS-CoV expressing fluorescence protein derived from Korean MERS-CoV, and method of preparing the same}
본 발명은 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 유전자를 BAC 벡터에 도입해 제조한 전장(full-length) 클론 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 전장 클론에 형광 단백질 발현 유전자를 추가로 도입하여 제조한 재조합 벡터 및 그 제조방법에 관한 것이다.
2012년 중동호흡기증후군 코로나 바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 발병이 중동지역에서 발생한 이후, 이 신종 코로나 바이러스는 2015년 5월 20일 국내로 유입돼 약 두 달간 186명을 감염시키고 이 중 38명이 사망했으며 확진자의 접촉자로 분류된 16,693명이 격리되는 등 사회적 혼란을 유발하였다. 또한, 아직도 중동지역을 비롯한 여러 지역에서 산발적으로 계속해서 메르스 환자가 발생하고 있으며, 이미 22개국 이상에서 발병한 상태여서 우리나라에 재유입 가능성 또한 배재할 수 없다. 메르스 코로나 바이러스는 고열을 동반한 심한 호흡기 증상을 유발하고 특히 10%의 치사율을 보이는 사스 바이러스 보다 높은 20-50%의 치사율을 나타내는 것으로 보고되고 있다.
메르스 코로나 바이러스는 다양한 진단기법들(분자진단, 항원 및 항체 검출 ELISA 등)이 개발되어 있으며, 그 치료법 또한 활발히 연구되고 있다. 구체적으로 현재 국내외에서 항바이러스제의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 임상에서 효능을 보인 비 특이적 항바이러스제는 type I 인터페론과 리바비린(ribavirin)이 있으나 감염초기에만 바이러스 억제 효과가 있는 것으로 보고된 바 있고, 메르스 코로나 바이러스 치료제와 사스 코로나 바이러스에 대한 치료제는 최근 개발 필요성이 높아짐에 따라 주목을 받고 있다(A. Zumla et.al, Nature Reviews Drug Discovery, 15:327-347,2016).
그러나, 현재 국내외에 허가 받은 치료제나 백신이 없고, 개발되는 물질의 평가 시스템이 확립되지 못하여 효능 평가를 위한 시스템 개발이 시급한 실정이다. 특히, 현재 메르스 코로나 바이러스 치료제 및 백신 연구에 관심을 보이고 있는 다수의 연구진들은 국내 메르스 코로나 바이러스에 대한 접근 및 바이러스의 직접 배양이 어려워, 새로 개발된 항바이러스제의 효능을 평가하는데 어려움이 있다.
최근 국내에서 발견되어 분리된 메르스 코로나 바이러스는 중동 지역 특히 사우디아라비아에서 발견된 메르스 코로나 바이러스주(strain)와 비교하여 염기서열의 차이가 0.5%에 불과할 정도로 매우 유사한 염기서열을 지니고 있다. 그러나 최근 질병관리본부와 국내연구진들의 염기서열 분석결과, 두 바이러스가 매우 유사한 염기서열을 지니고 있지만 바이러스의 진입에 관여하는 스파이크 당단백질(S 단백질) 및 바이러스 복제에 관여하는 유전자를 코딩하는 ORF1a/1b의 여러 위치에서 염기서열이 변화되었고, 이중의 일부는 아미노산 치환을 유발하는 것으로 확인되었다. 또한 중국에서 한국인 환자로부터 분리한 메르스 코로나 바이러스 서열과는 99.96% 일치하나, S 단백질에서 2개의 아미노산 차이, ORF1a/1b 유전자에서 3개의 아미노산 변화를 나타내는 것으로 확인되었다.
현재 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론은 2개 외국기관에서 개발하여 보고된 바 있다. 또한, 2006년 스페인의 Enjuanes 교수 연구팀은 BAC 벡터를 사용한 방법으로 사스 코로나 바이러스 전장 클론 및 레플리콘도 제작하였다(F. Almazan et.al, Journal of Virology, 80(21):10900-10906, 2006). 또한, 2013년 상기 교수 연구팀은 데이터베이스 상의 메르스 코로나 바이러스 유전자 염기서열을 기반으로 BAC 벡터를 이용한 전장 클론을 개발하였다(F. Almazan et.al, mBio, 4(5) e00650-13, 2013). 또한, 미국의 Baric 교수 연구진은 MERS-CoV EMC 균주의 전장 클론을 개발하였다(T. Scobey et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,110(40):16157-16162, 2013).
또한, 캐나다의 Theriault 교수 연구진은 사우디아라비아 MERS-CoV EMC 균주의 전장 클론을 제작하였다(A.M. Nikiforuk et.al, Journal of Virological Methods, 236:178-183, 2016). 그러나, 데이터베이스 상에 있는 염기 서열 약 30 kb의 바이러스 유전자를 1 kb의 조각들로 31 등분하여 유전자를 합성하고, 다시 약 10 kb의 3 조각의 절편으로 splice-by-overlap extension PCR 기법을 사용하여 연결한 후에, 이를 다시 상동 재조합(homologous recombination) 방법으로 전장 클론을 제작하였으며, CMV 프로모터, 리보자임 및 BGH(Bovine Growth Hormone) 등의 유전적 요소들을 사용한 것으로, 기존의 MERS-CoV EMC 균주에 대한 클론과 비교하여 크게 기술적으로 진보된 것이 없다고 평가된다.
한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론은 염기서열 및 아미노산의 변화가 바이러스의 복제 및 감염능에 미치는 영향에 대한 연구 뿐만 아니라, 이종(낙타-인간) 및 동종(인간-인간) 간의 바이러스 전파에 대한 연구를 위하여 반드시 요구되는 것이다.
그러나 상기한 외국의 성공 사례들과 달리, 국내에서 다수의 연구진들이 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 개발을 시도해 왔으나, 외국의 메르스 코로나 바이러스와 염기 서열의 차이가 있는 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스에 대한 전장 클론은 개발되지 못한 상태이다.
본 발명자들은 상기한 문제를 극복하고, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 숙주 감염능 및 복제능 변화 등을 연구하고, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 인간전파 기전을 연구하는데 활용할 수 있도록, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론을 개발하여 성공하였다.
본 발명자들은 큰 유전체의 크기로 인하여 벡터에 전장 유전자 삽입이 어려웠던 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스에 대하여, 전장 유전자를 BAC 벡터에 삽입하여 제조한 전장 클론, 및 형광 단백질 발현 유전자를 추가로 삽입한 형광 단백질 발현 재조합 벡터를 제조하였다.
또한, 상기 전장 클론의 제조시 감염성과 복제능을 유지하여 바이러스의 복제 및 인간전파 기전 이해를 위한 연구에 활용할 수 있는 전장 클론의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 (1) 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 및 제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편에 해당하는 메르스 코로나 바이러스의 cDNA 절편을 준비하는 단계; (2) 카세트 BAC 벡터를 제조하는 단계; 및 (3) 상기 카세트 BAC 벡터에 상기 cDNA 절편을 순차적으로 삽입하는 단계를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 전장 클론의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 메르스 코로나 바이러스는 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 (국가관리번호 1-001-MER-IS-2015001)일 수 있으며, 상기 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.
본 발명에서, 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR1로 하고, 서열번호 2의 서열을 갖는다.
상기 MERS/KOR1은 서열번호 3의 서열을 갖는 MERS/KOR1-1 및 서열번호 4의 서열을 갖는 MERS/KOR1-2로 나누어진다.
제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR2로 하고, 서열번호 5의 서열을 갖는다.
제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)이 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR3로 하고, 서열번호 6의 서열을 갖는다.
제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)이 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR4로 하고, 서열번호 7의 서열을 갖는다.
본 발명은 (a) 서열번호 8의 서열을 갖는 5′- Rz - BGH - BAC - CMV - 3′ 벡터를 준비하는 단계; (b) 서열번호 9의 서열을 갖는 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 5′ 말단의 1번부터 810번까지의 cDNA 단편을 상기 (a) 단계에서 제조한 벡터에 삽입하는 단계; (c) 서열번호 10의 서열을 갖는 cDNA 단편을 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터에 삽입하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 벡터 내부에 존재하는 StuI, PvuI, 및 SacII 절단부를 침묵 돌연변이 시키는 단계를 포함하는 카세트 BAC 벡터의 제조 방법을 제공한다.
상기 서열번호 10의 서열을 갖는 cDNA 단편은 다중 클로닝 부위, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유전자 서열 29157번부터 3′말단의 polyA, 및 리보자임(ribozyme) 서열의 5′말단 일부를 갖는다.
