DE3315081A1 - Insolubilisiertes adult-t-zellen-leukaemieantigen, verfahren zu dessen herstellung und bestimmung des entsprechenden antikoerpers hierzu - Google Patents
Insolubilisiertes adult-t-zellen-leukaemieantigen, verfahren zu dessen herstellung und bestimmung des entsprechenden antikoerpers hierzuInfo
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Description
OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., Ltd., Tokyo / Japan
Insolubilisiertes Adult-T-Zellen-Leukämieantigen,
Verfahrren zu dessen Herstellung und Bestimmung des entsprechenden Antikörpers hierzu
Die Erfindung betrifft ein insolubilisiertes Adult-T-Zellen-Leukämieantigen,
ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie ein Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers, der mit Adult-T-Zellen-Leukämie assoziiert
ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers nach der
indirekten Fluorescenz-Antikörper-Methode oder der Enzym-Antikörper-Methode unter Verwendung eines Antigens,
das spezifisch mit Seren von Patienten reagiert, die an Adult-T-Zellen-Leukämie leiden.
• ι» «ο
Adult-T-Zellen-Leukämie (im folgenden als ATL bezeichnet)
stelle eine bösartige Erkrankung dar, die Erwachsene überfällt. Die Ursache dieser Erkrankung
ist bis heute noch nicht völlig aufgeklärt (siehe Takatsuki, K., Uchiyarna, T., Sagawa, K. und Yodoi, J.
[1977] in "Topics in Hematologoy, Herausgeber Seno, S. Takaku F., und Irino S., (Excepta Medica, Amsterdam)
Seiten 73-77, und Uchiyama, T., Yodoi, J., Sagawa, K., Takatsuki, K. und Uchino, H., Blood 50, 481
bis 492 [1977], etc.).
Auf der Grundlage der Erkenntnis, dass kultivierte ATL-Zellen oder ATL-Virus-assoziierte Zellinien ein
für ATL spezifisches Antigen enthalten (ATL-assoziiertes
Antigen oder ATL-Antigen, im folgenden als ATLA bezeichnet), das in frischen ATL-Zellen im periphären
Blut von ATL-Patienten nicht nachgewiesen wurde, und dass Seren von ATL-Patienten oder bestimmten
Erwachsenen in ATL-endemischen Bereichen einen Antikörper enthalten, der spezifisch mit dem genannten
ATLA reagiert (im folgenden als ATLA-Antikörper bezeichnet) wurde in jüngster Zeit ein Verfahren zur
Bestimmung von ATLA-Antikörper mittels Fluorescenz-Immunoassay vorgeschlagen, das die Diagnose von ATL
ermöglicht (Proc. Natl. Acad. Sei, USA, Band 78, Nr.
10, S. 6476-6480 [1981]).
Dieses Verfahren besteht darin, dass man ATL-positive Zellen als ein Antigen auf eine Glasplatte aufbringt,
das Antigen mit einem Testprobenserum und Fluorescenz-markiertem anti-human-Imrnunoglobulin G reagieren
lässt, und mikroskopisch die Lokalisierung von Fluorescenzmarker zur Bestimmung von ATLA-Antikörper
beobachtet.
'
Dieses Verfahren hat jedoch verschiedene Nachteile, indem es lebende Zellen als solche als ein Antigen
verwendet, und es ist erforderlich, für jede Probe (Testprobenserum) eine mikroskopische Untersuchung
durchzuführen. Dies führt aber dazu, dass das Verfahren kompliziert ist und dass es schwierig ist, grosse
Mengen an Testproben auf einfache Weise und schnell zu bestimmen und zu diagnostizieren.
Ein weiterer Nachteil des vorstehenden Verfahrens besteht darin, dass es schwierig ist, die Fluktuation
der Antigen-Positivität zu vermeiden, da intakte Zellen verwendet werden. Deshalb ist es schwierig, konstant
eine gewünschte Antigenqualität zu erhalten, was wiederum zu einer falschen Bestimmung und Diagnose
führt. Aus diesem Grunde erfüllt dieses Verfahren nicht die Anforderung, dass es unter fixierten Bedingungen
ausgeführt werden kann. Diese Anforderung muss aber bei einer breiten Anwendung des Verfahrens erfüllt
sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Bestimmung von ATLA-Antikörper zur Verfügung zu stellen, mit welchem die Nachteile der konventionellen
Methode zur Bestimmung von ATLA-Antikörper überwunden werden.
Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen wurde nun von der Anmelderin gefunden, dass lösliches cytoplasmisches
Protein von kultivierten ATL-Zellen (im folgenden als SCP bezeichnet) und solubilisiertes Protein
von ATL-Virus (im folgenden als VAP bezeichnet) als ein Antigen verwendet werden kann, welches spezi-
« MM ma
- 11 -
fisch mit ATLA-Antikörper reagieren kann, und das grosse Mengen an Testproben auf einfache und schnelle
Weise bestimmt werden können, wobei diese Bestimmungen
unter fixierten Bedingungen mit hoher Effizienz erfolgen, wenn ein insolubilisiertes Antigen verwendet
wird, das hergestellt wird, durch Insolubilisierung von SCP oder VAP auf einem unlöslichen Träger,
Die vorliegende Erfindung beruht auf den vorstehend genannten Erkenntnissen und stellt ein Verfahren zur
Bestimmung von ATLA-Antikörper mit Hilfe von Pluorescenz-Immunoassay
oder Enzym-Immunoassay zur Verfugung, welches die Verwendung eines insolubilisierten
Antigens vorsieht, das einen unlöslichen Träger umfasst, auf welchem mindestens eine Substanz, ausgewählt
aus der Gruppe eines löslichen cytoplasmischen Proteins von ATL-Zellen und einem solubilisierten
Protein von ATL-Virus, insolubilisiert ist.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung können grosse Mengen an Testproben nach einer vereinfachen Arbeitsweise
schnell bestimmt werden. Z.B. ist es möglich zehnmal so viele Proben zu untersuchen als mit Hilfe
der konventionellen mikroskopischen Untersuchung, oder es kann die gleiche Menge an Proben etwa zehnmal
so schnell bestimmt werden als nach dem konventionellen Verfahren.
Fig. 1 stellt ein Diagramm dar, in welchem gegen die Serenverdünnung die optische Dichte bei 492 nm von
ATLA-Antikörper, bestimmt nach der erfindungsgemässen Methode (Beispiel 5), aufgetragen ist.
:.L..::::":: 3315O81
Als Kultur von ATL-Zellen, die gemäss der Erfindung
als Quelle für SCP verwendet wird, sind die ATL-Zellen, die bereits als Zellinie etabliert sind, zu nennen
(Miyoshi, I., Kubonishi, I., Sumida, M., Hiraki, S., Tsubota, T, Kimura, I., Miyamoto, K. und Sato J.,
Gann 71, 155-176 [1980]), eine Kultur von ATL-Zellen, die aus dem periphären Blut oder Lymphknoten von Patienten
mit ATL auf konventionelle Weise abgetrennt wurden, und ATL-Virus-assoziierte Zellen, die durch
Kokultivierung der vorstehend beschriebenen ATL-Zellen und human-T-Zellen erhalten wurden (z.B. Nature
294, S. 770-771 [1981]). Die bei der vorstehend beschriebenen Kokultivierung zu verwendenden human-T-ZeIlen
sind nicht besonders beschränkt, es können hierfür z.B. verschiedene T-Zellen von periphärem
Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Milz, Tonsillen, Thymus, etc. verwendet werden.
Die Kultivierung der vorstehend genannten ATL-Zellen oder die Kokultivierung von ATL-Zellen und human-T-Zellen
kann in üblicher Weise vorgenommen werden. Das Medium ist nicht besonders limitiert, und es können
verschiedene Nährstoffmedien, wie sie für übliche Zellkulturen verwendet werden, eingesetzt werden. Bevorzugte
Beispiele von Kulturmedien umfassen z.B.
RPMI 1640-Medium (Flow Laboratories, Co.) und Minimum-Eagle-essentielles-Medium
(MEM-Medium), modifiziert mit einem ergänzenden Serum, wie z.B. Fötalrinderserum
(FCS) oder Kälberserum. 30
ft · m * *·
- 13 -
Die Bedingungen zur Kultivierung unterscheiden sich nicht im wesentlichen von denen, wie sie für die übliche
Zellkultur angewendet werden. Im allgemeinen wird eine Temperatur von ca. 36 bis 38°C und ein pH-Wert
von ca. 6,4 bis 7,6 angewendet. Sofern dies gewünscht wird, können Wachstumsacceleratoren, wie T-Zellen-Wachstumsfaktor
(TCGF) oder Chemikalien, die als Induktoren von Retrovirus von Säugern bekannt
sind, wie z.B. 5-Jodo-2'-desoxyuridin (IdUrd), Cyclohexylimid
(CH), Puromycin, Phorbol-12-myristat-13-acetat (TPA), n-Butyrat (Natrium-n-butyrat), etc.,
zugegeben werden. Die Kultivierung wird vorteilhafterweise durch Austausch der Lösung jeden dritten
oder fünften Tag vorgenommen, wodurch gewährleistet wird, dass die gewünschten Zellen bevorzugt wachsen.
Ausserdem kann als SCP eine Präparation verwendet werden, die erhalten wird durch Homogenisieren der
vorstehend genannten kultivierten ATL-Zellen in einer geeigneten Pufferlösung, wie z.B. physiologische
Kochsalzlösung, phosphatgepufferte-Kochsalzlösung,
■ etc., und Gewinnung der Substanz als überstand mit Hilfe der Zentrifugation oder einem ähnlich geeigneten
Trennschritt.
