CH652033A5 - Antigene de la leucemie de la cellule t adulte, et methode de determination d'un anticorps de cet antigene. - Google Patents
Antigene de la leucemie de la cellule t adulte, et methode de determination d'un anticorps de cet antigene. Download PDFInfo
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Description
La présente invention se rapporte à un antigène de la leucémie de la cellule T adulte et à une méthode pour la détermination d'un anticorps associé à la leucémie de la cellule T adulte et, plus particulièrement, à une méthode pour la détermination d'un anticorps selon une technique anticorps fluorescent indirecte ou une technique enzyme/anticorps utilisant un antigène qui réagit spécifiquement avec le sérum de patients atteints de leucémie de la cellule T adulte.
La leucémie de la cellule T adulte (adult T-cell leukemia, ci-après mentionnée comme ATL) est une maladie maligne qui attaque les adultes, mais dont la cause n'a jusqu'à présent pas été éclaircie complètement [voir à ce sujet K. Takatsuki, T. Uchiyama, K. Sagawa et J. Yodoi (1977) dans «Topics in Hematology», éd.; S. Seno, F. Takaku, et S. Irino, «Excerpta Medica», Amsterdam, pp. 73-77, et T. Uchiyama, J. Yodoi, K. Sagawa, K. Takatsuki et H. Uchino, «Blood», 50, 481-492 (1977), etc.].
Sur la base de la connaissance que les cultures de cellules ATL ou de lignes cellulaires associées au virus de l'ATL contiennent un antigène spécifique à ATL (ATL-associated antigen ou ATL-anti-gen, ci-après mentionné comme ATLA) qui n'est pas détecté dans les cellules fraîches ATL du sang périphérique de patients ATL, et que les sérums des patients ATL, ou de certains adultes sains dans des régions d'ATL endémique, contiennent un anticorps qui réagit spécifiquement avec ledit ATLA (ci-après mentionné comme anticorps ATLA), il a été récemment proposé une méthode pour la détermination de l'anticorps ATLA utilisant l'immunodétermination par fluorescence qui est capable de diagnostiquer l'ATL («Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.», vol. 78, N° 10, pp. 6476-6480,1981).
Cette méthode comprend la mise en place de cellules ATL positives comme antigène sur une lame de verre, la réaction de l'antigène avec un échantillon de sérum test et de l'immunoglobuline G antihumaine marquée par fluorescence, et l'observation microscopique de la localisation du marquage fluorescent pour déterminer l'anticorps ATLA.
Toutefois, cette méthode présente divers défauts, étant donné qu'elle utilise des cellules vivantes en soi comme un antigène et qu'il est nécessaire de réaliser une observation microscopique pour chaque échantillon (échantillon de sérum test), ce qui conduit non seulement à une opération compliquée, mais également à la difficulté de déterminer et de diagnostiquer une grande quantité d'échantillons tests avec facilité et rapidement.
En outre, la méthode ci-dessus est désavantageuse en ce qu'il est difficile d'éviter la fluctuation dans la positivité de l'antigène étant donné que des cellules intactes sont utilisées et, par conséquent, il est difficile d'obtenir constamment une qualité désirée d'antigène, ce qui tend à conduire vers une détermination et un diagnostic erronés. Par conséquent, cette méthode ne remplit pas l'exigence que la détermination peut être effectuée dans des conditions fixes, cette exigence nécessitant d'être satisfaite lorsque l'on recherche une prédominance étendue de la technique concernée.
Un but de cette invention consiste donc à fournir une méthode pour la détermination de l'anticorps ATLA qui obvie aux défauts de la méthode classique pour la détermination de cet anticorps ATLA.
Comme résultat de recherches intensives, il a maintenant été trouvé qu'une protéine cytoplasmique de cellules ATL cultivées (ci-après dénommée SCP) et une protéine solubilisée du virus ATL (ci-après dénommée VAP) peuvent être utilisées comme antigène pouvant réagir spécifiquement avec l'anticorps ATLA, et qu'une grande quantité d'échantillons tests peuvent être dosés facilement et rapidement, de même que dans des conditions fixes, avec une efficacité élevée lorsqu'un antigène insolubilisé est utilisé, qui est préparé par insolubilisation de SCP ou VAP sur un support insoluble.
