CN105200032B - 一种固相化细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相化细胞的制备方法，所述方法包括在含欲被固相化细胞的悬液中加入果胶溶液，并加入氯化钙和壳聚糖溶液，以得到含果胶钙的细胞微球悬浮液。所述方法可以保持细胞的活性，允许细胞的营养成分进入微丸，维持细胞的正常生长和分裂，细胞的代谢产物可以分泌出微丸，进而从培养基中分离纯化相关的重组蛋白。本发明还公开了所述方法在固相化细胞工程化应用和药物制备方面的应用。

Description

一种固相化细胞的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种固相化的细胞，及在生物工程领域的应用。

背景技术

固相化细胞技术(Immobilized Cells)是20世纪60年代发展起来的一门新兴技术，在化工、能源、环保和医药等领域得到广泛的应用，它是指利用各种理化方法将游离细胞定位于特定的空间区域内，提高细胞或酶的浓度，并保持生物活性和反复利用的技术。与传统的悬浮生物处理法相比，固相化细胞有提高单位体积的细菌密度、菌体易回收、环境耐受力增强等优点，而且将菌体固相化可增加底物或产品对细胞膜的渗透性和酶的热稳定性。固相化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然环境，有效地利用游离细胞的完整酶系和细胞膜的选择通透性，其优点体现于：1.不需要将酶从微生物细胞中提取出来并加以纯化，酶活力损失小，成本低；2.酶处于天然细胞环境中中稳定性高；3.细胞生长停滞期时间短，细胞多，反应快，抗污染能力强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低。

目前的细胞固相化技术最多采用的方法中，以海藻酸钠、角叉菜聚糖等为载体，水溶解后通过和待固相化的细胞种子液混合，在含钙的溶液中形成凝胶，从而将细胞包埋或者结合其中，形成包含有细胞的固相化颗粒。能够形成凝胶的材料分子还包括聚乙烯醇。

海藻酸钠是从褐藻中提取的多糖，主要成分是Beta-D甘露糖醛酸和Alpha-L-古洛糖醛酸构成的多糖。L-古洛糖只在海洋植物中存在，动物体内不存在L-古洛糖及其衍生物，因此采用海藻酸钠包埋的细胞在动物体内生物相容性差，会引起免疫反应。而且海藻酸可以吸附铜、锌和锰等二价金属离子，这些金属离子是动物细胞培养过程中需要添加的微量元素，对于维持细胞的正常代谢和提高重组蛋白的表达水平有重要的作用。角叉菜聚糖是从鹿角菜等海洋植物中提取的聚糖，又名卡拉胶。角叉菜聚糖需要在较高的温度下(80℃)才能溶于水，低温下容易沉淀，而哺乳动物细胞一般不能耐受高温。聚乙二醇也可以用于细胞的包埋，但是易引起细胞脱水，在机体内有一定的毒性。

果胶是食品的天然成分之一，天然果胶类物质以原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的一种组成成分，它们伴随纤维素而存在，构成相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。原果胶是不溶于水的物质，但可在酸、碱、盐等化学试剂及酶的作用下，加水分解转变成水溶性果胶。果胶本质上是一种线形的多糖聚合物，含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基，其相应的平均相对分子质量为50000～150000。半乳糖及其衍生物是动物体内常见的糖分子，因此果胶在动物体内有较好的生物相容性，安全性高，不会引起免疫反应。在细胞培养工程中也不会吸附微量元素及其它的营养成分，对于维持哺乳动物细胞的正常代谢和高的重组蛋白表达水平具有重要的意义。

壳聚糖(Chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(Chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、生化和生物医学工程等诸多领域的有了广泛的应用。同时，果胶和壳聚糖是联合国粮农组织和世界卫生组织认定的食品添加剂，没有添加限制。

由于果胶可以被人结肠中菌群分泌的果胶酶所降解，因此以果胶作为阴离子组分、壳聚糖和钙离子作为阳离子组分，采用液中固相法制备骨架型微丸来制备药物结肠定位释放制剂已经有广泛报道，但是没有报道用于活细胞的固相化。鉴于现有技术在细胞固相化存在的上述技术问题，本发明意欲提供一种使用果胶对工程细胞进行固相化的方法，从而有利于工程细胞的产物生成和应用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种固相化细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在含欲被固相化细胞的悬液中加入果胶溶液，加入后的细胞悬液中，细胞浓度为10⁴-10⁷/ml；果胶浓度为1-10％；

