JP2520681B2

JP2520681B2 - 生合成のヒトの成長ホルモン製品

Info

Publication number: JP2520681B2
Application number: JP50475187A
Authority: JP
Inventors: フィリップグレイ，ピーター; ラザルス，レズリー; ロイドマーズデン，ウォーウィック
Original assignee: GAABAN INST OBU MEDEIKARU RISAACHI; YUNIBAASHITEI OBU NYUU SAUSU UEERUZU ZA
Current assignee: GAABAN INST OBU MEDEIKARU RISAACHI; YUNIBAASHITEI OBU NYUU SAUSU UEERUZU ZA
Priority date: 1986-08-04
Filing date: 1987-08-04
Publication date: 1996-07-31
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: DE3787805D1; EP0318487A4; JPH02500946A; WO1988000967A1; DE3787805T2; EP0318487A1; EP0318487B1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、空気との露出下で付着が必要な哺乳類細胞
の培養に使用される改良培養培地に関する。

更に、本発明は、要望されるポリペプチドをコードす
るDNAが挿入された哺乳類細胞ライン（細胞系）からポ
リペプチドを生成する方法に関する。

背景技術最構成DNA技術の発展は、要望されるポリペプチドを
コードするDNAを無限増殖性哺乳類細胞系のゲノムに挿
入させることを可能にさせている。これら細胞ライン
は、E.coilのような原核生物の宿主細胞の使用に勝る利
点を持っている。これら利点は、蛋白質を分泌しグリコ
シル化する能力と、遺伝学的物質を本体の細胞に発生す
る遺伝物質に同一形態で処理する能力とを含んでいる。
これら利点に対して重み付けされるものは、蛋白質の生
成用の最構成哺乳類細胞の使用が殆ど無抗生培地におけ
る大規模の組織培養を伴っている事実である。組織培養
は、原核生物の細胞培養で実施されるより正確な環境制
御、より過酷な仕様及び汚染を排除した装置の操作が要
求される。哺乳類細胞の使用における更なる欠点は、こ
れら細胞の培養に使用される培地が代表的に血清を含ん
でいることである。血清の存在は、培養培地から要望の
ポリペプチドを隔離及び精製することに複雑さを提供す
る。

組織培養に使用される細胞は、２つの広い範疇、ハ
ブリドーマ細胞のような分散培養に無関係に増殖する細
胞及び表面に付着して増殖する細胞に分けることが可
能である。前者のの細胞は、細胞が細胞膜を持たず、
従って剪断力に敏感である事実を考慮した分散培養で増
殖できる。第２の範疇の細胞は、大規模生成するために
細胞増殖用の増加した表面領域が要求される。文献に
は、増加した表面領域を提供する種々の装置、ガラス製
のハニカム面、シートを巻回した表面及び数mm径の複数
のガラス球を形成した装置が記載されている。文献に記
載された種々の研究の全評論は1983年グラッケン氏等の
Trends in Biotechnology第１巻102〜108頁に示されて
いる。

他の研究は、架橋デキストラン、ポリスチレン或はガ
ラスを含む物質等から構成できる更に小径の球体粒子を
使用することである。時々マイクロキャリアとして参照
するこれら粒子の利点は、100〜200マイクロメータ台の
直径を持つ粒子によって、単位質量毎に非常に高い表面
領域を持つビーズ群（5000cm²/g）を達成することが可
能となることである。この研究の行き着く先は、ビーズ
群の外面と同様に内部に細胞を増殖させられる多孔性マ
イクロキャリアの使用である。他の可能性は、複数のビ
ーズに相互に細胞を結合させる中核箇所として作用する
１マイクロメータ台の直径のいっそう小径のラテックス
ビーズ群を使用することである。ある条件下では、細胞
群或は塊の小集団を形成するために、相互に結合する細
胞群を誘導することが可能である。複数の細胞がマイク
ロキャリア、ビーズ或は塊群に結合した時には、細胞を
分散培養に増殖させることが可能である。分散培養で細
胞を増殖させる装置は手引書に沿った使用であり、この
装置の使用が薄膜装置のような別の装置を使用した開発
中の技術の問題を回避している。しかし、マイクロキャ
リアで増殖させられる細胞に伴う困難さの１つは、細胞
の群生密度が酸素の量で制限されることである。このよ
うな制限は、公知の通気技術で克服されるが、培地が無
血清の時に、このような通気が細胞を支持培地から遊離
させる。