La présente invention est fondée sur les observations ci-dessus et a par conséquent pour premier objet un antigène insolubilisé comprenant un support insoluble portant un antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte choisi parmi le groupe comprenant une protéine cytoplasmique soluble d'une cellule de leucémie de cellule T adulte et une protéine solubilisée d'un virus de leucémie de cellule T adulte.
Un second objet de cette invention consiste en une méthode pour la détermination d'un anticorps d'un antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte selon une immunodétermination par fluorescence ou une immunodétermination enzymatique, qui comprend la réaction de l'antigène insoluble défini ci-dessus avec un échantillon test de sérum, puis le dosage du complexe antigène/anticorps obtenu.
Grâce à la méthode selon la présente invention, une grande quantité d'échantillons tests peuvent être dosés rapidement par une opération simplifiée; par exemple, des échantillons en quantité supé5
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rieure d'environ 10 fois à la quantité d'échantillons pouvant être traitées par observation microscopique classique peuvent être dosées, ou bien la même quantité d'échantillons peut être dosée environ 10 fois plus rapidement que par la méthode classique.
La fig. 1 annexée est un graphique sur lequel est reportée en fonction de la dilution des sérums la densité optique à 492 nm de l'anticorps ATLA déterminée par la méthode selon la présente invention (exemple 5).
Comme culture de cellules ATL à utiliser en tant que source de SCP dans le procédé selon l'invention, il y a les cellules ATL illustrées déjà établies comme ligne cellulaire (I. Miyoski, I. Kubonishi, M. Sumida, S. Hiraki, T. Tsubota, I. Kimura, K. Miyamoto et J. Sato, «Gann», 71, 155-156,1980), une culture de cellule ATL séparée d'une manière traditionnelle du sang périphérique ou du nodus lymphatique de patients atteints d'ATL, et des cellules associées au virus ATL obtenues par culture simultanée des cellules ATL décrites ci-dessus et de cellules T humaines (par exemple «Nature», 294, pp. 770-771, 1981). Les cellules T humaines à utiliser dans la coculture ci-dessus ne sont pas particulièrement limitées, et on peut mentionner à titre d'exemple diverses cellules T du sang périphérique, de la moelle osseuse, du nodus lymphatique, de la rate, de l'amygdale, du thymus, etc.
La culture des cellules ATL décrites ci-dessus ou la coculture des cellules ATL et des cellules T humaines peut être effectuée de manière ordinaire. Le milieu n'est pas particulièrement limité, et n'importe lequel des différents milieux nutritifs utilisés pour la culture cellulaire ordinaire peut être utilisé. De préférence, des exemples de milieux comprennent, par exemple, le milieu RPMI1640 (Flow Laboratories, Co.) et le milieu Minimum Eagle Essential (MEM medium) modifié avec un sérum tel que du sérum bovin fœtal (FCS) ou du sérum de veau.
Les conditions de culture ne sont pas particulièrement différentes de celles employées dans la culture cellulaire ordinaire, et une température d'environ 36 à environ 38° C et un pH d'environ 6,4 et 7,6 sont généralement choisis. Si désiré, des accélérateurs de croissance tels que le facteur de croissance des cellules T (TCGF) ou des produits chimiques connus comme inducteurs de tétrovirus des mammifères, tels que la 5-iodo-2'-déoxyuridine (IdUrd), le cyclohexylimide (CH), la puromycine, le 12-myristate 13-acétate de phorbol (TPA), un n-butyrate (n-butyrate de sodium), etc., peuvent être ajoutés. La culture est effectuée de façon avantageuse par échange de la solution tous les 3 à 5 d, de manière à permettre aux cellules désirées de croître de façon favorable.
En outre, comme SCP, une préparation peut être utilisée qui est obtenue par homogénéisation des cellules ATL cultivées ci-dessus dans une solution-tampon appropriée telle qu'une solution physiologique saline, une solution saline tamponnée de phosphate, etc., et par récupération de la substance surnageant par centrifugation ou par une méthode de séparation appropriée.
Des exemples de virus ATL pouvant être utilisés comme source de VAP comprennent ceux isolés d'une manière traditionnelle du milieu de culture des cellules ATL décrites ci-dessus. L'isolation du virus ATL peut être effectuée en utilisant une technique de centrifugation classique. On préfère utiliser le virus ATL purifié en outre par une méthode de gradient de densité.
