JPH02150276A - 細胞培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、細胞を固定化用ゲル内で増殖させる際に、そ
の増殖に必要なゲル内の空隙量を定置的に増大させ、ひ
いては細胞を短時間にしかも高い細胞密度に到達させる
培養方法に関するものである。

〔従来の技術〕

近年のバイオテクノロジーの進歩により、医薬品などの
高付加価値物質の生産が培養細胞で行われている。そし
て生産物質の需要が増大するにつれ大量に細胞を培養す
ることが必要になってきている。細胞を大量に工業的規
模で培養する装置としては、微生物の培養に用いられる
ものと同様のジャーファーメンタ−やエアーリフト型フ
ァーメンタ−が用いられている。

大型ファーメンタ−による大量培養では、大型化による
設備投資費の増大、機械的シェアの増大、培地と細胞と
の分離の困難性、さらには細胞の剥離、脱落などの種々
の問題点がある。

ところが、上記の問題点は細胞培養の高密度化および固
定化培養という方向で解決されつつある。

そのひとつの方法としてアルギン酸のような細胞固定化
用ゲルの使用がある。部ち、細胞をゲル内に固定化する
ことにより、従来の大量培養で問題であった機械的シェ
ア、培地と細胞の分離の困難さが解決され、培地の交換
率が上昇し、細胞の生育環境が向上し高密度培養が可能
となっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで、固定化細胞では、細胞と培養液との分離が容
易になるため、培地の交換率を上げることができる、そ
して交換率に比例して細胞密度は上昇する。しかしなが
ら細胞固定化用ゲル内で細胞を培養するためには、ゲル
内に空隙がなければならず、ゲル当たりの空隙量が到達
細胞密度を左右している。この空隙の形成は、細胞や気
泡を起点としたカチオン濃度勾配の不均一性に起因して
いると考えられている。この空隙量は、固定化剤のロフ
トにより差があり、またゲル化させる時の条件にも大き
く左右される。この様に現在行われている培養方法では
空隙量をコントロールできないという問題点がある。

本発明は、細胞固定化用ゲル内の空隙で細胞を培養する
ことによる培養法における上記の問題点を解決すべく鋭
意努力の結果なされたものであって、その目的とすると
ころは細胞を固定化用ゲル内で増殖させる時に、その増
殖に必要なゲル内の空隙量を定量的に増大させ、細胞を
短時間にしかも高い細胞密度に到達させる培養方法を捷
供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

」二記目的を達成し得た本発明とは、可溶性固形物に細
胞を付着させた後に、細胞を付着した可溶性固形物を細
胞固定化用ゲルに固定化し、次に可溶性固形物を溶解す
ることによって当該ゲル内に空隙を形成させ、当該空隙
内で細胞を培養することによる細胞培養法である。

本発明において使用される可溶性固形物は、細胞に対し
て親和性があり、また細胞に対する悪影響が実質的にな
いか、または悪影響の少ない手段、たとえば加熱処理、
酵素処理などの手段によって溶解して非固形物となり得
るものであれば特に制限はな（、たとえばコラーゲンビ
ーズ、ゼラチンビーズ、アガロースビーズ、デキストロ
ースビーズなどの高分子化合物よりなるビーズなどが例
示される。当該可溶性固形物は、好ましくは１００〜５
００μ−１より好ましくは１５０〜２５０μ−程度であ
る。

本発明で使用される細胞は、増殖を意図するものであれ
ば、特に制限はなく動物由来細胞、植物由来細胞、微生
物由来細胞のいずれでもよく、それは遺伝子組換え細胞
、形質転換細胞、正常細胞などのいずれであってもよい
。また、当該細胞は付着依存性の細胞、付着非依存性の
細胞のいずれでもよい０本発明によって増殖される細胞
の好ましい具体例としては、たとえば大腸菌、酵母など
の微生物細胞、チャイニーズ・ハムスター・オバリー・
細胞、マウス細胞などの何着依存性動物細胞、ハイブリ
ドーマ、血球系細胞などの付着非依存性動物細胞、植物
カルス、昆虫細胞などが例示される。

当該細胞によって生産される物質としては、たとえばエ
リスロポエチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、イ
ンターフェロン、インターロイキン１、インターロイキ
ン２、インターロイキン３、モノクローナル抗体、イン
シュリン、成長ホルモンなどが例示される。