発明の開示本発明者は、支持培地に付着された細胞を、血清の不
存在下でも剥がれないで、空気培養できる新規な組織培
養培地を開発した。更に、本発明者は、付着が必要な細
胞を培養する新規な方法を開発した。

本発明は、次の段階、 1.細胞が付着して所望の細胞群生濃度まで増殖するため
の支持培地が設けられた反応槽内で血清含有培地中で哺
乳類細胞を培養し、 2.血清含有培地をデカントし、 3.デカントした培地の代わりに、細胞及び支持培地のま
わりにある膜状の培地の流出を低減することによって細
胞保護剤として機能する非毒性ポリマーを含む無血清培
地を入れ、 4.培養物が直接通気を受ける段階を備えた、付着が必要
な哺乳類細胞の培養方法からなっている。

科学的に裏付けされた理論を確立していないが、細胞
保護剤として作用するポリマ（ポリマー）は、細胞が血
清の不存在下で直接通気をうける時に、細胞／支持培地
の集団回りに保護膜を形成して、細胞が支持培地から遊
離しないこと及び細胞の溶解を防止するものと信じられ
る。細胞／支持培地集団回りの保護膜は、細胞／支持培
地集団が気泡と接触した時に、細胞を囲む膜状の培地が
にじみ出ること（流出）を防止するものと信じられる。
この培地の流出を膜のドレナージと称する。また、この
膜は、気泡による物理的損傷から細胞を保護する障壁を
形成するものと信じられる。

用語「直接通気」は、培養される細胞がガスの泡に露
出される培養培地の通気を記述するために使用される。

ポリマが非イオン性で低発泡であることが好ましい。

本発明の好ましい実施例においては、ポリマがポリエ
チレングリコール、ポリビニルピロリドン或は１個以上
の酸化アルケンを含有するポリマである。酸化アルケン
は、２個或は３個の炭素原子を含むことが好ましい。ポ
リマは、酸化プロピレン及び酸化エチレン共重合体であ
ることが特に好ましい。

本発明の更に好ましい実施例においては、酸化アルケ
ンのポリマが0.1〜1.0％の濃度で存在している。

本発明の別の好ましい実施例においては、組織培養培
地が必須的に蛋白質を含有しない。

本発明の好ましい実施例においては、反応槽は、培養
培地が移動できるが、細胞が移動できないフィルタの手
段によって、培養領域と、無細胞領域とに分割されてい
る。

培養培地の通気即ち換気は、反応槽の無細胞領域に泡
状のガスを通過させることによって達成される。この通
気方法は、気泡の量が通常フィルタ手段を通過するの
で、培養される細胞が気泡に露出される元となる。しか
し、通気が反応槽内に位置した上昇空気流を使用して導
入されることが特に好ましい。

本発明の好ましい実施例においては、哺乳類細胞は、
特にヒトの成長ホルモン（hGH）等の所望のポリペプチ
ドをコードするDNAが挿入されたチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞系等の無限増殖性細胞系である。

好ましくは、要望されるポリペプチドをコードするDN
Aは、必須的に無血清培地の成分で誘導される誘導性促
進子（プロモータ）の制御下におかれている。更に、好
ましい実施例においては、必須的無血清培地が必須的無
蛋白質である。

培地の撹拌は、発生する剪断力を低くさせる速度で錨
型の羽根のような羽根を使用して達成できる。明らか
に、他の羽根の外形も剪断力発生も弱くして使用され
る。

更に、好ましい実施例においては、必須の無血清培地
が連続的に補給されて、要望されるポリペプチドが連続
的に回収される。

図面の簡単な説明本発明の特質を十分に理解するためには、好ましい形
態が添付図面を参照して例として記載されている。

図面は、通気が反応槽内に位置した空気柱（上昇空気
流）の手段による反応システムの代表例を示すブロック
図である。

発明を実施するための最良の形態実施例１チャイニーズハムスター卵巣細胞系（CHO）へ、強力
に制御可能なプロモーター／エンハンサー配列に連結さ
れたヒトの成長ホルモンをコードするDNAをトランスフ
ェクションした。この遺伝学的構造については、国際公
開番号WO86/04920に詳述されている。

