JPS63237782A - 付着性動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は付着性動物細胞の培養方法に関するもので必る
。更に詳しくは付着性動物細胞をゲル粒子にて固定して
培養する方法に関するものである。

ｂ、従来技術 細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製品にとって重要である。更に近年特定
タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生産
は抗体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマの１
８　ｍによるものであり、その技術の解決は工業的に重
要なテーマである。

従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年ｍ的の大間培ａを目的としてその培養法及びそ
のための装置として、いくつかの提案がなされている。

これらの提案は、大きく分けて主として付着性細胞のた
めの付着性培養（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　　ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ　　ｃｕｌｔｕｒｅ　）と主として浮遊性細胞の
ための？！；ｌ′ｔｌ培符、つまりサスペンシコン培ｉ
　（ＳＬｌＳｐｅｎＳｉＯｎ　　ＣＬｌｌｔｌｌｒ（！
　）との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培
養される細胞の特性によっていずれかに決められる。

後者の浮遊培養に関しては近時大組培養乃至高密度培養
の研究がさかんに行なわれ、種々の技術が提案されてい
る。

しかし前者の付着性細胞のための付着培養に関しては、
大ｆｆ１ｊ８養を中心とする工業的技術の研究は比較的
遅れている。それは付着性細胞は、その培養が付着する
担体の表面積に大きく依存しているために、高密度乃至
大量培養の手段が自ら制限を受しプていたためと思われ
る。また付着性細胞を大量に培養するためには、当然の
ことながら培養面積を大きくする必要があり、そのため
装置が複雑になったり、また培養液と細胞の接触を効率
的にするために煩雑な構造を要することはさけ難かった
。

そこで本発明者は、付着性動物細胞を大量に且つ高密度
で培養する工業的方法について研究を進めた結果、付着
性動物細胞をアルギン酸カルシウムグル粒子中に成る状
態ひ包封するとそのゲル粒子中で極めて高密度で培養さ
せることができしかもそのゲル粒子は培養液中にて自由
に、高いゲル粒子濃度でも培ｉすることが可能であるこ
とを見出し先に提案した（昭和６２年２月２７日付出願
：発明の名称「付着性動物細胞の培養方法」）。本発明
者は、かかる提案方法を工業的に一層有利に行うことが
可能な改良法を見出すべく研究を重ねた。

一方動物細胞の培養に使用される培地、つまり培養液と
しては秤々の血清を含む培地〈血清培地という）が一般
的に使用されている。動物細胞の培養に血清培地が適し
ている理由は、明確ではないが栄養成分、生育必須成分
が含まれており、タンパクなどのバランスが良いからで
あると推察される。しかしながら血清は、その供給源が
天然に依存していること、僅かの争しか供給できず大量
の安定入手が困難であること、入手源によって品質が一
定しないこと、極めて高価であることなどのために、血
清を工業的なレベルで細胞培養を行うための培地として
使用することは、種々の問題を生じていた。また血清培
地を用いて細胞培養を行った場合、培地中から細胞が産
生じた物を単離するためには、いくつかの障害をひき起
していた。例えば成る特定の有用蛋白質を産生さぜる場
合、血清中にもともと含まれていた蛋白質を含まない目
的蛋白質を分離して取り出すことは極めて困難であり、
また目的蛋白質を精製・生殖するために経済的に不利な
手段を必要とする。

これに対して、血清を使用しない所謂無血清培地の研究
・開発が進められ、いくつかは既に実用化されている。

無血清培地は人工的に栄養源、無機塩、ビタミン類、抗
生物質などを組合せたものであり、血清培地に比べて安
価であり、大量に且つ安定した品質のものを入手するこ
とが容易であるという工業的な利点を有している。

殊に無血清培地を使用して有用蛋白質の産生を行った場
合、培地からの有用蛋白質の分離・精製は、はるかに簡
単である。

しかしながら、無血清培地は血清培地に比べてかかる利
点を有している反面、細胞の種類や性質によっては生育
・増殖が血清培地程にうまく行かなかったり、成る場合
には増殖しないことや時には生育が停止することがある
。