Beispiele von ATL-Virus, die als VAP-Quelle verwendet
werden können, umfassen solche, die von der Kulturflüssigkeit der vorstehend beschriebenen ATL-Zellen
in konventioneller Weise isoliert wurden. Die Isolierung des ATL-Virus kann mit Hilfe konventioneller
Zentrifugationsmethoden erfolgen. Es ist bevorzugt,
einen ATL-Virus zu verwenden, der im weiteren durch die Dichtegradienten-Methode gereinigt wurde.
:.:..::::":: 3315O81
VAP kann erhalten werden durch Solubilisieren von ATL-Virus. Die Solubilisierung von ATL-Virus kann auf
einfache Weise unter Verwendung üblicher So]ubilisierungsagentien durchgeführt werden.
Beispiele von Solubilisierungsagentien umfassen verschiedene oberflächenaktive Stoffe, wie nicht-ionische,
oberflächenaktive Stoffe, z.B. "Triton X-IOO"
(ein Handelsname für ein Produkt von Wako Pure Chemical
Co., Ltd.), "NP-40n (ein Handelsname für ein Produkt
von Shell Co.), Digitonin, Harnstoff, etc., und anionische, oberflächenaktive Mittel, z.B. Natriumdodecylsulfat
(SDS), etc..
Hinsichtlich der Methode zur Solubilisierung bestehen keine Beschränkungen. Es ist jedoch bevorzugt, die
Solubilisierung unter Verwendung eines Solubilisierungsagens in einer Menge von 0,01 % zu verwenden, in
bezug auf die Menge, die einen Mycellen-bildendem Punkt entspricht, bei einer Temperatur von ca. 00C
bis ca. 100°C im Verlaufe von mehreren Minuten bis ca. 6 h. Bevorzugt wird das auf diese Weise erhaltene
VAP im weiteren durch übliche Methoden gereinigt, wie z.B. Zentrifugation, Dialyse, etc., und dann einer
Anionenaustausch-Säulenchromatografie unter Verwendung
von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, etc., unterworfen,
um virale Nucleinsäure, die bei dem VAP verblieben ist, zu adsorbieren und zu entfernen.
Das inso3ubilisierte Antigen, das gemäss der Erfindung
verwendet wird, kann hergestellt werden durch Insolubilisierung von SCP und/oder VAP auf einem unlöslichen
Träger. Es bestehen keine besonderen Beschränkungen hinsichtlich des zu verwendenden unlöslichen
Trägers; es können übliche, bei physikalischen Adsorptionsmethoden verwendete Träger eingesetzt werden,
insbesonder. poröse Träger von Polystyrol, Glas, Polycarbonat, Polypropylen, etc..
Die Fixierung von SCP und/oder VAP auf dem unlöslichen
Träger kann auf konventionelle Weise durchgeführt werden. Z.B. werden ein unlöslicher Träger und
SCP und/oder VAP zu einer Lösung, wie eine physiologische Kochsalzlösung, Phosphatpuffer, etc., zugegeben,
und man lässt das Gemisch bei ca. 00C bis ca.
37°C ca. 2 bis ca. 24 h lang umsetzen. Es ist bevorzugt,
diese Reaktion unter vermindertem Druck durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion werden die Adsorptionssteilen,
die auf dem unlöslichen Träger verbleiben, in üblicher Weise abgesättigt, z.B. mit 0,2
% Gelatine, 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA), etc..
Das auf diese Weise erhaltene unlösliche Antigen wird mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Präparation wird
im trockenen Zustand oder in der vorstehend beschriebenen Pufferlösung gelagert.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann ausgeführt werden
durch Bestimmung der Marker (lable)-Aktivität eines markierten Antigen-Antikörper-Komplexes nach
dem übliche Fluorescenz-Immunoassay oder Enzym-Immunoassay
unter Verwendung des unlöslichen Antigens.
Inbesondere wird das Verfahren ausgeführt durch Zugabe
eines Testprobenserums, das gegebenenfalls verdünnt ist, zu dem unlöslichen Antigen, wobei eine Immunreaktion
zwischen denselben erfolgt; daraufhin wird der gebildete Antigen-Antikörper-Komplex gewaschen,
der Komplex mit einem Markierungseffektor umgesetzt, um den Komplex zu markieren, und die Markeraktivität
des markierten Komplexes auf übliche Weise bestimmt.
Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens unter
Verwendung eines unlöslichen Antigens ist es möglich, innerhalb einer bestimmten Zeit grosse Mengen an
Testprobenseren schnell, einfach und genau bei fixierten Bedingungen zu bestimmen.
Als Testprobenseren können verwendet werden, Seren, die aus dem in üblicher Weise gesammelten Blut von
einem Erwachsenen, bei dem eine Bestimmung von ATLA-Antikörper durchgeführt werden soll, abgetrennt wurden,
oder verdünnte Präparationen dieser Seren, wobei die Verdünnung mit einer geeigneten Pufferlösung vorgenommen
wird. Es bestehen keine besonderen Beschränkungen hinsichtlich der zu verwendenden Pufferlösung.