Le VAP peut être obtenu par solubilisation du virus ATL. Cette solubilisation du virus ATL peut être effectuée facilement en utilisant des agents de solubilisation ordinaires.
Des exemples d'agents de solubilisation comprennent divers ten-sio-actifs tels que les tensio-actifs non ioniques, par exemple Triton X-100 (marque d'un produit de Wako Pure Chemical Co. Ltd), NP-40 (marque d'un produit de Shell Co.), la digitonine, l'urée, etc., et des tensio-actifs anioniques, par exemple du sulfate de dodécyl-sodium (SDS), etc.
Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne la méthode de solubilisation. Toutefois, on préfère effectuer cette solubilisation en utilisant un agent de solubilisation en une quantité de 0,01% par rapport à celle correspondant au point de formation d'une micelle à une température d'environ 0 à environ 100° C et pendant une durée allant de plusieurs minutes jusqu'à environ 6 h. De préférence, le VAP ainsi obtenu est en outre purifié par des techniques ordinaires telles que centrifugation, dialyse, etc., puis soumis à une Chromatographie sur colonne échangeuse d'anions utilisant la DEAE-cellulose, le DEAE-séphadex, etc., pour adsorber et éliminer l'acide nucléique viral qui peut rester dans le VAP.
L'antigène insolubilisé qui est utilisé dans cette invention peut être préparé par insolubilisation du SCP et/ou VAP sur un support insoluble. Il n'y a pas de limitation particulière en ce qui concerne le support insoluble à utiliser, et ceux habituellement utilisés dans les techniques d'adsorption physique, plus particulièrement des supports poreux en polystyrène, en verre, en polycarbonate, en polypropylène, etc., peuvent être utilisés.
La fixation du SCP et/ou VAP sur le support insoluble peut être effectuée d'une manière traditionnelle. Par exemple, un support insoluble et le SCP et/ou VAP sont ajoutés à une solution telle qu'une solution saline physiologique, un tampon phosphate, etc., et le mélange est mis en réaction à une température allant d'environ 0 à environ 37° C, pendant environ 2 à environ 24 h. Il est préférable que cette réaction soit effectuée sous pression réduite. Après la fin de la réaction, les sites d'absorption qui restent sur le support insoluble sont saturés de manière traditionnelle, par exemple au moyen de gélatine à 0,2%, d'albumine de sérum bovin (BSA) à 0,2%, etc.
L'antigène insoluble ainsi obtenu est lavé ensuite avec de l'eau. La préparation lavée est conservée à l'état sec ou dans la solution-tampon décrite ci-dessus.
La méthode selon la présente invention peut être effectuée par détermination de l'activité d'un complexe antigène/anticorps marqué selon les techniques ordinaires d'immunodétermination par fluorescence ou immunodétermination enzymatique utilisant l'antigène insoluble. Plus particulièrement, elle peut être effectuée par addition d'un échantillon test de sérum éventuellement dilué à l'antigène insoluble pour effectuer la réaction immune entre eux, par lavage du complexe antigène/anticorps obtenu, par réaction du complexe avec un effecteur de marquage pour marquer le complexe, et par détermination de l'activité du complexe marqué de manière traditionnelle.
Ainsi, dans la méthode selon l'invention, l'utilisation de l'antigène insoluble permet de déterminer en une fois une grande quantité de l'échantillon de sérum test, rapidement, facilement et avec une précision élevée dans des conditions déterminées.
Comme échantillon de sérum test, on peut utiliser les sérums séparés du sang recueilli de manière traditionnelle chez un adulte sur lequel la détermination de l'anticorps ATLA est désirée, ou de préparations de ces sérums diluées avec une solution-tampon appropriée. La solution-tampon utilisable n'est pas particulièrement limitée. Généralement, on préfère utiliser une solution-tampon phosphate (pH=7,4).
La réaction immune entre l'échantillon test de sérum et l'antigène insoluble peut être effectuée simplement par mélange de ceux-ci. Généralement, la réaction est effectuée à environ 4 jusqu'à environ 37° C, pendant environ 0,5 à environ 16 h. Il est souhaitable, après la fin de la réaction, de laver le produit réactionnel de façon suffisante avec une solution-tampon appropriée, de préférence une solution saline physiologique ou la solution qui a été utilisée pour la dilution de l'échantillon de sérum test.