本発明においては、可溶性固形物に細胞を付着させた後
に、細胞固定化用ゲルに固定化するところに一つの特徴
がある。即ち、可溶性固形物に細胞を付着させることな
く、固定化した場合には当該細胞の増殖性は著しく劣る
ことになる。

本発明において、可溶性固形物に細胞を付着させる方法
としては、たとえば細胞と可溶性固形物を培地中に混合
し、細胞の生育にとって最適な温度でもって、容器中で
静置するか、間歇撹拌するか、または連続攪拌するかし
て細胞を可溶性固形物に付着させる方法（この時、可溶
性固形物表面にその細胞に対する親和性の高い物質、た
とえば、抗体などを塗布しておくと付着する細胞が多く
なる）などが例示される。

本発明において使用される細胞固定化用ゲルは細胞を固
定化しうるちのであり、ゲル化反応を行わせる際に細胞
に与える障害が少なく、かつ形成されたゲルを通して、
細胞により生成されたベプタイドや蛋白質が流出してく
るものであれば特に制限されるものではない。かかる細
胞固定化用ゲルとしては、具体的にはアガロース、Ｋ−
カラギナン、アルギン酸、アルギン酸塩（ナトリウム塩
、カリウム塩などのアルカリ金属塩など）などの天然高
分子、ポリビニルアルコール、光架橋性のボリエチレン
グリコール、ポリプロピレングリコールなどの合成高分
子などが挙げられる。

〔作用） 本発明においては、まず細胞を付着させた可溶性固形物
を用意する。当該ｒｉＴ溶性固形物は前述した方法によ
って容易に調製することができる。

次に、当該細胞を付着させた可溶性固形物を細胞固定化
用ゲルに固定化させる。ここに固定化とは細胞固定化用
ゲル内へ細胞を付着した可溶性固形物を封じ込めること
をいう。

一般に、当該固定化は目的とする細胞または細胞の付着
した可溶性固形物を細胞固定化用水溶液と混合し、２価
カチオンを添加したり、温度を上昇させたり、または温
度を下降させたりしてゲル化させ、細胞を閉じ込めるな
どの手段によって行われる。たとえば、細胞固定化用ゲ
ルとしてアルギン酸を使用する場合には、アルギン酸溶
液は、２価のカチオンが存在すると、ゲルを形成して固
化するので、この性質を利用して、アルギン酸カルシウ
ムゲルを形成させることが出来、これによって細胞を付
着した可溶性固形物の固定化が行われる。即ち、その表
面において細胞の増殖した可溶性固形物（たとえば、細
胞付着コラーゲンビーズ）の培地浮ｙｉ液とアルギン酸
塩水溶液とを混合し、これを塩化カルシウム溶液中に滴
下すると、アルギン酸カルシウムのゲルビーズが形成さ
れて、それに伴って可溶性固形物のアルギン酸カルシウ
ムのゲル、即ち細胞付着細胞固定化用ゲルへの固定化が
行われる。

その際、アルギン酸塩水溶液におけるアルギン酸塩は通
常０．５〜５％、好ましくは０．７５〜３％程度の濃度
であることが好適である。また、塩化カルシウム溶液は
５〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１１００ｒｎである
ことが好適である。可溶性固形物の培地浮遊液とアルギ
ン酸塩水溶液との混合割合は、前者１重量部に対して後
者０．５〜２重１部程度である。

その後、細胞固定化用ゲルに固定化された可溶性固形物
を溶解させる。当該溶解手段は可溶性固形物の種類など
によって異なるが、通常加熱処理、酵素による分解など
が例示される。加熱処理は通常３０〜４２゛Ｃ程度に加
熱することによって行われる。特に、コラーゲンビーズ
は３７°Ｃ程度に加熱することによって溶解させること
ができる。また、酵素による分解にて使用される酵素と
しては、たとえばコラーゲンビーズに対してはコラゲナ
ーゼが、アガロースビーズに対してはアガラーゼが、デ
キストロースビーズに対してはデキストラナーゼが使用
される０本発明においては、細胞に対する障害が少ない
ことから、酵素による溶解が好ましい、たとえば、可溶
性固形物がコラーゲンビーズである場合には、これをコ
ラゲナーゼ溶液（好ましくは、約１００μ／ｄの濃度の
コラゲナーゼ溶液）に浸漬してコラーゲンビーズを溶解
させる。