본 발명은 상기 메르스 코로나 바이러스 전장 클론의 제조를 위하여, 카세트 BAC 벡터에 서열번호 5의 서열을 갖는 MERS/KOR2 cDNA, 서열번호 4의 서열을 갖는 MERS/KOR1-2 cDNA, 서열번호 3의 서열을 갖는 MERS/KOR1-1 cDNA, 서열번호 6의 서열을 갖는 MERS/KOR3 cDNA 및 서열번호 7의 서열을 갖는 MERS/KOR4 cDNA의 순서로 cDNA 절편을 삽입하는 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편 및 제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편에 해당하는 메르스 코로나 바이러스의 cDNA 절편을 제조하는 단계; (2) 카세트 BAC 벡터를 제조하는 단계; (3) 상기 카세트 BAC 벡터에 cDNA 절편들을 순차적으로 삽입하는 단계; 및 (4) 상기 카세트 BAC 벡터에 형광 단백질 유전자를 삽입하는 단계를 포함하는 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 형광 단백질 유전자가 토마토 레드 형광 단백질(tomato red florescence protein: RFP)인 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 외국 분리주 메르스 코로나 바이러스와 유전자 염기서열이 달라 전장 클론의 제조가 어려웠던 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 및 이의 제조 방법을 제공한다. 또한, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론에 토마토 레드 형광 단백질(tomato red florescence protein: RFP) 유전자를 추가로 삽입한 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 제공하는, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론은 바이러스로 복원시 감염성과 복제능을 그대로 유지하면서 세포주와 동물모델에서 치료제와 백신의 효능 평가를 위한 표준물질로 활용할 수 있고, 치료제 개발을 위한 대용량 검사법 개발에 활용할 수 있으며, 약독화 백신주 개발에 활용할 수 있다. 또한, 한국 분리주 유래 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터는 형광발현 리포터를 추가로 포함함으로써, 치료제 및 검사법 개발, 효능 평가를 더욱 용이하게 한다.
도 1은 M-CoV-B1 과 pBAC-SARS-CoV-REP에서 유래한 선형 pBAC 골격을 1차적으로 이어 붙여 pBAC-BB를 만드는 과정을 모식도로 나타낸다.
도 2는 BamHI 자리를 사이에 두고 M-CoV-B2와 선형 pBAC-BB를 이어 붙여 pBAC-MERS-CoV-5′-3′ 카세트 BAC 벡터를 완성하는 모식도이다.
도 3은 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 제작시 사용하는 BAC 벡터에서 다중 클로닝 부위(MCS) 외부에 존재하여 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜야 되는 제한효소 자리를 빨간색으로 나타낸다.
도 4는 pBAC-SARS-CoV-REP에서 유래한 선형 pBAC 와 229E-B를 이어 붙여 pBAC-hCoV/229E-5′-3′ 카세트 BAC 벡터를 완성하는 모식도이다.
도 5는 인간 코로나 바이러스의 전장 클론 제작시 사용하는 BAC 벡터에서 다중 클로닝 부위(MCS) 외부에 존재하여 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜야 되는 제한효소 자리를 빨간색으로 나타낸다.
도 6은 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론을 이용해 바이러스를 복원하는 전체 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론을 사용하여 복원된 P0 바이러스를 Huh7에 감염시켜 세포병변 효과를 확인한 이미지를 나타낸다.
도 8은 형광발현 재조합 바이러스에서 토마토 레드 형광 단백질(RFP)이 발현되는 모습을 나타낸 모식도이다.
도 9는 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터로부터 복원된 형광 단백질 발현 재조합 바이러스 P0를 Huh7에 감염시켜 48시간 후에 공초점(confocal) 현미경으로 촬영한 형상을 나타낸다.
도 10은 Huh7에 moi 0.001로 rYKC 및 rYKC-RFP를 각각 감염시킨 후 1, 2, 3일 후에 세포 모양을 관찰한 사진을 나타낸다.
도 11은 rYKC 및 rYKC-RFP의 각각의 감염모델에서 plaque assay를 한 결과를 나타낸다.
메르스 코로나 바이러스는 약 30 kb의 단일 양성가닥 유전자를 갖고 있으며 이 유전자는 5‘ 말단에 Cap으로 보호된 5’-UTR (Untlanslated Region)과 3' 말단에 polyA-tail을 포함하는 3'-UTR를 갖고 있다. 메르스 코로나 바이러스는 RNA 바이러스 중 가장 긴 유전자를 갖고 있으며, 총 8개의 mRNA(1개의 full-length genome 및 7개의 subgenome)를 사용하여 복제에 관여하는 단백질(ORF1a/1b), 구조단백질 및 부속단백질들을 생성한다.
메르스 코로나 바이러스 EMC주는 메르스 코로나 바이러스가 첫 발견된 2012년, 사우디아라비아 환자로부터 네덜란드 의과학연구센터(Erasmus Medical Center, EMC)가 처음으로 분리한 바이러스로 미국 국립보건원의 유전자 은행에 보관되어 있으며 메르스의 변종 등을 비교할 때 표준이 된다.
인간 코로나 바이러스 229E주는 1960년대 중반에 감기에 걸린 사람들로부터 분리되어 처음으로 보고된 감기 바이러스이다. 본 발명에서는 메르스 코로나 바이러스의 대조물질로 사용되었다.
메르스 코로나 바이러스는 사스 코로나 바이러스와 유사한 유전자 구조를 가지고 있으며, 바이러스 subgenome mRNA는 RNA 재조합을 통해 생성된다. 이들 subgenome mRNA는 다른 코로나 바이러스와 유사하게 개별적으로 복제가 되어 바이러스 단백질을 만드는데 사용된다. 각 코로나 바이러스에서 subgenome mRNA의 감염세포 내 생성비율은 다른 것으로 보고되어 있으며, 이는 subgenome mRNA 합성에 중요한 역할을 하는 전사 조절서열(transcriptional regulatory sequence; TRS)과 복제효소-숙주단백질의 상호작용에 의해 조절된다.
본 발명에서 용어 “조절서열(regulatory sequence)”은 유전자의 발현을 조절하는 염기서열을 뜻한다. 하나의 세포 또는 개체에서 유전자 형질발현을 엄격하게 조절하기 위해 유전자를 활성화시키거나 억제하여 형질발현을 조절하는 단백질들을 전사인자라고 하는데, 조절서열은 전사인자가 결합하는 자리를 제공하는 역할 및 전사인자와의 복합체 구조에 영향을 미쳐 전사인자의 기능을 결정하는 역할을 한다.
본 발명에서 용어 “클로닝(cloning)”은 동일한 유전자를 대량 생산하는 유전 공학기술로, 유전자 또는 DNA 절편을 대량 생산하기 위하여 벡터(vector)로 작용하는 플라스미드 또는 바이러스에 도입하여 세포분열을 통하여 유전적으로 동일한 클론을 복제하는 기술을 의미한다.
본 발명에서 용어 “클론(clone)”은 동일한 복제물을 의미하는 것으로, 동일한 세포집단 또는 특정 유전자 절편의 동일한 복제물을 뜻한다. 본 발명에서 클론이란 메르스 코로나 바이러스의 전장 또는 일부 유전자의 동일한 복제물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "전장 클론"은 메르스 코로나 바이러스의 전장 cDNA를 벡터에 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 의미하는 것으로 사용되었다.
본 발명에서 용어 "cDNA"는 mRNA와 상보적인 DNA를 의미하는 것으로, 바람직하게는 메르스 코로나 바이러스의 mRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “다중 클로닝 부위(multi cloning site, MCS)”는 벡터 내에 여러 종류의 제한효소로 잘릴 수 있는 위치를 한 곳에 모아 놓은 부위를 의미하며, 벡터의 다른 부분은 잘리지 않고, 이 부분만 잘릴 수 있도록 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓은 부위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "벡터"란 외래 유전자를 도입하여 외래 유전자가 발현될 수 있게 하는 수단으로써, 스스로 자신을 복제할 수 있는 플라스미드(plasmid) 벡터, 코즈미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "BAC(bacterial artificial chromosome) 벡터"는 E. coli의 F 플라스미드를 이용하여 제조된 플라스미드, 또는 약 300 kb 이상의 커다란 DNA 단편을 박테리아 내부에서 안정하게 유지하고 생장 가능한 벡터를 의미한다. BAC 벡터는 스스로의 복제를 위해 필수적인 영역을 반드시 포함하며, 이러한 영역은 F 플라스미드의 복제기점(oriS) 및 그의 변이체일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “F 플라스미드(F plasmid)”는 세균류의 특정 균주에서 발견되는 염색체외 DNA(extrachromosomal DNA)로서 세균간 DNA 전달에 필요한 유전자들을 포함하는 접합 플라스미드(conjugative plasmid)를 의미한다. F 플라스미드의 F는 가임성(fertility)을 의미하며, F 플라스미드는 세포간 접촉을 통해 유전자 전달을 유도하는 접합(conjugation) 과정에 반드시 필요한 인자이다.
