HU228210B1 - Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells - Google Patents

Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells Download PDF

Info

Publication number
HU228210B1
HU228210B1 HU0202759A HUP0202759A HU228210B1 HU 228210 B1 HU228210 B1 HU 228210B1 HU 0202759 A HU0202759 A HU 0202759A HU P0202759 A HUP0202759 A HU P0202759A HU 228210 B1 HU228210 B1 HU 228210B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
medium
cells
free
protein
serum
Prior art date
Application number
HU0202759A
Other languages
English (en)
Inventor
Manfred Reiter
Wolfgang Mundt
Friedrich Dr Dorner
Leopold Grillberger
Artur Dr Mitterer
Original Assignee
Baxter Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3518214&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU228210(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baxter Ag filed Critical Baxter Ag
Publication of HUP0202759A2 publication Critical patent/HUP0202759A2/hu
Publication of HUP0202759A3 publication Critical patent/HUP0202759A3/hu
Publication of HU228210B1 publication Critical patent/HU228210B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

A találmány tárgya táptalaj sejtek, főleg emlős sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztéséhez, amely táptalaj egy rész szója-hidrolizátumot tartalmaz.
« φ
74.406/SZE *·*·♦
Táptalaj sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztéséhez
A jelen találmány tárgya táptalaj sejtek fehérjementes és szérumxnentes tenyésztéséhez.
A sejtek, főleg eukariőta sejtek vagy emlős sejtek tenyésztése során folyamatosan felmerül az igény olyan speciális tenyésztő táptalajokra, amik hozzáférhetővé teszik a hatékony növekedéshez és a kívánt fehérje termeléséhez szükséges tápanyagokat és növekedési anyagokat. Ebből a szempontból az a szabály, hogy szérumot vagy szérumból származó vegyületeket (azaz például szarvasmarha szérumot) használunk a táptalaj komponenseként.
Azonban abban az esetben, amikor emberi, vagy állati forrásból származó szérumot vagy fehérje adalékanyagot használunk sejttenyészetekben, számos probléma lép fel, különösen akkor, ha a kiindulási anyagot egy embernek beadandó gyogyászati hatóanyag sejttenyészettel történő előállításában használjuk.
Ennek következtében· az ilyen szérum készítmények esetében az összetétel és a minőség sarzsról sarasra változik, már csak azért, is, meri. az ilyen készítményekhez használt donor szervezetek eltérnek egymástól. Ez jelentős problémát, jelent, különösen a sejtek termékeinek standardízálása miatt, valamint az ilyen sejtek standard növekedési körülményeinek meghatározása «φ « fi * fi * Λ φ * X » ♦ Φ
ΚφΦ « * φ ·*» ttfi fi * » fi *
X Φ 4 *·Χ «* miatt. Minden ilyen esetben a használt szérum-anyag intenzív és állandó minőség-ellenőrzésére van szükség. Ez azonban rendkívül időigényes és költséges, különösen azokban az esetekben, amikor az ilyen komplex készítményeket szérumként használjuk.
Emellett, az ilyen komplex készítmények számos különböző fehérjét tartalmaznak, amiknek káros a hatásuk, különösen a sejtenyészetből kinyerendő rekombináns fehérje tisztítási eljárásában. Ez különösen azokra a fehérjékre igaz, amik homológok vagy hasonlítanak a kinyerendő fehérjéhez, Ezek a problémák természetesen különösen akutak abban az esetben, ha a használt táptalajban levő biogén part (azaz például a szarvasmarha fehérjét) a tisztítás során megfelelő módon csak meglehetősen, specifikus differenciál-tisztítási eljárással lehet eltávolítani (azaz például olyan ellenanyagokkal, amik specifikusan csak a rekombináns fehérje ellen irányulnak, és nem a szarvasmarha fehérje ellen) (Bjorck, L<: J, of Immunoi. 140, 1194-1197 (1988)]; Nilson és mtsai: J . Immunologieai Methods 164, 33-40 (1993)).
Azonban a szérumnak, vagy a szérumból származó vegyuleteknek a tenyésztő táptalajban való használata egy másik komoly problémát vet fel, nevezetesen a mikoplazmával, vírusokkal vagy ŐSE ágensekkel való szennyezettséget. Az emberi vérből származó készítményekkel kapcsolatban leginkább a vírusokkal. azaz például hepatitisszel vagy HlV-vel való fertőzés kockázatát hangsúlyozzák. A szarvasmarhából származó szérum, vagy szérum-komponensek esetében a BSE szennyeződés vészéivé áll & * * φ * β
Φ#Φ « V
Φ
X *
φφ φ ·* φ « ««φ» fenn. Ezek niellett, azonban az összes, szérűmből származó anyag eddig ismeretlen betegség-indukálő ágensekkel lehet szennyezve,
A szérum-komponenseknek a hozzáadását, azzal a céllal, hogy' garantáljuk a sejteknek a felszínekhez való tapadását, és garantáljuk a kívánt anyagoknak a termelődését a sejtekben, korábban néhány kivétellel nélkülözhetetlennek tekintették, főleg a sejtek szilárd felszínen való tenyésztésére, így a WO· 91 /09935 számú szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel ki lehet, dolgozni olyan eljárást, amivel szérummentesen, és fehérjementesen lehet tenyészteni az? FSME vírus/vírus antigént, a felszín-dependens permanens sejtek, előnyösen verő sejtek szérummentes és fehérjementes tenyésztésével (lásd a WO 96/15231 számú szabadalmi leírást). Ezek azonban nem rekombináns sejtek, hanem inkább gazdasejtek., amiket egy lítíkus folyamatban vírus antigén előállítására használnak.
Ezzel ellentétben a leginkább rekombináns készítmény előállítására használt sejtek, azaz például a CHO sejtek csak. korlátozott mértékben képesek megtapadni, így a hagyományos módszerekkel tenyésztett CHO sejtek mind. a sima, mind a porózus mikrohordozőkhoz kizárólag szérumtartalmü körülmények között tapadnak (lásd a ,973,616 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást; Cytotechnology 9, 247-253 (1992)]. Ha azonban ezeket a sejteket szérummentes körülmények között tenyésztjük, akkor ezek elvesztik ezt a tulajdonságukat, és nem tapadnak a sima hordozókhoz, vagy könnyen leválnak róla, ha a φ φ «φ »««* φ φ φ #φ φ * * $ Φ Φ Φ * · « «ΦΦΦ « * » « ««Φ« * »*» *♦ * táptalajhoz nem adunk niás tapadást elősegítő adalékanyagot, azaz például fíbronekúnt, inzulint vagy transzferrint. Azonban ezek is szérumból származó
Egy másik változat szerint a sejteket szuszpenzíös tenyésztési technikákkal tenyészthetjük, valamint tenyészthetjük sarzs eljárással, vagy folyamatos tenyésztési technikával· A tenyésztést előnyösen a kemosztát eljárással hajthatjuk végre [Oztnrk S,S. és mtsai: Abstr, Pap, Ám. Chem. Soc., BIOT 164. Payne G.F. és mtsai: In: „Large Scale Cell Culture Technology” 206-212. old., szerk.: Lydersen B.K., Mauser kiadok {1987)|.
Kattinger H. és munkatársai, leírják a sejtek fehérjementes közegben való, hosszú idejű tenyésztését, de ezeket, a sejteket hordozókon kell tenyészteni, és nem biztosít alternatívákat, mint például folyamatos tenyésztési technikákat [Kattinger, H. és mtsai; Advanees Mól. Cell. Biology .1SA, 193-207 (1996)). Az az állítás, hogy ezek a sejtek csak akkor mutatnak hosszú idejű stabilitást, ha a csökkent növekedés miatt a hordozók felszínéhez tapadnak, és ennek következtében csökken a növekedési faktorok iránti igényük.
