FR2525475A1 - Antigenes de la leucemie des cellules t de l'adulte, procedes pour leur preparation et pour le dosage d'anticorps contre ces antigenes - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN ANTIGENE INSOLUBILISE ET UN PROCEDE POUR SA PREPARATION ET UN PROCEDE DE DOSAGE D'UN ANTICORPS DIRIGE CONTRE L'ANTIGENE ASSOCIE A LA LEUCEMIE DES CELLULES T DE L'ADULTE. L'ANTIGENE INSOLUBILISE SELON L'INVENTION COMPREND UN SUPPORT INSOLUBLE SUR LEQUEL EST INSOLUBILISE UN ANTIGENE ASSOCIE A LA LEUCEMIE DES CELLULES T DE L'ADULTE CHOISI PARMI LES PROTEINES CYTOPLASMIQUES SOLUBLES DES CELLULES DE LEUCEMIE DES CELLULES T DE L'ADULTE ET LES PROTEINES SOLUBILISEES DE VIRUS DE LEUCEMIE DES CELLULES T DE L'ADULTE. APPLICATIONS: L'UTILISATION DE L'ANTIGENE INSOLUBILISE SELON L'INVENTION PERMET UN DOSAGE RAPIDE DE L'ANTICORPS DANS DE GRANDES QUANTITES D'ECHANTILLONS DE SERUM.
Description
La présente invention concerne un antigène de la leucémie des cellules T
de l'adulte, un procédé pour sa préparation et un procédé pour doser un anticorps associé à la leucémie des cellules T de l'adulte, et plus particulièrement un procédé pour doser un anticorps selon la technique aux anticorps par fluorescence indirecte ou la technique enzyme-anticorps utilisant un antigène qui réagit spécifiquement avec les sérums de patients atteints de
leucémie des cellules T de l'adulte.
La leucémie des cellules T de l'adulte(ci-après dénommée ATL)est une maladie maligne qui attaque les adultes, mais dont la cause n'a pas encore été totalement élucidée (voir Takatsuki, K., Uchiyama, T, Sagawa, K et Yodoi, J ( 1977) dans "Topics in Hematology", éds Seno, S, Takaku, F, et Irino, S (Excepta Medica, Amsterdam), pages 73-77,et Uchiyama, T, Yodoi, J, Sagawa,K
Takatsuki, K et Uchino, H, Blood 50,pages 481-492 ( 1977), etc).
A partir de la connaissance que les cellules ATL cul-
tivées ou les lignées de cellules associées au virus de l'ATL con-
tiennent un antigène spécifique de l'ATL (antigène associé A 'ATL ou antigène d'ATL, ci-après dénommé ATLA), qui n'est pas décelé dans les cellules d'ATL fraîches dans le sang périphérique de patients atteints d'ATL, et que les sérums de patients atteints d'ATL ou de certains adultes sains dans des régions endémiques à AT Lcontiennentun anticorps qui réagit spécifiquement avec ledit ATLA (ci-après dénommé anticorps anti-ATLA), on a proposé récemment un procédé pour doser l'anticorps anti- ATLA utilisant un dosage immunologique par fluorescence, qui est capable de donner un diagnostic de l'ATL (Proc Natl Acad Sci.
Etats-Tnis d'Amérique, vol 78, n 10, pages 6476-6480 ( 1981)).
Ce procédé consiste à placer des cellules ATL-
positives comme antigène sur une lame de verre, à faire réagir l'antigène avec un échantillon de sérum et l'anti-imnunoglobuline G humaine marquée par fluorescence et à observer au microscope la
localisation du marqueur fluorescent pour doser l'anticorps auti-ATLA.
Cependant, ce procédé présente divers inconvénients.
car il utilise des cellules vivantes elles-mémes comme anticorps et il est nécessaire d'effectuer une observation au microscope pour chaque échantillon (échantillon de sérum d'essai) de sorte que non seulement l'opération est compliquée,mais également il est difficile de doser et de diagnostiquer une grande quantité
d'échantillons d'essai avec facilité et rapidité.
En outre, le procédé ci-dessts a l'inconvénient qu'il est difficile d'éviter les fluctuations de la positivité d'antigène puisqu'on utilise des cellules intactes et il est donc difficile d'obtenir de manière constante une qualité désirée
d'antigène, ce qui conduirait à un dosage et un diagnostic erronés.
Donc, ce procédé ne satisfait pas l'exigence que le dosage puisse être effectué dans des conditions fixes, condition qui nécessite d'être satisfaite lorsque l'on recherce une large prédominance
de la technique concernée.