본 발명에서 용어 “카세트(cassette)”는 프로모터(promotor), 리보솜 결합부위 (ribosome binding site), 특정 제한부위(unique restriction site), 및 종결자(terminator)로 구성된 염기서열로서 특정 제한부위에 삽입된 외래유전자의 발현을 조절할 수 있는 발현벡터 상의 염기서열 부위를 의미한다. 즉, 상기 카세트는 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하기를 원하는 외래의 유전자를 자유롭게 삽입할 수 있는 벡터 상의 특정 영역을 의미하며, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR) 등을 통해 증폭된 외래의 유전자를 상기 특정 영역에 삽입하여 재조합 할 수 있다. 본 발명에서는 BAC 벡터를 이용해 제조한 “카세트 BAC 벡터”에 메르스 코로나 바이러스 전장 유전자를 클로닝 하였다.
본 발명에서 용어 “제한효소(restriction enzyme)”는 DNA 또는 RNA의 특정한 염기배열을 인식하고 염기사슬을 절단하는 핵산분해효소의 하나인 엔도뉴클레아제(endonuclease)로서 유전공학에서 재조합 DNA 또는 RNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소를 말한다.
본 발명에서 사용되는 제한효소 BamHI(807)은 메르스 코로나 바이러스 전장 유전자의 807번째 염기를 제한부위로 인식하고, StuI(9075)은 9075번째 염기를 제한부위로 인식하며, PvuI(18776) 및 PvuI(25760)은 18776 및 25760번째 염기를 제한부위로 인식하고, SacII(29157)은 29157번째 염기를 제한부위로 인식한다.
또한, 제한효소 EcoNI(585)는 인간 코로나 바이러스 229E 전장 유전자의 585번째 염기를 제한부위로 인식하며, AfeI(8232), AfeI(13984), BbvCI(24639) 및 AvrII(27132)는 인간 코로나 바이러스 229E 전장 유전자의 8232, 13984, 24639 및 27132번째 염기를 제한부위로 인식한다.
본 발명에서 용어 “프라이머(primer)”는 합성하고자 하는 특정 유전자 서열에 대하여 상보적인 짧은 유전자 서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 말하는 것으로, PCR, DNA sequencing 등에 이용할 목적으로 합성된 것을 말한다.
본 발명에서 용어 "프로모터(promotor)"는 RNA 중합효소가 특이적으로 결합하여 전사를 시작하는 DNA 상의 영역을 의미하며, 본 발명에서 프로모터는 전사에 필요한 기본인자(basal element) 뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"은 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하고, 숙주가 진핵세포인 경우에는 “형질주입(transfection)”이라는 용어를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 형질전환은 외래 유전자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 모든 방법을 포함할 수 있고, 바람직하게는 외래 유전자를 대장균에 도입하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “전기천공(electroporation) 법”은 세포를　DNA 용액에 현탁하여 직류 고전압의 펄스를 통과시키면 세포 내에　DNA가 도입되는 것을 이용한 유전자 도입법의 하나이다. 전기에 의해 세포막에 구멍이 뚫리고 동시에　DNA 분자가 전기 영동의 작용으로 세포 내로 도입된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
[실시예]
본 발명자들은 전장 클론 제작을 위한 방법으로 1) 합성 DNA, 2) cDNA와 합성 DNA 병용, 3) cDNA만을 사용하는 3가지 방법을 검토하였다.
그 중에서, cDNA만을 사용하는 방법은 합성 DNA를 사용하는 방법과 비교할 때, 환자로부터 얻은 메르스 코로나 바이러스와 비교하여 세포주에서 계대(passage)되면서 차별되도록 진화된 클론을 얻을 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 환자에서 분리한 당시의 바이러스 서열과 비교 분석하여, 메르스 코로나 바이러스가 세포주에 적응하여 진화하는 단계를 연구하는데 필요한 정보를 얻을 수 있고, 나아가 향후 약독화된 바이러스를 통하여 백신을 개발하는데도 유용한 정보를 얻을 수 있을 수 있을 것으로 기대되는, cDNA만을 사용하는 세번째 방법을 선택하였다.
이에 따라, 본 발명자들은 cDNA를 가장 안정적으로 유지할 수 있는 것으로 알려진 BAC 벡터를 이용하여, 전장 cDNA를 포함하는 재조합 벡터를 세포내로 도입해 재조합 바이러스 복원을 시도하였다.
본 발명에서, 단일 전장 클론을 제조하는데 사용한 BAC 벡터는 5’ 말단에 CMV 프로모터가 위치하고, 3’ 말단에는 전사 종료 서열, 및 리보자임(ribozyme) 인식부위를 삽입하여 도입될 바이러스 유전자 말단에 polyA-tail이 생성될 수 있도록 디자인된 것을 사용하였다.
[실시예 1]
전기천공적격(Electrocompetent) E. coli 세포의 준비
본 발명자들은 E. coli 500 ml culture에서 약 60 개의 50 μL 전기천공적격 세포(electrocompetent cell)를 하기의 방법으로 준비하였다.
먼저, LB agar를 30 g/L에 맞춰 3차 증류수에 넣고 고압증기 멸균기(autoclave)로 멸균한 후, 42 ℃까지 식힌 후 90 x 15 mm 페트리 접시에 굳혔다. LB broth 배지는 1% (w/v) 트립톤(tryptone), 0.5% (w/v) 효모 추출물(yeast extract), 1% (w/v) NaCl을 혼합 후 pH 7.0까지 NaOH로 맞춰주거나, LB broth high salt (Duchefa Biochemie, L1704)를 25 g/L로 맞춰 증류수에 녹인 후, 적당한 플라스크 또는 용기에 덜어서 고압증기 멸균기(autoclave)로 멸균하였다. LB agar 배지에 전기천공적격 세포를 만들 균주를 streaking하여 하룻밤 동안 37℃에서 배양하여 단일 콜로니(single colony)를 수득하였다.
SOB 배지는 2.5mM KCl, 2% (w/v) 트립톤(tryptone), 0.5% (w/v) 효모 추출물(yeast extract), 0.05% (w/v) NaCl로 녹인 후 pH 7.0까지 NaOH로 맞춘 후 고압증기 멸균기로 멸균하여 준비하였다. 상기 과정에서 수득한 단일 콜로니(single colony)를 10 mL의 SOB 배지에서 하룻밤 동안 37℃에서 진탕 배양 (약 180-220 rpm)하였다.
이후 500 ml SOB 배지에 전날 배양한 진탕 배양액을 1/100로 희석하여 550 nm에서 OD값이 0.7이 될 때까지 37℃, 200 rpm에서 2~3시간 동안 진탕 배양하였다. 배양한 플라스크를 얼음에서 최소 20분 동안 방치하여 냉각시키고, 미리 냉각시켜 둔 병에 옮겨 10분 동안 4℃, 6000 x g에서 원심분리하였다. 이후 모든 과정을 4℃ 이하에서 진행하였다.
상기 원심분리 후 세포를 제외한 상층액(배지)을 버리고, 배양액을 냉각된 10% 글리세롤 500 mL에 현탁하고 다시 10분간 4℃, 6000 x g에서 원심분리하였다. 이때, 10% 글리세롤은 고압증기 멸균기로 멸균한 상태로 준비하였다. 그후 상층액(배지)을 버리고, 냉각된 250 mL의 10% 글리세롤에서 한번, 125 mL의 10% 글리세롤에서 한 번씩 현탁하고 원심분리하는 과정을 되풀이하였다.
마지막으로 상층액을 버리고 10% 글리세롤 3 mL을 첨가하여 분산시키고, 50 μL씩 e-tube에 분취(aliquot)한 후, 액체질소에 얼려 -80℃ 초저온 냉장고(deep freezer)에 보관하였다. 이를 pUC19으로 시험한 결과, 한 튜브 당 1 x 109 cfu/μg 정도의 결과물을 수득하였다.