Emellett a szakirodalomban számos kísérletet tettek, hogy a sejteket a fehérjementes közeghez adaptálják, szérum-tartalmú körülményekből kiindulva. Azonban ilyen adaptáció esetében ismételten azt tapasztalták, a szérumtartalmú körülményekkel összehasonlítva, hogy az expresszált fehérje hozama és a rekombínáns sejtek produktivitása jelentősen lecsökken a a fehérjementes után [Applied Mícrobíology and
Azt is kiderítették, hogy a magas sejtsűruség esetében a rekombináns fehérjék termelődése alkalmanként erősen korlátozódik. Azoknak a kísérleteknek a során, amikor a sejteket fehérjementes vagy szérummentes közegekhez próbálták adaptálni, a használt sejtek instabilitása, a sejtek csökkent növekedésével ismételten előfordult, ezzel csökkent expressziéi mutató sejtek termelődnek, miközben ezeknek a sejteknek a termelő sejtekhez viszonyítva növekedési előnyük van a fehérjementes és szérummentes közegben, és ez eredményezi azt a tényt, hogy túlnövik a termelő sejteket, majd végezetül a teljes tenyészet ennek következtében nagyon alacsony hozamot ad.
A jelen találmány tárgya tehát az, hogy javítsuk a rekombináns sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztésének valószínűségét, és olyan ágenseket és eljárásokat tegyünk hozzáférhetővé, amivel a rekombináns sejteket hatékonyan lehet tenyészteni szérummentes vagy .fehérjementes körülmények között, Emellett az is lehetséges lehet, hogy nemcsak felszín-dependens sejteket tenyésszünk, hanem szuszpenziós tenyésztési technikát is használjunk, miközben a sejtek produktivitásának instabilitását a lehető legjobban el kell nyomni.
A jelen találmány tárgyú továbbá az, hogy növeljük a r
Végezetül, a jelen találmány szerint a rekombináns sejtek szérummentes és fehérjementes közeghez való adaptálását szükséges javítani és hatékonyabban konfigurálni.
A jelen találmány szerint ezeket a feladatokat egy olyan, a sejtek, különösen emlős sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztésére alkalmas közeg használatával kell végrehajtani, amely közeget az a tulajdonság jellemzi, hogy egy rész szója··
Meglepő módon lehetséges volt annak kimutatása, hogy az előzőkben definiált célokat ügy lehet elérni, hogy a sejteket szójahidrolizátumot tartalmazó közegben tenyésztjük, anélkül hogy el kellene viselni a szérummentes tenyésztés hátrányait, amiket az előzőkben ismertettünk. Más, a szakirodalomból korábban ismert hidrolizátumokkal, mint például a büza-hidrolizátumokkal, rizs-hidrolizátumokka! vagy élesztő-hidrolizátumokkal ellentétben azt találtuk, hogy csak a szója-hidrolizátumok módosítják a jelen találmány szerint a tulajdonságokat, és például a rekombináns célfehérje szignifikánsan megnőtt hozamát eredményezte. Ha ezeket a szakkifejezéseket használjuk, akkor a szőja-hldrolizátum vagy szojapepton szakkifejezést egymás helyettesítésére használhatjuk, anélkül hegy különböző jelentésük lenne.
A jelen találmány szerinti közeg előnyösen, szója-hidrolizátumot tartalmaz, több mint 10 tömegszázalék mennyiségben, a közeg száraz-súlyára vonatkoztatva. A szabály az, hogy a közegben a szója-hídroiizátum mennyiségét 4-40%-ban biztosítjuk.
A specifikus szója-hídrolízátum megválasztása nem kritikus a jelén találmányban. A piacon található sok különböző szója készítmény használható a jelen találmány szerint, azaz például szöjalisztbö.1 készített peptonok, enzimatikusan. (azaz például papainnal) emésztve, a pH értéke 6,5· és 7,5 változik, az össz-nitrogéntarfalom 9% és. 9,7% között van, a hamutartalma 8 és 15% között van. Ezek szójababból származó peptonok, olyan formában, amiben a szakterület szakértői általánosan tenyésztésre.
Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint egy szója-hidrolizátum tisztított készítményét, vagy annak nyers frakcióját használhatjuk a jelen találmány szerinti közegben. Ennek a tisztításnak a során előnyösen eltávolítjuk azokat a. szennyeződéseket, amik zavarják a hatékony tenyésztést, vagy a hidrolizátum pontosságát javítjuk, például a molekulasúly szempontjából.
A jelen találmány szerint, egy ultraszűr esi lépés különösen értékesnek bizonyult a tisztítás elvégzése során; emiatt az ultraszűrt szója-hidrokzátum használatát különösen előnyben részesítjük a jelen találmány szerinti közegekben.
Az ultraszürést a szakirodalomban korábban részletesen.
ismertetett módszerrel hajthatjuk végre, azaz például meghatározott vágási értékű membrán szűrőket használunk.
Az ultraszűrt széjapepton tisztítását gélkromatográfíával végezhetjük el, azaz például Sephadex kromatográfiával, például Sephadex G25 vagy Sephadex G10 vagy ekvivalens anyagú oszlopon, ioncserélő kromatográfiával, aífinításkrömatográfíával, * Χ«Φ « φ » meretkízárásos kromatográíiával, vagy „fordított, fázisú”' kromatográfiával. Ezek a szakterületen régebben ismert eljárások, amikkel a szakterületen jártas szakember tisztában van. Ezeknek a módszereknek az alkalmazásával azok a frakciók választhatók. ki, amik egy meghatározott molekulasúlyü szőja-hidrolizátumot, azaz például < 1000 Dalton molekulasúlyút, előnyösen < 1000 Dalion mnlekulasúlyűt, még előnyösebben < 350 Dalion molekulasúlyút tartalmaznak.
a jelen találmány targya eljárás szerammenres es tehéijementes sejttenyésztő táptalaj előállítására, ami abból áll, hogy előállítunk egy szőja-hídrolízátumot, az említett szőja-hidroKzátumot ultraszűrő berendezéssel ultraszűrésnek vetjük alá, az említett szója-hidrolízátum frakciót méretkízárásos kromatográfiával megtisztítjuk, és kiválasztjuk azokat a szója-hidrolizátum. frakciókat, amiknek a molekulasúlya < 1000 Dalion, előnyösen < 1000 Dalton, még előnyösebben < 350 Dalion.
Egy különösen előnyös szója-hidrolizáfumot az jellemez, hogy szabad aminosav- tartalma 10,3 és 15,6%, vagy, előnyösen 12 és 1.3,5% között van, össz-nitrogén tartalma 7,6 és 11,4%, vagy előnyösen 8,7 és 9,5% között van, exotoxin tartalma <500 E/g, és ennek következtében legalább 40 százalékának, előnyösen legalább 5Ö százalékának, főleg előnyösen legalább 55 százalékának a molekulasúlya 2ÖÖ-5GÖ Dalton, és legalább 10 százalékának, előnyösen 15 százalékának a molekulasúlya 5ÖÖ-1Ö00 Dalton,. A legelőnyösebb, ha a szöja-hídrolízátum legalább 90 százalékának a molekulasúlya < 500 Dalton.
A szőja-hidrolizátum mellett a jelen találmány szerinti közeg tartalmazhat szintetikus táptalajt, az eddig megismert módon, azaz például DMEM/HAM féle FI2-t,. Médium 190-et vagy RPMi-t, amik a szakirodalomból megfelelő módon ismertek.
Emellett a jelen találmány szerinti közeg előnyösen tartalmaz aminosavakat, előnyösen olyanokat, amiket az alábbi csoportból választunk ki: h-aszparagín, L-cisztein, L-cisztín, Lprolín, L-triptofán, L-glutamin és ezek keverékei.
