JP2012503487A - 高力価抗体の製造 - Google Patents
高力価抗体の製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012503487A JP2012503487A JP2011529210A JP2011529210A JP2012503487A JP 2012503487 A JP2012503487 A JP 2012503487A JP 2011529210 A JP2011529210 A JP 2011529210A JP 2011529210 A JP2011529210 A JP 2011529210A JP 2012503487 A JP2012503487 A JP 2012503487A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liter
- medium
- hcl
- acid
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 175
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 124
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 70
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 62
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 62
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 57
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 57
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 55
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 54
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 53
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 53
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 52
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 51
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 51
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 50
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 50
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 49
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 45
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 37
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 36
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 35
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 34
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 31
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 30
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 28
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 claims description 28
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 28
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 27
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 27
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 27
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 27
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 27
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 27
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 27
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 27
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 27
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 26
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 26
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 26
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 26
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 26
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 26
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 26
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 26
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 26
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 26
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 26
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 26
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 26
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 26
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 26
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 26
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 25
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 25
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 25
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 24
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 23
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 23
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 22
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 21
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 21
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 21
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 21
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 21
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 21
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 19
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 19
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 17
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims description 17
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims description 17
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 17
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 17
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 17
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 17
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 16
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 16
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 16
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 16
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 16
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 16
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims description 15
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 15
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 15
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 claims description 15
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 15
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims description 15
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 14
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 claims description 14
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 claims description 14
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 claims description 14
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 claims description 14
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 14
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 14
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 claims description 14
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- GGTYBZJRPHEQDG-WCCKRBBISA-N (2s)-2,5-diaminopentanoic acid hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC[C@H](N)C(O)=O GGTYBZJRPHEQDG-WCCKRBBISA-N 0.000 claims description 13
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical compound O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 13
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims description 13
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 13
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims description 13
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 claims description 13
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 13
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 13
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 claims description 13
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 claims description 13
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 claims description 13
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims description 13
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 13
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 13
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 13
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 13
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 13
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 13
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 13
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 claims description 13
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 13
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 13
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 13
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 claims description 12
- LAIZPRYFQUWUBN-UHFFFAOYSA-L nickel chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Ni+2] LAIZPRYFQUWUBN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 claims description 12
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 claims description 12
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 11
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 10