La présente invention a pour objet de proposer un procédé pour doser l'anticorps (anti-)ATLA qui évite les défauts
du procédé elassique de dosage d'anticorps ATLA.
A la suite de recherches approfondies, la deman-
deresse a découvert selon l'invention que l'on peut utiliser la protéine cytoplasmique soluble de cellules d'ATL cultivées (ci-après dénommée SCP) et la protéine solubilisée de virus d'ATL (ci-après
dénommée VAP) comme un antigène qui peut réagir de manière spéci-
fique avec l'anticorps ATLA et que l'on peut doser facilement et rapidement une grande quantité d'échantillons comme dans des conditions fixées avec une efficacité élevée lorsqu'on utilise un antigène insolubilisé qui est préparé par insolubilisation de
SCP ou de VAP sur un support insoluble.
La présente invention repose sur les découvertes ci-dessus et propose un procédé pour doser l'anticorps ATLA selon le dosage immunologique par fluorescence-ou enzymatique comprenant l'utilisation d'un antigène insolubilisé comprenant un support insoluble sur lequel est insolubilisée au moins une substance choisie parmi une protéine cytoplasmique soluble de cellules d'ATL
et une protéine solubilisée de virus d'ATL.
Selon l'invention, on peut doser rapidement et dans des opérations simples une grande quantité déchantillons; par exemple, on peut doser plus d'environ dix fois la quantité
dééchantillons qui peuvent être traités par observation microsco-
pique classique, ou bien on peut doser la même quantité d'échan-
tillons plus d'environ dix fois plus rapidement que par la méthode classique. L'invention sera mieux comprise à la lecture de
la description qui va suivre en référence à la figure unique du
dessin annexé qui représente graphiquement, en fonction de la dilution des sérums, la densité optique A 492 nm de l'anticorps (anti ATLA déterminé selon le procédé de l'invention (exemple 5).
Comme exemples de cultures de cellules ATL à uti-
liser comme source 3 e SCP dans la présente invention, on peut citer les cellules ATL déjà établies comme lignée de cellules (Miyoshi, I, Kubonishi, I, Sumida, M, Hiraki, S, Tsubota, T, kimura, I, Miyamoto, K et Sato, J, Gann 71, 155-156 ( 1980)), les
cultures de cellules ATL séparées de manière classique du sang péri-
phérique ou des ganglions lymphatiquesde patients atteints d'ATL et
les cellules associées au virus ATL obtenues par co-culture des cel-
lules ATL décrites ci-dessus et de cellules Thumaines (par exemple Nature 294, pages 770-771 ( 1981)) Les cellules T humaines à utiliser dans
la co-culture décrite ci-dessus ne sont pas particulièrement limi-
tées et on peut citer,par exemple, diverses cellules T du sang périphérique, de la moelle osseuse, des ganglions lymphatiques, de la rate, des amygdales, du thymus, etc. La culture des cellules ATL décrites ci-dessus ou la co-culture des cellules ATL et des cellules T humaines peuvent
Otre effectuées de manière classique Le milieu n'est pas parti-
culièrement limité et l'on peut utiliser l'un quelconque des divers
milieux nutritifs utilisés pour les cultures cellulaires ordinaires.
Des exemples préférés de milieux comprennentpar exemple,le milieu "RPMI 1640 " (Flow Laboratories, Co) et le milieu essentiel d'Eagle minimal (milieu MEM) modifié par un supplément de sérum tel que
sérum de foetus bovin (FCS) ou sérum de veau.
Les conditions de culture ne sont pas particulièrement différentes de celles utilisées dans la culture cellulaire ordinaire et l'on utilise généralement une température d'environ 36 à 38 C et un p H d'environ 6,4 a 7,6 Si on le désire, on peut ajouter des
accélérateurs de croissance tels que facteur de croissance des cel-
lules T (TCGF) ou des substances chimiques connues comme inducteurs de rétrovirus des mammifères, telles que 5-iodo-2 '-désoxyuridine (Id Urd), cyclohexylimide (CH), puromycine, 12-myristate 13-acétate de phorbol (TPA) , n-butyrate (n-butyrate de sodium), etc La
culture est avantageusement effectuée par remplacement de la solu-
tion tous les 3 à 5 jours, de manière à permettre une croissance
favorable des cellules désirées.
En outre, on peut utiliser comme SCP une préparation
qui est obtenue par homogénéisation des cellules ATL cultivées ci-
dessus dans une solution de tampon appropriée, telle que sérum physiologique, sérum physiologique tamponné au phosphate, etc et
récupération de la substance comme liquide surnageant par centrifu-
gation ou par des moyens de séparation appropriés analogues.