本発明者の研究によれば、前記提案方法のように付着性
動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中に包封して
このゲル粒子を培養液中で培養する方法を、ゲル中で細
胞が大量に高密度で増殖できることがわかったが、更に
研究を進めたところ、血清培地を用いて培養を行う場合
には何等の問題は認められなかったが、付着性動物細胞
の成る種のものについて、培養の初期、つまり細胞密度
が充分高くない時期に無血清培地中で培養すると増殖が
満足すべき速度で進まないことが認められた。ところが
、培養を初期においては血清培地中に行ない、次いで成
る程度細胞密度が高くなって侵、その細胞を無血清培地
中で培養すると、何等の障害もなく増殖が行なわれるこ
とがわかった。

Ｃ１発明の溝底 本発明は、かかる知見に基いて到達されたものであって
、付着性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中に
包封せしめ、該粒子を培養液中に存在せしめて培養する
に当り、培養は血清を含有する培養液中にて開始し、最
終的には無血清の培養液を供給して行うことを特徴とす
る付着性動物細胞の培養方法である。

かかる本発明方法によれば、付着性動物１８胞をアルギ
ン酸カルシウムゲル粒子中で高密度で培養することが可
能となり、そのゲル粒子を培養液中に高い密度で例えば
浮遊状態で培養することができるので、小さな装置また
は簡単な装置で付着性動物細胞を大扉に且つ高密度に培
養することができる。

しかも本発明によれば生育した細胞は、ゲル粒子に存在
するので、培養後の培養液からの細胞の取り出しまたは
分離や細胞の培Ｍ装置からの分離が極めて簡単であって
、その工業的価値は甚大である。

ざらに本発明方法においては、培落の開始には血清培地
を使用するが、途中で無血清培地を用いて培養するので
全体として培地コストを大巾に節減でき、しかも有用蛋
白質産生を目的とする場合には、培地からの目的蛋白質
の分離・精製コストは極めて安価になることが期待でき
る。

以下発明方法について更に詳細に説明する。

本発明の培養方法において、培養する動物細胞は付着性
のものひあれば、種々のものが対象となり、殊に培養条
件で増殖可能なものであればよく、天然の動物細胞のみ
ならず、人為的或いは遺伝子組み換え操作などによって
変性された細胞であってもよい。また有用な蛋白を産生
ずるか、それを目的として改変された動物細・胞である
こともできる。その例としては、例えば、ＣＨＯ，ＢＨ
Ｋ、　　　ＨｅｐＧ２．　　　Ｃｈａｎａ　　　　Ｌｉ
ｖｅｒ。

ＮＣＴＣｃｌｏｎｅ１４６９　、　ｃｌｏｎｅ　９．　
Ｖｅｒｏ　。

Ｈｅ１ａ　、Ｂ１０−１　、ＬＭＴＫ−、’２９３゜Ｃ
１２７ｉ、　Ｃａｋｉ　２．　ＣＶ　１　、　Ｃ１２７
，ＣＯ８゜Ｌ、ＦＭ３Ａ、ＡＰ−８の如き遺伝子導入用
宿主細胞＋ＭＧ−６３，Ｃ−１０，）（ｕｍａｎ　　ｄ
ｉｐｌｏｉｄｆ　１ｂｒｏｂｌａｓｔの如きインターフ
ェロン産生細胞；例えばＢ　ＯＷ　Ｅ　Ｓ　−ｍｅｌａ
ｎｏｍａ、血管内皮細胞。