(2)在步骤(1)获得的细胞悬液中加入含有氯化钙和壳聚糖的溶液，搅拌5-15分钟，其中氯化钙的浓度为0.5-10％，壳聚糖的浓度为0.1-5％；

(3)过滤步骤(2)获得的溶液，并重新悬浮获得的细胞。

在一个优选的技术方案中，所述步骤(1)中细胞浓度为5×10⁵/ml，果胶浓度为5％。

在另一个优选的技术方案中，所述步骤(2)中氯化钙的浓度为3％，壳聚糖的浓度为0.5％。

在一个更为优选的技术方案中，所述细胞为可以表达并分泌抗人Her-2抗原人源化单克隆抗体的工程细胞CHO。

另一方面，本发明还提供了一种应用上述固相化细胞的制备方法表达并分泌抗人Her-2抗原的人源化单克隆抗体的方法。

在一个优选的技术方案中，所述方法包括：

(1)将上述步骤(3)制备好的CHO细胞微球悬浮于CD-Forti-CHO无血清培养基中，振荡培养3-5天；

(2)回收培养基中的双特异性人源化单克隆抗体。

在一个更为优选的技术方案中，所述细胞微球与所述培养基的体积比为1：2，

在一个最为优选的技术方案中，所述细胞的培养环境为37℃，5％的CO₂，及150rpm振荡培养。

第三方面，本发明还提供了根据上述固相化细胞的制备方法获得的细胞在制备乳腺癌治疗药物中的应用。

在一个优选的技术方案中，所述细胞被制备为皮肤植入剂。

发明人设计了采用果胶、壳聚糖和钙离子液相固化微丸的方法对工程细胞进行固相化，从而可以保持细胞的活性。而果胶钙形成的骨架允许细胞的营养成分进入微丸，维持细胞的正常生长和分裂，细胞的代谢产物可以分泌出微丸，进而从培养基中分离纯化相关的重组蛋白；采用果胶钙包埋的能够表达并分泌双特异性人源化单克隆抗体的CHO工程细胞，可以连续培养进行抗体的生产；包埋后的细胞抗体分泌量在第一次培养阶段，抗体的表达量略低于常规培养的CHO细胞，在第二和第三批次3-5天的抗体表达量，可以达到常规培养14天的表达量。抗体的生产时间可以缩短到3-5天，与常规的培养20-30天的时间相比，大大提高了生产效率；而且，细胞微球的培养基中CHO细胞残留蛋白的浓度显著低于正常培养的CHO细胞，第一批次HCP的浓度为37.5μg/ml，第二批次的HCP浓度为43.4μg/ml，第三批次的HCP浓度为52.7μg/ml，而常规培养的CHO细胞培养基中HCP的浓度达到162.6μg/ml，说明包埋后细胞的存活率较高，HCP的浓度较低，在后续的抗体纯化中，可以显著降低HCP的残留。而死亡细胞的DNA与果胶钙结合，不全部释放到培养基中，测定的CHO DNA浓度只有常规培养细胞的1/10，因此可以显著提高后续纯化过程抗体的纯度，降低杂质的含量。

固相化的细胞可以作为植入剂植入病人皮下，分泌的治疗性蛋白，如抗体类药物、EPO等可以直接进入人体，起到治疗疾病的作用。在一定时间，可以将微丸通过手术的方法取出并放置新的微丸，避免了长期注射的问题。而且，果胶钙微丸具有良好的生物相容性，未在移植部位产生明显的排斥反应，稳定性也较好，17天未见微丸明显的降解和破坏，因此这一方法也可以用于疾病的治疗。

附图说明

图1.常规培养细胞与被包埋后的细胞分泌抗体浓度的柱状图；

图2.培养基中CHO细胞蛋白残留浓度的柱状图；

图3.被包埋细胞微丸的小鼠观察图；

图4.被包埋小鼠血清中双特异性抗体的浓度随时间变化的曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.固相化细胞微丸的制备

细胞的培养：可以表达抗人Her-2抗原的人源化单克隆抗体Herceptin的CHO细胞(构建方法见中国专利申请CN201510368641.7)接种于CD-Forti-CHO培养基(Invitrogen，货号：A11483-01)，37℃，5％CO₂，150rpm振荡培养至细胞密度达到5×106/ml，1000rpm室温离心5分钟，弃上清，用新鲜的培养基垂悬细胞，调整细胞密度到10⁷/ml，备用。

氯化钙交联溶液的配制：氯化钙3％(g/v，浓度范围：0.5-10％)，0.5％(0.1-5％)壳聚糖，溶解于80ml CD-Forti-CHO培养基中，采用1％的磷酸调节pH值到5.5(2.5-7.0)，至溶液完全变清，补充体积到100ml，0.22um滤器过滤除菌。

果胶钙微丸的制备步骤：

(1)含果胶细胞悬液的配制：

果胶5g溶解于90ml CD-Forti-CHO培养基(Invitrogen)，4℃搅拌过夜，0.22um过滤除菌，温度恢复到室温后，加5ml细胞悬液，补充体积到100ml，此时细胞密度5×10⁵/ml(范围：10⁴-10⁷/ml)，果胶浓度为5％(浓度范围：0.5-10％)。