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 10
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 9
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 9
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 8
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 6
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 6
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 5
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 4
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- XEEYVTMVFJEEEY-UHFFFAOYSA-L magnesium;dichloride;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] XEEYVTMVFJEEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 claims description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 21
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 20
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 9
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 6
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 5
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L disodium L-tyrosinate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C([O-])C=C1 ASIYFCYUCMQNGK-JZGIKJSDSA-L 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HHGZUQPEIHGQST-RGVONZFCSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.OC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](N)C(O)=O HHGZUQPEIHGQST-RGVONZFCSA-N 0.000 description 2
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- ZISSAWUMDACLOM-UHFFFAOYSA-N triptane Chemical compound CC(C)C(C)(C)C ZISSAWUMDACLOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000007755 F10 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 229910002554 Fe(NO3)3·9H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- -1 hydrochloric acid Amine Chemical class 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000009428 plumbing Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0056—Xeno-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本発明は、部分的には、タンパク質を高レベルで組換え発現させるための方法、およびそれを行うための細胞培養培地を提供する。
Description
本発明は、一般には、大量のタンパク質、例えば抗体を細胞培養内で製造するための製造方法、および該細胞培養自体に関する。
治療用タンパク質の工業的製造のための細胞培養は、高い経費を要する方法である。必要な設備は高くつき、研究開発および製造コストは高い。細胞培養1リットル当たりの治療用タンパク質の量を最大にする細胞培養方法の開発は、与えられた量の該タンパク質を製造するのに必要な資源を最小にするであろう。したがって、大量のタンパク質を製造する商業的に実施可能な方法を用いることが望ましい。
天然に存在する多数の細胞は標準的な培養条件下で所望のタンパク質を大量には産生しない。したがって、培養内の細胞に大量の治療用タンパク質を産生させる細胞培養方法の広範な研究開発が行われる必要がある。典型的には、最適な細胞培養条件の特定は困難であり、相当量の創作力を要する。
発明の概括
本発明は、一般には、種々の培養補足物を及び培養条件に対する他の改変を用いることにより培養内の細胞から大量のタンパク質を製造するための方法および組成物を提供する。
本発明は、一般には、種々の培養補足物を及び培養条件に対する他の改変を用いることにより培養内の細胞から大量のタンパク質を製造するための方法および組成物を提供する。
本発明は、タンパク質を発現する宿主細胞を初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、以下に記載のものを場合によってはおおよその記載濃度(他の起源からの、例えば初期哺乳類細胞培地からの各成分の量を含まない)で含む補足物を加えることを含む、タンパク質の製造方法を提供する:
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
グリシン:72mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アルギニン:312.4mg/リットル
L−アスパラギン:842mg/リットル
L−アスパラギン酸:97.6mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−グルタミン酸:155.4mg/リットル
L−ヒスチジン:167mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
L−イソロイシン:422mg/リットル
L−ロイシン:384mg/リットル
L−リシン:365mg/リットル
L−メチオニン:147.2mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
L−フェニルアラニン:207mg/リットル
L−プロリン:239mg/リットル
L−セリン:281mg/リットル
L−トレオニン:211.6mg/リットル
L−トリプトファン:109.2mg/リットル
L−チロシン:234mg/リットル
L−バリン:308.8mg/リットル
塩化マグネシウム四水和物:0.0003mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
塩化スズ脱水物:0.00008mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
グルコース:1.5g/リットル
L−グルタミン:150mg/リットル。
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
グリシン:72mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アルギニン:312.4mg/リットル
L−アスパラギン:842mg/リットル
L−アスパラギン酸:97.6mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−グルタミン酸:155.4mg/リットル
L−ヒスチジン:167mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
L−イソロイシン:422mg/リットル
L−ロイシン:384mg/リットル
L−リシン:365mg/リットル
L−メチオニン:147.2mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
L−フェニルアラニン:207mg/リットル
L−プロリン:239mg/リットル
L−セリン:281mg/リットル
L−トレオニン:211.6mg/リットル
L−トリプトファン:109.2mg/リットル
L−チロシン:234mg/リットル
L−バリン:308.8mg/リットル
塩化マグネシウム四水和物:0.0003mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
塩化スズ脱水物:0.00008mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
グルコース:1.5g/リットル
L−グルタミン:150mg/リットル。
本発明の1つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度のアミノ酸を含むアミノ酸供給ストック溶液(例えば、50×ストック溶液)から幾つかの補足物を加える:
L−アルギニン:6.32g/リットル
L−シスチン:1.7g/リットル
L−ヒスチジン:2.1g/リットル
L−イソロイシン:2.6g/リットル
L−ロイシン:2.6g/リットル
L−リシン:3.6g/リットル
L−メチオニン:0.76g/リットル
L−フェニルアラニン:1.65g/リットル
L−トレオニン:2.38g/リットル
L−トリプトファン:0.51g/リットル
L−チロシン:1.8g/リットル
L−バリン:2.34g/リットル。
L−アルギニン:6.32g/リットル
L−シスチン:1.7g/リットル
L−ヒスチジン:2.1g/リットル
L−イソロイシン:2.6g/リットル
L−ロイシン:2.6g/リットル
L−リシン:3.6g/リットル
L−メチオニン:0.76g/リットル
L−フェニルアラニン:1.65g/リットル
L−トレオニン:2.38g/リットル
L−トリプトファン:0.51g/リットル
L−チロシン:1.8g/リットル
L−バリン:2.34g/リットル。
本発明の1つの実施形態においては、培養1リットル当たり約20mlのアミノ酸供給ストック溶液を加える。本発明の1つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度のアミノ酸を含むアミノ酸供給ストック溶液(例えば、100×ストック溶液)から以下の補足物を加える:
L−アラニン:0.89g/リットル
L−アスパラギン:1.5g/リットル
L−アスパラギン酸:1.33g/リットル
L−グルタミン酸:1.47g/リットル
グリシン:0.75g/リットル
L−プロリン:1.15g/リットル
L−セリン:1.05g/リットル。
L−アラニン:0.89g/リットル
L−アスパラギン:1.5g/リットル
L−アスパラギン酸:1.33g/リットル
L−グルタミン酸:1.47g/リットル
グリシン:0.75g/リットル
L−プロリン:1.15g/リットル
L−セリン:1.05g/リットル。
本発明の1つの実施形態においては、培養1リットル当たり約10mlの該アミノ酸供給ストック溶液を加える。本発明の1つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度の補足物を含む栄養供給ストック溶液(例えば、50×ストック溶液)から該補足物のいくつかを加える:
L−アスパラギン:40.6g/リットル
L−プロリン:10.81g/リットル
L−イソロイシン:18.53g/リットル
L−システイン−HCl:11.19g/リットル
L−ロイシン:16.58g/リットル
L−トレオニン:8.2g/リットル
L−チロシン:9.9g/リットル
L−アルギニン:9.29g/リットル
L−アスパラギン酸:3.56g/リットル
L−グルタミン酸:6.28g/リットル
グリシン:2.83g/リットル
L−ヒスチジン:6.23g/リットル
L−メチオニン:6.58g/リットル
L−トリプトファン:4.93g/リットル
L−リシン:14.66g/リットル
L−フェニルアラニン:8.64g/リットル
L−バリン:13.08g/リットル
L−セリン:13g/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):14.41g/リットル
硫酸亜鉛:0.054g/リットル
硫酸第二銅:0.00016g/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.000039g/リットル
塩化コバルト:0.000125g/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.00002g/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.000008g/リットル
塩化スズ脱水物:0.000004g/リットル
塩化マンガン四水和物:0.000015g/リットル。
L−アスパラギン:40.6g/リットル
L−プロリン:10.81g/リットル
L−イソロイシン:18.53g/リットル
L−システイン−HCl:11.19g/リットル
L−ロイシン:16.58g/リットル
L−トレオニン:8.2g/リットル
L−チロシン:9.9g/リットル
L−アルギニン:9.29g/リットル
L−アスパラギン酸:3.56g/リットル
L−グルタミン酸:6.28g/リットル
グリシン:2.83g/リットル
L−ヒスチジン:6.23g/リットル
L−メチオニン:6.58g/リットル
L−トリプトファン:4.93g/リットル
L−リシン:14.66g/リットル
L−フェニルアラニン:8.64g/リットル
L−バリン:13.08g/リットル
L−セリン:13g/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):14.41g/リットル
硫酸亜鉛:0.054g/リットル
硫酸第二銅:0.00016g/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.000039g/リットル
塩化コバルト:0.000125g/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.00002g/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.000008g/リットル
塩化スズ脱水物:0.000004g/リットル
塩化マンガン四水和物:0.000015g/リットル。
本発明の1つの実施形態においては、培養1リットル当たり約20mlの該栄養供給ストック溶液を加える。本発明の1つの実施形態においては、おおよそ以下の濃度の補足物を含むビタミン/塩供給ストック溶液(例えば、50×ストック溶液)から該補足物の幾つかを加える:
亜セレン酸ナトリウム:7.13×10−4g/リットル
硫酸アデニン:0.0816g/リットル
アデノシン:0.88g/リットル
シチジン:0.88g/リットル
グアノシン:0.88g/リットル
ウリジン:0.88g/リットル
ヒポキサンチン:0.59g/リットル
L−シトルリン:0.63g/リットル
L−オルニチン−HCl:1.28g/リットル
ビオチン:0.014g/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.0025g/リットル
葉酸:0.23g/リットル
リポ酸:0.026g/リットル
ナイアシン:1.57g/リットル
ピリドキシンHCl:0.15g/リットル
リボフラビン:0.093g/リットル
チアミンHCl:0.8g/リットル
ビタミンE:0.0188g/リットル
ビタミンB12:0.17g/リットル
塩化コリン:2.51g/リットル
エタノールアミンHCl:0.22g/リットル
i−イノシトール:3.66g/リットル
チミジン:0.39g/リットル
プトレッシン2HCl:0.02g/リットル
プロゲステロン:0.00075g/リットル
D−パントテン酸カルシウム:1.19g/リットル。
亜セレン酸ナトリウム:7.13×10−4g/リットル
硫酸アデニン:0.0816g/リットル
アデノシン:0.88g/リットル
シチジン:0.88g/リットル
グアノシン:0.88g/リットル
ウリジン:0.88g/リットル
ヒポキサンチン:0.59g/リットル
L−シトルリン:0.63g/リットル
L−オルニチン−HCl:1.28g/リットル
ビオチン:0.014g/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.0025g/リットル
葉酸:0.23g/リットル
リポ酸:0.026g/リットル
ナイアシン:1.57g/リットル
ピリドキシンHCl:0.15g/リットル
リボフラビン:0.093g/リットル
チアミンHCl:0.8g/リットル
ビタミンE:0.0188g/リットル
ビタミンB12:0.17g/リットル
塩化コリン:2.51g/リットル
エタノールアミンHCl:0.22g/リットル
i−イノシトール:3.66g/リットル
チミジン:0.39g/リットル
プトレッシン2HCl:0.02g/リットル
プロゲステロン:0.00075g/リットル
D−パントテン酸カルシウム:1.19g/リットル。