Az alábbi aminosavakat előnyösen szintén hozzáadjuk a jelen találmány szerinti táptalajhoz: L-aszparagin. <0,001-1 g/1 táptalaj mennyiségben, előnyösen 0,1 -0,05 g/1, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1 mennyiségben); L-cisztein { 0,001-1 g/1, előnyösen 0,005-0,05 g/1, különösen előnyösen 0,01-0,03 g/1); Leisztein (0,001-1 g/1, előnyösen 0,01-Ö,05g/l, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1); L-prolin (0,001-1,5 g/1, előnyösen 0,01-0,07 g/1, különösen előnyösen 0,02-0,05 g/1); L-triptofán (0,01-1 g/1, •előnyösen 0,01-0,05 g/1, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1); és L-glutamin (0,05-1 g/1, előnyösen 0,1-1 g/1).
Az előzőkben említett amínosavak a. jelen találmány szerinti táptalajhoz vagy egyenként, vagy kombinációban adhatók hozzá. Különösen előnyben részesítjük olyan amínosav keverék kombinált hozzáadását, ami az előzőkben említett összes aminosavat tartalmazza.
Egy szérummentes és fchérjementes táptalajt használunk ennek a. megváló sitási módnak egy speciális formájában, mikőzben a táptalaj tartalmazza még az előzőkben említett aminosavkeveréket, valamint tisztított ultraszürt szójapepfonL
Meglepő módon azt találtuk például, hogy ahhoz, hogy íriaktiváljuk a vírusokat vagy más patogéneket, a táptalaj negatív hatások nélkül megmelegíthető, például 5-20 percre, előnyösen 15 percre 70-95 °C -ra, vagy előnyösen 85-95 °C-ra.
A jelen találmány szerint minden ismert szintetikus táptalaj használható a szója-hidrolizátummai kombinálva. A hagyományos szintetikus táptalajok tartalmazhatnak szervetlen sókat, amino savakat, vitaminokat, vagy szénhidrát-forrást és vizet.
Használhatjuk a DM'EM/HAM féle FI 2 táptalajt. A táptalajban a szőjak.ivo.nat koncentrációja előnyösen Ö, 1 és 100 g/l, különösen előnyösen 1 és 5 g/l, Ennek a megvalósítási módnak egy különösen előnyös formája szerint az a. szőjapepton használható, amit a molekulasúlya alapján standardizáltak. A szöjapepton molekulasúlya előnyösen kevesebb mint 50 kDa, különösen előnyösen kevesebb mint 10 kDa, és legelőnyösebben kevesebb mint 1 kDa.
Az ultraszűrt szöjapepton hozzáadása különösen előnyősnek bizonyult a rekomblnáns sejtvonalak termelőképessége szempontjából, amikor a szöjapepton molekulasúlya 350 Dalion (Quesi Companyj, Ez egy olyan szőja-izolátum, aminek a nitrogén-tartalma körülbelül 9,5%, rülbelű 1 13%, és szabad ammosav-tartalma kö-os a előnyösen
Dalion, különösen előnyösen < 350 Dalion molekula-súlyú tisztított ultraszúrt szöjapepton használata.
A jelen találmány szerinti táptalaj előnyösen tartalmaz kiegészítő anyagokat is, azaz például pufferelő anyagokat, oxidációstabilizátorokat, a mechanikai stressz elviselését segítő síabílízátorokat vagy proteáz inhibitorokat.
Különösen jól használható az alábbi összetételű táptalaj: szintetikus minimál táptalaj (1-25 g/1), szőjapepton (0,5-50 g/1), L-glutamin (0,05--1 g/1), NaHCOs (0,1-10 g/1), aszkorhinsav (0,0005-0,05 g/1), etanolamin (0,0005-0,05 g/1) es nátriumszelenít (1-15 pg/1),
Ha szükséges, akkor egy nem-ionos felületaktív anyagot, azaz például pohpropilén-glíkolt (PLURONIC F-61, PLURONIC F68, SVNPERONIC F-68, PLURONIC P-71 vagy PLURONIC F-108) adhatunk a táptalajhoz, a jelen találmány szerinti habgátló
Híiy
Ezt az ágenst általában azzal a céllal használják, hogy megóvják a sejteket a levegőztetés negatív hatásaitól, mivel egy babzásgátlö hozzáadása nélkül a felszálló és kipukkadó levegő-buborékok azoknak a sejteknek a károsodását okozhatják, amik a szóban forgó levegőhnhorékok felszínén találhatók („bekeverés'’) (Murhammer és Gooche: Biotechnoi. Prog. 6, 142-18 (1990)],
Tehát a nem-ionos felületaktív anyagok mennyisége 0,05 és 10 g/I között lehet, bár, a legkisebb mennyiség különösen előnyösen 0,1 és 5 g/1 között van.
Emellett a jelen találmány szerinti táptalaj tartalmazhat oiklodextrínt vagy cíklodextrm-származékot.
«φ « φ φ »- « *
«#*♦
A szérummentes és féhérjémentes. táptalaj előnyösen tart? máz egy proteáz inhibitort., azaz például szerín proteáz inhibitorokat, amik megfelelnek a szövettenyészetekhez, és szintetikus vagy növényi eredetűek.
Előnyösen a már adaptált sejteket használjuk a jelen találmány szerinti táptalajban való tenyésztéshez, azaz olyan sejteket, amik már adaptálódtak ahhoz, hogy fehérjementes és szérummentes táptalajban szaporodjanak. Kiderült, hogy az ilyen elonemcsak nagyobb hozamok érhetők el, hanem a szérummentes és fehérjementes tenyésztéshez a stabilitásuk is világosan megnő, ha a jelen találmány szerinti táptalajt használjuk.
Azonban a rekomhináns sejt-klőnok különösen értékesnek bizonyultak a jelen találmány szerint, mivel ezek az indulástól számítva legalább 40 generáción keresztül, előnyösen legalább 50 generáción keresztül stabilak szerum.ment.es és fehérjemente s táptalajokban, és rekomhináns termékeket expresszálnak.
Az ilyen sejt-klónok egy olyan sejttenyészetből nyerhetők ki, amit egy eredeti rekomhináns sejt-klón szérum tartalmú táptalajon való tenyésztésével kaptunk, és a. sejteket újra szérummentes és fehérjementes táptalajhoz adaptáljuk.
Az „eredeti sejt-klón” szakkifejezés jelentése egy rekombináns sejt-klón transzfektáns, ami a gazdasejtek rekomhináns nukleotid szekvenciával való transzfekciőja után egy rekombináns terméket laboratóriumi körülmények között stabilan expresszák Az eredeti kiónt szérumot, tartalmazó táptalajban tartjuk
Φ< « * ♦*
Φ φ ®
Φ Φ* » X * * φ ΦΧΦΦ X « ♦ * fenn, hogy optimalizáljuk növekedését. Ahhoz, hogy termelőképességét fokozzuk, az eredeti kiónt szaporítjuk, adott esetben szelekciós ágens jelenlétében, a szelekciós markerrel és/vagy amplífikácíős markerrel végzett szelekcióval. A nagymennyiségű, ipari termeléshez az eredeti sejt-kiónt magas sejt-· sűrűségig szaporítjuk, szérumot tartalmazó tenyésztési körülmények között, majd újra adaptáljuk szérummentes és fehérjementes táptalajhoz, közvetlenül a termelő fázis előtt. Ebben az esetben a tenyésztés előnyösen szelekciós nyomás nélkül megy végbe,
Az eredeti rekombináns sejt-klón tenyésztése az indulástól kezdve történhet, szérummentes és fehénementes táptalajban; ebben az esetben az újra-adaptálásra már nincs szükség. Ha szükséges, akkor ebben az esetben szelekciós ágenst használhatunk, és a szelekciót a szelekciós markerral és/vagy az ampliSkációs markerrel hajthatjuk végre. Ezt az eljárást például az EP 0 711 835 számú szabadalmi leírásban ismertetik.