Im allgemeinen ist es bevorzugt, eine Phosphatpufferlösung
(pH 7,4) zu verwenden.
Die Immunreaktion zwischen dem Testprobenserum und dem unlöslichen Antigen kann durch einfaches Vermischen
derselben durchgeführt werden, üblicherweise
erfolgt die Reaktion bei ca. 4 bis ca. 37°C in einem
Zeitintervall von ca. 0,5 bis ca. 16 h. Wenn dies gewünscht wird, so wird nach Beendigung der Reaktion
das Reaktionsprodukt in ausreichender Weise mit einer geeigneten Pufferlösung, vorzugsweise physiologischer
Kochsalzlösung, oder der Pufferlösung, die für die Verdünnung des Testprobenserums verwendet wurde, gewaschen.
Die Markierung (labeling) des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes
mit einem Markierungseffektor, die nach der Immunreaktion durchgeführt wird, erfolgt
durch Vermischen des erhaltenen Antigen-Antikörper-Komplexes
mit einem Markierungseffektor, welcher mit der gleichen Pufferlösung, wie dies vorstehend beschrieben
ist, verdünnt wurde; man lässt das Gemisch bei ca. 4°C bis ca. 37°C ca. 0,5 bis 16 h reagieren.
Nach Beendigung der Reaktion ist es bevorzugt, den erhaltenen Komplex ausreichend und in ähnlicher Weise,
wie dies vorstehend angegeben ist, zu waschen.
Als Markierunseffektor kann jedes beliebige zusammengesetzte
Material verwendet werden, welches aus einer Substanz besteht, die in der Lage ist, spezifisch mit
einem Antikörper zu binden, und einem beliebigen Enzym oder Fluorescein. Repräsentative Beispiele von
Enzymen umfassen eine Reihe üblicher Enzymreagentien, wie Peroxidase (POX), Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase,
Glyceroaldehyd-3-phosphorsäure-dehydrogenase,
Amylase, Phosphorylase, D-Nase, P-Nase, etc..
Das Fluorescein stellt beispielsweise übliche Fluorescenzfarbstoffe
dar, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetrarnethylrhodamin-isothiocyanat
(TRITC), substituiertes Rhodamin-isothiocyanat (XRITC), Rhodamin B-isothiocyanat, Dichlorotriazinfluorescein
(DTAF), etc..
Beispiele von Substanzen, die in der Lage sind, spezifisch mit einem Antikörper zu binden, umfassen
"Protein A" (Pro A, ein Produkt von Pharmacia Co.) und anti-human-Immunoglobulin G (im folgenden bezeichnet
als IgG) Antikörper, wie Schaf-anti-human-IgG-Antikörper,
Kaninchen-anti-human-IgG-Antikörper,
Ziegen-anti-human-IgG-Antikörper, Maus-anti-human-IgG-Antikörper,
Ratten-anti-human-IgG-Antikörper etc..
Verschiedene Komplexe einer Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an einen Antikörper zu binden, und
der Markierungssubstanz sind kommerziell erhältlich; sie können als Markierungseffektor gemäss der Erfindung
verwendet werden.
Andererseits können solche Komplexe vor deren Verwendung nach üblichen Methoden, wie sie von B.F. Erlanger
et al: Acta Endocrinol. Suppl. 168, 206 [1972] und M.H. Karol et al: Proc. Nat. Acad.Sci. USA 57,
713 [1967]) beschrieben werden, frisch hergestellt werden.
Genauer gesagt bedeutet dies, dass wenn ein Enzym verwendet wird, dieses Enzym und Pro A oder anti-hurn-.
an-IgG-Antikörper in ein%r Pufferlösung (pH 4 bis 6)
in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels, wie
z.B. NaJO4, bei Zimmertemperatur innerhalb von 2 bis 5 h gekoppelt und dann mit einem geeigneten Reduktionsmittel,
wie z.B. NaBH,, reduziert werden.
Im Hinblick auf die eingesetzten Mengen der Reagentien ist es bevorzugt, dass ca. 1 bis ca. 3 Mol Enzym
und ca. 100 bis 300 Mol des Oxidationsmittels pro Mol Pro A oder anti-human-IgG-Antikörper verwendet werden.
Vorzugsweise wird das Reduktionsmittel in einer Menge von ca. 1 bis ca. 2 Mol pro Mol Oxidationsmittel
verwendet.
Wenn Markierungseffektoren hergestellt werden unter
Verwendung eines Pluoresceins, wird das Fluorescein zu Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung, dessen
pH-Wert 6 bis 8 beträgt, zugegeben, und das Gemisch wird mit Pro A oder anti-human-IgG-Antikörper bei ca.