本発明の1つの実施形態においては、培養1リットル当たり約20mlのビタミン/塩供給物を加える。本発明の1つの実施形態においては、該タンパク質が該細胞から該培地内に分泌される場合、該方法は更に、該細胞から該培地を採取することを含む。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該細胞の生存率が約60%未満である場合、該細胞から該培地を採取する。例えば、該培地を遠心分離し、および/または該培地をデプス濾過(depth filter)し、および/または該培地を0.2ミクロンフィルターで濾過することにより、該培地を該細胞から採取することが可能である。本発明の方法を用いて発現されたタンパク質は、任意のタンパク質、例えばIGF1Rに特異的に結合する例えば抗体またはその抗原結合性フラグメントであることが可能であり、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列、それらの成熟フラグメントまたはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む完全抗体であり、例えば、ここで、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている。本発明の1つの実施形態においては、該補足物が加えられる初期哺乳類細胞増殖培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない。
本発明は、抗体(例えば、モノクローナル、組換え、および/または完全ヒト)の製造方法をその範囲内に含み、該製造方法は、約37℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地(該培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない)に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するCHO DXB11宿主細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物:
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、おおよそ以下の最終濃度(他の起源からの、例えば該初期哺乳類細胞培地からの該アミノ酸の量を含まない)までのアミノ酸:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル
を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え[ここで、該補足供給物(他の供給物からの各成分の量を含まない)からの成分は、以下に記載されているおおよその最終培養濃度に達する:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル]、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持することを含む。本発明の1つの実施形態においては、該抗体は、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体は、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている。該方法は更に、場合によっては、該培地のディスク・スタック(disk−stack)遠心分離、該培地のデプス濾過(depth filtering)および0.2ミクロンの細孔径を有するフィルターでの該培地の濾過により該細胞から該培地を回収すること、ならびに場合によっては、カラムクロマトグラフィー分画により該培地から該免疫グロブリン鎖を精製する工程を含む。
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、おおよそ以下の最終濃度(他の起源からの、例えば該初期哺乳類細胞培地からの該アミノ酸の量を含まない)までのアミノ酸:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル
を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え[ここで、該補足供給物(他の供給物からの各成分の量を含まない)からの成分は、以下に記載されているおおよその最終培養濃度に達する:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル]、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持することを含む。本発明の1つの実施形態においては、該抗体は、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体は、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている。該方法は更に、場合によっては、該培地のディスク・スタック(disk−stack)遠心分離、該培地のデプス濾過(depth filtering)および0.2ミクロンの細孔径を有するフィルターでの該培地の濾過により該細胞から該培地を回収すること、ならびに場合によっては、カラムクロマトグラフィー分画により該培地から該免疫グロブリン鎖を精製する工程を含む。
本発明はまた、
約10g/リットル ダイズ水解物、
約1.5g/リットル グルコース、
約150mg/リットル L−グルタミン、
約6.8±0.02のpH、
HEPES、
炭酸水素ナトリウムバッファー、
無機塩、
非必須アミノ酸、
組換えヒトインスリン、
微量元素、
界面活性剤、
アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)
を含む水性液体細胞培養培地を提供し、ここで、該培地は、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない。さらに、本発明は、関心のある免疫グロブリンを発現する細胞が培養された細胞培養を提供する。
約10g/リットル ダイズ水解物、
約1.5g/リットル グルコース、
約150mg/リットル L−グルタミン、
約6.8±0.02のpH、
HEPES、
炭酸水素ナトリウムバッファー、
無機塩、
非必須アミノ酸、
組換えヒトインスリン、
微量元素、
界面活性剤、
アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)
を含む水性液体細胞培養培地を提供し、ここで、該培地は、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない。さらに、本発明は、関心のある免疫グロブリンを発現する細胞が培養された細胞培養を提供する。
例えば、本発明は、約37℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地(該培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない)に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するCHO DXB11宿主細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物:
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持する(ここで、細胞生存率は約60%以下である)ことを含む製造方法により製造された液体培地を提供する。本発明の1つの実施形態においては、該培地は、抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含む宿主細胞を含み、ここで、宿主細胞により分泌された抗体またはフラグメントは該培地内に存在する。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、IGF1Rに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを形成し、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに/または配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む完全抗体である。本発明のもう1つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている。例えば、該宿主細胞は、抗体の免疫グロブリンまたはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含み、ここで、該抗体またはフラグメントは該培地内に分泌される。本発明の1つの実施形態においては、該宿主細胞の生存率は約60%以下であり、および/または、例えば該培地および細胞を遠心分離し、該培地から該細胞を除去することにより、細胞増殖は約14〜24日間(約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間、約21日間、約22日間、約23日間または約24日間)続行し、例えば、ここで、該培地はまた、遠心分離後に、デプス濾過され、および/または0.2ミクロンフィルターで濾過される。前記のとおりに得られる培地の特徴を含むいずれの培地も、該培地が実際に得られた方法には無関係に、本発明の一部を構成する。
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持する(ここで、細胞生存率は約60%以下である)ことを含む製造方法により製造された液体培地を提供する。本発明の1つの実施形態においては、該培地は、抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含む宿主細胞を含み、ここで、宿主細胞により分泌された抗体またはフラグメントは該培地内に存在する。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、IGF1Rに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを形成し、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに/または配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含み、例えば、ここで、該抗体またはフラグメントは、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む完全抗体である。本発明のもう1つの実施形態においては、該軽鎖免疫グロブリンはカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンはガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている。例えば、該宿主細胞は、抗体の免疫グロブリンまたはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターを含み、ここで、該抗体またはフラグメントは該培地内に分泌される。本発明の1つの実施形態においては、該宿主細胞の生存率は約60%以下であり、および/または、例えば該培地および細胞を遠心分離し、該培地から該細胞を除去することにより、細胞増殖は約14〜24日間(約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間、約21日間、約22日間、約23日間または約24日間)続行し、例えば、ここで、該培地はまた、遠心分離後に、デプス濾過され、および/または0.2ミクロンフィルターで濾過される。前記のとおりに得られる培地の特徴を含むいずれの培地も、該培地が実際に得られた方法には無関係に、本発明の一部を構成する。
本発明はまた、本発明のいずれかの培地を含む容器(例えば、フラスコ、バイオリアクター、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動床バイオリアクターまたは充填層バイオリアクター)を提供する。
発明の詳細な説明
本出願は、哺乳類細胞、例えばCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞からの抗体(例えば、抗IGF1R)の製造方法を含む。該方法は、攪拌タンクバイオリアクター、バッグおよび使い捨てバイオリアクターならびに振とうフラスコを含む種々のバイオリアクター培養系において実施される。「レベル3」製造方法は、平均して、約1.2g/Lの抗体の力価、および約22pg/細胞/日の培養比生産性をもたらす。「増強」方法は、平均して、約2.3g/Lの抗体の力価、および約30pg/細胞/日の比生産性をもたらす。どちらの方法も、培養比生産性、力価、バイオマスおよび培養生存性を増加させるために、接種前に又は製造過程中の供給として製造バイオリアクター培養に特定の補足物を加えることを含む。レベル3方法においては、培養比生産性を増加させるために、3つの補足物を加え、コムギおよび/またはダイズ水解物(水解物供給)を加える(例えば、200g/L(水性)溶液として)。典型的には、両方の水解物、またはダイズ水解物供給物のみを該培養に加える。培養バイオマスを増加させプロセス力価を増加させるために、2つのアミノ酸濃縮供給溶液(アミノ酸供給物)を加える。培養生存性を安定させバイオマスを増加させるために、濃縮ビタミンおよび塩溶液(ビタミン/塩供給物)を加える。該ビタミン供給溶液は、例えばビオチン、プロゲステロン、イノシトール、核酸、シトルリン、ヒポキサンチン、リポ酸リボフラビン、チアミン、コリン、エタノールアミン、葉酸、フラビンおよびビタミンB12を含む。
本出願は、哺乳類細胞、例えばCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞からの抗体(例えば、抗IGF1R)の製造方法を含む。該方法は、攪拌タンクバイオリアクター、バッグおよび使い捨てバイオリアクターならびに振とうフラスコを含む種々のバイオリアクター培養系において実施される。「レベル3」製造方法は、平均して、約1.2g/Lの抗体の力価、および約22pg/細胞/日の培養比生産性をもたらす。「増強」方法は、平均して、約2.3g/Lの抗体の力価、および約30pg/細胞/日の比生産性をもたらす。どちらの方法も、培養比生産性、力価、バイオマスおよび培養生存性を増加させるために、接種前に又は製造過程中の供給として製造バイオリアクター培養に特定の補足物を加えることを含む。レベル3方法においては、培養比生産性を増加させるために、3つの補足物を加え、コムギおよび/またはダイズ水解物(水解物供給)を加える(例えば、200g/L(水性)溶液として)。典型的には、両方の水解物、またはダイズ水解物供給物のみを該培養に加える。培養バイオマスを増加させプロセス力価を増加させるために、2つのアミノ酸濃縮供給溶液(アミノ酸供給物)を加える。培養生存性を安定させバイオマスを増加させるために、濃縮ビタミンおよび塩溶液(ビタミン/塩供給物)を加える。該ビタミン供給溶液は、例えばビオチン、プロゲステロン、イノシトール、核酸、シトルリン、ヒポキサンチン、リポ酸リボフラビン、チアミン、コリン、エタノールアミン、葉酸、フラビンおよびビタミンB12を含む。
増強方法においては、追加的な濃縮栄養溶液(栄養供給物)と共に該供給溶液を加える。「栄養供給物」は、例えばアミノ酸、硫酸亜鉛、硫酸第二銅、バナジン酸アンモニウム、塩化コバルト、二塩化ニッケル、塩化スズおよび塩化マンガンを含む。それは、プロセス力価を改善し生存性を増加させるために、接種前に又は製造過程中の供給として加えることが可能である。
また、場合によっては、濃縮塩溶液、ダイズ水解物溶液または二酸化炭素および水酸化ナトリウム(該バイオリアクターのためのpH制御の一部として)の添加による、製造過程中の(400〜500mOsmへの)浸透圧重量モル濃度変化を利用する。該浸透圧重量モル濃度変化は、培養比生産性を増加させ回収生存性を改善するために利用される。さらに、場合によっては、高い生細胞数での培養生存性を安定化させるために、約36℃〜37℃から33〜35℃への製造過程中の温度低下を用いる。
本発明の目的においては、「製造過程中」なる語は、初期細胞接種後の製造細胞培養(例えば、マスター細胞バンクまたは実施細胞バンクのために増殖される細胞)の成長中に生じる事象を意味する。
「製造細胞培養」は、最終産物、例えば抗体(例えば抗IGF1R抗体)が単離される細胞培養を意味する。
「増殖細胞培養」は、製造細胞培養の初期接種のために使用される細胞または細胞培養を意味する。
補足物の「n×」ストック溶液(ここで、nは数字、例えば50である)は、該ストック溶液が、該培養に加えられる場合に1/nの濃度に希釈されることを示す。例えば、50×ストック溶液は、通常、培養に加えられる場合に1/50の濃度に希釈される。
供給物
本発明の方法は、初期哺乳類細胞増殖培地に種々の供給物を加える工程を含む。これらの供給物には、水解物供給物、ビタミン/塩供給物、アミノ酸供給物および栄養供給物が含まれる。用いる細胞培養方法のタイプ、レベル3方法であるか増強方法であるかに応じて、異なる時点で該供給物は加えられうる。
本発明の方法は、初期哺乳類細胞増殖培地に種々の供給物を加える工程を含む。これらの供給物には、水解物供給物、ビタミン/塩供給物、アミノ酸供給物および栄養供給物が含まれる。用いる細胞培養方法のタイプ、レベル3方法であるか増強方法であるかに応じて、異なる時点で該供給物は加えられうる。
「初期哺乳類細胞増殖培地」は、当技術分野で公知の幾つかのタイプの水性培地のいずれかであることが可能であり、この用語の意味はいずれの当業者にも容易に認識されるであろう。具体例には、EX−CELL ACF CHO培地(Sigma−Aldrich(St.Louis,MO);後記で更に詳しく記載する)、DMEM、DMEM/F−12、F−10栄養混合物(Nutrient Mixture)、RPMI培地1640、F−12栄養混合物(Nutrient Mixture)、培地(Medium)199、イーグル(Eagle)MEM、RPMI、293倍地およびイスコブ培地(Iscove’s Media)が含まれる。例えば、イーグル最少必須培地(MEM)は、塩酸L−アルギニン(126mg/l)、L−シスチン2HCl(31mg/l)、塩酸L−ヒスチジン−H2O(42mg/l)、L−イソロイシン(52mg/l)、L−ロイシン(52mg/l)、塩酸L−リシン(73mg/l)、L−メチオニン(15mg/l)、L−フェニルアラニン(32mg/l)、L−トレオニン(48mg/l)、L−トリプトファン(10mg/l)、L−チロシン二ナトリウム塩脱水物(52mg/l)、L−バリン(46mg/l)、塩化コリン(1mg/l)、D−パントテン酸カルシウム(1mg/l)、葉酸(1mg/l)、ナイアシンアミド(1mg/l)、塩酸ピリドキサール(1mg/l)、リボフラビン(0.1mg/l)、塩酸チアミン(1mg/l)、i−イノシトール(2mg/l)、塩化カルシウム(CaCl2)(無水物)(200mg/l)、硫酸マグネシウム(MgSO4)(無水物)(97.67mg/l)、塩化カリウム(KCl)(400mg/l)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)(2200mg/l)、塩化ナトリウム(NaCl)(6800mg/l)、リン酸ナトリウム(一塩基酸)(NaH2PO4−H2O)(140mg/l)、D−グルコース(デキストロース)(1000mg/l)およびフェノールレッド(10mg/l)を含む。