Az üjra-adaptálás után kapott sejttenyészet szérummentes és fehérjementes táptalajhoz, való újra-adaptálását teszteljük a sejtpopuláció azon sejt-klánjainál, amik a terméket stabilan termelik szérummentes és fehérjementes körülmények között, adott esetben szelekciós nyomás nélkül. Ez megtörténhet például ímmunfiuoreszeenciával, jelzett specifikus ellenanyagokkal, amik a rekombináns polipeptid vagy fehérje ellen irányulnak. A termékelőállítóként azonosított sejteket izoláljuk a sejttenyészefböl, és tovább szaporítjuk, szérummentes és fehérjementes körülmények között, amik előnyösen ekvivalensek a termelési körülményekkel.
Μ
A sejtek izolálását tehát ügy hajthatjuk végre, hogy izoláljuk a sejteket, majd vizsgáljuk, hogy termelik-e a terméket.
A stabil sejteket tartalmazó sejttenyészet ismét megvizsgálható, hogy tartalmaz-e stabil rekombináns klőnokat, majd ezeket izoláljuk a sejttenyészetből és szubklőnozzuk. A szérummentes és fehérjementes körülmények között kapott stabil rekombináns sejt-klánokat azután tovább tenyésztjük szérummentes és fehérjemeníes körülmények között.
Az ílymódon, a jelen találmány szerinti táptalajban készített rekombináns sejt-klón ok vagy sejtpopulációk különösen azzal tűnnek ki, hogy legalább 40 generáción át stabilak, előnyösen legalább 50 generáción át, és különösen előnyösen több mint 60 generáción át, és egy rekombináns terméket expresszálnak.
Egy ilyen rekombináns stabil sejt-klón vagy sejtpopuláció egy példáját a Budapesti Egyezmény alapján az European Collection of Animál Ceti Culture-nél (Nagy-Britannia) helyeztük letétbe 98012206 letéti számon.
A sejttenyészet, amit a jelen találmány szerint kell tenyészteni, előnyösen egy rekombináns emlős sejtből származik. A rekombináns emlős sejt lehet tehát az összes olyan sejt, ami egy rekombináns polipeptidet vagy fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz. Az összes folyamatosan szaporodó sejt, ami letapadva vagy nem-letapadva. növekszik, ebből a szempontból ide tartozik. Különösen előnyben részesítjük a rekombináns CHO sejteket vagy BHK sejteket. A rekombináns polipeptidek vagy fehérjék *
ν X Φ « φ » χ « « * «
ΦΦ«* Φ »» «♦»* ♦ Φ Φ ♦ ♦ Φ ♦ Φ φ Φ * * *φφ »« * lehetnek vér-faktorok, növekedési faktorok, vagy más biológiaigyógyászati szempontból releváns termékek.
A jelen találmány szerint azokat a sejt-klönokat részesítjük előnyben, amik egy rekombináns véralvadási faktor, azaz például a II~es faktor, Y-ós faktor, VIÍ-es faktor, VHI-as faktor, IX-es faktor, X-es faktor, 11-es faktor, .Protein S, Protein C, ezeknek a faktoroknak egy aktivált formája, vagy vWF kódoló szekvenciáját bilan expresszálni. Ebből a szempontból előnyben részesítjük azokat a CHO sejteket, amik vWF-et, vagy vWF aktivitással rendelkező poiipeptidet, VlII-as faktort, vagy VHI-as faktor aktivitással rendelkező poiipeptidet. vWF-et és VlII-as faktort, IX-es faktort vagy Π-es faktort expresszálnak.
generációra van szükség ahhoz, hogy egy rnaster sejtbankot beindítsunk. Legalább körülbelül 40 generációra van szükség ahhoz, hogy egy átlagos sarzs-tenyésztést elvégezzünk 1000 literes méretben. Egy egyedi, sejl-klőnbó! kiindulva lehetséges, hogy a jelen találmány szerinti táptalajjal 8-10 generáció alatt elkészítsünk egy „rnaster sejt-bankot” (MCE), valamint egv „munka sejt-bankot” (WCB), és ezáltal egy sejttenyészetet 20-25 generáció alatt fehérjementes és szérummentes körülmények között termelési méretben (termelő biomassza), míg, ezzel szemben, a korábbi klóitokkal és táptalajokkal való tenyésztés után néhány generáció instabillá, válik, és ennek eredményeképpen a) nem kapunk uniform, termelő sejteket tartalmazó sejtte16 ** χ » * « « ♦ χ n «*χ«φ y «» ♦ ·χ χ ♦ ♦ χ * * ♦
Φ <· Φ * φ ♦ * * X * nyészeteket, és b) hosszú időtartamú stabil termék-előállításnem lehetséges.
Azonban a jelen találmány szerint, ezzel szemben lehetséges megnőtt. termelőképességet találni, még az eredeti sejtkiónnal összehasonlítva is, amit szérumot tartalmazó táptalajban tenyésztettünk.
Egy további szempont szerint a jelen találmány tárgya eljárás sejtek, főleg emlős sejtek előállítására, amiket az jellemez, hogy ezeket a sejteket a találmány szerint bejuttatjuk a táptalajba, majd azután ebben a táptalajban tenyésztjük.
Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya továbbá egy sejttenyészet, ami a a jelen találmány szerinti táptalajt és sejteket, előnyösen eukarióta sejteket, főleg emlős sejteket tartalmazza.
A találmányt részletesebben megvilágítják az alábbi példák, valamint, a mellékelt ábrák, amiket nem tekintünk a jelen találmány oltalmi köre korlátozásának.
Az 1, ábra mutatja egy rFVIH-CHÖ sejt-klón tenyésztését egy tízliteres perfúziós bíore&ktorbam
1. VIH-as faktor aktivitás ímilliegység/ml) és perfúziós sebesség (1-5/nap) 42 nap alatt;
2. térfogati termelőképesség (Víll-as faktor egység/liter/.nap) a perfúziós bíoreaktorban.
A 2. ábra mutatja az rVÍH--as faktort expresszálö C.H.O sejtek Víll-as faktor termelőképességének (mE/mlj összehasonlítását a sarzs eljárással különböző táptalajokban végzett te*« * « φ φ » φ φ « « φ ί * »♦»··♦ * * * * φ φ Φ φ φ φ X « ·*φ φφ * nyésztés során. Az 1, elegy tartalmaz egy szérummentes és fehérjementes táptalajt szöja-hidrolizátum nélkül, de tartalmaz a 4. táblázatban felsorolt aminosav-keveréket; a. 2. elegy szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szója-hidrolizátumot tartalmaz; a 3, elegt’' szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szója-hidrolizátumot és a 4, táblázatban felsorolt aminosavkeveréket tartalmaz; a 4. elegy szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami 2,5 g/1 tisztított, ultraszúrt szója-hidrolizátumot és a 4, táblázatban felsorolt aminosav-keveréket tartalmaz. Az ultraszűrt szőja-hidrolizátum tisztítására egy Sephadex oszlopot használunk.
A 3. ábra mutatja a VIH-as faktor termelőképességet fE/liter) rVIÍl-as faktort expresszáló CHO sejtek szérummentes és fehérjementes táptalajban való folyamatos tenyésztése esetében, tisztított, ultraszúrt szójapepton hozzáadásának megkezdése után, nevezetesen a tenyésztés 6. napján; és
A. 4. ábra mutatja azokat a rekombináns Π-es faktort expresszáló BHK sejteket, amiket szója-hidrolizátumot tartalmazó fehérjementes és szérummentes táptalajban tenyésztettünk.