ＰＣ−３，ＰＣ−１０，ＰＣ−６の如きｔＰＡ産生細胞
；例えばＨｍ　Ｌｕ　、ＭＰＫ、ＣＰＦＫ。

ＣＫＴＣ６−１，ＥＳＫ、ＣＫ、Ｗｌ−３８，ＭＲＣ−
５の如きワクチン製造用細胞を挙げることができる。

本発明方法における動物細胞が包封されたアルギン酸カ
ルシウムゲル粒子は、その平均粒径が０．５〜５１Ｍ１
好ましくは０．８〜４Ｍの範囲であるのが望ましい。こ
の平均径とは、粒子の体積と同じ体積の球体とした時の
、その球体の直径を平均して表わした値である。

粒子の大ぎさが、前記範囲より小さいと、粒子を製造す
ることが困難であるばかりでなく培養操作、殊に粒子と
培養液との分離操作が困難となる。一方粒子があまりに
大きいと培養液の拡散や酸素の供給が充分に達成しにく
くなり、また粒子自体も形態保持が出来ないことがある
ので、その粒子の大きさ及び形状は、粒子の組成、培養
条件、装置の形式などによりその最適条件は左右され、
適当に決められるが、その大きさは前記範囲から選択さ
れる。

本発明方法においてゲルを形成しているアルギン酸カル
シウムの濃度は、０．５〜２０〈重量〉％、特に０．１
〜１５（重量）％の範囲であるのが好ましい。前記範囲
よりもアルギン酸カルシウムＱ度が低いと、ゲルの物理
的強度が弱くなり、ゲル粒子としての形態保持が困難と
なる。一方アルギン酸カルシウムのｍａが高過ぎると充
分な強度のゲル粒子を維持するが、培養液の流入と流出
、酸素の移動が充分に行なわれなくなりｉ胞の生育に支
障を来すことがあるのでその上限は前記の値に設定され
るべきである。

本発明方法の実施に当って、ゲル粒子中における細胞の
密度は、特に制約を受けないが、一般には少くとも１０
４個／Ｍｌ、好ましくは少くとも１０′Ｊ個／ｉの！度
であるのが有利である。

本発明者の研究によれば、前記付着性動物細胞を包封し
たアルギン酸カルシウムゲル粒子は、付着性動物細胞を
含有させたアルギン酸ナトリウム水懸濁液を、７０〜２
００ｍＭの範囲、好ましくは８０〜１５０ｙｙｔＭの範
囲の塩化カルシウムの比較的高い濃度の水溶液中へ滴下
することにより、細胞が増殖するのに適したゲル粒子が
形成されることがわかった。上記濃度範囲の塩化カルシ
ウム水溶液に前記細胞含有アルギン酸ナトリウム水！？
；！濁液を滴下することによって、ゲル粒子が形成され
るが、この場合ゲル中にアルギン酸カルシウムで満され
ない空隙部分が形成され、その空隙部分が細胞の増殖に
寄与し、結果としてゲル中で高密度の培養が可能になっ
たものと本発明者は推察している。

上記塩化カルシウム水溶液のｍ度において、”　ｒｒｔ
　Ｍ　”とは水溶液１文中に含まれる塩化カルシウムの
ミリモル数を意味するものとする。

ざらに本発明者のＣ１究によれば、前記ゲル粒子を形成
させる場合に、付着性動物細胞と共に固体微粒子担体を
ゲル粒子中に包封させると一居高い密度で増殖づ゛るこ
とかできることが判明した。ゲル粒子中に前記両者を包
封するには、付着性動物細胞と固体微粒子担体のそれぞ
れをアルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁させ、懸濁液を
前記塩化カルシウム水溶液中に滴下させる方法或いは付
着性動物細胞を予め固体微粒子担体の表面に付着させ、
次いでこれをアルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁させて
この懸濁液を１）０記塩化カルシウム水溶液中に滴下さ
せる方法のいずれによっても行うことができる。後者の
方法が前者方法よりも高い密度で培養することができる
。