変法イーグル培地(Modified Eagle Medium)(MEM)(2×)は、L−塩酸アルギニン(504mg/l)、L−シスチン(96mg/l)、L−グルタミン(870mg/l)、塩酸L−ヒスチジン−H2O(168mg/l)、L−イソロイシン(208mg/l)、L−ロイシン(208mg/l)、塩酸L−リシン(290mg/l)、L−メチオニン(60mg/l)、L−フェニルアラニン(128mg/l)、L−トレオニン(192mg/l)、L−トリプトファン(40mg/l)、L−チロシン二ナトリウム塩脱水物(208mg/l)、L−バリン(155mg/l)、塩化コリン(4mg/l)、D−パントテン酸カルシウム(4mg/l)、葉酸(4mg/l)、ナイアシンアミド(4mg/l)、塩酸ピリドキサール(4mg/l)、リボフラビン(0.4mg/l)、塩酸チアミン(4mg/l)、i−イノシトール(8mg/l)、塩化カルシウム(CaCl2)(無水物)(285mg/l)、硝酸第二鉄(Fe(NO3)3・9H2O)(1mg/l)、硫酸マグネシウム(MgSO4)(無水物)(195mg/l)、塩化カリウム(KCl)(800mg/l)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)(8400mg/l)、塩化ナトリウム(NaCl)(12800mg/l)、リン酸ナトリウム(一塩基酸)(NaH2PO4−H2O)(250mg/l)およびD−グルコース(デキストロース)(9000mg/l)を含む。
RPMI培地1640(1×)は、グリシン(10mg/l)、L−アルギニン(200mg/l)、L−アスパラギン(50mg/l)、L−アスパラギン酸(20mg/l)、L−シスチン2HCl(65mg/l)、L−グルタミン酸(20mg/l)、L−グルタミン(300mg/l)、L−ヒスチジン(15mg/l)、L−ヒドロキシプロリン(20mg/l)、L−イソロイシン(50mg/l)、L−ロイシン(50mg/l)、塩酸L−リシン(40mg/l)、L−メチオニン(15mg/l)、L−フェニルアラニン(15mg/l)、L−プロリン(20mg/l)、L−セリン(30mg/l)、L−トレオニン(20mg/l)、L−トリプトファン(5mg/l)、L−チロシン二ナトリウム塩脱水物(29mg/l)、L−バリン(20)、ビオチン(0.2mg/l)、塩化コリン(3mg/l)、D−パントテン酸カルシウム(0.25mg/l)、葉酸(1mg/l)、ナイアシンアミド(1mg/l)、パラ−アミノ安息香酸(1mg/l)、塩酸ピリドキシン(1mg/l)、リボフラビン(0.2mg/l)、塩酸チアミン(1mg/l)、ビタミンB12(0.005mg/l)、i−イノシトール(35mg/l)、硝酸カルシウム(Ca(NO3)24H2O)(100mg/l)、硫酸マグネシウム(MgSO4)(無水物)(48.84mg/l)、塩化カリウム(KCl)(400mg/l)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)(2000mg/l)、塩化ナトリウム(NaCl)(6000mg/l)、リン酸ナトリウム(二塩基酸)(Na2HPO4)無水物(800mg/l)、D−グルコース(デキストロース)(2000mg/l)およびグルタチオン(還元型)(1mg/l)を含む。
一般に、本発明の目的においては、「水解物供給物」には、コムギおよび/またはダイズ水解物が含まれる。一般に、ダイズまたはコムギ水解物はダイズまたはコムギの酵素消化の産物であり、商業的に購入可能である。典型的には、該水解物は細胞培養等級の水中に存在し、無菌である。本発明の1つの実施形態においては、該水解物は200g/リットルにおけるストック溶液である。本発明の1つの実施形態においては、該水解物を、約10g/リットルの最終濃度に達するよう培地に加える。本発明の1つの実施形態において、レベル3方法または増強方法を用いる場合、最初に、または接種の前、途中もしくは後に、または接種の約3日後に、または生細胞密度が約1×106 細胞/ml以上に達したら、該水解物を該培地に加える。
「生細胞密度」は、生存可能な、例えば、増殖(成長)および複製可能な(例えば、液体培養または固体培地に接種するために使用される場合)または色素排除アッセイにおいて色素、例えばトリプタンブルー、エオシンまたはプロピジウミンを排除しうる、分析されている培地内の細胞の濃度(例えば、細胞/ml)を意味する。そのようなアッセイは当技術分野で広く知られている。
一般に、本発明の目的においては、「ビタミン/塩供給物」は以下のものを含む:
亜セレン酸ナトリウム:例えば、約7.13×10−4g/リットルの濃度
硫酸アデニン:例えば、約0.0816g/リットルの濃度
アデノシン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
シチジン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
グアノシン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
ウリジン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
ヒポキサンチン:例えば、約0.59g/リットルの濃度
L−シトルリン:例えば、約0.63g/リットルの濃度
L−オルニチン−HCl:例えば、約1.28g/リットルの濃度
ビオチン:例えば、約0.014g/リットルの濃度
フラビンアデニンジヌクレオチド:例えば、約0.0025g/リットルの濃度
葉酸:例えば、約0.23g/リットルの濃度
リポ酸:例えば、約0.026g/リットルの濃度
ナイアシン:例えば、約1.57g/リットルの濃度
ピリドキシンHCl:例えば、約0.15g/リットルの濃度
リボフラビン:例えば、約0.093g/リットルの濃度
チアミンHCl:例えば、約0.8g/リットルの濃度
ビタミンE:例えば、約0.0188g/リットルの濃度
ビタミンB12:例えば、約0.17g/リットルの濃度
塩化コリン:例えば、約2.51g/リットルの濃度
エタノールアミンHCl:例えば、約0.22g/リットルの濃度
i−イノシトール:例えば、約3.66g/リットルの濃度
チミジン:例えば、約0.39g/リットルの濃度
プトレッシン2HCl:例えば、約0.02g/リットルの濃度
プロゲステロン:例えば、約0.00075g/リットルの濃度、および
D−パントテン酸カルシウム:例えば、約1.19g/リットルの濃度。
亜セレン酸ナトリウム:例えば、約7.13×10−4g/リットルの濃度
硫酸アデニン:例えば、約0.0816g/リットルの濃度
アデノシン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
シチジン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
グアノシン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
ウリジン:例えば、約0.88g/リットルの濃度
ヒポキサンチン:例えば、約0.59g/リットルの濃度
L−シトルリン:例えば、約0.63g/リットルの濃度
L−オルニチン−HCl:例えば、約1.28g/リットルの濃度
ビオチン:例えば、約0.014g/リットルの濃度
フラビンアデニンジヌクレオチド:例えば、約0.0025g/リットルの濃度
葉酸:例えば、約0.23g/リットルの濃度
リポ酸:例えば、約0.026g/リットルの濃度
ナイアシン:例えば、約1.57g/リットルの濃度
ピリドキシンHCl:例えば、約0.15g/リットルの濃度
リボフラビン:例えば、約0.093g/リットルの濃度
チアミンHCl:例えば、約0.8g/リットルの濃度
ビタミンE:例えば、約0.0188g/リットルの濃度
ビタミンB12:例えば、約0.17g/リットルの濃度
塩化コリン:例えば、約2.51g/リットルの濃度
エタノールアミンHCl:例えば、約0.22g/リットルの濃度
i−イノシトール:例えば、約3.66g/リットルの濃度
チミジン:例えば、約0.39g/リットルの濃度
プトレッシン2HCl:例えば、約0.02g/リットルの濃度
プロゲステロン:例えば、約0.00075g/リットルの濃度、および
D−パントテン酸カルシウム:例えば、約1.19g/リットルの濃度。
本発明の1つの実施形態においては、該ビタミン/塩供給物は50×ストック溶液である。本発明の1つの実施形態においては、該ビタミン/塩供給物を、約20ml/リットルの最終濃度に達するように該培地に加える。レベル3方法を用いる場合には、第3〜5日、接種後または生細胞密度が約1×106 細胞/ml以上に達した際に該ビタミン/塩供給物を該培養に加える。本発明の1つの実施形態において、増強方法を用いる場合には、第3〜5日、接種後または生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達した際に該ビタミン/塩供給物を該培養に加える。
一般に、本発明の目的においては、「アミノ酸供給物」は以下のものを含む:
L−アルギニン:例えば、約6.32g/リットルの濃度
L−シスチン:例えば、約1.7g/リットルの濃度
L−ヒスチジン:例えば、約2.1g/リットルの濃度
L−イソロイシン:例えば、約2.6g/リットルの濃度
L−ロイシン:例えば、約2.6g/リットルの濃度
L−リシン:例えば、約3.6g/リットルの濃度
L−メチオニン:例えば、約0.76g/リットルの濃度
L−フェニルアラニン:例えば、約1.65g/リットルの濃度
L−トレオニン:例えば、約2.38g/リットルの濃度
L−トリプトファン:例えば、約0.51g/リットルの濃度
L−チロシン:例えば、約1.8g/リットルの濃度
L−バリン:例えば、約2.34g/リットルの濃度
L−アラニン:例えば、約0.89g/リットルの濃度
L−アスパラギン:例えば、約1.5g/リットルの濃度
L−アスパラギン酸:例えば、約1.33g/リットルの濃度
L−グルタミン酸:例えば、約1.47g/リットルの濃度
グリシン:例えば、約0.75g/リットルの濃度
L−プロリン:例えば、約1.15g/リットルの濃度、および
L−セリン:例えば、約1.05g/リットルの濃度。
L−アルギニン:例えば、約6.32g/リットルの濃度
L−シスチン:例えば、約1.7g/リットルの濃度
L−ヒスチジン:例えば、約2.1g/リットルの濃度
L−イソロイシン:例えば、約2.6g/リットルの濃度
L−ロイシン:例えば、約2.6g/リットルの濃度
L−リシン:例えば、約3.6g/リットルの濃度
L−メチオニン:例えば、約0.76g/リットルの濃度
L−フェニルアラニン:例えば、約1.65g/リットルの濃度
L−トレオニン:例えば、約2.38g/リットルの濃度
L−トリプトファン:例えば、約0.51g/リットルの濃度
L−チロシン:例えば、約1.8g/リットルの濃度
L−バリン:例えば、約2.34g/リットルの濃度
L−アラニン:例えば、約0.89g/リットルの濃度
L−アスパラギン:例えば、約1.5g/リットルの濃度
L−アスパラギン酸:例えば、約1.33g/リットルの濃度
L−グルタミン酸:例えば、約1.47g/リットルの濃度
グリシン:例えば、約0.75g/リットルの濃度
L−プロリン:例えば、約1.15g/リットルの濃度、および
L−セリン:例えば、約1.05g/リットルの濃度。
本発明の1つの実施形態においては、以下の2つの別々のアミノ酸供給ストック溶液を調製する:L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、グリシン、L−プロリンおよびL−セリンを前記の濃度で含む100×ストック溶液;ならびにL−アルギニン、L−シスチン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシンおよびL−バリンを前記の濃度で含む50×溶液。これらのストックは別々に調製され、別々に該培地に加えられうる。本発明の1つの実施形態においては、該アミノ酸ストック溶液を第0日、細胞接種の前、途中または後に該初期培地に加える。
一般に、本発明の目的においては、「栄養供給物」は以下のものを含む:
L−アスパラギン:例えば、約40.6g/リットルの濃度
L−プロリン:例えば、約10.81の濃度
L−イソロイシン:例えば、約18.53の濃度
L−システイン−HCl:例えば、約11.19の濃度
L−ロイシン:例えば、約16.58の濃度
L−トレオニン:例えば、約8.2の濃度
L−チロシン:例えば、約9.9の濃度
L−アルギニン:例えば、約9.29の濃度
L−アスパラギン酸:例えば、約3.56の濃度
L−グルタミン酸:例えば、約6.28の濃度
グリシン:例えば、約2.83の濃度
L−ヒスチジン:例えば、約6.23の濃度
L−メチオニン:例えば、約6.58の濃度
L−トリプトファン:例えば、約4.93の濃度
L−リシン:例えば、約14.66の濃度
L−フェニルアラニン:例えば、約8.64の濃度
L−バリン:例えば、約13.08g/リットルの濃度
L−セリン:例えば、約13g/リットルの濃度
リン酸ナトリウム(一塩基酸):例えば、約14.41g/リットルの濃度
硫酸亜鉛:例えば、約0.054g/リットルの濃度
硫酸第二銅:例えば、約0.00016g/リットルの濃度
バナジン酸アンモニウム:例えば、約0.000039g/リットルの濃度
塩化コバルト:例えば、約0.000125g/リットルの濃度
二塩化ニッケル六水和物:例えば、約0.00002g/リットルの濃度
モリブデン酸ナトリウム脱水物:例えば、約0.000008g/リットルの濃度
塩化スズ脱水物:例えば、約0.000004g/リットルの濃度
塩化マンガン四水和物:例えば、約0.000015g/リットルの濃度。
L−アスパラギン:例えば、約40.6g/リットルの濃度
L−プロリン:例えば、約10.81の濃度
L−イソロイシン:例えば、約18.53の濃度
L−システイン−HCl:例えば、約11.19の濃度
L−ロイシン:例えば、約16.58の濃度
L−トレオニン:例えば、約8.2の濃度
L−チロシン:例えば、約9.9の濃度
L−アルギニン:例えば、約9.29の濃度
L−アスパラギン酸:例えば、約3.56の濃度
L−グルタミン酸:例えば、約6.28の濃度
グリシン:例えば、約2.83の濃度
L−ヒスチジン:例えば、約6.23の濃度
L−メチオニン:例えば、約6.58の濃度
L−トリプトファン:例えば、約4.93の濃度
L−リシン:例えば、約14.66の濃度
L−フェニルアラニン:例えば、約8.64の濃度
L−バリン:例えば、約13.08g/リットルの濃度
L−セリン:例えば、約13g/リットルの濃度
リン酸ナトリウム(一塩基酸):例えば、約14.41g/リットルの濃度
硫酸亜鉛:例えば、約0.054g/リットルの濃度
硫酸第二銅:例えば、約0.00016g/リットルの濃度
バナジン酸アンモニウム:例えば、約0.000039g/リットルの濃度
塩化コバルト:例えば、約0.000125g/リットルの濃度
二塩化ニッケル六水和物:例えば、約0.00002g/リットルの濃度
モリブデン酸ナトリウム脱水物:例えば、約0.000008g/リットルの濃度
塩化スズ脱水物:例えば、約0.000004g/リットルの濃度
塩化マンガン四水和物:例えば、約0.000015g/リットルの濃度。
本発明の実施形態においては、該栄養供給物は50×ストック溶液である。本発明の1つの実施形態においては、該栄養供給物を、約20ml/リットルの最終濃度に達するように該培地に加える。増強方法を用いる場合には、該栄養供給物を、第3〜5日、接種後または生細胞密度が約約1.2×106 細胞/mlに達した際に該培地に加える。
さらに、本発明の1つの実施形態において、レベル3方法または増強方法を用いる場合には、グルコース(2.5M ストック溶液からのもの)およびL−グルタミン(0.2M ストック溶液からのもの)を、任意の時点、例えば、該栄養物の濃度が1.5g/リットル グルコースおよび150mg/リットル L−グルタミン未満に低下した際に該培地に加える。
浸透圧重量モル濃度および温度変化
本発明はまた、場合によっては該培養の浸透圧重量モル濃度および/または温度を変化させる、方法を含む。該浸透圧重量モル濃度または温度変化は製造過程中の任意の時点で行われうる。
本発明はまた、場合によっては該培養の浸透圧重量モル濃度および/または温度を変化させる、方法を含む。該浸透圧重量モル濃度または温度変化は製造過程中の任意の時点で行われうる。
該浸透圧重量モル濃度変化は培養比生産性および細胞生存性を増加させることが示されている。典型的には、該初期哺乳類細胞増殖培地は約300mOsmの出発浸透圧重量モル濃度を有する。しかし、本発明の「浸透圧重量モル濃度変化」は、培養の浸透圧重量モル濃度を約400mOsMから約500mOsmへと変化させることを含む。
浸透圧重量モル濃度は溶媒1キログラム当たりの溶質のオスモルの尺度である。浸透圧重量モル濃度は、例えば凝固点降下、蒸気圧または沸点上昇のような束一性を測定する浸透圧計を使用して測定されうる。
細胞培養の浸透圧重量モル濃度は幾つかの手段のいずれかにより変化されうる。例えば、濃縮塩溶液(例えば、8〜12mL/Lで加えられる5M NaCl塩ストックを含む)、ダイズ水解物溶液(50〜80mL/Lで加えられる200g/L ストック)または二酸化炭素が加えられうる。本発明の1つの実施形態においては、該培地への該栄養供給物の添加は該浸透圧重量モル濃度を変化させる。