この細胞は、液体窒素アンプル内に貯蔵され、その後
ルーフラスコ或はローラビン内で成長（増殖）させて再
構成される。これらの細胞は、EDTAを使用して取出さ
れ、PBSで洗浄され、予め処理されたマイクロキャリア
に接触させられる。これらのマイクロキャリアは、デキ
ストラン基剤のシトデックス（Cytodex）１及び２（フ
ァルマシア社）或はポリスチレン基剤のバイオシラン
（Nunc）である。マイクロキャリア毎に６〜10個の細胞
を種付けする密度が好適であると発見され、細胞がマイ
クロキャリアに付着し、約18時間の遅滞期及び倍加時間
で増殖した。培地は、５或は10％のFCSを含有する合成
培地であった。大規模槽に接種するために十分な細胞数
を確立するためには、合流するマイクロキャリアの集団
に新鮮なマイクロキャリアを追加することが可能であ
り、新鮮なマイクロキャリアの植民地化が発生する。マ
イクロキャリアの要望される接種材料が図面に示す発酵
槽（ファーメンタ）の外形に転移される。

この実施例は、空気柱の原理を使用して実施され、従っ
てガス相は、物質移動用のガス相を形成すると同様に低
剪断混合を促進するために使用される。ガス相は、反応
槽の頂部で降水筒に接続される反応槽の部分（上昇部
分）の底で泡が発生させられる。上昇部分へのガス相の
導入は、この部分の密度を低下させるが、この結果、降
水部の気泡のない高密度の培養が低密度の培養と置換し
て、従って反応槽内で穏健な混合を促進している。種々
の反応槽の外形においては、降水部及び上昇部を合同す
ることが可能である。円筒形の反応槽15内で同軸配置さ
れた同軸チューブ14として上昇部を持つ一外形が図面に
示されている。この外形は、ハイブリドーマ細胞の増殖
用に既に使用されている。この外形を使用して、マイク
ロキャリアに付着したCHO細胞を0.02VVMのガス流量で増
殖及び生成物形成が可能であることを示した。使用され
たガス相は、基本的に空気であり、通常の制御方法を使
用して二酸化炭素或はアンモニアが補充されて培養pHを
維持することができた。勿論、もし必要ならば、酸素が
ガス相に追加できて、過剰ガス速度を使用しないで所望
レベルの溶解酸素が維持できる。この作業に使用した低
ガス速度では、発泡問題が最小であったが、もし発泡が
初期段階で発生したならば、例えば細胞が血清含有媒体
で増殖した時に、導体センサ或は追加時間を使用して、
シリコンを基剤とした抗−発泡剤、例えば抗−発泡剤Ｃ
或は他の抗−発泡剤を計量添加して制御することが可能
である。勿論、これら抗−発泡剤が細胞の増殖及び生成
物形成を妨害しないことが条件である。増殖段階が発生
し、マイクロキャリアビーズ群が合流した時には、マイ
クロキャリアを維持するステンレススチールメッシュを
使用して、細胞が１容量部のPBSで洗浄される。その
後、反応槽には、hGHの生成用に、酸化プロピレン及び
酸化エチレンの共重合体（プルリオールPE6800）を含有
した無血清培地が必須的に充填される。この培地は次の
成分からなっている。

無機塩 mg/l CaCl₂（無水物） 162.15 CuSO₄・5H₂O 0.0013 Fe(NO₃)₃・9H₂O 0.05 FeSO₄・7H₂O 0.417 KCl 352.5 KH₂PO₄ 30.62 MgCl₂（無水物） 23.33 MgSO₄（無水物） 61.48 NaCl 6958.5 NaHCO₃ 1338 NaH₂PO₄（H₂O） 62.5 ZnSO₄・7H₂O 0.432 Na₂HPO₄・7H₂O 125 アミノ酸Ｌ−アラニン 9.0 Ｌ−アスパラギン・H₂O 15.0 Ｌ−アルギニン・HCl 253.0 Ｌ−アスパラギン酸 13.0 Ｌ−システインHCl・H₂O 35.13 Ｌ−シスチン・2HCl 31.29 Ｌ−グルタミン酸 15.00 Ｌ−グルタミン 438.0 Ｌ−グリシン 23.0 Ｌ−ヒスチジンHCl・H₂O 42.0 Ｌ−イソロイシン 56.4 Ｌ−ロイシン 65.6 Ｌ−リジンHCl 109.5 Ｌ−メチオニン 19.5 Ｌ−フェニルアラニン 38.0 Ｌ−プロリン 35.0 Ｌ−セリン 31.5 Ｌ−スレオニン 59.4 Ｌ−トリプロファン 10.0 Ｌ−バリン 58.7 ビタミンアスコルビン酸（ビタミンＣ） 7.5 ビオチン（ビタミンＨ） 0.0037 Ｄ−パントテン酸カルシウム 2.119 塩化コリン（ビタミンＢ複合体） 8.98 葉酸（ビタミンＢ複合体） 2.66 ｉ−イノシトール 12.61 ニコチンアミド 2.02 ピリドキサルHCl（ピリドキシン） 2.03 リボフラビン 0.22 チアミンHCl 2.169 ビタミンB₁₂ 0.68 他の成分Ｄ−グルコース 3151 HEPES 3570 ピルビン酸ナトリウム 110 ヒポキサンチン（２ナトリウム塩） 2.7 リノール酸 0.045 プトレシン2HCl 0.081 チオクト酸（リポ酸） 0.103 チミジン 0.35 プルリオールPE6800 2000 10⁷細胞/mlの細胞濃度で、反応槽を連続操作で運転
し、0.15時間^-1の流出速度及び80mg/lのhGH濃度で生成
物の流れを形成することが可能である。勿論、反応槽
は、内容の全部或は部分がステンレススチールメッシュ
を介して反応槽から取り出され、新鮮な培地がバッチ或
は連続槽で置換されるバッチ或は反復されたバッチモー
ドで運転することができる。この技術を使用して、250m
g/リットルのhGH濃度を持つ生成物の流れを得ることが
可能である。