Példák
1. Példa.
Az .rvWF-CHQ sejtek stabilitása szérumot tartalmazó táptalajról szérummentes és fehérjementes táptalajra való átállás után
A CHÖ-dhfr sejteket a phAct-rvWF és pSV-dhfr plazmídokkal ko-transzfektáljnk, majd a vWF-et expresszáló kiónokat *»·*♦4 » Φ ♦ * Φ> * * Φ » Φ * * * * Φ «4 £ Φ Φ # * ♦ X Φ Φ ΦΦ ·
Fischer és munkatársai publikációja szerint szubkiónozzuk [Fischer és mtsai: FFBS Letters 351, 345-348 (1994)]. Egy munka sejt-bankot (WCB) indítunk az rvWF-et szérumot tartalmazó, de MTX-et nem tartalmazó körülmények között stabilan expresszálő szub.klóno'kból, majd a sejteket szérumot tartalmazó körülmények között egy porózus- míkrohordozóra (Cytopore) immobilizáljuk. A sejteket szérummentes és fehérjementes táp talajra .azután visszük át, .hogy a sejtsűrűség elérte a 2*107 sejt/ml hordozó értéket. A sejteket tovább tenyésztjük több generációban szérummentes és .fehérjementes körülmények közölt. A sejteket különböző időpontokban szérummentes és fehérjementes táptalajban teszteljük, immunfluore.szcenciát használva anti-vWF ellenanyagokkal. A sejtek stabilitását a munka, sejt-bankkal értékeljük kí. mielőtt kicseréljük a táptalajt, 10 generációval és 60 generációval a szérummentes és fehérje-mentes táptalajban való tenyésztés után. Eközben a munka sejt-bank még 100% rvWF termelőket tartalmaz, az rvWF termelők aránya körülbelül -50%~ ra csökken a szérummentes és fehérjementes táptalajban 10 generáció tenyésztése után. 60 generáció után a sejteknek több mint 95%-át nem-termelőkként lehetett azonosítani.
2. Példa
Az 1. példa szerint hígitási sorozatot, készítünk az rvWFCHÖ sejteket tartalmazó sejttenyészetből (ez a stabil sejt-klón az r-vWF-CHO F7 jelölést, kapta, és a Budapesti Egyezmény szerint
Sv Φ Φ *« «ΦΦ* φ φ # φ * φ » * « Φ φ β κ Φ S φ **Φ4> » 8 Φ « «φφ« Φ Φφ* 4tx Φ az Europeari Collection of Animál Cell Culture-nél (ECACC, Salishury, Wiltshire SP4 OJG, Nagy-Brítannia) helyeztük letétbe 1988. január 22-én, 980122-06 letéti számon), majd 60 generáción át szérummentes és fehérjementes táptalajban tenyésztjük, és 0,1 sejtet szélesztunk ki egy mikrotiter lemez minden egyes lakába. A sejteket körülbelül három hétig tenyésztjük DMEM/HAM féle F12 táptalajban, szérum vagy fehérje hozzáadása, és szelekciós nyomás nélkül, majd a sejteket immunfluoreszeeneíával teszteljük, jelzett vWF ellenanyagok használatával. Egy pozitívként azonosított sejt-klőnt használunk kiindulási klónként egy oltóanyag sejt-bank készítésére. Az oltóanyag sejtbankból szérummentes és fehérjementes közegben egy master sejt-bankot (MCB) indítunk, majd ampullákba szétmérjük és lefagyasztjuk, egy munka sejt-bank későbbi előállításához. Egy ampullából munka sejt-bankot készítünk szérummentes és fehérjementes táptalajban. A sejteket porózus míkrohordozokra irumobilizáljuk, majd. több generációban tovább tenyésztjük szérummentes és fehérjementes körülmények között. A sejtek termelőképességét különböző időpontokban teszteljük szérummentes és fehérjementes táptalajban, immunfluoreszeenciát használva jelzett anti-vWF ellenanyagokkal. A sejtek stabilitásának kiértékelését elvégezzük a munka sejt-bank állapotban, valamint 10 és 60 generáció után. ami szérummentes és fehérjem.ent.es táptalajban követi egymást. A sejteknek körülbelül 100%-át azonosítottuk rvWF-et exprcsszáló pozitív stabil klónként, a munka sejt-bank állapotban, 10 generáció és 60 generáció után.
3. Példa
A sejtek, meghatározott számát a rekombináns sejtek tenyésztésének meghatározott pontjaiban eltávolítjuk,, majd ezeket 24 óra hosszat friss táptalajban ínkubáljuk. az rvWF; Risto-CoFaktivitását a sejttenyészetek felülúszójáből határozzuk meg. Az 1. táblázat azt mutatja., hogy a jelen találmány szerinti stabil rekombináns sejttenvészetek esetében a sejtspecifikus termelőké·· pesség még 60 generáció után is stabil volt egy szérummentes és fehérjementes táptalajban, sőt még meg is nőtt az eredeti klónhez viszonyítva, amit szérumot tartalmazó táptalajban tenyésztünk.
« φ
*) az Eur-opean Collectlon of Animál Coll Culture-nel (ECACC, Salísbury, Wiltshire SP4 ÜJ'G, Nagy-Sritannia) helyeztük letétbe 1988. január 22-én, 98012206 letéti számon
4. Példa
Szintetikus szérummentes és fehérjementes táptalaj összetétele
Komponens | Szintetikus minimál g/liter | Előnyben részesített j mennyiség ía találmány benyújtásakor érvényes ismereteink szerint) g/l-ben
| táptalaj 1 (DMEM/HAM, F12) 1-100 11,0-12,0 1
| Szójapepton 0,5-50 2,5
i L-glutamin 0,05-1 0,36 !
| Ászkorhinsav 0,0005-0,05 0,0035
NaHCOs 0,1-10 2,00
| Etanolamin 0,0005-0,05 0,0015
1 Na-szélem! 1-15 pg/ml 8,6 ug/l
; Adott esetben: Synperoníe F68 0,01-10 0,25
« ♦ »
5. Példa
r'FVin-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet tenyésztünk tízliteres kevertetett tartályban, perfózióval. Ebben az esetben a
4. példa szerinti táptalajt használunk. A sejteket egy porózus mikrohordozóra (Cytopore, Pharmacia) ímmobilizáljuk, majd legalább 6 hétig tenyésztjük. A perfúzió sebessége 4 térfogat-váltás per nap; a pH értéke 5,9-7,2; az oxigén-koncentráció körülbelül 20-50%, a hőmérséklet 37 °C,
Az 1. ábra mutatja egy rFVIII-CHO sejt-klón tenyésztésének eredményeit egy tízliteres perfúziós bioreaktorban.
1. VHI-as faktor aktivitás (milLiegység/mlj és perfúziós sebesség (I -5/nap) 42 nap alatt;
2. térfogati termelőképesség (VÍII-as faktor egység/liter/nap): a perfúziós bíoreaktorban.
« X* Φ » κ-χ· *
Α 3. táblázat mutatja az rFVIIÍ-at expresszáló sejtek stabilitását és specifikus termelőképességét. Ahhoz, hogy megkapjuk ezeket az eredményeket, a 15., 21, 28., 35, és 42 napon mintát veszünk, majd 300*g~vel centrifugáljuk, és friss szérummentes és fehérjementes táptalajban reszuszpendáljuk. 24 óra elteltével meghatározzuk a VIH-as faktor koncentrációját és a sejtszámot a sejttenyészetek felülúszójában. A specifikus VIH-as faktor termelőképességet ezekből az adatokból számítjuk ki.
Stabil, 888 mílíegység/10ö sejt/nap termelőképességet kaptunk. Ezt a stabil termelőképességet .immunfíuoreszcenciával is igazoltuk, ehhez jelzett anti-FVIIÍ ellenanyagokat használva, 15, 21, 28, 35 és 42 napos, szérummentes és fehérjementes táptalajban való tenyésztés után..