本発明の1つの実施形態においては、該培養の温度は、場合によっては、例えば段階変化において、約36.5℃(+0.5℃)から約33℃〜35℃へ変化される。
タンパク質
本発明は、タンパク質、例えば免疫グロブリン鎖の組換え製造方法を含む実施形態を含む。本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、抗IGF1R抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体)、あるいはその抗原結合性フラグメント、例えば、免疫グロブリン定常領域に場合によっては連結された免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖可変領域を含む。
本発明は、タンパク質、例えば免疫グロブリン鎖の組換え製造方法を含む実施形態を含む。本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、抗IGF1R抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体)、あるいはその抗原結合性フラグメント、例えば、免疫グロブリン定常領域に場合によっては連結された免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖可変領域を含む。
例えば、本発明は、発現されるタンパク質(例えば、抗IGF1R抗体軽鎖または重鎖免疫グロブリン)がプラスミドベクターにおいてポリヌクレオチドによりコードされている、例えば、ここで、該ポリヌクレオチドがプロモーター、例えばCMVプロモーターに機能的に連結されている、方法を含む。本発明の1つの実施形態においては、該軽鎖および重鎖は単一のプラスミドベクター内に含まれる。
本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリン鎖は、後記のもののいずれか、例えば、以下の免疫グロブリン軽鎖および/もしくは重鎖のいずれか、ならびに/またはそれらのCDR(例えば、単一の軽鎖または重鎖からの全3個)のいずれかをコードしている。点線下線付きの記号はシグナルペプチドをコードしている。実線下線付きの記号はCDRをコードしている。無修飾記号はフレームワーク領域をコードしている。本発明の1つの実施形態においては、該鎖は該シグナルペプチドと共に発現され、それは該宿主細胞からの分泌に際して切断されて該鎖の成熟フラグメントが産生される。
以下の標的免疫グロブリンアミノ酸配列またはその成熟フラグメントのいずれを製造するための組成物および方法も本発明の一部を構成する。
国際出願公開第WO2003/100008(その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)を参照されたい。
本発明の実施形態は、本明細書に記載されているもの(例えば、重鎖Ig.#1.0および軽鎖Ig#1.0;LCCおよびHCA;またはLCFおよびHCA;またはLCCおよびHCB)のいずれかと共に該免疫グロブリンを発現させる実施形態を含む。軽鎖と重鎖とのペア形成は抗体またはその抗原結合性フラグメントの生成をもたらしうる。
本発明の1つの実施形態においては、該軽鎖は免疫グロブリン定常鎖、例えばカッパ鎖に融合されている。本発明の1つの実施形態においては、該重鎖は免疫グロブリン定常鎖、例えばガンマ−1、ガンマ−2、ガンマ−3またはガンマ−4鎖に融合されている。
本発明の方法および組成物を用いて発現されうる関心のある他のタンパク質には、受容体、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモンおよび酵素が含まれる。
製造方法および材料
本発明の方法により発現されるべき遺伝子を含む例えばプラスミドのようなベクターは、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。形質転換は、例えば、GrahamおよびVan der Eb,Virology,52:546(1978)に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。DNAを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびDEAE−デキストラン形質転換も含まれる。
本発明の方法により発現されるべき遺伝子を含む例えばプラスミドのようなベクターは、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。形質転換は、例えば、GrahamおよびVan der Eb,Virology,52:546(1978)に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。DNAを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびDEAE−デキストラン形質転換も含まれる。
本発明の1つの実施形態においては、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)である。CHO−K1細胞はプロリン要求性であり、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子に関して二倍体である。本発明の1つの実施形態においては、該細胞系はDXB11 CHO細胞系(Urlaubら (1983)Cell 33:405−412)である。他の細胞系には、例えばHEK293が含まれる。
本発明の方法を用いて発現されるべき遺伝子を含む宿主細胞は、標的遺伝子の発現のための必要な特性を有するクローンを特定するために選択されスクリーニングされうる。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞においては、最大発現を達成するための1つの一般的なアプローチは、突然変異細胞系の使用、およびコトランスフェクトされた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)に関する数ヶ月にわたる選択圧の漸増の利用を含む(Kaufmanら(1982)J.Mol.Biol.159:601−621;Schimkeら(1982)Natl.Cancer Inst.Monogr.60:79−86)。高い生産率を達成するためには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)陰性細胞系(例えば、CHO細胞系)(Urlaubら(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220)を、発現されるべき標的遺伝子と共に機能性DHFR遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換する。該ベクター挿入標的遺伝子の増幅は該培地への漸増量のDHFRアンタゴニスト メトトレキセート(MTX)の添加に応答して生じ、該組換え遺伝子の複数のコピーを含有するクローンまたは亜集団が生じ、選択されうる(Wurm(1990)Biologicals 18:159−164)。該遺伝子増幅方法は、典型的には、高い標的遺伝子コピー数および所望のタンパク質の高い生産率を示す安定細胞系が得られるまでに数ヶ月を要する。
本発明の1つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞(例えば、CHO、CHO−K1、CHO DXB11)染色体DNA内に組込まれるか、または異所的および自律的に複製される。本発明の1つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは1細胞当たり数コピー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20コピー)で細胞内に存在する。安定性を改善するために発現ベクターが宿主細胞のゲノムDNA内に組込まれている場合、該ベクターDNAのコピー数、ひいては、発現されうる産物の量は、該宿主細胞のDNA内への組込みの後で該ベクター配列が増幅された細胞系に関して選択することにより増加されうる。組込まれた遺伝子は、染色体に組込まれたDNAならびに対応mRNAおよびポリペプチド合成の存在および相対量に関して、標準的な方法によりスクリーニングされうる。例えば、所望の組込み体の存在は、標準的な方法、例えばDNA配列決定、サザンブロット法、ノーザンブロット法および/またはウエスタンブロット法により検出されうる。
当技術分野で公知の幾つかの細胞培養培地のいずれもが、標的遺伝子を発現する細胞を増殖させるために使用されうる。幾つかの商業的に入手可能な培地が利用可能である。治療用に使用されるタンパク質を発現させる場合には、動物産物非含有培地(例えば、無血清培地(SFM))が望ましいかもしれない。無血清培地内での増殖に細胞を適応させることが可能な幾つかの方法が当技術分野で公知である。例えば、直接適応は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと単に移すことを含む。逐次適応またはウィーニング(weaning)は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと幾つかの段階(例えば、25% SFM、50% SFM、75% SFM、ついで90% SFM(約3継代)、ついで100% SFM)で移すことを含む。逐次適応は、細胞に対する過酷さが直接適応より低い傾向にある。一般に、細胞を無血清培地に適応させるためには、該培養は中期対数期にあるべきであり、90%を超える生存率を示すべきであり、直接適応の場合より高い初期細胞接種物数で接種されるべきである。本発明の1つの実施形態においては、該初期哺乳類細胞増殖培地は、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO)から商業的に入手可能であるEX−CELL ACF CHO培地である。この培養は動物成分を含有せず、HEPES(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸)を含有し、L−グルタミンを含有せず、液体であり、滅菌濾過されており、細胞培養が試験されている。該培地はまた、無機塩、炭酸水素ナトリウムバッファー、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、組換えヒトインスリン、植物水解物、他の有機化合物、微量元素および界面活性剤をも含む。該培地はまた、抗生物質、抗真菌物質またはトランスフェリンのいずれをも含有せず、また、動物由来タンパク質も他の成分も含有しない。典型的には、該培地の還元(再構成)のために、実施者は、使用前に、培地1リットル当たり20〜40mlの200mM L−グルタミン溶液を無菌的に加えるべきである。
本発明の方法を用いて発現されるべき遺伝子を含む宿主細胞を含有する細胞系はマスター細胞バンク(MCB)および/または実施用細胞バンク(WCB)中で保存されうる。典型的には、細胞系が多数の製造サイクルにわたって使用される場合には、マスター細胞バンクまたはマスターシードバンク(MSB)と実施細胞バンクとからなる2段式細胞保存系が確立されうる。細胞系は単一宿主細胞クローンから樹立され、この細胞系は、MCBを形成するために使用される。一般に、このMCBは、汚染物、例えば細菌、真菌、ウイルスおよびマイコプラズマに関して特徴づけられ、徹底的に試験されなければならない。MCBからの細胞のサンプルは、WCBを形成するために増殖されることが可能であり、これは、製造方法において使用される前に細胞生存性に関して特徴づけられる。MCBまたはWCBにおける細胞はバイアル内で、例えば低温(例えば0℃以下、−20℃または−80℃)で保存されうる。
典型的には、該実施用細胞バンクは、保存前に数継代にわたって増殖された、該マスターバンクのバイアルの1つからの細胞を含む。一般に、将来の細胞が必要な場合には、それらは該実施細胞バンクから採取され、一方、該マスター細胞バンクは、必要な場合だけ使用され、該細胞培養内の遺伝的変異を回避するために、低い継代数を有する細胞のストックが確保される。
本発明は、細胞を増殖させタンパク質を組換え製造するための2つの方法、すなわち、「レベル3」方法および「増強方法」を提供する。どちらの方法も高レベルの対象タンパク質を産生するが、増強方法は特に高いレベルをもたらす。
本発明の1つの実施形態においては、タンパク質、例えば抗体(例えば抗IGF1R)を製造するためのレベル3方法は以下の工程を含む。
1−標準的な初期哺乳類増殖培地(例えば、L−グルタミン(4mM)が添加されたSigma CHO培地)内で、該タンパク質を発現する細胞を増殖させる。
この増殖は、例えば、振とうフラスコ内で行われうる。本発明の1つの実施形態においては、約1〜2×106 細胞/mlへの増殖、それらの細胞のサンプルの希釈(例えば、約2.5〜5×105 細胞/mlの密度へ)、およびそれに続く約10〜30継代にわたる約1〜2×106 細胞/mlへの再増殖により増殖を行う。
2−工程(1)からの増殖細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、該培地に補足物を加える。該補足物はコムギおよび/またはダイズ水解物、アミノ酸供給物、ビタミン/塩供給物、グルコースならびにL−グルタミンである。
接種の日が「第0日」、次の日が「第1日」、次の日が「第2日」、以下同様である。
ダイズまたはコムギ水解物は、例えば、第0日または生細胞密度が約106 細胞/ml以上に達した後で加えられる。本発明の1つの実施形態においては、該水解物は、生細胞密度が典型的には106 細胞/mlに達する第3日に単に加えられる。
アミノ酸供給物(前記)は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度(例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない)に達するように、例えば第0日に加えられる。
成分:培養内の最終濃度(mg/リットル)
L−アルギニン:126.4
L−シスチン:34
L−ヒスチジン:42
L−イソロイシン:52
L−ロイシン:52
L−リシン:72
L−メチオニン:15.2
L−フェニルアラニン:33
L−トレオニン:47.6
L−トリプトファン:10.2
L−チロシン:36
L−バリン:46.8
L−アラニン:8.9
L−アスパラギン:30
L−アスパラギン酸:26.6
L−グルタミン酸:29.4
グリシン:15
L−プロリン:23
L−セリン:21。
L−アルギニン:126.4
L−シスチン:34
L−ヒスチジン:42
L−イソロイシン:52
L−ロイシン:52
L−リシン:72
L−メチオニン:15.2
L−フェニルアラニン:33
L−トレオニン:47.6
L−トリプトファン:10.2
L−チロシン:36
L−バリン:46.8
L−アラニン:8.9
L−アスパラギン:30
L−アスパラギン酸:26.6
L−グルタミン酸:29.4
グリシン:15
L−プロリン:23
L−セリン:21。
本発明の1つの実施形態においては、アミノ酸供給物を該培地に加えない。
ビタミン/塩供給物溶液(前記)は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度(例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない)に達するように、例えば、第3日〜第5日または生細胞密度が約106 細胞/mlに達する際に加えられる。
成分:最終培養濃度(mg/リットル)
亜セレン酸ナトリウム:0.01426
硫酸アデニン:1.632
アデノシン:17.6
シチジン:17.6
グアノシン:17.6
ウリジン:17.6
ヒポキサンチン:11.8
L−シトルリン:12.6
L−オルニチン−HCl:25.6
ビオチン:0.28
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05
葉酸:4.6
リポ酸:0.52
ナイアシン:31.4
ピリドキシンHCl:3
リボフラビン:1.86
チアミンHCl:16
ビタミンE:0.376
ビタミンB12:3.4
塩化コリン:50.2
エタノールアミンHCl:4.4
i−イノシトール:73.2
チミジン:7.8
プトレッシン2HCl:0.4
プロゲステロン:0.015
D−パントテン酸カルシウム:23.8。
亜セレン酸ナトリウム:0.01426
硫酸アデニン:1.632
アデノシン:17.6
シチジン:17.6
グアノシン:17.6
ウリジン:17.6
ヒポキサンチン:11.8
L−シトルリン:12.6
L−オルニチン−HCl:25.6
ビオチン:0.28
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05
葉酸:4.6
リポ酸:0.52
ナイアシン:31.4
ピリドキシンHCl:3
リボフラビン:1.86
チアミンHCl:16
ビタミンE:0.376
ビタミンB12:3.4
塩化コリン:50.2
エタノールアミンHCl:4.4
i−イノシトール:73.2
チミジン:7.8
プトレッシン2HCl:0.4
プロゲステロン:0.015
D−パントテン酸カルシウム:23.8。
グルコースは、例えば、該培地内のグルコース濃度が約1.5g/リットル未満に低下した際に加えられ、L−グルタミンは、例えば、該培地内のグルタミン濃度が約150mg/リットル未満に低下した際に加えられる。
3−場合によっては、例えば生存率が60%未満である場合に、該培地から該細胞を取り出すことにより(例えば、該細胞の温度を約15℃に低下させ、リン酸ナトリウムバッファーを加えてpHを約6.8に安定化させ、該培地を遠心分離してそれを細胞から除去することにより)、該製造細胞培養培地から該細胞を回収する。該タンパク質が分泌される場合には、該培地が更なる加工のために保持されることが可能であり、該タンパク質が分泌されない場合には、該細胞が更なる加工のために保持されることが可能である。
該培地から該細胞を除去する(取り出す)ためには、幾つかの方法のいずれか、例えば遠心分離が用いられうる。例えば、連続的ディスクスタック(disk−stack)遠心機、例えば、約9.27×10−7の流量/シグマ(cm/秒)を有するものが使用される。