Le marquage du complexe antigène/anticorps obtenu au moyen d'un effecteur de marquage qui suit la réaction immune peut être effectué par mélange du complexe antigène/anticorps obtenu avec un effecteur de marquage dilué avec la même solution-tampon que celle décrite ci-dessus, puis la mise en réaction du mélange à environ 4 jusqu'à environ 37° C pendant environ 0,5 à environ 16 h. Après l'achèvement de la réaction, il est préférable de laver le complexe obtenu de façon suffisante comme précédemment.
Comme effecteur de marquage, peut être utilisé tout matériau composite comportant une substance capable de se lier de façon spécifique à un anticorps et de divers enzymes ou de fluorescéine. Des exemples représentatifs de substances d'enzymes comprennent divers
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réactifs enzymatiques ordinaires tels que Peroxydase (POX), chymo-trypsinogène, procarboxypeptidase, déhydrogénase de l'acide glycéroaldéhyde-3-phosphorique, amylase, Phosphorylase, D-Nase, P-Nase, etc.
La fluorescéine est par exemple constituée de colorants fluorescents ordinaires tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l'isothiocyanate de rhodamine substitué (XRITC), l'isothiocyanate de rhodamine B, la dichlorotriazinefluorescéine (DTAF), etc.
Des exemples de substances capables de se lier spécifiquement à un anticorps comprennent la protéine A (Pro A, un produit de Pharmacia Co.) et l'immunoglobuline G antihumaine (ci-après désignée par IgG), un anticorps tel que l'anticorps IgG antihumain de mouton, l'anticorps IgG antihumain de lapin, l'anticorps IgG antihumain de chèvre, l'anticorps IgG antihumain de souris, l'anticorps IgG antihumain de rat, etc.
Divers complexes de la substance capable de se lier spécifiquement à un anticorps et à la substance de marquage sont disponibles commercialement et ils peuvent être utilisés comme effecteurs de marquage dans le procédé selon l'invention.
D'autre part, de tels complexes être préparés juste avant l'utilisation selon une méthode traditionnelle telle que décrite par B.F. Erlanger et al.'. «Acta Endocrinol. Suppl.», 168, 206 (1972) et par M.H. Karol et al., «Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.», 57, 713, (1967).
Plus particulièrement, lorsqu'un enzyme est utilisé, cet enzyme et la Pro A ou l'anticorps IgG antihumain sont couplés dans une solution-tampon (pH=4-6) en présence d'un agent d'oxydation approprié tel que NaI04, à température ambiante et pendant 2 à 5 h, puis réduite avec un agent réducteur approprié tel que NaBH4.
En ce qui concerne les quantités de réactifs utilisés, il est préférable qu'environ 1 à environ 3 mol de l'enzyme et environ 100 à 300 mol d'agents oxydants soient utilisés par mole de Pro A ou d'anticorps IgG antihumain. De préférence, l'agent réducteur est utilisé en une quantité d'environ 1 à environ 2 mol par mole de l'agent oxydant.
Lorsque des effecteurs de marquage sont préparés en utilisant la fluorescéine, cette fluorescéine est ajoutée à de l'eau ou à une solution saline physiologique, dont le pH est de 6 à 8, et le mélange est mis en réaction avec la Pro A ou l'anticorps IgG antihumain à environ 0° C jusqu'à la température ambiante, et pendant environ 0,5 à environ 3 h (voir «Keiko Kotai Ho» (Fluorescent Antibody Method), Ikagaku Jikkenho Koza, N° 4, 263-270, 1972, lre éd., Na-kayama Shoten Co., Ltd, Tokyo). Il est préférable que la quantité de fluorescéine soit utilisée de manière à représenter environ 1/50 partie en poids par partie en poids de Pro A ou d'anticorps IgG antihu-main.
Dans la méthode selon l'invention, le complexe insoluble antigène/sérum test (anticorps ATLA)/effecteur de marquage peut être déterminé d'une manière traditionnefle de façon appropriée selon la substance de marquage dans l'effecteur de marquage utilisé, par la détermination de l'activité (par exemple activité de l'enzyme ou de fluorescence). De cette manière, une grande quantité d'échantillons tests de sérum, d'anticorps ATLA peuvent être déterminés facilement et rapidement.