かくして、コラーゲンビーズの溶解した後の空隙には、
コラーゲンビーズに付着していた細胞が増殖することに
なる。

〔実施例〕

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、以
下に記載する例は本発明を比定するものではない。

実施例１ 培養装置として１．５Ｐスピナーフラスコを使用し、マ
イクロキャリアー培養を行った。また、細胞としてはヒ
トエリスロボエチン産生のマウス細胞（ＩＩ［Ｔ−１）
を培養し、ヒトエリスロボエチンを生産させた。培地と
しては、ＤＭＥ培地＋１０％ＦＣ５を使用した。

スピナーフラスコ培養によって細胞を壁着させたコラー
ゲンビーズと無菌の２％アルギン酸ナトリウム溶液を用
意する。当該コラーゲンビーズ浮遊液と２％アルギン酸
ナトリウム溶液を１：１　（重量比）で混合した。これ
を５０ｍＭ塩化カルシウム生理食塩液の中に滴下し、ア
ルギン酸カルシウムのゲルビーズを調製した。この状態
で約２０分間放置後、コラゲナーゼ溶液に置喚した。そ
のまま、３７°Ｃ数時間インキュベート後、培地で洗浄
し培養を開始する。培地交換を３〜４日間に１回行い、
ヒトエリスロボエチンの濃度を測定した。

本発明による細胞培養法により、アルギン酸カルシウム
ゲル内に、コラーゲンビーズの占めていた空間が、細胞
増殖用の空隙になっていることがわかる（第１図参照）
、これを経時的に観察すると６日目、１５５日目１８８
日目それぞれ第２図、第３図、第４図参照）に見られる
ように、上記空隙にのみ細胞が増加していくのが観察さ
れる。

比較例１ アルギン酸カルシウムゲルへ、可溶性固形物に細胞を付
着させないで細胞のみを固定化し、実施例１同様に処理
だ場合、墳養６日目にもかかわらず、細胞の増殖が観察
されなかった（第５図参照）比較例２ コラゲナーゼ処理をしない以外は実施例１の操作に準じ
て処理すると、コラーゲンビーズ表面にのみに細胞の増
殖が認められ、細胞がゲル内へ伸展して増加する傾向は
認められなかった（第６問）実験例１ 実施例１、比較例１および比較例２の培養の結果、培養
液中に分泌される、ヒトエリスロボエチン濃度の経時変
化を調べた。その結果を第７図に示した。第７図中、Ｏ
は実施例１を、・は比較例１を、Δは比較例２を示す。

第７図に示した結果から明らかなように、コラーゲンビ
ーズをコラゲナーゼ処理し溶解してできた空隙が有効に
働いて、培１ｉ２１日目にはヒトエリスロボエチン生産
性は、非常に高い状態を保つことが認められた。

（発明の効果） 以上述べた如（、本発明により細胞固定化用ゲル内の細
胞増殖可能空隙を定量的に調製することができ、これに
よって到達細胞密廣を高めることができる。かくして細
胞の生産する、エリスロボエチンなどの医薬品などとし
て有用な蛋白質の生産量の向上を図ることができるとい
う効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１〜６図は、培養時の細胞を示すところの生物の形態
に関する写真である。 第１図は実施例１における培養６日目の写真である（Ｘ
１００）。 第２図は実施例１における培！！６日自の写真である（
Ｘ４０）。 第３図は実施例１における培養１５５日目写真である（
Ｘ４Ｑ）。 第４図は実施例１における培養１８８日目写真である（
ｘ４０）。 第５図は比較例１における培養６日目の写真である（Ｘ
１００）。 第６図は比較例２における培養１８８日目写真である（
ｘ４０）。 第７図は実施例１、比較例１および比較例２におけるヒ
トエリスロボエチン生産量の経時変化を示すグラフであ
る。 第５図 第６図 第１図 図面の浄８ 第５図 第２図 第４図 第７図 手続補正書（自発） 平成１年４月１８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 可溶性固形物に細胞を付着させた後に、細胞を付着した
   可溶性固形物を細胞固定化用ゲルに固定化し、次に可溶
   性固形物を溶解することによって当該ゲル内に空隙を形
   成させ、当該空隙内で細胞を培養することを特徴とする
   細胞培養法。