[실시예 2]
BAC 벡터 및 cDNA의 준비
본 발명자들은 BAC 벡터에 cDNA를 삽입하기 위하여, BAC 벡터 및 cDNA가 들어있는 플라스미드를 알맞은 제한효소로 처리하여 최소 3시간 내지 하룻밤 동안 처리하였다. 제한효소는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 전장 클론 제작시 BamHI, StuI, PvuI, SacII를 사용하였고, 인간 코로나 바이러스 229E(hCoV/229E)의 클론 제작시 EcoNI, AfeI, BbvCI, AvrII를 사용하였다.
DNA의 크기 및 효율에 맞추어, 겔 추출법으로 적당한 크기의 DNA를 깨끗하게 정제하여 순도 높은 DNA를 준비하고, gel extraction은 QIAGEN QIAEX II Kit 또는 low melting agarose를 사용하여 phenol extraction하였다. 이때, UV의 노출을 최대한 피하고 DNA 이중나선 사이에 킬레이트 될 수 있는 물질의 사용량을 최대한 감소시킨 상태로 진행하였다.
DNA에 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 처리한 후 페놀-클로로포름(phenol-chloroform) preparation 및 에탄올 침전 방법으로 정제하였다. 그후, 정제할 DNA의 부피를 100~200μL에 맞게 증류수나 TE buffer로 채워준 후 동일 양의 페놀 : 클로로포름: 이소아밀알코올 (25 : 24 : 1의 비율) 혼합액을 첨가하여 강하게 혼합하였다. 상기 혼합액을 13,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 수상층의 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. DNA가 있는 상층액의 0.1배 부피의 3M 소디움 아세테이트, 글리코겐 (20μg/μL) 1μL, 및 2.5배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 분산시킨 후 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후에는 13,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 DNA를 침전시키고, 침전물을 제외한 상층액을 제거하였다.
1 mL의 70% 에탄올로 세척한 후 13,000 x g, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 침전물을 제외한 상층액을 제거하였다. 에탄올을 제거한 후 상온에서 10분간 에어드라이 시킨 후 결과물을 적절한 양의 증류수에 녹였다.
UV 분광측광기(spectrophotometry)로 DNA의 순도 및 농도를 확인하고 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 재확인하였다.
[실시예 3]
BAC 벡터에 cDNA의 삽입 과정
BAC 벡터에 cDNA를 삽입하는 방법은 각 상황에 맞게 ligation 또는 infusion 방식을 사용하였다.
접합(ligation) 방법의 경우, 실시예 2에서 준비한 BAC 벡터 및 DNA를 분자비 1:3으로 혼합하였다. 이후 T4 DNA ligase 반응액을 조성한 후. 16℃ 16시간 반응시켰다.
재조합(infusion) 방법의 경우, 벡터와 삽입 유전자의 분자비를 1:2로 하되, 각각 Takara 및 NEB사의 제품의 반응 조성을 준비하여 50℃에서 15~30분 반응시켰다.
전기천공을 위해 반응액에서 페놀-클로로포름 추출(phenol-chloroform extraction) 및 에탄올 침전법으로 완충액을 제거하고 증류수 5~10 μL에 재분산하여 고순도의 재조합벡터를 수득하였다.
[실시예 4]
cDNA의 클로닝
본 발명자들은 세포주에서 계대 배양된 바이러스의 RNA로부터 cDNA 절편들을 확보하였다. 이를 pCR2.1-TOPO 벡터 및 상대적으로 긴 cDNA 절편 클로닝에 사용되는 TOPO® XL 벡터에 삽입한 후 대장균에 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 분석해 본 결과, (1) cDNA 절편이 너무 커서 cDNA가 클로닝되지 않고 self-ligation된 벡터만 분리되거나, (2) E. coli에게 독성을 갖는 DNA 서열이 있어 콜로니가 매우 늦게 자라거나, (3) 서열이 불안정하여 파편화(fragmentation)되는 현상을 관찰하였다.
이와 같은 결과는 다수의 복제체(high copy number)를 갖는 pCR2.1-TOPO 벡터에서 도입 유전자가 쉽게 변형된다는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해 소수의 복제체(low copy number)만 갖는 벡터인 BAC 벡터를 이용하여 클로닝을 하였다. 구체적으로 상기 BAC 벡터는 pBeloBAC11(Caltech)에서 유래한 pBAC 벡터를 사용하였다.
[실시예 5]
cDNA 절편 서열분석 및 교정
클로닝된 cDNA 절편들의 염기서열을 비교 분석한 결과, 돌연변이가 생긴 부분을 따로 짧게 RT-PCR을 한 후 각 6개의 독립된 클론에 대한 서열분석을 진행하였다. 점 돌연변이(point mutation)의 경우, 적응 돌연변이(adaptive mutation) 로 판단된 것은 그대로 유지하고, 다른 독립된 클론에서 발견되지 않은 돌연변이의 경우 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)로 서열을 수정하는 작업을 수행하였다. 또한 삭제 돌연변이(deletion mutation)나 삽입 돌연변이(insertion mutation)으로 인한 틀-변환(frame-shift) 돌연변이가 생긴 것 역시 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)로 원 서열로 복원하였다.
[실시예 6]
전기천공법으로 형질전환
실시예 1에서 준비한 전기천공적격 E. coli cell과 실시예 3에서 준비한 재조합벡터를 혼합하고, 얼음에서 3분간 인큐베이션 하였다. 이후, 1 mm 큐벳(cuvette)에 상기 세포와 제조합벡터의 혼합물을 로딩하고, 기포가 발생하지 않고 균일하게 로딩이 되도록 큐벳을 tapping 하였다.
상기 혼합물을 BioRad Gene Pulser를 이용하여 200 Ω, 25 μF, 1.8 kV 세팅에서 전기적 펄스(electric pulse)를 주었다. 그후, 펄스를 줌과 동시에 미리 37℃로 준비해 놓은 SOC 배지 1 mL에 세포를 분산시키고 e-tube에 옮겨 37℃ 혼합 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 안정화 과정을 거쳤다. 이때, SOC 배지는 SOB 배지에 멸균한 MgCl2 및 MgSO4를 각각 10 mM이 되도록 첨가하고 여과한 글루코스를 20 mM이 되도록 첨가해 만든 것을 사용하였다.
상기 안정화를 마친 혼합물 중의 일부를 LB agar 배지에 도말한 후 37℃ 인큐베이터에 약 20-24시간 넣어 콜로니가 형성될 때까지 배양하였고, 적절한 대조군을 준비하여 self-ligation 및 background colony 여부를 확인하였다.
[시험예 1]
한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 제조를 위한 제한효소 선정
서열번호 1의 서열을 갖는 질병관리본부에서 분양한 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 (P3, 계대수3 분리주; 국가관리번호 1-001-MER-IS-2015001, 이하 MERS-CoV/KOR)의 유전자(GenBank no. KT029139)를 분석하여 BAC 벡터에는 제한효소 절단부가 존재하지 않고, 바이러스의 cDNA에만 절단부가 1-2개 존재하는 제한효소를 선정하여 전장 클론 제작에 사용하였다. 이때, 상기 BAC 벡터는 pBeloBAC11에서 유래한 pBAC 벡터를 사용하였다.
구체적으로, 30 kb가 넘는 긴 RNA에서 최소 두개 이상의 제한부위를 가지면서 BAC 벡터의 골격을 절단하지 않는 제한효소를 탐색하였으며, 그 중 cDNA 합성 및 PCR 증폭이 가능한 크기인 10 kb 미만의 cDNA 절편을 생성할 수 있는 제한효소를 사용하였다.
구체적으로 상기 제한효소는 메르스 코로나 바이러스의 807번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 BamHI(이하, BamHI(807)), 9075번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 StuI(이하, StuI(9075)), 18776 및 25760번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 PvuI(이하, PvuI(18776) 및 PvuI(25760)), 및 29157번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 SacII(이하, SacII(29157))을 선정하였다.
제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR1로 하고, 서열번호 2의 서열을 갖는다.
제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR2로 하고, 서열번호 5의 서열을 갖는다.
제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)이 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR3로 하고, 서열번호 6의 서열을 갖는다.
제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)이 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 MERS/KOR4로 하고, 서열번호 7의 서열을 갖는다.