La présente invention sera maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples suivants :
Exemple 1:
Préparation de l'antigène insoluble
Du sang (20 ml) recueilli chez un patient atteint d'ATL (âgé de 50 ans, mâle, vivant dans la ville de Nagasaki) en utilisant de l'héparine a été centrifugé dans un Ficoll Pack (produit par Pharmacia Japan Co.) afin d'obtenir 5 x 107 cellules de lymphocyte de sang périphérique.
Ces cellules ont été cultivées à 37° C pendant 3 d dans du sérum de veau RPMI 1640/10% (Flow Laboratories Co.) en une concentration cellulaire de 3 x 105 cellules/ml. Une partie des cellules ainsi obtenues (6 x 108 cellules) a été homogénéisée dans une solution-tampon phosphate 0,05M (contenant NaCl 0,14M, ayant un pH de 7,4, et désignée ci-après par PBS) et centrifugée pendant 1 h (105 000 x g). La partie surnageante a été recueillie et sa teneur en protéine a été ajustée avec PBS jusqu'à 120 |ig/ml (la teneur en protéine a été déterminée par une méthode colorimétrique utilisant Tonéine ®-TP, une marque d'un réactif pour détermination quantitative des protéines totales produit par Otsuka Assay Laboratories, Co, Ltd), afin d'obtenir une solution SCP.
A la solution SCP (140 ml) ont été ajoutées 700 perles de polystyrène (diamètre = 6,4 mm, produites par Précision Plastic Co., Ltd, U.S. A.) préalablement lavées séquentiellement avec une solution aqueuse de HCl 0,1N, une solution aqueuse de NaOH 0,1N et avec de l'éthanol, et le mélange a été laissé au repos pendant 6 h à température ambiante sous aspiration en utilisant un aspirateur,
puis soumis à une filtration afin d'obtenir un antigène insolubilisé. Celui-ci a été conservé dans une solution-tampon phosphate 0,05M contenant de la gélatine 0,2% (pH = 7,4) à 4° C.
Exemple 2:
Préparation de l'antigène insoluble
1) Des cellules ATL (cellules Kyo-Ya obtenues du Virus Research Institute de l'Université de Kyoto) ont été cultivées à 37° C pendant 4 d dans un sérum de veau RPMI 1640/10% + 50 |ig/ml de IdUrd (Flow Laboratories Co.) à une concentration cellulaire de
3 x 105 cellules/ml. Le milieu de culture a été centrifugé à
1500 tr/min pendant 10 min afin de séparer les cellules et le milieu de culture, qui ont été recueillis séparément.
2) A une partie des cellules ATL cultivées (5 x 109 cellules) obtenues ci-dessus sous 1 ont été ajoutés 30 ml d'une solution saline physiologique, et le mélange a été homogénéisé, puis centrifugé à 105 000 x g pendant 1 h. La partie surnageante a été recueillie et sa teneur en protéine a été ajustée de la même manière que dans l'exemple 1 afin de préparer une solution SCP ayant une teneur en protéine de 120 ng/ml, à partir de laquelle un antigène insoluble, à savoir antigène sur bille de polystyrène absorbant a été préparé de la même manière que dans l'exemple 1. L'antigène obtenu a été laissé au repos pendant ime nuit dans une solution-tampon phosphate 0,05M contenant de la gélatine 0,2% (pH=7,4), lavé avec de l'eau, séché et conservé jusqu'à utilisation.
3) Le milieu de culture (500 ml) obtenu sous 1 a été centrifugé à 40 000 x g pendant 1 h, et la pastille ou boulette formée a été recueillie. Cette pastille ou boulette a été soumise à une centrifugation par gradient de densité sur du sucre 25 à 60%, et les fractions correspondant à des densités de 1,15 à 1,16 ont été recueillies. Ces fractions ont été solubilisées avec 1,5 ml d'une solution aqueuse de NaCl 0,8M contenant du Triton X-100 0,5% à 4° C pendant 40 min, puis soumises à une centrifugation à 35 000 tr/min pendant 1 h pour recueillir la portion surnageante.