さらに、該培地は、細胞を除去するために、例えば、遠心機を使用する又は使用しないデプス濾過により濾過されうる。例えば、遠心機を使用する場合には、本発明の1つの実施形態においては、該方法は8±2Lブロス/ft2のフィルター(例えば、荷電セルロースフィルター)の使用を含むことが可能であり、遠心機を使用しない場合には、本発明の1つの実施形態においては、該方法は20±3Lブロス/ft2のフィルターの使用を含むことが可能である。
また、該培地は、微細フィルター、例えば0.2ミクロンの細孔径を有するフィルター(例えば、PVDFフィルター)により濾過されうる。
4−場合によっては、該タンパク質、例えば抗体を、例えばクロマトグラフィーにより更に精製する。
本発明の1つの実施形態においては、タンパク質、例えば抗体(例えば抗IGF1R)を製造するための増強方法は以下の工程を含む。
1−標準的な初期哺乳類増殖培地内で、該タンパク質を発現する細胞を増殖させる。
この増殖は、例えば、振とうフラスコ内で行われうる。本発明の1つの実施形態においては、約1〜2×106 細胞/mlへの増殖、それらの細胞のサンプルの希釈(例えば、約2.5〜5×105 細胞/mlの密度へ)、およびそれに続く約10〜30サイクルにわたる約1〜2×106 細胞/mlへの再増殖により増殖を行う。
2−該増殖細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、該培地に補足物を加える。該補足物はダイズおよび/またはコムギ水解物、アミノ酸供給物、ビタミン/塩供給物、栄養物供給物、グルコースならびにL−グルタミンである。
接種の日が「第0日」、次の日が「第1日」、次の日が「第2日」、以下同様である。
ダイズおよび/またはコムギ水解物は、例えば、第0日または生細胞密度が約106 細胞/ml以上に達した後で加えられる。本発明の1つの実施形態においては、該水解物は第3日に単に加えられる。
アミノ酸供給物(前記)は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度(例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない)に達するように、例えば第0日に加えられる。
成分:培養内の最終濃度(mg/リットル)
L−アルギニン:126.4
L−シスチン:34
L−ヒスチジン:42
L−イソロイシン:52
L−ロイシン:52
L−リシン:72
L−メチオニン:15.2
L−フェニルアラニン:33
L−トレオニン:47.6
L−トリプトファン:10.2
L−チロシン:36
L−バリン:46.8
L−アラニン:8.9
L−アスパラギン:30
L−アスパラギン酸:26.6
L−グルタミン酸:29.4
グリシン:15
L−プロリン:23
L−セリン:21。
L−アルギニン:126.4
L−シスチン:34
L−ヒスチジン:42
L−イソロイシン:52
L−ロイシン:52
L−リシン:72
L−メチオニン:15.2
L−フェニルアラニン:33
L−トレオニン:47.6
L−トリプトファン:10.2
L−チロシン:36
L−バリン:46.8
L−アラニン:8.9
L−アスパラギン:30
L−アスパラギン酸:26.6
L−グルタミン酸:29.4
グリシン:15
L−プロリン:23
L−セリン:21。
本発明の1つの実施形態においては、アミノ酸供給物を該培地に加えない。
ビタミン/塩供給物溶液(前記)は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度(例えば初期哺乳類細胞増殖培地のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない)に達するように、例えば、第3日〜第5日または生細胞密度が約1.2×106 細胞/mlに達する際に加えられる。
成分:最終培養濃度(mg/リットル)
亜セレン酸ナトリウム:0.01426
硫酸アデニン:1.632
アデノシン:17.6
シチジン:17.6
グアノシン:17.6
ウリジン:17.6
ヒポキサンチン:11.8
L−シトルリン:12.6
L−オルニチン−HCl:25.6
ビオチン:0.28
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05
葉酸:4.6
リポ酸:0.52
ナイアシン:31.4
ピリドキシンHCl:3
リボフラビン:1.86
チアミンHCl:16
ビタミンE:0.376
ビタミンB12:3.4
塩化コリン:50.2
エタノールアミンHCl:4.4
i−イノシトール:73.2
チミジン:7.8
プトレッシン2HCl:0.4
プロゲステロン:0.015
D−パントテン酸カルシウム:23.8。
亜セレン酸ナトリウム:0.01426
硫酸アデニン:1.632
アデノシン:17.6
シチジン:17.6
グアノシン:17.6
ウリジン:17.6
ヒポキサンチン:11.8
L−シトルリン:12.6
L−オルニチン−HCl:25.6
ビオチン:0.28
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05
葉酸:4.6
リポ酸:0.52
ナイアシン:31.4
ピリドキシンHCl:3
リボフラビン:1.86
チアミンHCl:16
ビタミンE:0.376
ビタミンB12:3.4
塩化コリン:50.2
エタノールアミンHCl:4.4
i−イノシトール:73.2
チミジン:7.8
プトレッシン2HCl:0.4
プロゲステロン:0.015
D−パントテン酸カルシウム:23.8。
該ビタミン/塩供給物の幾つかの成分は、他の供給物、例えば該アミノ酸供給物中にも存在する。これらの最終培養濃度は該ビタミン/塩供給物からの成分のものであり、該アミノ酸供給物と該ビタミン/塩供給物との両方からの示されている成分の累積濃度を示すものではない。
栄養供給物(前記)は、例えば、以下に示すおおよその最終培養濃度(例えば初期哺乳類細胞増殖培地またはアミノ酸供給物のような他の起源からの示されているいずれの成分の濃度をも含まない)に達するように、例えば、第3日〜第5日または生細胞密度が約1.2×106 細胞/mlに達する際に加えられる。
成分:最終培養濃度(mg/リットル)
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル
塩化スズ脱水物:0.00008mg/リットル
塩化マグネシウム四水和物:0.0003mg/リットル。
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル
塩化スズ脱水物:0.00008mg/リットル
塩化マグネシウム四水和物:0.0003mg/リットル。
該栄養供給物の幾つかの成分は、他の供給物、例えば該アミノ酸供給物中にも存在する。これらの最終培養濃度は該栄養供給物からの成分のものであり、該アミノ酸供給物と該栄養供給物との両方からの示されている成分の累積濃度を示すものではない。
グルコースは、例えば、該培地内のグルコース濃度が約1.5g/リットル未満に低下した際に加えられ、L−グルタミンは、例えば、該培地内のグルタミン濃度が約150mg/リットル未満に低下した際に加えられる。
3−場合によっては、例えば生存率が60%未満である場合に、該培地から該細胞を取り出すことにより(例えば、該細胞の温度を約15℃に低下させ、リン酸ナトリウムバッファーを加えてpHを約6.8に安定化させ、該培地を遠心分離してそれを細胞から除去することにより)、該製造細胞培養培地から該細胞を回収する。該タンパク質が分泌される場合には、該培地が更なる加工のために保持されることが可能であり、該タンパク質が分泌されない場合には、該細胞が更なる加工のために保持されることが可能である。
該培地から該細胞を除去する(取り出す)ためには、幾つかの方法のいずれか、例えば遠心分離が用いられうる。例えば、連続的ディスクスタック(disk−stack)遠心機、例えば、約9.27×10−7の流量/シグマ(cm/秒)を有するものが使用される。
さらに、該培地は、細胞を除去するために、例えば、遠心機を使用する又は使用しないデプス濾過により濾過されうる。例えば、遠心機を使用する場合には、本発明の1つの実施形態においては、該方法は8±2Lブロス/ft2のフィルター(例えば、荷電セルロースフィルター)の使用を含むことが可能であり、遠心機を使用しない場合には、本発明の1つの実施形態においては、該方法は20±3Lブロス/ft2のフィルターの使用を含むことが可能である。
また、該培地は、微細フィルター、例えば0.2ミクロンの細孔径を有するフィルター(例えば、PVDFフィルター)により濾過されうる。
4−場合によっては、該タンパク質、例えば抗体を、例えばクロマトグラフィーにより更に精製する。
場合によっては、レベル3方法または増強方法のいずれかを用いる場合、該培養の浸透圧重量モル濃度を約400mOsmから約500mOsmに変化させる(前記)。本発明の1つの実施形態においては、この変化は、該細胞が1×106 細胞/ml以上の密度である場合に生じる。
場合によっては、レベル3方法または増強方法のいずれかを用いる場合、該培養の温度を33℃から約35℃に変化させる(前記)。本発明の1つの実施形態においては、この変化は、本発明の1つの実施形態においては、第4日〜第8日、例えば、24時間にわたる生細胞密度における変化が10%未満である場合に生じる。
本発明の1つの実施形態においては、レベル3方法または増強方法のいずれかを用いる場合、細胞増殖中に細胞培養O2濃度、pHおよび温度条件を連続的にモニターし、調節する。本発明の1つの実施形態においては、細胞増殖中にO2濃度をモニターし、約60%に維持し、および/または細胞増殖中にpHを連続的にモニターし、約6.8(例えば、±0.02)に維持し、および/または細胞増殖中に温度を連続的にモニターし、約36.5℃(例えば、約±0.5℃)に維持する。
細胞増殖は幾つかの系のいずれかにおいて行われうる。例えば、細胞増殖は、単純なフラスコ、例えばガラス振とうフラスコ内で行われうる。他の系には、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターおよび使い捨てバイオリアクターが含まれる。タンクバイオリアクターは、典型的には、細胞を液体培地内で増殖させる金属容器(例えば、ステンレス鋼ジャケット付き容器)を含む。タンクバイオリアクターは広範な培養体積(例えば、100L、150L、10000L、15000L)で使用されうる。タンクバイオリアクターは、しばしば、温度制御、培地攪拌、スパージガス濃度の制御、pHの制御、O2濃度の制御、培地からのサンプルの除去、リアクター重量表示および制御、ハードウェアの清掃、ハードウェアの滅菌、全供給を送るための配管またはチューブ配置、培地の添加、pHの制御、溶液の制御および気体の制御、増殖溶液内への無菌流体の送出し、ならびに管理上の制御およびデータ収集のための手段を含む、細胞増殖条件を制御するための追加的な特徴を有する。タンクバイオリアクターの分類は、熱および材料(例えば、酸素および基質)を分配するためにリアクターを混合するために機械的攪拌装置(例えば、羽根車)が使用される攪拌タンクリアクターを含む。バブルカラムリアクターは、内容物を混合するために空気のみを使用する背の高いリアクターである。エアリフトリアクターはバブルカラムリアクターに似ているが、それがドラフトチューブを含有する点で異なる。該ドラフトチューブは、典型的には、循環および酸素移動を改善し該リアクター内のせん断力を均等化する内部チューブである。流動床リアクターにおいては、細胞は、流体と共に移動する小粒子上に「固定化」される。該小粒子は、細胞が付着するための並びに該細胞への酸素および栄養物の高率の移動を可能にする大きな表面積をもたらす。充填床リアクターにおいては、細胞は大粒子上に固定化される。これらの粒子は液体と共には移動しない。充填床リアクターは、構築および運転が簡単であるが、閉塞および酸素移動不良を被りうる。使い捨てバイオリアクターは、使い捨て可能な1回使用のためのバイオリアクターである。しばしば、使い捨てバイオリアクターは、非使い捨てバイオリアクターに類似した特徴(例えば、攪拌系、スパージ、プローブ、出入口など)を有する。
本発明は更に、本明細書に記載の製造方法のいずれかにより製造された任意の液体培地を含む。例えば、約37℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地(該培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない)に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するCHO DXB11宿主細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物:
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持する(例えば、ここで、該培地は、生存率60%に達した細胞を含む)ことを含む製造方法により製造された液体培地が含まれる。
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達する場合には補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、細胞増殖中、グルコースレベルが約1.5g/リットル未満に低下した場合には該培地にグルコースを加え、L−グルタミンレベルが約150mg/リットル未満に低下した場合にはL−グルタミンを加え、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持する(例えば、ここで、該培地は、生存率60%に達した細胞を含む)ことを含む製造方法により製造された液体培地が含まれる。
実施例
以下の情報は、本発明をより明瞭に説明するために記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下に記載する組成物および方法の全ては全体的または部分的に本発明の範囲内に含まれる。
以下の情報は、本発明をより明瞭に説明するために記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下に記載する組成物および方法の全ては全体的または部分的に本発明の範囲内に含まれる。
レベル3方法および増強方法を用いる抗IGF1Rの発現
増強方法およびレベル3方法を用いる幾つかの実施を行った。これらの実施においては、抗IGF1R LCF(カッパ)およびHCA(ガンマ−1)鎖を発現するCHO DXB11細胞を増殖させた。補足物を添加した初期哺乳類細胞増殖培地はEX−CELL ACF CHO培地(Sigma−Aldrich;St.Louis,MO)であった。
増強方法およびレベル3方法を用いる幾つかの実施を行った。これらの実施においては、抗IGF1R LCF(カッパ)およびHCA(ガンマ−1)鎖を発現するCHO DXB11細胞を増殖させた。補足物を添加した初期哺乳類細胞増殖培地はEX−CELL ACF CHO培地(Sigma−Aldrich;St.Louis,MO)であった。
供給物の添加を行わない(製造過程中のグルタミンおよびグルコース以外)類似した一連の実施を行った。これらの条件下、435mg/Lの力価が得られた。この力価は、プロテインAに特異的に付着した産生免疫グロブリンを定量することにより推定された。以下のレベル3方法および増強方法の実施において得られた力価は、逆相クロマトグラフィー基質に付着した免疫グロブリンを定量することにより推定された。逆相法の定量を用いた場合の供給物の添加を伴わない実施においては約300mg/Lの推定力価が得られたであろう。
供給物の添加を行わない実施において得られる力価と比較して、レベル3方法および増強方法(後記)は遥かに優れた力価を与える。
グルコースを、例えば、該培養内のグルコース濃度が1.5g/リットル未満に低下した場合に加え、L−グルタミンを、例えば、該培養内のグルタミン濃度が150mg/リットル未満に低下した場合に加えた。浸透圧重量モル濃度を該栄養供給物の添加により400mOsm以上に変化させた。該細胞を第21〜24日に回収した。ただし、バッチ3および4に関しては、それより早く(第14〜18日)細胞を回収し、一般には、細胞生存率が約60%に低下した際に細胞を回収した。
該増強方法において該栄養供給物が使用される場合には、アミノ酸供給物の添加は省略されうる。
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載されている実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態を含み、本明細書に具体的に記載されている実施形態は必ずしも包括的なものではない。本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
本出願の全体にわたり特許、特許出願、刊行物、産物説明およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
Claims (38)
- タンパク質を発現する宿主細胞を初期哺乳類細胞増殖培地に接種し、
グルコース;
L−グルタミン;
ダイズ水解物またはコムギ水解物またはそれらの両方;
硫酸アデニン;
アデノシン;
バナジン酸アンモニウム;
ビオチン;
塩化コリン;
塩化コバルト;
硫酸第二銅;
シチジン;
D−パントテン酸カルシウム;
エタノールアミンHCl;
フラビンアデニンジヌクレオチド;
葉酸;
グリシン;
グアノシン;
ヒポキサンチン;
i−イノシトール;
L−アラニン;
L−アルギニン;
L−アスパラギン;
L−アスパラギン酸;
L−シトルリン;
L−システイン−HCl;
L−シスチン;
L−グルタミン酸;
L−ヒスチジン;
リポ酸;
L−イソロイシン;
L−ロイシン;
L−リシン;
L−メチオニン;
L−オルニチン−HCl;
L−フェニルアラニン;
L−プロリン;
L−セリン;
L−トレオニン;
L−トリプトファン;
L−チロシン;
L−バリン;
塩化マンガン四水和物;
ナイアシン;
二塩化ニッケル六水和物;
プロゲステロン;
プトレッシン2HCl;
ピリドキシンHCl;
リボフラビン;
モリブデン酸ナトリウム脱水物;
リン酸ナトリウム(一塩基酸);
亜セレン酸ナトリウム;
チアミンHCl;
チミジン;
塩化スズ脱水物;
ウリジン;
ビタミンB12;
ビタミンE;および
硫酸亜鉛