이후, 상기 각 절편에 대한 프라이머를 제작하고, 해당 프라이머를 이용해 PCR로 cDNA 절편들을 합성하였다. 이때, MERS/KOR1에 해당하는 절편은 두 조각으로 나누어 각각 서열번호 3의 서열을 갖는 MERS/KOR1-1과 서열번호 4의 서열을 갖는 MERS/KOR1-2로 명명하고 따로 PCR로 합성하였다.
[시험예 2]
한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 제조를 위한 카세트 BAC 벡터 제조
BamHI, StuI, PvuI, SacII를 다중 클로닝자리(multiple cloning site, MCS)로 가지며 MCS를 사이에 두고 앞뒤로 5′말단부터 807번까지, 그리고 29157번부터 3′말단까지를 포함하는 카세트 BAC 벡터를 제조하였다.
상기 카세트 BAC 벡터 제작을 위해 pBAC-SARS-CoV-REP (Almazan et al., 2006)으로부터 서열번호 8의 서열을 갖는 5′- Rz - BGH - BAC - CMV - 3′ 부분의 8.2 kb를 아래와 같은 조건에서 PCR로 증폭하였다.
① initiation : 3 min, 93℃,
② denaturation : 15 sec, 93℃
③ annealing : 30 sec, Tm-5℃
④ extension : 1min/kb, 68℃,
②~④ x 35 cycle
⑤ termination : 7 min, 68℃
5′ 말단의 1번부터 810번까지의 cDNA 조각을 한국 분리주 바이러스의 RNA로부터 RT-PCR을 하여 수득한 후, 벡터와 양 말단이 15 bp가 겹치도록 프라이머를 주문 제작하여 PCR로 증폭시켜 얻은 산물을 M-CoV-B1라고 명명하고, 해당 염기서열을 서열번호 9에 기재하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 선형 벡터 및 M-CoV-B1 단편을 연결하여 제조한 산물을 pBAC-BB라고 명명하였다. pBAC-BB를 BamHI으로 자른 후, 이를 주형으로 PCR을 하여 선형 pBAC-BB를 증폭하였다.
이후 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론 제작시 사용할 제한효소 자리들을 순차적으로 지닌 다중클로닝 부위(multicloning site)를 포함하고, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유전자 서열 29157번부터 3′말단의 polyA와 리보자임(ribozyme) 서열의 5′말단의 일부를 지닌 단편을 M-CoV-B2로 명명하고, 해당 염기서열을 서열번호 10에 기재하였다. M-CoV-B2를 합성할 때 pBAC-BB와 양 말단이 15 bp씩 오버랩 되도록 디자인하였다.
이후, 도 2에 나타낸 바와 같이, 선형 pBAC-BB와 M-CoV-B2를 연결하였다.
pBAC은 pBeloBAC11 유래이며, pBeloBAC11에는 StuI, PvuI, 및 SacII 절단부가 도 3과 같이 존재하여 이들을 각각 부위-특이적 돌연변이 유도 키트(site-directed mutagenesis kit: Agilent사 제품)를 사용하여 침묵 돌연변이(silent mutation)를 시켜주었다. 돌연변이를 유도한 부위의 염기서열을 확인하고 최종적으로 XbaI으로 절단하였을 때 8.0 kb와 2.0kb의 band를 확인할 수 있었고, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 카세트 BAC 벡터로 이용할 pBAC-MERS-CoV/KOR-5′-3′을 완성하였다.
[시험예 3]
한국 분리주 메르스 코로나 바이러스의 전장 클론 제조
상기 카세트 BAC 벡터에, 시험예 1에서 합성한 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV/KOR)의 cDNA 절편 중 가장 긴 9.7 kb 크기의 MERS/KOR2 cDNA(서열번호 5) 절편을 삽입하고, pBAC- MERS-CoV/KOR-5′-KOR2-3′로 명명하였다. 그리고 연결부분 서열 및 최종 플라스미드 산물의 서열을 분석하여 제대로 연결되었는지 여부를 확인하였다.
이후에 MERS/KOR2 cDNA 절편이 삽입된 pBAC- MERS-CoV/KOR-5′-KOR2-3′ 벡터에 서열번호 4에 해당하는 MERS/KOR1-2 절편을 연결하고, 상기 확인 과정을 반복하였다. 이후 동일한 과정을 반복하여 차례대로 서열번호 3에 해당하는 MERS/KOR1-1, 서열번호 6에 해당하는 MERS/KOR3 및 서열번호 7에 해당하는 MERS/KOR4 절편을 삽입하고, 염기서열을 분석하여 제대로 연결되었음을 확인하였다.
[비교예 1]
메르스 코로나 바이러스 EMC strain(MERS-CoV/EMC)의 전장 클론 제조
상기 시험예 1 및 2와 동일한 방법으로 제한효소를 선정하여 카세트 BAC 벡터 pBAC-MERS-CoV/EMC-5′-3′를 제조하였다. 또한, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 (MERS-CoV/KOR)와 동일한 패턴의 cDNA 절편을 얻을 수 있었으며, 이를 각각 MERS/EMC1-1, MERS/EMC1-2, MERS/EMC2, MERS/EMC3 및 MERS/EMC4로 명명하였다.
메르스 코로나 바이러스 EMC주(MERS-CoV/EMC)는 시험예 3에 개시된 한국 분리주 MER-CoV/KOR 전장 클론 제작과정과 유사하게, 상기 과정에서 얻어낸 제일 긴 MERS/EMC2 cDNA 절편을 가장 먼저 카세트 BAC 벡터인 pBAC-MERS-5′-3′에 연결하였다. 이후 MERS/EMC1-2 및 MERS/EMC1-1을 차례로 연결하는데 성공하였다.
그러나, EMC2(9.7 kb) 및 EMC1(8.3 kb)를 합한 18 kb까지 연결하는 데에는 성공하였으나, MERS/EMC3과 MERS/EMC4는 추가로 벡터에 도입하는 것이 불가능하였다. 구체적으로, EMC strain에는 3번 및 4번 cDNA 사이에 있어야 할 PvuI 제한효소 자리가 없어 EMC3과 EMC4를 합친 10.4kb의 EMC3+4를 먼저 제작하고 이를 벡터에 도입하고자 하였으나, 상기 cDNA를 벡터에 도입시 재조합벡터의 안정성이 극도로 낮아져 전장 클론 제작이 불가하였다.
[비교예 2]
인간 코로나 바이러스 229E strain(hCoV/229E)의 전장 클론 제조
인간 코로나 바이러스 229E(hCoV/229E)의 전장 클론은 상기 시험예 1 및 2와 유사한 방법으로 제한효소를 선정하여, 카세트 BAC 벡터를 제조하였다. 각 제한효소가 인식하는 제한부위의 위치를 제한효소 뒤에 괄호로 표기하였다.
1. 제한효소 선정
구체적으로, 순차적으로 인간 코로나 바이러스 229E의 585번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 EcoNI(이하, EcoNI(585)), 8232 및 13984번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 AfeI(이하, AfeI(8232) 및 AfeI(13984)), 24639번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 BbvCI(이하, BbvCI(24639)), 및 27132번째 염기를 제한부위로 인식하는 제한효소 AvrII(이하, AvrII(27132))를 선정하였다.
제한효소 EcoNI(585)과 AfeI(8232)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 hCoV/229E1로 하고, 제한효소 AfeI(8232)과 AfeI(13984)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 hCoV/229E2로 명명했다. 제한효소 AfeI(13984)과 BbvCI(24639)이 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 hCoV/229E3로 하고, 제한효소 BbvCI(24639)과 AvrII(27132)가 각각 인식하는 제한부위 사이에 해당하는 cDNA 절편은 hCoV/229E4로 명명했다.
이후, 상기 각 절편에 대한 프라이머를 제작하고 해당 프라이머를 이용해 PCR로 상기 cDNA hCoV/229E1 내지 hCoV/229E4를 합성하였다.
2. 카세트 BAC 벡터 제조
인간 코로나 바이러스 229E의 경우 EcoNI, AfeI, BbvCi, AvrII를 순차적으로 다중 클로닝 부위(MCS)로 가지며 MCS를 사이에 두고 앞뒤로 5′말단부터 585번까지, 및 27132번부터 3′말단까지를 포함하는 카세트 BAC 벡터를 제작하였다.
상기 카세트 BAC 벡터 제작을 위해 pBAC-SARS-CoV-REP으로부터 5′- Rz - BGH - BAC - CMV - 3′부분의 8.2 kb를 PCR로 증폭하고, 결과물인 선형의 벡터를 pBAC-hCoV로 명명하였다.