La portion surnageante ainsi obtenue a été dialysée par rapport à une solution-tampon de Tris-HCl 0,02M contenant du NaCl 0,3M (pH=7,5) en utilisant une membrane de cellophane pendant 5 h afin d'éliminer l'agent de solubilisation et d'ajuster la concentration des sels. La solution VAP ainsi obtenue a été passée à travers une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec la même solution-tampon de Tris-HCl que précédemment afin d'obtenir la fraction qui a passé à travers la colonne sans arrêt. De l'eau distillée a été ajoutée à cette fraction afin d'ajuster sa teneur en protéine à 2,8 (ig/ml. A une portion de 40 ml de cette solution ont été ajoutées 80 perles de polystyrène décrites dans l'exemple 1 préalablement lavées comme dans cet exemple et laissées au repos pendant 6 h à température ambiante pour obtenir l'antigène insoluble. Celui-ci a été laissé au repos pendant une nuit dans une solution-tampon phosphate 0,05M contenant de la gélatine 0,2% (pH=7,4), lavé dans de l'eau, séché et conservé jusqu'à utilisation.
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Exemple 3:
Préparation de l'échantillon de sérum
Des échantillons de sang ont été recueillis chez un patient atteint d'ATL et chez un adulte en bonne santé en utilisant de l'héparine, et ont été laissés au repos pendant 3 h à température ambiante pour recueillir les portions surnageantes. Chacune de ces portions surnageantes a été centrifugée pendant 10 min à 2000 tr/min pour recueillir les portions surnageantes qui ont été utilisées comme échantillon de sérum test.
Exemple 4:
Détermination de l'anticorps ATLA
Une série de sérums dilués (80 x, 160 x, 320 x, 640 x, 1280 x ) a été préparée par une double dilution de chacun des échantillons de sérum test préparés dans l'exemple 3 avec un tampon phosphate 0,05M contenant de la gélatine à 0,2% (pH = 7,4). A 0,5 ml de chacun des échantillons dilués de sérum a été ajoutée une pièce de l'antigène insoluble (perle de polystyrène adsorbant l'antigène) préparée dans l'exemple 1 et laissée au repos à 37° C pendant 2 h. Le mélange réactionnel a été éliminé par aspiration au moyen d'un aspirateur, la perle a été lavée avec 2 ml d'une solution saline physiologique et le produit de lavage a été éliminé par aspiration au moyen d'un aspirateur. Cette procédure a été répétée trois fois.
En outre, une pièce de la perle ainsi traitée a été ajoutée à 0,55 ml de protéine A marquée à la peroxydase (un produit de E.Y. Laboratories Co.) diluée avec le même tampon phosphate que précédemment jusqu'à 44000 x et laissée au repos à 37° C pendant 2 h, puis lavée de façon suffisante de la même manière que ci-dessus.
D'autre part, du H202 a été ajouté sous agitation à 20 ml d'une solution-tampon McLevin 0,2M contenant 60 mg d'o-phénylène-diamine (pH = 5,8) pour ajuster celle-ci à une concentration finale de 0,02 v/v% afin de préparer un agent colorant.
2 ml d'une solution saline physiologique et 0,5 ml de l'agent colorant ont été introduits dans un tube, et une perle préparée comme décrit précédemment y a été ajoutée. Après que le mélange a été laissé au repos à température ambiante pendant 30 min, 1 ml d'acide chlorhydrique 3N a été ajouté pour arrêter la réaction enzymatique, et la densité optique à 492 nm du mélange réactionnel a été mesurée.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
Tableau 1
Dilution des échantillons tests de sérums
y. 80
x 160
x320
x. 640
x 1280
Patient ATL
A
0,789
0,748
0,646
0,550
0,410
B
0,701
0,624
0,550
0,423
0,356
C
0,558
0,449
0,367
0,291
0,222
Personne saine
D
0,166
0,114
0,081
0,047
0,028
E
0,114
0,089
0,054
0,037
0,027
F
0,142
0,089
0,063
0,037
0,023
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Les mêmes étapes que ci-dessus ont été répétées, excepté en ce que, au lieu de l'antigène insoluble préparé comme dans l'exemple 1, l'antigène insoluble (perles de polystyrène adsorbant l'antigène) préparé dans l'exemple 2-2 et dans l'exemple 2-3 respectivement a été utilisé pour des sérums dilués 80 ou 100 fois.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 2 et 3.