を含む補足物を該培地に加えることを含む、該タンパク質の製造方法。 - 該補足物から該培地に加えられる成分の最終濃度が、おおよそ以下に記載されているもの:
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
グリシン:72mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アルギニン:312.4mg/リットル
L−アスパラギン:842mg/リットル
L−アスパラギン酸:97.6mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−グルタミン酸:155.4mg/リットル
L−ヒスチジン:167mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
L−イソロイシン:422mg/リットル
L−ロイシン:384mg/リットル
L−リシン:365mg/リットル
L−メチオニン:147.2mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
L−フェニルアラニン:207mg/リットル
L−プロリン:239mg/リットル
L−セリン:281mg/リットル
L−トレオニン:211.6mg/リットル
L−トリプトファン:109.2mg/リットル
L−チロシン:234mg/リットル
L−バリン:308.8mg/リットル
塩化マグネシウム四水和物:0.0003mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
塩化スズ脱水物:0.00008mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
グルコース:1.5g/リットル
L−グルタミン:150mg/リットル
である、請求項1記載の製造方法。 - おおよそ以下の濃度のアミノ酸:
L−アルギニン:6.32g/リットル
L−シスチン:1.7g/リットル
L−ヒスチジン:2.1g/リットル
L−イソロイシン:2.6g/リットル
L−ロイシン:2.6g/リットル
L−リシン:3.6g/リットル
L−メチオニン:0.76g/リットル
L−フェニルアラニン:1.65g/リットル
L−トレオニン:2.38g/リットル
L−トリプトファン:0.51g/リットル
L−チロシン:1.8g/リットル
L−バリン:2.34g/リットル
を含むアミノ酸供給物から該補足物を加える、請求項1記載の製造方法。 - 培地1リットル当たり約20mlのアミノ酸供給物を加える、請求項3記載の製造方法。
- おおよそ以下の濃度のアミノ酸:
L−アラニン:0.89g/リットル
L−アスパラギン:1.5g/リットル
L−アスパラギン酸:1.33g/リットル
L−グルタミン酸:1.47g/リットル
グリシン:0.75g/リットル
L−プロリン:1.15g/リットル
L−セリン:1.05g/リットル
を含むアミノ酸供給物から該補足物を加える、請求項1記載の製造方法。 - 培地1リットル当たり約10mlのアミノ酸供給物を加える、請求項5記載の製造方法。
- おおよそ以下の濃度の補足物:
L−アスパラギン:40.6g/リットル
L−プロリン:10.81g/リットル
L−イソロイシン:18.53g/リットル
L−システイン−HCl:11.19g/リットル
L−ロイシン:16.58g/リットル
L−トレオニン:8.2g/リットル
L−チロシン:9.9g/リットル
L−アルギニン:9.29g/リットル
L−アスパラギン酸:3.56g/リットル
L−グルタミン酸:6.28g/リットル
グリシン:2.83g/リットル
L−ヒスチジン:6.23g/リットル
L−メチオニン:6.58g/リットル
L−トリプトファン:4.93g/リットル
L−リシン:14.66g/リットル
L−フェニルアラニン:8.64g/リットル
L−バリン:13.08g/リットル
L−セリン:13g/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):14.41g/リットル
硫酸亜鉛:0.054g/リットル
硫酸第二銅:0.00016g/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.000039g/リットル
塩化コバルト:0.000125g/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.00002g/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.000008g/リットル
塩化スズ脱水物:0.000004g/リットル
塩化マンガン四水和物:0.000015g/リットル
を含む栄養供給物から該補足物を加える、請求項1記載の製造方法。 - 培地1リットル当たり約20mlの栄養供給物を加える、請求項7記載の製造方法。
- おおよそ以下の濃度の補足物:
亜セレン酸ナトリウム:7.13×10−4g/リットル
硫酸アデニン:0.0816g/リットル
アデノシン:0.88g/リットル
シチジン:0.88g/リットル
グアノシン:0.88g/リットル
ウリジン:0.88g/リットル
ヒポキサンチン:0.59g/リットル
L−シトルリン:0.63g/リットル
L−オルニチン−HCl:1.28g/リットル
ビオチン:0.014g/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.0025g/リットル
葉酸:0.23g/リットル
リポ酸:0.026g/リットル
ナイアシン:1.57g/リットル
ピリドキシンHCl:0.15g/リットル
リボフラビン:0.093g/リットル
チアミンHCl:0.8g/リットル
ビタミンE:0.0188g/リットル
ビタミンB12:0.17g/リットル
塩化コリン:2.51g/リットル
エタノールアミンHCl:0.22g/リットル
i−イノシトール:3.66g/リットル
チミジン:0.39g/リットル
プトレッシン2HCl:0.02g/リットル
プロゲステロン:0.00075g/リットル
D−パントテン酸カルシウム:1.19g/リットル
を含むビタミン/塩供給物から該補足物を加える、請求項1記載の製造方法。 - 培地1リットル当たり約20mlのビタミン/塩供給物を加える、請求項9記載の製造方法。
- 該タンパク質が該細胞から該培地内に分泌される場合、該宿主細胞から該培地を採取することを更に含む、請求項1記載の製造方法。
- 該細胞の生存率が約60%未満である場合、該宿主細胞から該培地を採取する、請求項13記載の製造方法。
- 該培地を遠心分離する、および/または該培地をデプス濾過する、および/または該培地を0.2ミクロンフィルターで濾過することにより、該細胞から該培地を精製することを更に含む、請求項11記載の製造方法。
- 該タンパク質が、抗体の、1以上の免疫グロブリン鎖、またはそれらの抗原結合性フラグメントである、請求項1記載の製造方法。
- 該抗体またはフラグメントがIGF1Rに特異的に結合する、請求項14記載の製造方法。
- 該抗体またはフラグメントが、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに/または配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含む、請求項15記載の製造方法。
- 該宿主細胞から分泌される抗体またはフラグメントが、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと、配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である、請求項16記載の製造方法。
- 該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項17記載の製造方法。
- 該補足物が加えられる初期哺乳類細胞増殖培地が、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない、請求項1記載の製造方法。
- 約37℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地(該初期培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない)に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するCHO DXB11宿主細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物:
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)
を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達したら補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、該培地内のグルコース濃度を約1.5g/リットルに維持し、該培地内のL−グルタミン濃度を約150mg/リットルに維持し、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持し、場合によっては、細胞生存率が約60%未満である場合には該培地から該宿主細胞を除去することを含む、抗体の製造方法。 - 該抗体が、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む重鎖免疫グロブリン、ならびに/または配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む軽鎖免疫グロブリンを含む、請求項20記載の製造方法。
- 該抗体またはフラグメントが、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む該宿主細胞から分泌される抗体を含む、請求項21記載の製造方法。
- 該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項22記載の製造方法。
- 該培地のディスク・スタック(disk−stack)遠心分離、該培地のデプス濾過(depth filtering)および約0.2ミクロンの細孔径を有するフィルターでの該培地の濾過により該細胞から該培地を回収することを更に含む、請求項23記載の製造方法。
- カラムクロマトグラフィー分画により該培地から該免疫グロブリンを精製する工程を更に含む、請求項25記載の製造方法。
- 約10g/リットル ダイズ水解物、
約1.5g/リットル グルコース、
約150mg/リットル L−グルタミン、
約6.8±0.02のpH、
HEPES、
炭酸水素ナトリウムバッファー、
無機塩、
非必須アミノ酸、
組換えヒトインスリン、
微量元素、
界面活性剤、
アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)
を含み、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない水性液体細胞培養培地。 - 約37℃に予め加温された初期哺乳類細胞増殖培地(該培地は、HEPES、炭酸水素ナトリウムバッファー、無機塩、非必須アミノ酸、組換えヒトインスリン、微量元素および界面活性剤を含み、L−グルタミン、抗生物質、抗真菌物質または動物由来成分のいずれをも含まない)に、抗体軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを発現するCHO DXB11宿主細胞を約2.5〜5×105 細胞/mlの細胞密度まで接種し、該接種の前、それと同時またはその直後に該培地に以下の補足物:
約10g/リットルの最終濃度までのダイズ水解物、
そして場合によっては、アミノ酸供給物(ここで、該アミノ酸供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
L−アルギニン:126.4mg/リットル
L−シスチン:34mg/リットル
L−ヒスチジン:42mg/リットル
L−イソロイシン:52mg/リットル
L−ロイシン:52mg/リットル
L−リシン:72mg/リットル
L−メチオニン:15.2mg/リットル
L−フェニルアラニン:33mg/リットル
L−トレオニン:47.6mg/リットル
L−トリプトファン:10.2mg/リットル
L−チロシン:36mg/リットル
L−バリン:46.8mg/リットル
L−アラニン:8.9mg/リットル
L−アスパラギン:30mg/リットル
L−アスパラギン酸:26.6mg/リットル
L−グルタミン酸:29.4mg/リットル
グリシン:15mg/リットル
L−プロリン:23mg/リットル
L−セリン:21mg/リットル)を加え、生細胞密度が約1.2×106 細胞/ml以上に達したら補足供給物を加え(ここで、該補足供給物により加えられる成分の濃度は、おおよそ、以下に記載されているものである:
亜セレン酸ナトリウム:0.01426mg/リットル
硫酸アデニン:1.632mg/リットル
アデノシン:17.6mg/リットル
シチジン:17.6mg/リットル
グアノシン:17.6mg/リットル
ウリジン:17.6mg/リットル
ヒポキサンチン:11.8mg/リットル
L−シトルリン:12.6mg/リットル
L−オルニチン−HCl:25.6mg/リットル
ビオチン:0.28mg/リットル
フラビンアデニンジヌクレオチド:0.05mg/リットル
葉酸:4.6mg/リットル
リポ酸:0.52mg/リットル
ナイアシン:31.4mg/リットル
ピリドキシンHCl:3mg/リットル
リボフラビン:1.86mg/リットル
チアミンHCl:16mg/リットル
ビタミンE:0.376mg/リットル
ビタミンB12:3.4mg/リットル
塩化コリン:50.2mg/リットル
エタノールアミンHCl:4.4mg/リットル
i−イノシトール:73.2mg/リットル
チミジン:7.8mg/リットル
プトレッシン2HCl:0.4mg/リットル
プロゲステロン:0.015mg/リットル
D−パントテン酸カルシウム:23.8mg/リットル
L−アスパラギン:812mg/リットル
L−プロリン:216mg/リットル
L−イソロイシン:370mg/リットル
L−システイン−HCl:224mg/リットル
L−ロイシン:332mg/リットル
L−トレオニン:164mg/リットル
L−チロシン:198mg/リットル
L−アルギニン:186mg/リットル
L−アスパラギン酸:71mg/リットル
L−グルタミン酸:126mg/リットル
グリシン:57mg/リットル
L−ヒスチジン:125mg/リットル
L−メチオニン:132mg/リットル
L−トリプトファン:99mg/リットル
L−リシン:293mg/リットル
L−フェニルアラニン:174mg/リットル
L−バリン:262mg/リットル
L−セリン:260mg/リットル
リン酸ナトリウム(一塩基酸):288.2mg/リットル
硫酸亜鉛:1.08mg/リットル
硫酸第二銅:0.0032mg/リットル
バナジン酸アンモニウム:0.00078mg/リットル
塩化コバルト:0.0025mg/リットル
二塩化ニッケル六水和物:0.0004mg/リットル
モリブデン酸ナトリウム脱水物:0.00016mg/リットル)、該培地内のグルコース濃度を約1.5g/リットルに維持し、該培地内のL−グルタミン濃度を約150mg/リットルに維持し、細胞増殖中、O2濃度を約60%に、pHを約6.8±0.02に、そして温度を約36.5℃±0.5℃に維持することを含む製造方法により製造された水性液体培地。 - 該宿主細胞が、該抗体の免疫グロブリンをコードするベクターを含み、該抗体が該培地内に分泌される、請求項27記載の水性液体培地。
- 該宿主細胞の生存率が約60%以下であり、および/または宿主細胞の増殖が約14〜24日間続行している、請求項28記載の水性液体培地。
- 該宿主細胞が該培地から除去されている、請求項29記載の水性液体培地。
- 該培地を遠心分離し、および/または該培地をデプス濾過し、および/または該培地を0.2ミクロンフィルターで濾過することにより、該宿主細胞が該培地から除去されている、請求項30記載の水性液体培地。
- 該抗体がIGF1Rに特異的に結合する、請求項31記載の水性液体培地。
- 重鎖免疫グロブリンが、配列番号1、3〜6、13、21および26よりなる群から選択される要素において記載されているアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含み、軽鎖免疫グロブリンが、配列番号2、7〜9、17および25よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらの成熟フラグメントもしくはそれらからの1以上のCDRを含む、請求項32記載の水性液体培地。
- 該抗体またはフラグメントが、配列番号3、4、5または6のアミノ酸20−128を含む軽鎖免疫グロブリンと配列番号8または9のアミノ酸20−137を含む重鎖免疫グロブリンとを含む該宿主細胞から分泌される抗体である、請求項33記載の水性液体培地。
- 該軽鎖免疫グロブリンがカッパ定常免疫グロブリン鎖に連結されており、該重鎖免疫グロブリンがガンマ−1定常免疫グロブリン鎖に連結されている、請求項34記載の水性液体培地。
- 請求項27記載の水性液体培地を含む容器。
- フラスコ、バイオリアクター、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクターである、請求項36記載の容器。
- バイオリアクターが、攪拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動床バイオリアクターまたは充填層バイオリアクターである、請求項37記載の容器。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10045008P | 2008-09-26 | 2008-09-26 | |
US61/100,450 | 2008-09-26 | ||
PCT/US2009/058164 WO2010036767A1 (en) | 2008-09-26 | 2009-09-24 | High titer antibody production |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012503487A true JP2012503487A (ja) | 2012-02-09 |