인간 코로나 바이러스 229E의 5′말단의 1번부터 579번까지의 서열에 이어서 전장 클론 제조시 사용할 제한효소 부위들을 순차적으로 지닌 다중 클로닝 부위(MCS)를 지나 27132번부터 3′말단의 polyA와 리보자임 서열의 5′말단의 일부를 지닌 DNA 조각을 229E-B로 명명하였다. 이를 pBAC-hCoV 벡터와 양 말단이 15 bp가 오버랩이 되도록 PCR 증폭하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 선형의 벡터 pBAC-hCoV 및 229E-B 조각을 연결하여 pBAC-hCoV/229E-5′-3′을 제작하였다. pBAC은 pBeloBAC11 유래이며, pBeloBAC11에는 EcoNI과 AfeI 자리가 도 5에 붉은색 글씨로 표시한 바와 같이 존재하여 이들을 각각 부위-특이적 돌연변이 유도 키트(site-directed mutagenesis kit: Agilent사 제품)를 사용하여 침묵 돌연변이를 시켜주었다. 돌연변이를 유도한 부위의 염기서열을 확인하고 최종적으로 NotI으로 잘랐을 때 6.9 kb와 2.1kb의 band를 확인하여 229E 주(strain)의 카세트 BAC벡터인 pBAC-hCoV/2229E-5′-3′을 제조하였다.
3. 전장 클론의 제조
본 발명자들은 hCoV/229E 전장 클론의 제작을 위하여 앞서 제조한 229E strain의 cDNA 절편 중 가장 긴 hCoV/229E3 cDNA 절편을 상기 카세트 BAC벡터인 pBAC-hCoV/2229E-5′-3′에 가장 먼저 연결하고, 연결부위의 염기서열을 확인하였다. 이후, hCoV/229E4 cDNA를 연결하는데 성공하였다.
즉, 229E 전장 클론은 hCoV/229E3(10.7 kb)와 hCoV/229E4(2.5 kb)를 합한 총 13.2 kb를 삽입하는 것에는 성공하였으나, 많은 시도와 조건 변경에도 불구하고 hCoV/229E1와 hCoV/229E2를 삽입하는 경우 재조합벡터의 안정도가 급격히 떨어져 전장 클론의 제작이 불가능하였다.
이는 대장균 유전자간 non-homologous 재조합이 일어나거나 바이러스 cDNA 내에 있는 cryptic promoter에 의해 대장균에 매우 해로운 단백질이 발현하는 경우 등의 이유인 것으로 확인하였다.
시험예 3 및 비교예 1 및 비교예 2의 결과를 비교할 때, 동일한 메르스 코로나 바이러스라고 하더라도, MERS-CoV/EMC와 MERS-CoV/KOR는 유전자 서열 특성이 달라 동일한 제조방법으로 제조되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 비교예 2의 결과를 고려할 때 더욱 확실해지는 것을 알 수 있다.
[시험예 4]
형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터의 제조
본 발명자들은 MERS-CoV/KOR의 BAC 벡터 기반 전장 클론을 확보하고, 복제 및 감염성을 편리하게 평가하기 위해 리포터 유전자가 삽입된 메르스 코로나 바이러스의 재조합 벡터를 제조하였다.
구체적으로, 바이러스 구조단백질(S,M,N) 코딩유전자는 유지하고 복제에 영향을 주지 않은 비구조단백질(ORF3, ORF4, ORF5)에 토마토 레드 형광 단백질 (tomato red florescence protein, RFP) 유전자를 삽입한 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터를 제조하였다.
부속단백질(accessory protein) 4a는 type I 인터페론 저해제인 것으로 알려져 있어 이 유전자를 삭제 및 변형하지 않도록 하였다. 반면, 비구조단백질 부속단백질 5의 결손이 바이러스 복제 및 감염성에 크게 영향을 미치지 않는다고 알려져 있다.
전장 클론 제작에 성공한 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 (MERS-CoV/KOR)의 cDNA 서열 분석결과, ORF5 단백질의 발현이 일어나지 않아도 세포주에서 바이러스가 생성될 수 있는 것을 확인하였다. 이는 MERS-CoV/EMC의 감염성 클론을 만든 스페인의 Enjuanes 그룹의 연구결과 및 Almazan (Almazan et al., mBio, 2013)과 Baric 그룹의 연구 결과와 일치하는 것을 확인하였다(Scobey, et al., PNAS, 2013). 이에 본 발명자들은 MERS/KOR4 절편에 위치한 ORF5 전사 조절서열에 손상을 주지 않는 위치인 서열번호 11에 해당하는 26825-27512번 서열 부분에 리포터인 토마토 레드 형광 단백질(tomato red florescence protein: RFP) 코딩 유전자를 삽입하여 서열번호 12에 해당하는 MERS/KOR4-RFP를 제조하였다.
이후 MERS-CoV/KOR의 전장 클론 제조 과정과 동일하게 MERS/KOR3까지 연결된 pBAC-5′-KOR1-KOR2-KOR3-3′에 상기 MERS/KOR4-RFP를 연결하고, 염기서열을 분석하여 정확하게 형광 유전자가 도입된 것을 확인하여 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터를 성공적으로 제작한 것을 확인하였다.
[시험예 5]
형광 단백질 발현 재조합 메르스 코로나 바이러스의 감염성 및 복제능 확인
상기 시험예 4에서 제조된 재조합 벡터로부터 복원된 형광 단백질 발현 재조합 메르스 코로나 바이러스가 감염성 및 복제능이 유지되는지 여부를 확인하는 시험을 하기와 같이 실시하였다.
1. 시험 방법
시험예 4에서 얻은 재조합 벡터로부터 복원된 형광 단백질 발현 재조합 메르스 코로나 바이러스를 전기천공법 또는 리포펙타민을 사용하여 세포 내로 도입하였다.
이후에 형질전환된 세포로부터 시간별로 총 3일간 배양액과 감염된 세포에서 총 RNA 및 세포 용해물(cellular lysate)을 회수하고, 바이러스를 불활성화한 시료를 사용하여 qRT-PCR, 노던 블로팅(Northern blotting) 및 웨스턴 블로팅(Western blotting) 분석을 수행하였다.
2. 복원된 메르스 코로나 바이러스의 감염성 및 복제능의 확인
도 6에 나타낸 바와 같이, BHK-21 (Baby Hamster Kidney strain 21) 세포주에 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 전장 클론을 형질주입(transfection)하였다. BHK-21은 바이러스에 대한 감수성은 떨어지지만, 형질주입이 잘 되는 특성이 있다. 형질주입 하고 6시간 후 세포를 트립신 처리하여 분리하고 메르스 코로나 바이러스에 감염성을 가진 인간 간암 세포주(hepatocellular carcinoma)인 Huh7 세포주 단층에 공생 배양하였다.
상기 방법으로 2~3일 내로 세포병변 효과(cytopathic effect)를 나타내는 것을 확인하였고, 상기 결과를 도 7에 나타내었다. 이렇게 하여 나온 바이러스를 함유한 배양액을 P0 바이러스로 명명하여, 다시 새로운 Huh7에 P0 바이러스를 감염시켜 바이러스를 계대 배양하고, 계대 배양 결과 나온 바이러스 배양액을 P1 바이러스로 명명하고 이를 사용하여 복원된 재조합 바이러스의 복제능 및 감염성을 분석하였다.
도 7에 나타낸 것처럼 복원된 P0 바이러스를 Huh7에 감염시켜 세포병변 효과 이미지를 분석한 결과, 세포병변 효과의 특성인 다핵질의 융합세포(syncytia)와 세포가 동그랗게 되거나(cell rounding), 봉입체(inclusion body)를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 복원된 바이러스 P1으로 Huh7 세포주 및 MAVS knock-out Huh7에 MOI 0.01로 감염을 시켜, 24시간 후와 48시간 후 배지를 회수해 플라크 형성 측정법(plaque forming assay)을 수행하고, 감염 후 24시간이 경과한 세포 샘플을 취득하여 전체 RNA 및 세포 용해물을 사용하여 복제능 및 감염성을 플라크 형성 측정법(plaque forming assay), qRT-PCR, 웨스턴블롯 및 노던블롯 등 다각도로 평가하였다. 그 결과, 감염시킨 세포에서 바이러스 RNA 및 단백질이 24시간 만에 뚜렷하게 검출됨을 확인함으로써 재조합 메르스 코로나 바이러스의 감염성을 확인할 수 있었다.