Tableau 2
Antigène insoluble préparé selon l'exemple 2-2
Densité optique à 492 nm
Sérum dilué 100 fois
Patient ATL
G
1,154
H
1,012
I
0,879
Personne saine
J
0,108
K
0,094
L
0,011
Tableau 3
Antigène insoluble préparé selon l'exemple 2-3
Densité optique à 492 nm
Sérum dilué 80 fois
Patient ATL
M
0,826
N
0,722
O
0,611
Personne saine
P
0,234
Q
0,329
Exemple 5:
Pour la détermination de l'anticorps ATLA, les mêmes étapes que dans l'exemple 4 ont été répétées, excepté en ce que l'antigène adsorbé sur des perles de polystyrène préparées selon l'exemple 2-2 comme antigène insoluble et de I'IgG antihumain de chèvre marqué à la peroxydase diluée 600 fois (un produit de E.Y. Laboratories Co.) comme effecteur de marquage ont été utilisés. La densité optique à 492 nm a été mesurée pour chaque dilution des sérums.
Les résultats obtenus sont présentés sur le graphique de la fig. 1 dont la courbe 1 représente le niveau d'anticorps ATLA pour un patient atteint d'ATL et la courbe 2 celui pour une personne en bonne santé.
Comme il ressort des résultats présentés dans les tableaux 1,2 et 3, ainsi que sur la fig. 1, l'anticorps ATLA peut être déterminé par la méthode selon la présente invention avec facilité en mesurant la densité optique et, par conséquent, la présente invention est utile pour le diagnostic et l'examen des patients atteints d'ATL.
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1 feuille dessin
Claims (11)
1. Antigène insolubilisé comprenant un support insoluble portant un antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte choisi parmi le groupe comprenant une protéine cytoplasmique soluble d'une cellule de leucémie de cellule T adulte et une protéine solubilisée d'un virus de leucémie de cellule T adulte.
2. Antigène selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte est une protéine cytoplasmique soluble, et que le support insoluble est choisi parmi le groupe comprenant du polystyrène, du verre, du polycarbonate et du polypropylène.
2
REVENDICATIONS
3. Antigène selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le support insoluble est constitué par des perles de polystyrène.
4. Antigène selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte est constitué par une protéine solubilisée, et que le support insoluble est choisi parmi le groupe comprenant du polystyrène, du verre, du polycarbonate et du polypropylène.
5. Antigène selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le support insoluble est constitué par des perles de polystyrène.
6. Méthode pour la détermination d'un anticorps d'un antigène associé à la leucémie de la cellule T adulte selon une immunodéter-mination par fluorescence ou une immunodétermination enzymati-que, qui comprend la réaction de l'antigène insoluble selon l'une des revendications 1 à 5 avec un échantillon test de sérum, puis le dosage du complexe antigène/anticorps obtenu.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée par le fait que la détermination du complexe antigène/anticorps comprend la réaction de celui-ci avec un agent de marquage susceptible de se lier spécifiquement à un anticorps.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée par le fait que l'agent de marquage est une substance enzymatique ou fluorescente susceptible de lier spécifiquement un anticorps choisi parmi le groupe comprenant une protéine A, un anticorps d'immunoglobu-line G antihumaine de mouton, un anticorps d'immunoglobuline G antihumain de lapin, un anticorps d'immunoglobuline G antihumaine de chèvre, un anticorps d'immunoglobuline G antihumaine de souris et un anticorps d'immunoglobuline G antihumaine de rat.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée par le fait que l'effecteur de marquage est un enzyme, cet enzyme étant choisi parmi le groupe comprenant per oxydase, chymotrypsinogène, procarboxypeptidase, déhydrogénase d'acide glycéro-aldéhyde-3-phosphorique, amylase, Phosphorylase, D-Nase et P-Nase.
10. Méthode selon la revendication 8, caractérisée par le fait que l'effecteur de marquage est une fluorescéine, cette fluorescéine étant choisie parmi le groupe comprenant l'isothiocyanate de fluorescéine, isothiocyanate de tétraméthylrhodamine, l'isothiocyanate de rhoda-mine substituée, l'isothiocyanate de rhodamine B et la dichlorotri-azine fluorescéine.
11. Méthode selon la revendication 9, caractérisée par le fait que l'agent de marquage est une protéine A marquée à la Peroxydase.
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