この実施例においては、培地が非毒性、低発泡或は低
粘性、非イオン性化合物のプルリオールPE6800を含んで
いるので、培養培地に直接ガスを泡立てることが可能で
ある。この化合物は、酸化プロピレン及び酸化エチレン
共重合化で得られる。培養培地内のこの化合物の存在
は、支持培地から細胞を剥がれにくくさせ、しかも通気
即ち空気との接触ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グレイ，ピーターフィリップオーストラリア国 2027 ニューサウスウェールズエッヂクリフキャメロンストリート 74 (72)発明者ラザルス，レズリーオーストラリア国 2075 ニューサウスウェールズセントアイブズウッドワードプレイス５ (72)発明者マーズデン，ウォーウィックロイドオーストラリア国 2031 ニューサウスウェールズランドウィックアルジョンロード 109

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞が付着して所望の細胞群生濃度まで増
殖する支持培地が設けられた反応槽内において血清含有
培地中で哺乳類細胞を培養し、血清含有培地をデカントし、デカントした培地の代わりに非毒性ポリマーを含む無血
清培地を入れ、培養物を直接通気にさらすことを特徴とする、付着が必
要な哺乳類細胞の培養方法。
【請求項２】前記無血清培地に存在する前記非毒性ポリ
マーがポリエチレングリコール及びポリビニルピロリド
ンからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項３】前記無血清培地に存在する前記非毒性ポリ
マーが１個以上の酸化アルケンを含有するポリマーであ
る請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】前記酸化アルケンが２個或いは３個の炭素
原子を含む請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】前記ポリマーが酸化プロピレン及び酸化エ
チレンの共重合体である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】前記酸化アルケンのポリマーが0.1〜1.0重
量％の濃度で培養培地に存在している請求の範囲第３項
記載の方法。
【請求項７】前記反応槽が、前記培養培地は通過できる
が細胞は通過できないフィルタによって、培養領域と無
細胞領域とに分割されている請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項８】前記培養培地の通気が、反応槽の無細胞領
域に気泡を導入することによって行われる請求の範囲第
７項記載の方法。
【請求項９】前記通気が前記反応槽内に存在する上昇ガ
ス流れの手段によって実行される請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項１０】前記哺乳類細胞が、所望のポリペプチド
をコードするDANを含有する請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項１１】前記ポリペプチドが、反応槽内の無細胞
領域から得られた培養培地から回収され、精製される請
求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１２】前記ポリペプチドをコードするDNAが、
必須無血清培地の成分で誘導される誘導性プロモーター
の制御下におかれている請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１３】前記哺乳類細胞が無限増殖性細胞系であ
る請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１４】前記無限増殖性細胞系がチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞系である請求の範囲第13項記載の方
法。
【請求項１５】前記ポリペプチドがヒトの成長ホルモン
である請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１６】前記無血清培地が必須的に無蛋白質であ
る請求の範囲第１項から第15項までのいずれかに記載の
方法。
【請求項１７】前記培地は、発生する剪断力を低くする
方法で攪拌される請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１８】前記ポリペプチドは、反応槽から連続的
に取り出された培養培地から回収され、新鮮な必須無血
清培地が反応槽に連続的に補給される請求の範囲第10項
記載の方法。