3. 형광 단백질 재조합 메르스 코로나 바이러스의 감염성 및 복제능 확인
본 발명의 형광 단백질 발현 재조합 메르스 코로나 바이러스는 토마토 레드 형광 단백질 (tomato red florescence protein, RFP) 유전자가 ORF5의 자리에 삽입되어 있으므로, 복 제능을 지닌 바이러스에서 만들어진 하위 유전체(subgenome) RNA가 합성되어야 붉은색 형광 단백질(RFP)이 발현되어 붉은색 형광을 발한다. 즉, 바이러스의 복제능이 유지되어야 형광이 발현된다. 이러한 바이러스 복제단계 모식도를 도 8에 나타내었다.
형광 단백질 발현 재조합 메르스 코로나 바이러스는 MERS-CoV/KOR 전장 클론과 동일한 방법으로 재조합 바이러스를 복원하였다. 형광발현 클론을 형질주입(transfection)한 세포로부터 만들어진 재조합바이러스 P0를 Huh7에 감염시킨 후 48시간 후에 세포병변 효과가 확인되어 형광(RFP)이 발현되었는지 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용해 이미지 분석을 실시하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 형광 단백질 재조합 바이러스에 감염시킨 세포에서 붉은색 형광인 RFP가 뚜렷하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 감염된 세포에서 나타나는 융합세포(syncytium)의 형성도 관찰되었으며 우측 하단 확대도로 표시하였다. 이러한 실험 결과를 통해 전장 클론에 RFP 리포터가 추가로 삽입된 형광 단백질 재조합 메르스 코로나 바이러스 벡터는 동일한 복제능과 감염성을 갖고 있는 사실을 확인하였다.
[시험예 6]
rYKC 및 rYKC-RFP의 감염성 확인
본 발명의 전장클론의 명칭은 연세대학교의 Y와 대한민국질병관리본부(KCC)의 KC를 합쳐 YKC로 하여 표기하였으며, rYKC의 r은 recombinant, 즉 재조합 바이러스를 의미한다. 또한, rYKC-RFP는 RFP를 ORF5와 치환한 전장클론을 의미한다.
Huh7에 moi 0.001로 rYKC 및 rYKC-RFP를 각각 감염시킨 후 1, 2, 3일 후에 세포 모양을 관찰하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 1일부터 상기 2종류의 바이러스에 감염된 세포에서 세포병변효과(cytopathic effect,　CPE)의 증상인 syncitia가 형성됨을 확인할 수 있었다.
또한, 2일부터는 세포들이 넓게 뭉쳐 핵이 모여 있으며 세포 막의 경계선이 사라진 형태를 확인할 수 있었다.
또한, 3일에는 세포들이 죽어 있거나 죽기 시작하는 모습을 관찰할 수 있었다.
추가로, rYKC 및 rYKC-RFP 각각의 감염모델에서, 배지를 조금씩 모아서 plaque assay를 하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, rYKC 및 rYKC-RFP 바이러스의 growth kinetics가 비슷하며, 감염성이 있는 것을 확인 할 수 있다.
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Recombinant vector of MERS-CoV expressing fluorescence protein derived from Korean MERS-CoV, and method of preparing the same <130> P180041 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV <400> 1 gatttaagtg aatagcttgg ctatctcact tcccctcgtt ctcttgcaga actttgattt 60 taacgaactt aaataaaagc cctgttgttt agcgtattgt tgcacttgtc tggtgggatt 120 gtggcattaa tttgcctgct catctaggca gtggacatat gctcaacact gggtataatt 180 ctaattgaat actatttttc agttagagcg tcgtgtctct tgtacgtctc ggtcacaata 240 tacggtttcg tccggtgcgt ggcaattcgg ggcacatcat gtctttcgtg gctggtgtga 300 tcgcgcaagg tgcgcgcggt acgtatcgag cagcgctcaa ctctgaaaaa catcaagacc 360 atgtgtctct aactgtgcca ctctgtggtt caggaaacct ggttgaaaaa ctttcaccat 420 ggttcatgga tggcgaaaat gcctatgaag tggtgaaggc catgttactt aaaaaagagc 480 cacttctcta tgtgcccatc cggctggctg gacacactag acacctccca ggtcctcgtg 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tgcgcacggt tatgtggaca aaatacctgg ttacccaggc cgtgccggca cgttaaccgg 6960 gctgcatccg atgcaagtgt gtcgctgtcg acgagctcgc gagctcggac atgaggttgc 7020 cccgtattca gtgtcgctga tttgtattgt ctgaagttgt ttttacgtta agttgatgca 7080 gatcaattaa tacgatacct gcgtcataat tgattatttg acgtggtttg atggcctcca 7140 cgcacgttgt gatatgtaga tgataatcat tatcacttta cgggtccttt ccggtgatcc 7200 gacaggttac ggggcggcga cctcgcgggt tttcgctatt tatgaaaatt ttccggttta 7260 aggcgtttcc gttcttcttc gtcataactt aatgttttta tttaaaatac cctctgaaaa 7320 gaaaggaaac gacaggtgct gaaagcgagc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt 7380 ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtcc gagctcatcg ctaataactt cgtatagcat 7440 acattatacg aagttatatt cgatgcggcc gcaaggggtt cgcgtcagcg ggtgttggcg 7500 ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 7560 tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgcctaagtt 7620 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 7680 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 7740 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300 tcgcgcaagg tgcgcgcggt acgtatcgag cagcgctcaa ctctgaaaaa catcaagacc 360 atgtgtctct aactgtgcca ctctgtggtt caggaaacct ggttgaaaaa ctttcaccat 420 ggttcatgga tggcgaaaat gcctatgaag tggtgaaggc catgttactt aaaaaagagc 480 cacttctcta tgtgcccatc cggctggctg gacacactag acacctccca ggtcctcgtg 540 tgtacctggt tgagaggctc attgcttgtg aaaatccatt catggttaac caattggctt 600 atagctctag tgcaaatggc agcctggttg gcacaacttt gcagggcaag cctattggta 660 tgttcttccc ttatgacatc gaacttgtca caggaaagca aaatattctc ctgcgcaagt 720 atggccgtgg tggttatcac tacaccccag tccactatga gcgagacaac acctcttgcc 780 ctgagtggat ggacgatttt gaggcggatc 810 <210> 10 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV-B2 <400> 10 ggatccaggc ctcgatcgcc gcggcacttc tccaggtcca tctggaatcg gagcagtagg 60 aggtgatcta ctttaccttg atcttctgaa cagactacaa gcccttgagt ctggcaaagt 120 aaagcaatcg cagccaaaag taatcactaa gaaagatgct gctgctgcta aaaataagat 180 gcgccacaag cgcacttcca ccaaaagttt caacatggtg caagcttttg gtcttcgcgg 240 accaggagac ctccagggaa 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gaactatggc tttctcggcg tctttattta aacccgtcca gctagtccca 60 gtttctcctg catttcatcg cattgagtct actgactcta ttgttttcac atacattcct 120 gctagcggct atgtagctgc tttagctgtc aatgtgtgtc tcattcccct attattactg 180 ctacgtcaag atacttgtcg tcgcagcatt atcagaacta tggttctcta tttccttgtt 240 ctttataact ttttattagc cattgtacta gtcaatggtg tacattatcc aactggaagt 300 tgcctgatag ccttcttagt tatcctcata atactttggt ttgtagatag aattcgtttc 360 tgtctcatgc tgaattccta cattccactg tttgacatgc gttctcactt tattcgtgtt 420 agtacagttt cttctcatgg tatggtccct gtcatacaca ccaaaccatt atttattaga 480 aacttcgatc agcgttgcag ctgttctcgt tgtttttatt tgcactcttc tacttatata 540 gagtgcactt atattagccg ttttagtaag attagcctag tttctgtaac tgacttctcc 600 ttaaacggca atgtttccac tgttttcgtg cctgcaacgc gcgattcagt tcctcttcac 660 ataatcgccc cgagctcgct tatcgttt 688 <210> 12 <211> 4055 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS/KOR4-RFP <400> 12 gtttctgtcg atcgtgagtc tacttcaact catgatggtc ttaccgaaca tgttactagt 60 gtgaatcttt ttgacgttgg ttactcagtt aattaacgaa ctctatggat tacgtgtctc 120 tgcttaatca aatttggcag aagtacctta attcaccgta tactacttgt ttgtatatcc 180 ctaaacccac agctaagtat acacctttag ttggcacttc attgcaccct gtgctgtgga 240 actgtcagct atcctttgct ggttatactg aatctgctgt taattctaca aaagctttgg 300 ccaaacagga cgcagctcag cgaatcgctt ggttgctaca taaggatgga ggaatccctg 360 acggatgttc cctctacctc cggcactcaa gtttattcgc gcaaagcgag gaagaggagt 420 cattctccaa ctaagaaact gcgctacgtt aagcgtagat tttctcttct gcgccctgaa 480 gaccttagtg ttattgtcca accaacacac tatgtcaggg ttacattttc agaccccaac 540 atgtggtatc tacgttcggg tcatcattta cactcagttc acaattggct taaaccttat 600 ggcggccaac ctgtttctga gtaccatatt actctagctt tgctaaatct cactgatgaa 660 gatttagcta