00C bis Raumtemperatur in einem Zeitraum von ca. 0,5
bis ca. 3h umgesetzt (siehe "Keiko Kotai Ho" [Fluorescenz-Antikörper-Methode]
Ikagaku Jikkenho Koza, Nr. 4, 263-270 [1972], 1. Ausgabe, Nakayama Shoten Co., Ltd., Tokyo). Es ist bevorzugt, dass die Menge
an eingesetztem Fluorescein ca. 1/50 Gewichtsteil pro Gewichtsteil an Pro A oder Anti-human-IgG-Antikörper
beträgt.
Gemäss der Erfindung kann der Komplex aus unlöslichem Antigen-Testprobenserum (ATLA-Antikörper)-Markierungseffektor
in üblicherweise bestimmt werden, die im Hinblick auf die Markierungssubstanz in dem Markierungseffektor
gewählt wird, durch Bestimmung der Markierungsaktivität (i.e. Aktivität des Enzyms oder
der Fluorescenz). Auf diese Weise ist es möglich, eine grosse Menge an Testprobenserum, ATLA-Antikörper,
auf einfache und schnelle Weise zu bestimmen.
Im folgenden wird die Erfindung durch die nachfolgenden Referenzbeispiele und Beispiele näher erläutert,
die jedoch nicht eine Beschränkung der Erfindung darstellen sollen.
Blut (20 ml), das von einem Patienten mit ATL (50-jährig, männlich, aus Nagasaki City) unter Verwendung
von Heparin gesammelt wurde, wurde in "Ficoll Pack" (hergestellt von Pharmacia Japan Co.) zentrifugiert,
wobei 5x10 Zeil·
erhalten wurden.
wobei 5x10 Zellen von Peripären-Blut-Lymphocyten
Diese Zellen wurden 3 Tage lang bei 37°C in RPMI-1640/10%-Kälberserum
(Flow Laboratories Co.) bei einer Zellkonzentration von 3x10 Zellen/ml kultiviert.
Ein Teil der auf diese Weise erhaltenen Zellen
(6x10 Zellen) wurde in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (welche 0,14 M NaCl enthielt, pH 7,4, im
folgenden als PBS bezeichnet) homogenisiert und 1 h zentrifugiert (105.000xg). Der überstand wurde gesammelt
und der Proteingehalt mit PBS auf 120 ,ug/ml eingestellt (der Proteingehalt wurde mit Hilfe der
kolorimetrischen Methode unter Verwendung von "Tonein -TP", Markenname für ein Reagenz zur quantitativen
Bestimmung des Gesamtproteins, hergestellt von Otsuka Assay Laboratories, Co., Ltd., bestimmt),
wobei eine SCP-Lösung erhalten wurde.
Zu der SCP-Lösung (140 ml) wurden 700 Polystyrolkügelchen
(Durchmesser: 6,4 mm, hergestellt von Precision Plastic Co., Ltd., USA) zugegeben, welche vorher
der Reihe nach mit einer wässrigen 0,1 N HCl-Lösung,
einer wässrigen 0,1 M NaOH-Lösung und Ethanol gewaschen worden waren, und das Gemisch wurde 6 h lang
bei Raumtemperatur unter der Saugwirkung einer Wasserstrahlpumpe
(Aspirator) stehen gelassen, anschliessend erfolgte Filtration, wobei das unlösliche
Antigen erhalten wurde. Dieses wurde in 0,05 M Phosphatpufferlösung,
die 0,2 % Gelatine (pH 7,4) enthielt, bei 4°C gelagert.
Beispiel 2
25
25
(1) ATL-Zellen (Kyo-Ya-Zellen, die vom Virus Research
Institute der Kyoto-Universität zur Verfügung gestellt wurden) wurden 4 Tage bei 37°C in RPMI-
-640/10%-Kälberserum und 50 ,ug/ml IdUrd (Flow Laboratories
Co.) bei einer Zellkonzentration von
3x10 Zellen/ml kultiviert. Die Kulturflüssigkeit
wurde bei 1.500 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um
die Zellen und das Kulturmedium abzutrennen, die getrennt gesammelt wurden.
5
5
(2) Zu einem Anteil der kultivierten ATL-Zellen
(5x10 Zellen), wie sie vorstehend unter (1) erhalten wurden, wurden 30 ml pyhsiologische Kochsalzlösung
zugegeben; das Gemisch wurde homogenisiert und dann 1 h lang bei 105.000 χ g zentrifugiert. Der
überstand wrude gesammelt und dessen Proteingehalt auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 eingestellt,
um eine SCP-Lösung mit einem Proteingehalt von 120/Ug/ml herzustellen, aus welcher ein unlösliches
Antigen, i.e. Antigen-absorbierende Polystyrolkugeln, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bereitet wurde.
Das erhaltene Antigen wurde eine Nacht in 0,05 M Phosphatpufferlösung, die 0,2 % Gelatine (pH 7,4)
enthielt, stehen gelassen, mit Wasser gewaschen, getrocknet und bis zur Verwendung gelagert.