6. Példa
A rekombináns FVIH-CHÖ sejtek termelőképességének összehasonlítása különböző táptalaj-komponenseket tartalmazó fehérjementes és szérummentes táptalajban
Egy rFVHI-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet sarasban tenyésztünk. Ebben az esetben a 4, példában ismertetett táptalajt használjuk, amihez az alábbi aminosavakat adjuk hozzá.
« V
i kor érvényes ismereteink sze-1 rint) g/l-hen j
ί L-aszparagin i 1-100 20
; L-ciszteinxHClxHg 0 | 1-100 15
: L-cisztin i 1-100 Ϊ 20
L-proltn 1 1-150 35
L-glutamin I 50-1000 $ „I 240
A sejteket 37 °€~οη szaporítjuk, ρΉ=6,:9-7,2. A sejteket a satzs eljárással szaporítjuk, 24 -72 óra alatt.
A rekombináns FVIIÍ-CHO sejtek termelőképességét az alábbi táptalaj összetételekkel mérjük:
1. elegy: tartalmaz egy szérummentes és fehérjementes táptalajt szőjapepton nélkül, de tartalmaz a 4. táblázatban felsorolt amíne sav-keveréket;
2. elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szójapeptont tartalmaz;
3, elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szőjahídrolízátumot. és a 4. táblázatban felsorolt, aminosavkeverékeí. tartalmaz;
4, elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami 2,5 g/1 tisztított, ultraszűrt szója-hidrolizátumot és a 4„ táblázatban felsorolt aminosav-keveréket tartalmaz. Az ultraszűrt szójapeptont kromatográfiával tisztítjuk, Sephadex oszlopon.
A
X * *
φ ♦ X Φ
7. Példa
Rekombináns FVIll-CBO sejtek tenyésztése fehérjementes és szérummentes táptalajban, kemosztát tenyésztési módszerrel
Az rFVHÍ-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet tízliteres híore&ktor tartályban tenyésztjük. Ebben az esetben a 4. példában ismertetett táptalajt használjuk, szójapepton nélkül, és a 6. példában ismertetett aminosav-elegyet tartalmazza. A sejteket 37 °C-ön szaporítjuk, ρΗ«6,9-72; az oxigén-koncentráció 20~50%~os levegő-telítés. 24 óránként mintát veszünk, hogy a tenyészet felülúszöjában meghatározzuk a VlII-as faktor literét és a sejt-koncentrációját, Az össz-sejt koncentráció a 2. naptól a. 14. napig állandó volt. Az ultraszürt szőiapeptont a 6. naptól kezdve adjuk a táptalajhoz. A VHÍ-as faktor termelőképességet a 3. ábrán mutatjuk be; a méréseket CHROMOGEX1X CoA FVlIliC/4 rendszerrel végezzük. Az immnníluoreszcenciát jelzett anti-FVIII ellenanyagokkal hajtjuk végre. Az látható az adatokból, hogy a Vlll-as faktor termelőképesség jelentősen megnőtt, és ennek következtében a bioreaktor rendszer volumetrikus termelőképessége is megnőtt, a szöjapepton hozzáadása következtében, miközben ez nem eredményezte a sejtek növekedésének jelentős erősödését. A szöjapepton hiánya a folyamatos tenyészetben néhány nap elteltével az FVIII termelőképesség jelentős csökkenését eredményezi, míg a szójapepton hozzáadása viszont a termelőképesség körülbelül tízszeres növekedését eredményezi. Mivel azonban ez a hozzáadás nem növeli a sejtszámot, ez világosan arra utal, hogy az ült« X
XX >Χ raszűrt szöjapepton hozzáadása viszont jelentősen megnöveli a termelőképességet, a sejtnövekedéstől függetlenül.
Rekombínáns FVIH-C.HQ sejtek növekedési sebességének és termelőképességének összehasonlítása különböze hidrolízátumokat rFVHl-CHO sejteket tenyésztünk sarasonként. Ebben az esetben a 4. példában ismertetett szérummentes és fehérjementes táptalajt használjuk, amihez különböző hidrolízátumokat (szója-, élesztő-, rizs- és búza-hidrolizátum) adunk. Kontrollként olyan szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk, amihez semmilyen hídrolizátumot nem adtunk.
A kiindulási sejtsürüség 0,δ*105 illetve 0,4* IÜÖ. A sejteket 37 °C-on szaporítjuk, sarzs eljárással, pH~6,9-7;2.
.Az 5. táblázat az .rFVIH-CHO sejtek tenyésztési kísérleteinek eredményeit mutatja be, szérummentes és fehérjementes táptalajon, amihez ultraszűrt szója-hidroUzátumof és élesztő hídrolizátumot adtunk. A kiindulási sejtsürüség 0,6* 106 sejt. Kontrollként olyan szérummentes és fehérj ém entes táptalajt, használunk, amihez semmilyen hídrolizátumot nem adtunk.
5. Táblázat
Végső sejtsűrú- | FVllI liter ség. (x lO6/ml) | jmE/ml)
3,6 ί FVIH véralvadási | aktivitás UnE/rnl)
Élesztő
3.3 ,J7
230
A 6. táblázat mutatja az rFVÍH-CHO sejtek tenyésztési kísérleteinek eredményeitmutatja be, szérummentes és fehérjemolekul táptalajon, amihez ultraszűrt szdja-hídrolizátumot, rízs-hídrolizátumot és búza-bidrolizátumot adtunk. A kiindulási sejtsurdség 0,6*10e sejt.. Kontrollként olyan szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk, amihez semmilyen liidrolizátumot nem adtunk.
6, Táblázat
Hidrolizá- Végsó sejtsűrű- FVIIl títer í vWF - antigén
tűm ség(*106/ml) (mE/ml) ) (Pg/ml)
Szója. 3,7 1142 ) 6,7
Rizs 3,0 479 | 3,2
Búza 3,4 522 3 0 1
) Kontroll 3,0 406 | 3U
A. 7. táblázat mutatja az rFVIH-C'HO sejtek tenyésztési .kísérleteinek eredményeit mutatja be, szérummentes és fehérjemolekul táptalajon, amihez ultraszürt szója-hidrolízátumot és búzahidrolizátumot adtunk, Á kiindulási sejtsürűség 0,4* 106 sejt.
7.. Táblázat
Hidroli- [ Végső sejtsnrn- | FVIIl títer | FVIIl - anti- t v zátum j ség (*106/ml) J (mK/ml) igén. (pg/ml) antigén ♦ * * * ♦ # ·
-> v) ««-** ♦ *** *
] 1 1 (gg/ml) ;
| szója ) .1,6 | H27 | 166 47,2 |
| Búza | 1,0 1120 1 92 i 1 7,9 j
9. Példa
BHK sejtek tenyésztés >e fehérje-mente s és szérumment es tápta-
jajban, ami szőja-hldrollzátumot tartalmaz
BHK-21 (ATCC CCL 10) sejteket háromszorosan ko-transzfektáhmk az alábbi plazmídokk&l, CaPCL eljárás alkalmazásával!: 25 gg pSV-FII plazmid (Fischer, B. és mtsai: Journal of Biologícal Chemistry 271, 23737-23742 (1996)), ami a humán Π-es faktort (protrombin) kódoló cDNS-t tartalmazza SV40 promoter vezérlésével (SV4Ö korai gén promoter); 4 pg pSV-DHFR plazmid a metotrexát rezisztencia biztosítására, és 1 mg pUCSV-neo [Sehlokat, U. és mtsai: Biotech, Appl. Blochem. 24, 257-267 (1096)) plazmáddal, ami G4.1S/neom.icín rezisztenciát biztosít. A stabil sejt-klónokat olyan táptalajon való tenyésztéssel szelektáljuk, ami 500 gg/ml G418-at tartalmaz, a metotrexát koncentrációját lépésenként 3 gmol/l-ig növelve.