gagatttttc acccattgcg ctctttttgc gcaatgtcag atttgagcta 720 catgagttcg ccttgctgcg caaaactctt gttcttaatg catcagagat ctactgtgct 780 aacatacata gatttaagcc tgtgtataga gttaacacgg caatccctac tattaaggat 840 tggcttctcg ttcagggatt ttccctttac catagtggcc tccctttaca tatgtcaatc 900 tctaaattgc atgcactgga tgatgttact cgcaattaca tcattacaat gccatgcttt 960 agatggtgag caagggcgag gaggtcatca aagagttcat gcgcttcaag gtgcgcatgg 1020 agggctccat gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg 1080 agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc ttcgcctggg 1140 acatcctgtc cccccagttc atgtacggct ccaaggcgta cgtgaagcac cccgccgaca 1200 tccccgatta caagaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact 1260 tcgaggacgg cggtctggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcacgctga 1320 tctacaaggt gaagatgcgc ggcaccaact tcccccccga cggccccgta atgcagaaga 1380 agaccatggg ctgggaggcc tccaccgagc gcctgtaccc ccgcgacggc gtgctgaagg 1440 gcgagatcca ccaggccctg aagctgaagg acggcggcca ctacctggtg gagttcaaga 1500 ccatctacat ggccaagaag cccgtgcaac tgcccggcta ctactacgtg gacaccaagc 1560 tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag cgctccgagg 1620 gccgccacca cctgttcctg gggcatggca ccggcagcac cggcagcggc agctccggca 1680 ccgcctcctc cgaggacaac aacatggccg tcatcaaaga gttcatgcgc ttcaaggtgc 1740 gcatggaggg ctccatgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc 1800 cctacgaggg cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg 1860 cctgggacat cctgtccccc cagttcatgt acggctccaa ggcgtacgtg aagcaccccg 1920 ccgacatccc cgattacaag aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga 1980 tgaacttcga ggacggcggt ctggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggca 2040 cgctgatcta caaggtgaag atgcgcggca ccaacttccc ccccgacggc cccgtaatgc 2100 agaagaagac catgggctgg gaggcctcca ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc 2160 tgaagggcga gatccaccag gccctgaagc tgaaggacgg cggccgctac ctggtggagt 2220 tcaagaccat ctacatggcc aagaagcccg tgcaactgcc cggctactac tacgtggaca 2280 ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggaacag tacgagcgct 2340 ccgagggccg ccaccacctg ttcctgtacg gcatggacga gctgtacaag taagcagctc 2400 tgcgctacta tgggtcccgt gtagaggcta atccattagt ctctctttgg acatatggaa 2460 aacgaactat gttacccttt gtccaagaac gaatagggtt gttcatagta aactttttca 2520 tttttaccgt agtatgtgct ataacactct tggtgtgtat ggctttcctt acggctacta 2580 gattatgtgt gcaatgtatg acaggcttca ataccctgtt agttcagccc gcattatact 2640 tgtataatac tggacgttca gtctatgtaa aattccagga tagtaaaccc cctctaccac 2700 ctgacgagtg ggtttaacga actccttcat aatgtctaat atgacgcaac tcactgaggc 2760 gcagattatt gccattatta aagactggaa ctttgcatgg tccctgatct ttctcttaat 2820 tactatcgta ctacagtatg gatacccatc ccgtagtatg actgtctatg tctttaaaat 2880 gtttgtttta tggctcctat ggccatcttc catggcgcta tcaatattta gcgccattta 2940 tccaattgat ctagcttccc agataatctc tggcattgta gcagctgttt cagctatgat 3000 gtggatttcc tactttgtgc agagtatccg gctgtttatg agaactggat catggtggtc 3060 attcaatcct gagactaatt gccttttgaa tgttccaatt ggtggtacaa ctgtcgtacg 3120 tccactcgta gaggactcta ccagtgtaac tgctgttgta accaatggtc acctcaaaat 3180 ggctggcatg catttcggtg cttgtgacta cgacagactt cctaatgaag tcaccgtggc 3240 caaacccaat gtgctgattg ctttaaaaat ggtgaagcgg caaagctacg gaactaattc 3300 cggcgttgcc atttaccata gatataaggc aggtaattac aggagtccgc ctattacggc 3360 ggatattgaa cttgcattgc ttcgagctta ggctctttag taagagtatc ttaattgatt 3420 ttaacgaatc tcaatttcat tgttatggca tcccctgctg cacctcgtgc 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Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스(국가관리번호 1-001-MER-IS-2015001) 전장 클론의 제조 방법:
    (1) 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 및 제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편에 해당하는 메르스 코로나 바이러스의 cDNA 절편을 각각 준비하는 단계;
    (2) 카세트 BAC 벡터를 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 카세트 BAC 벡터에 상기 cDNA 절편들을 순차적으로 삽입하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스(국가관리번호 1-001-MER-IS-2015001)의 전장 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편은 서열번호 2의 서열로 이루어지고, 제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편은 서열번호 5의 서열로 이루어지고, 제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편은 서열번호 6의 서열로 이루어지고, 제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편은 서열번호 7의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계에서 상기 카세트 BAC 벡터는 하기의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법.
    (a) 서열번호 8의 서열로 이루어지는 5′- Rz - BGH - BAC - CMV - 3′' 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 9의 서열로 이루어지는 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 5′ 말단의 1번부터 810번까지의 cDNA 단편을 상기 (a) 단계에서 제조된 벡터에 삽입하는 단계;
    (c) 서열번호 10의 서열로 이루어지는 cDNA 단편을 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터에 삽입하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 벡터 내부에 존재하는 StuI, PvuI, 및 SacII 절단부를 침묵 돌연변이 시키는 단계.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 cDNA 절편을 (i) 서열번호 5의 서열로 이루어지는 MERS/KOR2 cDNA, (ii) 서열번호 4의 서열로 이루어지는 MERS/KOR1-2 cDNA, (iii) 서열번호 3의 서열로 이루어지는 MERS/KOR1-1 cDNA, (iv) 서열번호 6의 서열로 이루어지는 MERS/KOR3 cDNA 및 (v) 서열번호 7의 서열로 이루어지는 MERS/KOR4 cDNA의 순서로 카세트 BAC 벡터에 삽입하는 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법.
  6. 하기 단계를 포함하는 형광 단백질 발현 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스(국가관리번호 1-001-MER-IS-2015001) 재조합 벡터의 제조 방법:
    (1) 제한효소 BamHI(807)과 StuI(9075)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 StuI(9075)과 PvuI(18776)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 제한효소 PvuI(18776)과 PvuI(25760)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편, 및 제한효소 PvuI(25760)과 SacII(29157)가 각각 인식하는 제한부위 사이의 절편에 해당하는 메르스 코로나 바이러스의 cDNA 절편을 준비하는 단계;
    (2) 카세트 BAC 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 카세트 BAC 벡터에 cDNA 절편을 순차적으로 삽입하는 단계; 및
    (4) 상기 카세트 BAC 벡터에 형광 단백질 유전자를 삽입하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 형광 단백질 유전자가 토마토 레드 형광 단백질(tomato red florescence protein: RFP)인 것을 특징으로 하는 전장 클론의 제조 방법.
KR1020180161360A 2018-12-13 2018-12-13 한국 분리주 메르스 코로나 바이러스 유래의 형광 단백질 발현 메르스 코로나 바이러스 재조합 벡터 및 이의 제조방법 KR102005685B1 (ko)

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KR20230166221A (ko) 2022-05-30 2023-12-07 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) 중동호흡기증후군 코로나바이러스 및 이의 용도
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