(2)交联

在生物安全柜中采用注射器(5mL，7#针头)将果胶细胞悬液边缓慢搅拌边滴加到pH5.5氯化钙交联溶液中，针头离液面高度约为5cm左右，用磁力搅拌器搅拌，滴速大约2mL/min，交联时间10min。交联完成后，筛网过滤，PBS清洗三次，重悬于CD-Forti-CHO培养基中进行培养。

所制备的微丸均为圆球形，用光学显微镜进行目测法测定微丸的直径。具体操作为：取少许湿微丸，加蒸馏水分散，盖上盖玻片(注意除尽气泡)，用有刻度标尺(刻度已校正其每格的μm数)的接目镜的显微镜，测量100个微囊，微丸粒径分布在0.8-1.1mm间，微丸外膜的厚度大约为0.05-0.07mm。

实施例2.固相化细胞的流加培养及工程化应用

将制备好的果胶钙CHO细胞微球悬浮于CD-Forti-CHO无血清培养基中，体积比为1：2(微球：培养基)，37℃，5％的CO₂培养，150rpm振荡培养，在第3，5，7，9，11和13天，分别检测培养基中葡萄糖、各种氨基酸和乳酸的浓度，根据需要补加葡萄糖和Feed C-ATG(Invitrogen A14420-01)补料的浓度分别到4.5克/升和5-10％，同时用0.1mol/L的NaOH调节pH值到7.2，继续培养到14天，过滤回收培养基，用新鲜的培养基重悬细胞微球，继续培养细胞微球3-5天。每天检测培养基中葡萄糖、各种氨基酸和乳酸的浓度，第5天过滤回收培养基，微球用新鲜的培养基重悬，重复培养2-3次。

回收的培养基采用ELISA的方法检测培养基中抗体和CHO细胞残留蛋白(HCP)的浓度，采用荧光定量PCR的方法检测CHO细胞DNA的残留浓度。

实施例3.培养基中抗体浓度的检测：

1.包被：用PBS将Her-2抗原稀释为10ug/ml，每孔100ul，置于4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗3次，每次3分钟；

2.封闭：每孔加200ul新鲜配制的1％BSA，置于37℃，1小时；然后，弃去孔内溶液，用PBST洗3次，每次3分钟；

3.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤3次；标准品Herceptin所用浓度(ng/ml)如下：

0、0.488、0.9765、1.9531、3.906、7.8125、15.625、31.5、62.5、125；

4.加酶标抗体：在各反应孔中，加入新鲜稀释的HRP标记兔抗人IgG0.1ml；37℃孵育1小时，之后用PBST洗3次，每次3分钟；

5.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～15分钟；

6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

如图1所示，在不同培养代数的培养基中，Herceptin抗体的浓度分别为1.2克/升，1.4克/升、1.43克/升和1.2克/升，与14天正常培养的CHO细胞的产率相近(1.4克/升)。

实施例3的结果表明：

1.采用果胶钙包埋CHO工程细胞，可以连续培养进行抗体的生产；

2.采用果胶钙包埋的细胞，抗体的生产时间可以缩短到3-5天，与常规的培养20-30天的时间相比，大大提高了生产效率；

3.包埋后的细胞抗体分泌量在第一次培养阶段，抗体的表达量略低于常规培养的CHO细胞，在第二和第三批次3-5天的抗体表达量，可以达到常规培养14天的表达量。

实施例4.培养基中CHO细胞蛋白残留的检测

按照试剂盒中的操作步骤(Cygnus公司的CHO宿主细胞残留蛋白免疫酶法检测试剂盒：Catalog#F550)，

1.将回收的培养基稀释10000倍备用；

2.在已吸附的抗HCP抗体的酶标条的孔中，分别加入50微升稀释后的样品、阳性和阴性对照和1ng/ml、3ng/ml、12ng/ml、40ng/ml和100ng/ml的标准品，150rpm室温震荡2小时，弃液体，采用PBST缓冲液充分洗涤酶标板5次；

3.加入100微升HRP标记的抗HCP二抗；

4.加TMB溶液100微升，室温反应30分钟，不需振荡。然后加终止液100微升。30分钟内读取样品的吸收值并计算HCP的浓度。

从图2中可以看出，细胞微球的培养基中CHO细胞残留蛋白的浓度显著低于正常培养的CHO细胞，第一批次HCP的浓度为37.5μg/ml，第二批次的HCP浓度为43.4μg/ml，第三批次的HCP浓度为52.7μg/ml，而常规培养的CHO细胞培养基中HCP的浓度达到162.6μg/ml，说明包埋后细胞的活率较高，HCP的浓度较低，在后续的抗体纯化中，可以显著降低HCP的残留。