Az ílymódon kapott kiónokat szubklónozzuk, majd fehérjementes és szérummentes táptalajhoz adaptáljuk. A. tenyésztést szuszpenziós tenyésztési technikákkal hajtjuk végre.
Az eredmények a 6, táblázatban láthatók; a BHK sejtek, amiket szoja-hidroiizátumot tartalmazó fehérjementes és szé*» χ ΦΦ«« Φ Φ * * **«* Φ **» *♦ * rummentes táptalajban tenyésztettünk, a rekombináns FV1II magas és stabil termelődését mutatták.

Claims (15)

1. Febérjementes és szénxmmentes táptalaj emlős -sejtek tenyésztésére, amely az említett táptalaj teljes száraz tömegére vonatkoztatva. több mint 10 tömeg % szója-hidrolizátumot tartalmaz, ahol az említett szója-lúdrolizátum legalább 40%án&k molekulasúlya < SOÖ Dalion.
2. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami ultraszórt széja-hidrolizátnraot tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti táptalaj, arai tisztított szója-hidrolizátumot tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, amiben a szója-hidrolizátum endotoxin tartalma <500 E/g.
5. Az I . igénypont szerinti, táptalaj, amiben a szója-hidrolizátum legalább 50%-ánák molekulasúlya. .< 500 Dalion.
6. A 5. igénypont szerinti táptalaj, amiben a szója··hidrolizátum legalább 55%-ának molekulasúlya < 500 Dalion.
7. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami tartalmaz még aminosavat is.
8. A 6. igénypont szerinti táptalaj, amiben az említett aminosavat a következő csoportból választjuk tó.: L-aszparagin, L-cisztdn. L-dsztin, L-proün, Ltriptofán, L-glu tanún vagy ezek keverékei.
9. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, arai tartalmaz még kiegészítő anyagokat is, azaz például puferelő anyagokat, oradáció-stabilizátorokat, a mechanikai stressz elviselését segítő stabillzátorokat vagy proteáz inhibitorokat.
10. Az 1. igénypont szerinti táptalaj alkalmazása emlős sejtek tenyésztésére.
φφ *·
Φ' « « X
Φ X X Φ Φ » φ β β. β · φ
11, Α 10, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emlős sejtek CHO .sejtek és BHK
12. Eljárás sejtek tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy az említett sejteket az 1. igénypont szerinti, táptalajba visszük be, majd az említett sejteket az említett táptalajban szaporítjuk.
.1.3. Eljárás fehérje előállítására egy sejttenyészeffeől, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzak:
a sejteket az 1. igénypont szerinti táptalajba juttatjuk be, és az említett sejtek a kívánt fehérjét expresszálják;
az említett sejteket szaporítjuk az említett táptalajban, és az említett fehérjéi expresszáltatjuk, ezzel a táptalajban az említett sejtek és az említett fehérje keverékét állítva elő;
az említett fehérjét az említett keverékből tisztítjuk.
14. .Eljárás fehérje- előállítására egy 13. igénypont szerinti sejttenyészetből, azzal jellemezve, hogy a protein egy rekombináns protein,
15., Sejttenyészet, ami emlős sejteket és .az 1. igénypont szerinti táptalajt tartalmaz.
16, Eljárás az 1. igénypont, szerinti sejttenyéáztő táptalaj előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre;
szója-hidrolizátumot készítünk, az említett szója-hidrolizátumot ultra szűrési eljárással ultraszűrjük az említett szqja-feidrolizátum frakciót méretkizárásos kromatográfiával tisztítjuk kiválasztjuk azokat a szója-hidrolizátum frakciókat, amik £500 Dalion molekulasüíyű szója-hidrolizátumot tartalmaznák, és a kapott frakciókat, bármely táptalajhoz hozzáadva az 1. igénypont szerinti sejttenyésztő táptalajt állítjuk elő.
HU0202759A 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells HU228210B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0165999A AT409379B (de) 1999-06-02 1999-09-28 Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
PCT/EP2000/009453 WO2001023527A1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0202759A2 HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
HUP0202759A3 HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
HU228210B1 true HU228210B1 (en) 2013-01-28

Family

ID=3518214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0202759A HU228210B1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030203448A1 (hu)
EP (1) EP1220893B2 (hu)
JP (6) JP5441288B2 (hu)
CN (2) CN1318577C (hu)
AT (2) AT409379B (hu)
AU (1) AU780791B2 (hu)
CA (1) CA2385299A1 (hu)
CY (1) CY1106135T1 (hu)
CZ (1) CZ305307B6 (hu)
DE (1) DE60028989T3 (hu)
DK (1) DK1220893T4 (hu)
ES (1) ES2265991T5 (hu)
HU (1) HU228210B1 (hu)
IL (4) IL148642A0 (hu)
PL (1) PL215234B1 (hu)
PT (1) PT1220893E (hu)
RU (3) RU2266325C2 (hu)
SI (1) SI1220893T1 (hu)
SK (1) SK288059B6 (hu)
TR (1) TR200200757T2 (hu)
WO (1) WO2001023527A1 (hu)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
CA2466881A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
JP3916516B2 (ja) * 2002-06-10 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 硬組織−軟組織界面再生用足場材料
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
CA2548162C (en) * 2003-12-19 2013-10-29 Wyeth Serum-free vero cell banking process
ME01218B (me) 2004-03-01 2013-06-20 Ares Trading Sa Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
CA2585547A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
FR2879214A1 (fr) * 2004-12-14 2006-06-16 Pierre Fabre Medicament Sa Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus
WO2006084826A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Novo Nordisk Health Care Ag Production of a polypeptide in a serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate
EP1862537B1 (en) * 2005-03-10 2013-05-08 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US7375188B2 (en) * 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
PL3121266T3 (pl) 2006-01-04 2020-07-13 Baxalta Incorporated Wolne od oligopeptydów pożywki do hodowli komórkowej
CA2644926A1 (en) * 2006-03-06 2007-09-13 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human thrombin and fibrinogen
SG174804A1 (hu) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
EP2500415A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
EP2084265A2 (en) * 2006-11-13 2009-08-05 Schering Corporation Method for reducing protease activity in plant hydrolysate
US20090294288A1 (en) 2006-12-11 2009-12-03 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
EP1988101A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures
KR101190605B1 (ko) 2007-06-15 2012-10-15 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
WO2009115495A1 (de) * 2008-03-19 2009-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz
WO2009127098A1 (zh) 2008-04-18 2009-10-22 上海中信国健药业有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
JP5458536B2 (ja) * 2008-09-17 2014-04-02 不二製油株式会社 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤
CA2737580A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Schering Corporation High titer antibody production
EP2356247B2 (en) * 2008-11-12 2019-05-15 Baxalta Incorporated Method of producing serum-free insulin-free factor vii
KR101737645B1 (ko) 2008-12-30 2017-05-18 박스알타 인코퍼레이티드 알킬-아민-ｎ-옥시드 (ａａｎｏｘ)를 사용하는 세포 성장 증진 방법
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
KR101574056B1 (ko) 2009-07-31 2015-12-02 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 Ａｄａｍｔｓ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지
CN102115728B (zh) * 2009-12-31 2012-09-26 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
AU2011246502B2 (en) 2010-04-26 2014-08-28 Novartis Ag Improved cell cultivation process
SG185038A1 (en) * 2010-04-26 2012-11-29 Novartis Ag Improved cell culture medium
TWI670073B (zh) 2010-07-08 2019-09-01 美商巴克斯歐塔公司 在細胞培養物中生產重組高分子量ｖＷＦ的方法
CN101914485A (zh) * 2010-08-05 2010-12-15 乐能生物工程股份有限公司 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
KR20130101034A (ko) 2010-08-31 2013-09-12 프리슬랜드 브랜즈 비브이 진핵 세포를 위한 배양 배지