Family
ID=41334376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011529210A Withdrawn JP2012503487A (ja) | 2008-09-26 | 2009-09-24 | 高力価抗体の製造 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110229933A1 (ja) |
EP (1) | EP2342318A1 (ja) |
JP (1) | JP2012503487A (ja) |
KR (1) | KR20110060911A (ja) |
CN (1) | CN102224239A (ja) |
AU (1) | AU2009296708A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0919034A8 (ja) |
CA (1) | CA2737580A1 (ja) |
CO (1) | CO6351809A2 (ja) |
IL (1) | IL211639A0 (ja) |
MX (1) | MX2011003241A (ja) |
NZ (1) | NZ591651A (ja) |
RU (1) | RU2011116319A (ja) |
WO (1) | WO2010036767A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014054744A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2014-04-10 | 協和発酵キリン株式会社 | 培養液にアミノ酸を添加することによるポリペプチドの還元防止方法 |
JP2018509920A (ja) * | 2015-04-01 | 2018-04-12 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP2018113907A (ja) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 株式会社Regene Pharm | 動物細胞の培養方法 |
JP2018521676A (ja) * | 2015-08-04 | 2018-08-09 | リヒター ゲデオン エヌワイアールティー. | 組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法 |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PE20090368A1 (es) | 2007-06-19 | 2009-04-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-igf |
CN103396488A (zh) | 2008-12-12 | 2013-11-20 | 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 | 抗igf抗体 |
MX2012012525A (es) * | 2010-04-26 | 2012-11-23 | Novartis Ag | Medio de cultivo mejorado. |
DK2702164T3 (en) | 2011-04-29 | 2016-02-01 | Biocon Res Ltd | METHOD FOR REDUCING heterogeneity OF ANTIBODIES AND METHOD OF PRODUCING THESE ANTIBODIES |
JP6104242B2 (ja) | 2011-07-12 | 2017-03-29 | フードチェク・システムズ・インコーポレイテッドFoodchek Systems, Inc. | サルモネラおよび大腸菌を培養するための培養培地、方法、ならびにサルモネラおよび大腸菌を検出するための方法 |
US20130281355A1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-10-24 | Genentech, Inc. | Cell culture compositions and methods for polypeptide production |
US20140255413A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for neoplasia treatment |
US9217168B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-12-22 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods of cell culture |
RU2718986C2 (ru) * | 2013-03-15 | 2020-04-15 | Дженентек, Инк. | Композиции клеточных культур с антиоксидантами и способы получения полипептидов |
AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
ITTO20130493A1 (it) * | 2013-06-14 | 2014-12-15 | Determinants Of Metabolism Res Lab S R L | Composizione per l'eliminazione di animali molesti infestanti |
CN104212769B (zh) * | 2014-07-14 | 2017-05-10 | 北京益生合生物科技有限公司 | 一种用于高产单抗的细胞培养基添加剂 |
US20180105555A1 (en) * | 2015-03-20 | 2018-04-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Use of dextran for protein purification |
GB201506870D0 (en) | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
GB201506869D0 (en) * | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
EP3305891B1 (en) * | 2015-05-27 | 2021-01-06 | Astellas Pharma Inc. | Cell culturing method using nucleic acid-containing medium |
TW202340452A (zh) | 2015-08-04 | 2023-10-16 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
CN107460221B (zh) * | 2016-06-02 | 2021-01-15 | 正大天晴药业集团股份有限公司 | 一种降低抗pd-l1抗体中蛋白聚合物的细胞培养方法 |
WO2018018613A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
CN106479982A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-03-08 | 深圳万乐药业有限公司 | 抗pd‑1单克隆抗体生产用细胞培养基及其优化方法 |
EP3635093A1 (en) | 2017-06-08 | 2020-04-15 | Polpharma Biologics S.A. | Improved methods of cell culture |
KR102623647B1 (ko) * | 2017-06-27 | 2024-01-12 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 리보플라빈 유도체 함유 배지 |
MY190626A (en) | 2019-12-06 | 2022-04-27 | Regeneron Pharma | Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same |
CN113117455B (zh) * | 2021-04-12 | 2022-11-22 | 江西师范大学 | 氯化胆碱-甘油低共熔溶剂在吸收HCl气体中的应用 |
CN115369069B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-12-19 | 上海健士拜生物科技有限公司 | 293细胞补料培养基及其制备和应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT409379B (de) * | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
IL148060A0 (en) * | 1999-08-25 | 2002-09-12 | Immunex Corp | Compositions and methods for improved cell culture |
US7217796B2 (en) * | 2002-05-24 | 2007-05-15 | Schering Corporation | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
-
2009
- 2009-09-24 AU AU2009296708A patent/AU2009296708A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-24 RU RU2011116319/10A patent/RU2011116319A/ru not_active Application Discontinuation
- 2009-09-24 US US13/120,558 patent/US20110229933A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-24 NZ NZ59165109A patent/NZ591651A/xx not_active IP Right Cessation
- 2009-09-24 CN CN2009801468374A patent/CN102224239A/zh active Pending
- 2009-09-24 JP JP2011529210A patent/JP2012503487A/ja not_active Withdrawn
- 2009-09-24 KR KR20117006874A patent/KR20110060911A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-24 EP EP09792931A patent/EP2342318A1/en not_active Withdrawn
- 2009-09-24 CA CA 2737580 patent/CA2737580A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-24 WO PCT/US2009/058164 patent/WO2010036767A1/en active Application Filing
- 2009-09-24 MX MX2011003241A patent/MX2011003241A/es active IP Right Grant
- 2009-09-24 BR BRPI0919034A patent/BRPI0919034A8/pt not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-08 IL IL211639A patent/IL211639A0/en unknown
- 2011-03-28 CO CO11037693A patent/CO6351809A2/es not_active Application Discontinuation
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014054744A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2014-04-10 | 協和発酵キリン株式会社 | 培養液にアミノ酸を添加することによるポリペプチドの還元防止方法 |
JPWO2014054744A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2016-08-25 | 協和発酵キリン株式会社 | 培養液にアミノ酸を添加することによるポリペプチドの還元防止方法 |
US9976163B2 (en) | 2012-10-03 | 2018-05-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method for preventing reduction of polypeptide by adding amino acid to culture solution |
JP2018509920A (ja) * | 2015-04-01 | 2018-04-12 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP2022046631A (ja) * | 2015-04-01 | 2022-03-23 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP2022046632A (ja) * | 2015-04-01 | 2022-03-23 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP7230167B2 (ja) | 2015-04-01 | 2023-02-28 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP7354222B2 (ja) | 2015-04-01 | 2023-10-02 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞培養培地 |
JP2018521676A (ja) * | 2015-08-04 | 2018-08-09 | リヒター ゲデオン エヌワイアールティー. | 組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法 |
JP2018113907A (ja) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 株式会社Regene Pharm | 動物細胞の培養方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2010036767A1 (en) | 2010-04-01 |
BRPI0919034A8 (pt) | 2016-02-10 |
BRPI0919034A2 (pt) | 2015-08-18 |
EP2342318A1 (en) | 2011-07-13 |
NZ591651A (en) | 2012-12-21 |
AU2009296708A1 (en) | 2010-04-01 |
KR20110060911A (ko) | 2011-06-08 |
CA2737580A1 (en) | 2010-04-01 |
MX2011003241A (es) | 2011-04-21 |
CO6351809A2 (es) | 2011-12-20 |
CN102224239A (zh) | 2011-10-19 |
US20110229933A1 (en) | 2011-09-22 |
RU2011116319A (ru) | 2012-11-10 |
IL211639A0 (en) | 2011-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2012503487A (ja) | 高力価抗体の製造 | |
AU2021200418B2 (en) | Cell culture medium comprising small peptides | |
TWI548747B (zh) | 細胞培養改良 | |
EP1781802B1 (en) | Production of a tnfr-ig fusion protein | |
US7598083B2 (en) | Chemically defined media compositions | |
TWI782295B (zh) | 不含血清之細胞培養基 | |
EP2516624B1 (en) | Cell line 3m | |
EP1097194A2 (en) | Serum-free medium for culturing animal cells | |
JP2009509514A (ja) | 改良された細胞培地 | |
JP2016052310A (ja) | 改良型細胞培養培地 | |
CN102827905A (zh) | 多肽的生产 | |
WO2006047380A2 (en) | Method and media for single cell serum-fee culture of cho cells | |
CN114729306A (zh) | 浓缩灌注培养基 | |
WO2008013809A1 (en) | Cell culture methods | |
CN114621909A (zh) | 用于快速表达蛋白质的培养基及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120921 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20130308 |