实施例5.CHO细胞残留DNA的检测

采用美国Life Technology公司的PreprepDNA提取试剂盒和CHO DNA定量PCR试剂盒制备和检测培养基中CHO细胞的残留DNA。

1.DNA的制备：将回收的培养基的pH值调整到6-8，每100微升培养基加70微升的蛋白酶K，56℃孵育30分钟，加360微升的裂解缓冲液；

2.将磁珠平衡在37℃放置10分钟振荡混匀，取30微升磁珠悬液，加入DNA样品中。加300微升结合缓冲液，振荡5分钟后，离心15秒，将离心管置于磁场内，放置5分钟，弃上清；

3.加300微升洗涤液，重复上述步骤，洗涤3次后，弃上清，空气干燥5分钟，加50微升洗脱缓冲液洗脱DNA，回收上清备用；

4.建立0-300ng/ml的10倍梯度稀释的CHO DNA标准浓度试管；

5.从制备的DNA样品中取10微升置于PCR反应管中，每管加3ng/ml的CHO DNA16.7微升作为内参；

6.按照试剂盒的说明建立30微升PCR反应体系，采用绝对定量的方法在ABI 7500荧光定量PCR仪上检测CHO DNA的残留的浓度。

表1.CHO细胞培养过程中DNA残留的检测

	常规培养	包埋培养1	包埋培养2	包埋培养3
					残留DNA浓度(μg/ml)	55	2.2	4.6	5.3

从表中可以看出，细胞微球在培养基中的残留要显著低于正常CHO细胞培养后的DNA残留。第一批次细胞微丸的CHO细胞DNA浓度为2.2μg/ml，第二批次的CHO细胞DNA残留浓度为4.6μg/ml，第三批次的CHO细胞DNA残留浓度为5.3μg/ml，而常规培养的CHO细胞，培养基中CHO细胞DNA残留的浓度达到55μg/ml。

实施例4和5的结果表明：

果胶钙包埋的CHO细胞由于培养时间短，培养基中宿主细胞蛋白和DNA的残留都显著低于常规培养的CHO细胞宿主细胞。说明果胶钙包埋后的细胞虽然有死亡，但是死亡率小于常规培养的细胞，因此产生的HCP蛋白残留也较少。而死亡细胞的DNA可能与果胶钙结合没有释放全部到培养基中，测定的CHO DNA浓度只有常规培养细胞的1/10，因此可以显著提高后续纯化过程抗体的纯度，降低杂质的含量。

实施例6.果胶钙细胞微丸的小鼠移植实验

取包埋好的细胞微丸，在无菌条件下，在麻醉后的小鼠背部皮肤剪口，将1粒微丸移植到伤口内，小心缝合伤口，将小鼠置于生物安全柜内复苏(见图3)。复苏后，将小鼠放入笼中继续饲养。从第3天起从小鼠尾静脉取血，检测小鼠血液中Herceptin抗体的浓度，连续检测14天。

从图4中可以看出，第三天起小鼠血液中可以检测到Herceptin的浓度达到1.2μg/ml，到第7天达到8μg/ml并可以维持到至少17天的浓度。

实施例6的结果表明：

1.果胶钙包埋的表达重组蛋白的工程细胞可以在移植到动物和人体内进行表达，在血液中可以检测到所表达的重组蛋白，重组蛋白可以维持较高的血液浓度，并具有相应的生物学活性；

2.果胶钙微丸具有良好的生物相容性，未在移植部位产生明显的排斥反应，稳定性也较好，17天未见微丸明显的降解和破坏，因此这一方法也可以用于疾病的治疗。

Claims (7)

1.一种固相化细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）在含欲被固相化细胞的悬液中加入果胶溶液，加入后的细胞悬液中，细胞浓度为5×10⁵/ml；果胶浓度为5%，所述细胞为表达并分泌抗人Her-2抗原的人源化单克隆抗体Herceptin的工程细胞CHO；

（2）在步骤（1）获得的细胞悬液中加入含有氯化钙和壳聚糖的溶液，搅拌5-15分钟，其中氯化钙的浓度为3%，壳聚糖的浓度为0.5%；

（3）过滤步骤（2）获得的溶液，并重新悬浮获得的细胞。

2.一种应用权利要求1所述的方法制备的固相化细胞体外表达并分泌抗人Her-2抗原的人源化单克隆抗体的方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将权利要求1所述方法制备的固相化细胞，即CHO细胞微球，悬浮于CD-Forti-CHO无血清培养基中，振荡培养3-5天；

（2）回收培养基中的抗人Her-2抗原的人源化单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞微球与所述培养基的体积比为1：2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞的培养环境为37℃，5%的CO₂，及150rpm振荡培养。

6.根据权利要求1所述方法获得的细胞在制备乳腺癌治疗药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞被制备为皮肤植入剂。