前記した如き固体微粒子担体をゲル粒子に包封させると
、それによって一層ゲル粒子中にアルギン酸カルシウム
で満されない空隙部分が容易に且つ数多く形成され易く
なり、より好ましい。この固体微粒担体としては、動物
細胞が付着し易いものであるのが好ましく、且つ付着し
た細胞に生育、増殖を防げないものであるのが好ましい
。殊に固体微粒子担体としては、平均径が２０μ〜２０
０μ、好ましくは４０〜１００μの範囲のものが好適で
あり、その形状は概して円形のものが望ましい。この固
体微粒子担体の例としては、一般的に付着性細胞の培養
のためのマイクロキャリアーとして使用し得るものが有
利に用いられ、殊に多糖類系のものが使用される。

その具体例としては、例えばファルマシア社製のサイト
デックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ■）１．２または３が挙げら
れる。

本発明方法における前記ゲル粒子を形成させることに当
り、細胞を分散状態で含有するアルギン酸ナトリウム懸
濁液における、アルギン酸ナトリウムの濃度は、一般に
０．５〜１５重量％、好ましくは１〜１０重量％の範囲
がよい。またゲル粒子の形成は細胞を取扱う観点からｐ
Ｈを６〜７．５のは範囲に維持するのが望ましい。

本発明方法は、前記の如くして得られた細胞が包封され
たゲル粒子を培養液中に存在させることによって行なわ
れる。かくして本発明においては培養は血清を含む培養
液を用いて開始される。

血清としては種々の由来のものを用いることができるが
、具体例としては、１」Ｓ（馬血清）。

Ｃ８（牛血清）、ＮＢＣ８（牛新生児血清）。

Ｆｅ２（牛胎児血清）などを挙げることができる。これ
ら血清を基本培地に加えたものを血清含有培地として使
用する。この場合基本培地としては、実質的に水よりな
る水性媒体に、種々の無機塩５ビタミン類、補酵素、ブ
ドウ糖、アミノ酸、抗生物質、生長促進因子などの通常
細胞培養に使用される添加成分が加えられているものが
使用でき、具体的には市販の動物細胞培養用の多くの培
地を、単独或いは混合して使用することができる。また
基本培地にはさらにインスリン、１〜ランスフエリン、
エタノールアミン、ルナイトなどの増殖因子を添加して
もよく、多くの場合その方が有利である。

本発明方法は、前記血清含有培養液中にゲル粒子を存在
せしめ、培養を開始するが、ゲル粒子中で次第に細胞は
増加し、密度は高くなって来る。その俊適当な段階で無
血清培養液を用いて培養を行なうが、その培養液の切り
換えは、−気に行ってもよいが概して徐々に行うのが好
ましい。また切り換えの方法は培養形式によって好まし
い手段は変わってくる。

さらに血清含有培養液から無血清培養液の切り換えは、
細胞の種類、培養条件、培養形式などによってその好ま
しい時期は左右されるが、ゲル粒子中の細胞密度が、３
　Ｘ　１０Ｇ　ｃｅｌｌｓ　／　ｇ・ゲル好ましくは５
　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　／　ｇ・ゲルになるまでは
血清含有培養液中で培養するのが好ましい。その密度以
降になれば徐々に或いは一気に無血清培養液に切り換え
ることが望ましい。

しかし、細胞増殖が激しい時期には切り換えは極力避け
た方が好ましい。

経演的見地からは、早目に無血清培養液へ切り換えた方
がよいが、その時期は細胞の増殖密度を観察しながら、
予め簡単な実験を行うことによって決定することかでき
る。

本発明方法で使用される無血清培地としては、前述した
無血清の基本培地をそのまま或いはそれを改良して使用
することが可能である。もちろん市販の動物細胞培養用
の培養液を単独或いは二種以上混合して使用することが
可能である。

細胞の種類によってもその好適な無血清培養液は異なる
が、例えば３　＠　Ｋ　（３ａｂｙ　　Ｈａｍｓｔｅｒ
Ｋ　１ｄｎｅｙ　）　ｍ胞の場合は後述する第２表の如
き組成の培養液を使用することができる。