CN103154233A (zh) * 2010-10-05 2013-06-12 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN103160458A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 西南民族大学 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
JP2015509376A (ja) * 2012-03-08 2015-03-30 フリーズランド ブランズ ビー．ブイ． 真核細胞のための培養培地
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
CN104593317B (zh) * 2013-10-31 2018-05-04 中国食品发酵工业研究院 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
SG11201605146VA (en) 2013-12-30 2016-07-28 Baxalta GmbH A method of predicting a performance characteristic of a plant or yeast hydrolysate and its use
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
ES2909630T3 (es) 2014-06-04 2022-05-09 Amgen Inc Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero
TWI743024B (zh) 2014-06-06 2021-10-21 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
CN104560893B (zh) * 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CN105002242A (zh) * 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
EP3328403A4 (en) * 2015-07-31 2019-04-17 Zen-Bio, Inc. EXOSOME COMPOSITIONS AND USE THEREOF FOR SOFTWARE SAVING
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
US11070703B2 (en) * 2016-07-29 2021-07-20 Robert Bosch Tool Corporation 3D printer touchscreen interface lockout
JP6258536B1 (ja) 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
SG11201912548XA (en) * 2017-07-06 2020-01-30 Regeneron Pharma Cell culture process for making a glycoprotein
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
WO2024024671A1 (ja) * 2022-07-27 2024-02-01 不二製油グループ本社株式会社 動物細胞増殖促進剤

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4443540A (en) 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
FI86885C (fi) 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
EP0217822B1 (en) 1985-02-13 1993-05-12 Scios Nova Inc. Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
ZA862768B (en) 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8608020D0 (en) 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
EP0318487B1 (en) 1986-08-04 1993-10-13 The University Of New South Wales Serum free tissue culture medium containing polymeric cell-protective agent
AU627427B2 (en) 1987-06-30 1992-08-27 Amgen, Inc. Production of kallikrein
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
JP2815613B2 (ja) 1989-03-24 1998-10-27 株式会社リコー 静電荷像現像用トナー
US5573937A (en) 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
AT393356B (de) 1989-12-22 1991-10-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
WO1991010726A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2844484B2 (ja) * 1990-02-22 1999-01-06 味の素株式会社 組換え蛋白質の生産方法
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5378612A (en) 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
DK53792D0 (da) 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
RU2057176C1 (ru) 1992-05-20 1996-03-27 Институт генетики АН Республики Молдова Питательная среда для культивирования клеток человека и животных
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
JP2766165B2 (ja) * 1993-08-02 1998-06-18 株式会社バイオポリマー・リサーチ バクテリアセルロースの製造方法
CN1088984A (zh) * 1993-11-11 1994-07-06 江西省医学科学研究所 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
JP2684521B2 (ja) 1994-08-19 1997-12-03 ハムス株式会社 ベルトループ縫付けミシンにおけるテープ折り曲げ端の形成維持方法及びその装置
WO1996007730A2 (de) 1994-09-09 1996-03-14 Renner Wolfgang A Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
ATE542891T1 (de) 1994-11-10 2012-02-15 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freier kultur
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
EP0799310A1 (en) 1994-12-16 1997-10-08 Novartis AG Production of recombinant secretory component
JP3649249B2 (ja) * 1995-02-23 2005-05-18 クエスト・インターナショナル・サービシーズ・ビー・ブイ 組織および細胞培養用ペプチド
US5741705A (en) 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
WO1996040866A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and methods of use thereof
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
ATE222064T1 (de) * 1996-04-09 2002-08-15 Du Pont Isoflavon angereichertes sojaeiweissprodukt und verfahren zur herstellung
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
DE69738806D1 (de) * 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
JPH10211488A (ja) 1997-01-28 1998-08-11 Akai Electric Co Ltd 紫外線殺菌装置
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
PT1849860E (pt) 1997-05-28 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
DK0986644T3 (da) 1997-07-23 2007-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Fremstilling af erythropoietin ved endogen genaktivering med virale promotorer
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
DK1200561T3 (da) 1999-08-05 2006-10-16 Baxter Ag Rekombinant stabil celleklon, dens fremstilling og anvendelse
PT1210411E (pt) 1999-08-25 2006-12-29 Immunex Corp Composições e métodos para cultura celular melhorada
WO2002024876A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
EP1208966A1 (en) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Manufacturing process of patio tabletop glass with broken protection
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Also Published As

Publication number Publication date
DE60028989T3 (de) 2017-01-19
US20030203448A1 (en) 2003-10-30
IL250619B (en) 2018-04-30
PL355233A1 (en) 2004-04-05
AT409379B (de) 2002-07-25
CN101173246A (zh) 2008-05-07
JP6348521B2 (ja) 2018-06-27
ES2265991T3 (es) 2007-03-01
DK1220893T3 (da) 2006-10-23
PL215234B1 (pl) 2013-11-29
US20170002392A1 (en) 2017-01-05
SK288059B6 (sk) 2013-03-01
EP1220893B2 (en) 2016-08-31
JP2013135691A (ja) 2013-07-11
US20150072415A1 (en) 2015-03-12
JP2011135880A (ja) 2011-07-14
JP5777653B2 (ja) 2015-09-09
AU780791B2 (en) 2005-04-14
IL148642A0 (en) 2002-09-12
JP2017212977A (ja) 2017-12-07
IL250619A0 (en) 2017-06-29
JP5441288B2 (ja) 2014-03-12
US20110287482A1 (en) 2011-11-24
HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
AU7908300A (en) 2001-04-30
US8021881B2 (en) 2011-09-20
US8722406B2 (en) 2014-05-13
PT1220893E (pt) 2006-10-31
DE60028989T2 (de) 2007-01-25
JP2019030306A (ja) 2019-02-28
ES2265991T5 (es) 2017-05-03
EP1220893B1 (en) 2006-06-21
CZ20021096A3 (cs) 2003-01-15
US9982286B2 (en) 2018-05-29
US20080182297A1 (en) 2008-07-31
IL219969A (en) 2017-06-29
RU2536244C2 (ru) 2014-12-20
DK1220893T4 (en) 2016-12-05
US9441203B2 (en) 2016-09-13
SI1220893T1 (sl) 2006-12-31
CA2385299A1 (en) 2001-04-05
EP1220893A1 (en) 2002-07-10
SK4002002A3 (en) 2002-07-02
IL148642A (en) 2012-08-30
CN1318577C (zh) 2007-05-30
DE60028989D1 (de) 2006-08-03
US20160369316A1 (en) 2016-12-22
CY1106135T1 (el) 2011-06-08
RU2380412C2 (ru) 2010-01-27
TR200200757T2 (tr) 2002-09-23
JP2003510070A (ja) 2003-03-18
CZ305307B6 (cs) 2015-07-29
RU2009131610A (ru) 2011-02-27
CN101173246B (zh) 2011-03-09
IL219969A0 (en) 2012-06-28
RU2005123274A (ru) 2007-01-27
ATE331025T2 (de) 2006-07-15
ATA165999A (de) 2001-12-15
RU2266325C2 (ru) 2005-12-20
WO2001023527A1 (en) 2001-04-05
JP2016127839A (ja) 2016-07-14
CN1391604A (zh) 2003-01-15
JP6467459B2 (ja) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228210B1 (en) Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
US7094574B2 (en) Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
ES2267280T3 (es) Clon celular recombinante estable, su preparacion y utilizacion del mismo.
JP6097725B2 (ja) 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用
JP2010099093A (ja) 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: BAXALTA GMBH, CH

Free format text: FORMER OWNER(S): BAXTER AKTIENGESELLSCHAFT, AT

Owner name: BAXALTA INCORPORATED, US

Free format text: FORMER OWNER(S): BAXTER AKTIENGESELLSCHAFT, AT