CN101914485A - 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法 - Google Patents

Abstract

一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法，它涉及无血清或低血清通用细胞培养基，由氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、酚红、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺、大豆蛋白肽和蒸馏水制成。它解决了现有无血清培养基不能直接培养生长状况不良的细胞，多数细胞要逐步降低血清浓度才能适应现有的无血清培养基及易受外界因素影响，容易造成致死性损害的问题。细胞可直接在本发明培养基上培养，不必逐步驯化和培养，节省了培养周期和其它因素的干扰；减少血清带来的病毒污染，并且细胞成活率高达94％以上。

Description

一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法

一、技术领域

本发明涉及无血清或低血清培养基的配制，具体涉及一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法(病毒宿主)。

二、背景技术

动物细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响表达量，只有好的培养基才能筛选、驯化出优质细胞。普通的细胞培养基中含有小牛血清，由于血清都是批量生产，各批间差异很大、质量不稳定，而且血清中含有一些对细细胞产生毒性的物质，会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡，同时也增加了生产中分离纯化的难度，而且特别不适合生长因子对细胞作用的研究、细胞分泌物功能的研究及大量细胞分泌物的制备。

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。目前的无血清培养基在原代培养或者细胞状况不良时，还只能先用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后才能再换成无血清培养液；而且多数细胞转入无血清培养基培养需要有一个较长的适应过程，一般要逐步降低血清浓度，直至无血清培养。由于目前的无血清培养基包含非常少的蛋白质，所以更易于受外界因素的影响，容易导致所培养的细胞致死性损害。

三、发明内容

本发明的目的是为了解决现有无血清培养基不能直接培养生长状况不良的细胞，多数细胞要逐步降低血清浓度才能适应现有的无血清培养基及易受外界因素的影响，容易造成致死性损害的问题，而提供的一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基。

本发明是这样实现的：将氯化钙100-400mg、氯化钾100-500mg、无水硫酸镁50-150mg、氯化钠3000-8000mg、无水磷酸二氢钠100-200mg、L-谷氨酰胺100-500mg、D-葡萄糖500-2000mg、酚红5-20mg、D-泛酸钙0.50-5mg、氯化胆碱0.50-5mg、叶酸0.5-5mg、i-肌醇1-5mg、烟酰胺0.5-5mg、盐酸吡哆醛0.5-5mg、核黄素0.05-1mg、盐酸硫0.5-5mg和大豆蛋白肽2000-8000mg用蒸馏水定容至1000mL；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道尔顿，大豆蛋白肽含有18种氨基酸或以上。

使用该方法生产出来的培养基用于培养CHO细胞、NSO细胞、Sp2/O细胞、杂交瘤细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞和MDBK细胞。

本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中所使用的大豆蛋白肽要求其分子量应当≤3000道尔顿，由微生物发酵法制得。由于微生物的作用将大分子的蛋白分解为更具有活性的小分子肽，且含有18种氨基酸。在配制培养基的过程中小分子大豆蛋白肽可以代替血清中的动物源性蛋白和活性因子。由于采用的是大豆蛋白肽，所以可以有效的避免动物源性蛋白对所培养动物细胞或人细胞的干扰。

动物细胞可直接在本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基上培养而不必逐步驯化和培养，节省了培养周期和其它因素的干扰，并且使用本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基细胞成活率高达94％以上。

采用本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基简化了后期的分离纯化工艺，使杂质含量降低，提高产品纯度，降低生产成本。

四、具体实施方式

实例一

将氯化钙100mg、氯化钾100mg、无水硫酸镁50mg、氯化钠3000mg、无水磷酸二氢钠100mg、L-谷氨酰胺100mg、D-葡萄糖500mg、酚红5mg、D-泛酸钙0.50mg、氯化胆碱0.50mg、叶酸0.5mg、i-肌醇1mg、烟酰胺0.5mg、盐酸吡哆醛0.5mg、核黄素0.05mg、盐酸硫0.5mg和大豆蛋白肽2000mg用蒸馏水定容至1000mL；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道尔顿，大豆蛋白肽含有18种氨基酸或以上。

此培养基可用于培养CHO细胞、NSO细胞、Sp2/O细胞、杂交瘤细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞、MDBK细胞等。

对于培养基中必须添加血清培养的特殊细胞，如Marcl45细胞、BHK21、VERO细胞、骨髓间充质干细胞等，在本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中再添加质量分数小于3％的血清，后即可实现成功培养(现有血清培养基中血清加入量为质量的8％～10％)。

本实施方式无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基可增加所培养细胞的密度及收获次数，提高表达量，从而提高医药领域的疫苗产量；并解决因取消或降低牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱满问题。

本实施方式因为采用大豆蛋白肽，其成本远远低于使用牛血清的培养基，并同时解决了现有无血清培养基培养细胞过早死亡、形态不饱满的问题。而且本实施方式无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基培养的细胞不易发生老化脱落现象，细胞增殖迅速、代谢旺盛。

实例二

将氯化钙400mg、氯化钾500mg、无水硫酸镁150mg、氯化钠8000mg、无水磷酸二氢钠200mg、L-谷氨酰胺500mg、D-葡萄糖2000mg、酚红20mg、D-泛酸钙5mg、氯化胆碱5mg、叶酸5mg、i-肌醇5mg、烟酰胺5mg、盐酸吡哆醛5mg、核黄素1mg、盐酸硫5mg和大豆蛋白肽8000mg用蒸馏水定容至1000mL；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道尔顿，大豆蛋白肽含有18种氨基酸或以上。

此培养基可用于培养CHO细胞、NSO细胞、Sp2/O细胞、杂交瘤细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞、MDBK细胞等。

对于培养基中必须添加血清培养的特殊细胞，如Marcl45细胞、BHK21、VERO细胞、骨髓间充质干细胞等，在本发明无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中再添加质量分数小于3％的血清，后即可实现成功培养(现有血清培养基中血清加入量为质量的8％～10％)。

实例三

本实施方式用无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基培养HaLe细胞(非洲女性宫颈癌细胞)。

分别使用实例一培养基和MEM细胞培养基(产品代码：MD600，批号：070512)，在37℃的条件下直接培养复苏后的HaLe细胞，并用显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。

表1

无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中培养的细胞分裂百分率明显优于普通MEM细胞培养基，并且无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中细胞长成单层的时间与传统培养基相同，而且细胞形态基本一致。

无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的营养成分优于普通血清培养基，无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基中细胞增殖迅速，代谢旺盛，细胞分裂百分率(24h)明显高于普通血清培养基。说明实例一、二所配制的无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基用于动物细胞培养是可行的。

Claims (2)

1.一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法，其特征在于：将氯化钙100-400mg、氯化钾100-500mg、无水硫酸镁50-150mg、氯化钠3000-8000mg、无水磷酸二氢钠100-200mg、L-谷氨酰胺100-500mg、D-葡萄糖500-2000mg、酚红5-20mg、D-泛酸钙0.50-5mg、氯化胆碱0.50-5mg、叶酸0.5-5mg、i-肌醇1-5mg、烟酰胺0.5-5mg、盐酸吡哆醛0.5-5mg、核黄素0.05-1mg、盐酸硫0.5-5mg和大豆蛋白肽2000-8000mg用蒸馏水定容至1000mL；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道尔顿，大豆蛋白肽含有18种氨基酸或以上。

2.根据权利要求1所述的一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法，使用该方法生产出来的培养基用于培养CHO细胞、NSO细胞、Sp2/O细胞、杂交瘤细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞和MDBK细胞。