(3) Das Kulturmedium (500 ml), welches vorstehend unter (1) erhalten wurde, wurde bei 40.000xg 1 h lang
zentrifugiert und der Niederschlag (pellet) gesammelt. Der Niederschlag wurde daraufhin einer Dichtegradienten-zentrifugation
mit 25 bis 60 % Zucker unterworfen, und die Fraktionen mit einer Dichte von
1,15 bis 1,16 gesammelt. Diese Fraktionen wurden mit 1,5 ml einer wässrigen 0,8 M NaCl-Lösung, welche 0,5
% Triton X-100 enthielt, bei 4°C 60 Minuten lange solubilisiert
und dann eine Stunde lang einer Zentrifugation bei 35.000 UpM unterworfen und der Überstand
gesammelt.
Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde gegen 0,02 M Tris-HCl-Pufferlösung, welche 0,3 M NaCl (pH
7,5) enthielt, unter Verwendung einer Cellophanmembran 5 h lang dialysiert, um das Solubilisierungsagens
zu entfernen und die Konzentration der Salze einzustellen. Die auf diese Weise erhaltenene VAP-Lösung
wurde über eine DEAE-Cellulose-Säule, die mit
der gleichen Tris-HCl-Pufferlösung equilibriert war,
gegeben, um die Fraktion zu erhalten, die ohne adsorbiert zu werden, die Säule passierte. Dieser Fraktion
wurde destilliertes Wasser zugegeben, um deren Proteingehalt auf 2,8 ,ug/ml einzustellen. Zu einem Anteil
von 40 ml dieser Lösung wurden 80 Polystyrolkügelchen analog wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben,
wobei diese Polystyrolkügelchen wie in Beispiel 1 gewaschen worden waren; diese wurden dann 6 h lang
bei Raumtemperatur stehen gelassen, um das unlösliche Antigen zu erhalten. Dieses wurde dann über Nacht in
einer 0,05 M Phosphatpufferlösung, welche 0,2 % GeIatine
(pH 7,4) enthielt, stehen gelassen, mit Wasser gewaschen, getrocknet und bis zur Verwendung gelagert,
Beispiel 3
Herstellung von Probenserum
Herstellung von Probenserum
Es wurden Blutproben von einem Patienten, der an ATL litt, und einem gesunden Erwachsenen unter Verwendung
von Heparin gesammelt und 3 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Überstände zu sammeln. Jeder
dieser Überstände wurde 10 Minuten lang bei 2.000 UpM zentrifugiert und die Überstände, die als Testprobenseren
verwendet wurden, gesammelt.
Eine Reihe von verdünnten Seren (8Ox, 16Ox, 32Ox, 64Ox, 1.28Ox) wurden durch Doppelverdünnung mit 0,05M
Phosphatpuffer, welcher 0,2 % Gelatine (pH 7,4) enthielt,
eines jeden Testprobenserums von Beispiel 3 hergeteilt. Zu 0,5 ml eines jeden der verdünnten Probenseren
wurde ein Stück des unlöslichen Antigens (Antigen-absorbierendes Polystyrolkügelchen) wie es
in Beispiel 1 hergestellt wurde, zugegeben und 2 h lang bei 37°C stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe (aspirator) entfernt, die Kügelchen wurden mit 2 ml physiologischer
Kochsalzlösung gewaschen, das Waschwasser wurde wiederum durch die Saugwirkung einer Wasserstrahlpumpe
entfernt. Das Verfahren wurde dreimal wiederholt.
Im v/eiteren wurde ein Stück der auf diese Weise behandelten Kügelchen zu 0,55 ml Peroxidase-markiertem
Protein A (ein Produkt von E. Y. Laboratories Co.), verdünnt mit dem gleichen Phosphatpuffer wie vorstehend
auf 44.00Ox zugegeben und 2 h lang bei 37°C stehen gelassen, daraufhin in ausreichender Weise wie
vorstehend angegeben gewaschen.
Gleichzeitig wurde H2O2 unter Rühren zu 20 ml
0,2M McLevin Pufferlösung, welche 60 mg o-Phenylendiamin
(pH 5,8) enthielt, bis zur Einstellung einer Endkonzentration von 0,02 V/V % zugegeben und auf
diese Weise ein Farbreagens hergestellt.·
1 « · β
- 25 -
In einem Reagenzglas wurden 2 ml physiologische Kochsalzlösung
und 0,5 ml des Farbreagens gegeben und ein Stück des wie vorstehend beschriebenen Kügelchen dazugefügt.
Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurde 1 ml 3N Salzsäure zugegeben, um
die enzymatische Reaktion zu stoppen; daraufhin wurde die Extinktion bei 492 mn des Reationsgeinisches bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Verdünnung der Testprobenseren
Verdünnung der Testprobenseren
| A | χ 80 | χ 160 | χ 320 | χ 640 | X 128 | |
| ATL-Patient | B | |||||
| C | 0,789 | 0,748 | 0,646 | 0,550 | 0,410 | |
| Gesunde Person | 0,701 | 0,624 | 0,550 | 0,423 | 0,356 | |
| D | 0,558 | 0,449 | 0,367 | 0,291 | 0,222 | |
| E | ||||||
| F | 0,166 | 0,114 | 0,081 | 0,047 | 0,028 | |
| 0,114 | 0,089 | 0,054 | 0,037 | 0,027 | ||
| 0,142 | 0,089 | 0.063 | 0,037 | 0,023 |
Die gleichen Verfahren, wie sie vorstehend beschrieben werden, wurden wiederholt mit der Ausnahme, dass
anstelle des unlöslichen Antigens, wie es in Beispiel 1 hergestellt wurde, das unlösliche Antigen (Antigenabsorbierende
Polystyrolkügelchen) wie sie jeweils in Beispiel 2-(2) und Beispiel 2-(3) hergestellt wurden,
für 80fach und lOOfach verdünnte Seren verwendet wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 2 und 3 zusammengestellt.
Tabelle 2 5
Extinktion bei 492 nm lOOfach verdünntes Serum
10
ATL-Patient G 1,154
H 1,012
I 0,879
Gesunde Person J 0,108
K 0,094
L 0,011
Extinktion bei 492 nm 80-fach verdünntes Serum
ATL-Patient M 0,826
N 0,722
O 0,611 30
Gesunde Person P 0,234
Q 0,329
Zur Bestimmung von ATLA-Antikörper wurden die gleichen Verfahren wiederholt, wie sie in Beispiel 4 beschrieben
werden mit der Ausnahme, dass die Antigenabsorbierenden Polystyrolkügelchen, wie sie in Beispiel
2-(2) als ein unlösliches Antigen hergestellt wurden, und 600-fach verdünntes Peroxidase-markiertes
Ziegen-anti-human-IgG (ein Produkt von E.Y. Laboratories
Co.) als ein Markierungseffektor verwendet wurde. Für jede Verdünnung der Seren wurde die Extinktion
bei 492 nm bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 wiedergegeben, Wobei die Kurve 1 das ATLA-Antikörper-Niveau für
einen ATL-Patienten und die Kurve 2 dasjenige für eine gesunde Person darstellt.
Wie die Ergebnisse von Tabelle 1, 2 und 3 und Fig. 1 deutlich zeigen, kann mit Hilfe des erfindungsgemässen
Verfahrens ATLA-Antikörper auf einfache Weise durch Bestimmung der Extinktion ermittelt werden. Somit
eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren zur Diagnose und zum Screenen von ATL-Patienten.
25
if'
Leerseite
Claims (8)
1. Insolubilisiertes Antigen, welches einen unlöslichen
Träger umfasst, auf welchem ein Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziiertes
Antigen immobilisiert ist, das aus der Gruppe, bestehend aus einem löslichen cytoplasmischen
Protein einer Adult-T-ZeHen-Leukämiezelle
und einem solubilisierten Protein eines Adult-T-Zellen-Leukämievirus,
ausgewählt wird.
It «* *
2. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass das genannte Adult-T-Zellen-Leuka'mie-assoziierte Antigen
das genannte lösliche cytoplasmische Protein darstellt, welches auf dem genannten unlöslichen Träger
immobilisiert ist, wobei der Träger ausgewählt wird aus der Gruppe Polystyrol, Glas, Polycarbonat und Polypropylen.
3. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der unlösliche
Träger Polystyrolkügelchen darstellt.
4. Insolubilisiertes Antigen gemäss Ansprüchen 2
oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte cytoplasmische Protein den Zentrifugationsüberstand
eines Homogenates der genannten Adult-T-Zellen-Leukärniezellen darstellt.
5. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die
Adult-T-Zellen-Leukämiezelle aus dem periphären Blut
oder Lymphknoten isoliert wird, das bzw. der von einem Patienten mit Adult-T-Zellen-Leukämie stammt.
6. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet , dass die genannte Adult-T-Zellen-Leukämiezelle eine etablierte
AduIt-T-ZeIlen-Leukämiezellinie darstellt.
ft *
7. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die Adult-T-Zellen-Leukämiezelle durch Rekultivierung
einer Adult-T-Zellen-Leukämiezelle, die aus dem periphären
Blut oder Lymphknoten, gesammelt von Patienten mit Adult-T-Z;ellen-Leukämie, stammt, mit einer human-T-Zelle
transformiert ist.
8. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass die genannte human-T-Zelle aus periphärem Blut, Knochenmark,
Lymphknoten, Milz, Tonsillen oder Thymus stammt,
9. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet , dass die Kokultivierung?in
einem RPMI'1640-Medium oder einem Minimun-Eagle-essentiellen
Medium, modifiziert mit Fötal-Rinderserum oder Kälberserum, ausgeführt wird.