本発明の培養を行う形式としては、実験室的規模で行う
場合には静置培養でもよいが、本来本発明は工業的規模
に適した次の如き培酋方式に適用して培養するのが特に
望ましい。

すなわち、撹拌型培養槽、固定床型培養装置。

流体流動層型培養装置、流体流動層型培養装置などを用
いて培養を行うのが適している。例えば好ましい一例を
示すと培養槽中で流動層形式で行うことができる。この
際培養槽とは縦長の塔形式のものであってもよく、また
横長のタンク形式であってもよいが、いずれにしても、
基本的には新しい培養液が下部より供給され、粒子と接
触した古い培養液が上部より排出される形式のものであ
ればよい。

すなわち、基本的な培養形式について説明すると、培養
槽中に細胞が包封された多数のゲル粒子が充填された浮
遊し得る領域が形成され、その領域の下部から培養液が
供給され、その領域から、古い培養液を取り出す方式で
あって、下部からの培養液の供給は、粒子が浮遊した状
態を維持し、培養槽の上部からオーバーフローしないよ
うに制御される範囲で行なわれる。

さらに培養槽から排出された培養液はそのまま、或いは
酸素を供給して、生育のために再び循環使用することも
できる。

以上本発明によれば、細胞から培養液を極めて容易に分
離することができ、しかも細胞を効果的に生育すること
が可能となる。殊に本発明によれば、有用物質を産生ず
る細胞から有用物質の産生、及び分離を工業的に有利に
実施することができるのでその価値は甚大である。

本発明方法は、付着性を高密度且つ大圏に培養すること
ができしかも細胞自体及びそれが包封されたゲル粒子自
体がより安定に維持され、且つ培養液との接触を一層効
率的に行なうことが可能となる。

以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。

実施例 （細胞の固定化〕 ファルマシア社製マイクロキャリヤー（：、　ｙｔｏｄ
ｅｘ３　１ｇ当り２Ｘ１０’ｌ［ｌｉｌのＢＨＫ（Ｂａ
ｂｙｌ−１８１１Ｓｔ（！ｒ　　Ｋｉｄｎｅｌ／　）細
胞をあらかじめ付着させたのら、第１表に示す培地に上
記マイクロキャリヤー量が１０％になるように投入した
。

しかるのち算はの２％アルギン酸ナトリウム水溶液と混
合した。この混合物を均一になるようによくかきまぜな
がら氷冷下の１００７７１　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１２水溶液
中に滴下してゲル化し、上記細胞がマイクロキャリヤー
に付着した状態で包封固定化したゲルを得た。このゲル
の平均径は３　ｍｍであった。

［培養］ 直径　１２０Ｍのシャーレに第１表に示した培地２０厩
を投入したのら上記ゲル１．４ｇを加え３７℃。

ＣＯ２５％に保ったＣＯ２インキュベーター中で培養を
開始した。１日に１回培養液を新培地と全量交換して培
養を継続した。４６日経過侵培地を第２表に示す無血清
培地に変更して更に培養を継続した。この間の培養時間
と単位ゲル間当りのグルコース消費速度、生細胞密度と
の関係を次に示す。

第１表（血清含有培養液組成） 第２表　無血清培養液組成 比較例 実施例と同様にして固定化したＢ　ＨＫ細胞を直予あら
かじめ第２表に示した培養液２０成を入れである直径１
２０Ｍのシャーレに投入した。投入したプル量は１．４
ｇであった。これを３７℃、　ＣＯ２５％に保ったＣＯ
２インキュベーター中で培養した。

その結果を次に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、付着性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中
   に包封せしめ、該粒子を培養液中に存在せしめて培養す
   るに当り、培養は血清を含有する培養液中にて開始し、
   最終的には無血清の培養液を供給して行うことを特徴と
   する付着性動物細胞の培養方法。 ２、該培養は、該粒子中の細胞密度が少なくとも５×１
   ０＾６ｃｅｌｌｓ／ｇ・ゲルになるまでは血清を含有す
   る培養液中で行う第１項記載の方法。