IQ. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Adult-T-Zellen-Leukämiezelle eine etablierte
Adult-T-Zellen-Leukämiezellinie darstellt.
11. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 1, . dadurch gekennzeichnet, dass das
genannte Adult-T-Zellen-Leukärnie-assoziierte Antigen
das solubilisierte Protein darstellt, welches an dem
genannten unlöslichen Träger aus der Gruppe Polystyrol, Glas, Polycarbonat und Polypropylen immobilisiert
ist.
12. Insolubilisiert.es Antigen gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass der
unlösliche Träger Poüystyrolkügelchen darstellt.
13. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der
genannte Adult-T-Zellen-Leukämievirus durch Dichtegradienten-Zentrifugation
gereinigt wird.
14. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet , dass das genannte solubilisierte Protein ein Protein darstellt,
welches durch Solubilisierung von Adult-T-'Zellen-Leukämievirus
mit einem Solubilisierungsagens erhalten wird.
15. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass das
Solubilisierungsagens ein nicht-ionisches, oberflächenaktives Mittel darstellt, wie z.B. Triton X-100,
NP-40, Digitonin und Harnstoff, oder ein anionisches, oberflächenaktives Mittel, wie z.B. Natriumdodecylsulfat.
16. Insolubilisiertes Antigen gemäss Anspruch 15, dadurch gekennze ich net , dass das
Solubilisierungsagens Triton X-100 darstellt.
17. Verfahren zur Herstellung eines insolubilisierten Antigens, welches einen unlöslichen Träger umfasst,
auf dem ein Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziiertes
Antigen immobilisiert ist, welches aus der Gruppe
bestehend aus einem löslichen cytoplasmischen Protein einer Adult-T-Zellen-Leukämiezel]e und einem solubilisierten
Protein eines Adult-T-Zellen-Leukämievirus ausgewählt wird, dadurch gekennzeichnet,
dass man ein Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziiertes
Antigen mit einem unlöslichen Träger in einem wässrigen Medium vermischt und aufeinander einwirken
lässt, und gegebenenfalls die Adsorptionsstelle des genannten unlöslichen Trägers sättigt, und das erhaltene
Antigen mit Wasser wäscht.
1.8. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte
Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziierte Antigen das genannte
lösliche, cytoplasmische Protein darstellt, welches an dem genannten unlöslichen Träger immobilisiert
ist, der aus der Gruppe, bestehend aus Polystyrol, Glas, Polycarbonat und Polypropylen, ausgewählt
wird.
19. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch
gekennze ich net , dass das genannte Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziierte Antigen das genannte
solubilisierte Protein darstellt, welches an dem unlöslichen Träger immobilisiert ist, welcher aus
der Gruppe, bestehend aus Polystyrol, Glas, Polycarbonat und Polypropylen ausgewählt wird.
20. Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers gegen Adult-T-Zellen-Leukämie-assoziiertes Antigen mit
Hilfe des Fluoreszenz-Immunoassays oder Enzym-Immuno-33says,
dadurch gekennzeichnet ,
dass man ein insolubilisiertes Antigen, wie es in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16 definiert
ist, mit einem Testprobeserum umsetzt und den sich bildenden Antigen-Antikörper-Komplex bestimmt.
5
21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , dass man im weiteren
den genannten Antigen-Ant.ikörper-Komplex mit einem Markierungseffektor umsetzt, der in der Lage ist,
spezifisch an den Antikörper zu binden.
22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , dass der Markierungseffektor eine enzym-markierte oder fluoreszenz-mar-
kierte Substanz darstellt, die in der Lage ist, spezifisch an den Antikörper zu binden, ausgewählt aus
der Gruppe: Protein A, Schaf-anti-human-Immunoglobulin-G-Antikörper,
Kaninchen-anti-human-Immunoglobulin-G-Antikörper,
Ziegen-anti-human-Immunoglobulin-G-Antikörper,
Maus-anti-human-Immunoglobulin-G-Antikörper
und Ratten-anti-human-Immunoglobulin-G-Antikörper.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, dass der Markierungseffektor einen Enzymmarkierungseffektor darstellt,
wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus Peroxidase, Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, Glyceroaldehyd-3-phosphorsäure-dehydrogenase,
Amylase, Phosphorylase, D-Nase und P-Nase ausgewählt wird.
ft ·
24. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Markierungseffektor einen Fluoresceinmarkierungseffektor darstellt,
wobei das Fluorescein aus der Gruppe, bestehend aus Fluorescein-isothiocyanat, Tetramethylrhodamin-isothiocyanat,
substituiertem Rhodamin-isothiocyanat, Rhodamin-B-isothiocyanat und Dichlorotriazin-fluorescein,
ausgewählt wird.
25. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte
Markierungseffektor Peroxidase-markiertes Protein A darstellt.
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