Des exemples de virus ATL que l'on peut utiliser comme source de VAP comprennent ceux isolés de manière classique du liquide de culture des cellules ATL décrites ci-dessus L'isolement
du virus ATL peut être effectué en utilisant une technique de centri-
fugation classique On préfère utiliser un virus ATL qui a encore
été purifié par un procédé par gradient de densité.
La VAP peut être obtenue par solubilisation du virus ATL La solubilisation du virus ATL peut être effectuée facilement
en utilisant des agents solubilisants ordinaires.
Des exemples d'agents solubilisants comprennent divers tensioactifs, tels que des tensioactifs non ioniques, par exemple les produits vendus sous les noms de "Triton X-100 " (produit de la Société Wako Pure Chemical Co, Ltd), "NP-40 " (produit de la Société Shell Co), digitonine, urée, etc et les tensioactifs anioniques, par exemple dodécylsulfate de sodium (SDS), etc. Il n'y a pas de limitation particulière quant à la méthode de solubilisation Cependant, on préfère effectuer la solubilisation en utilisant un agent solubilisant en quantité de 0,01 % à celle correspondant au point de formation des micelles à une température d'environ O à 100 C, pendant quelques minutes à environ 6 h De préférence, la VAP ainsi obtenue est encore purifiée par des techniques ordinaires, telles que centrifugation, dialyse, etc et ensuite soumise à la chromatographie sur colonne échangeuse d'anions en utilisant la DEAEcellulose, la DEAE-Sephadex, etc. pour adsorber et séparer l'acide nucléique viral qui peut rester
dans la VAP.
L'antigène insolubilisé qui qui est utilisé dans la présente invention peut être préparé par insolubilisation de la SCP et/ou de la VAP sur un support insoluble Il n'y a pas-de limitation particulière quant au support insoluble à utiliser et l'on peut utiliser les supports ordinaires utilisés dans les méthodes d'adsorption physique, plus particulièrement les supports poreux de polystyrène, de verre, de polycarbonate, de polypropylène, etc. La fixation de la SCP et/ou de la VAP sur le support insoluble peut être effectuée de manière classique Par exemple, on ajoute un support insoluble et la SCP et/ou la VAP à une solution telle que sérum physiologique, tampon au phosphate, etc et on fait réagir le mélange à environ O à 370 C pendant environ 2 à 24 h.
On préfère que cette réaction soit effectuée sous pression réduite.
Lorsque la réaction est terminée, les centres d'adsorption qui restent dans le support insoluble sont saturés de manière classique, par exemple par la gélatine à 0,2 %, l'albumine de sérum de boeuf (BSA) à O C, etc. L'antigène insoluble ainsi obtenu est lavé à l'eau La préparation lavée est stockée à l'état séché ou dans la
solution tampon décrite ci-dessus.
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre
par dosage de l'activité du marqueur d'un complexe antigène/anti-
corps marqué par dosage immunologique de fluorescence ordinaire ou par dosage immuno-enzymatique utilisant l'antigène insoluble Plus
particulièrement, on peut le mettre en oeuvre en ajoutant un échan-
tillon du sérum d'essai facultativement dilué à l'antigène insoluble pour effectuer entre eux la réaction immune, en lavant le complexe antigèneanticorps résultant, en faisant réagir le complexe avec un effecteur marquant pour marquer le complexe et en dosast
l'activité du marqueur du complexe marqué de manière classique.
Ainsi, dans la présente invention, l'utilisation
de l'antigène insoluble permet de doser en une fois une grande quan-
tité d'échantillons de sérum rapidement, facilement et avec une
précision élevée,dans des conditions fixées.
Comme échantillons d'essai que l'on peut utiliser, on citera les sérums séparés du sang recueilli de manière classique chez un adulte sur lequel on souhaite doser l'anticorps ATLA ou
les préparationsde ces sérums diluées par une solution tampon appro-
priée La solution tampon à utiliser n'est pas particulièrement limi-
tée On préfère ordinairement utiliser une solution tampon au phos-
phate (p H 7,4).
La réaction immune entre l'échantillon de sérum
et l'antigène insoluble peut se dérouler simplement par mélange.
Ordinairement, la réaction peut se dérouler à environ 4 à 37 C pendant environ 0,5 à 16 h Il est souhaitable, après la réaction complète, de laver suffisamment le produit de réaction avec une solution tampon appropriée, de préférence le sérum physiologique, ou la solution tampon qui est utilisée pour diluer l'échantillon
de sérum.
Le marquage du complexe antigène-anticorps résul-
tant par un effecteur de marquage qui suit la réaction immune peut être effectué par mélange du complexe antigène-anticorps obtenu avec un effecteur de marquage dilué par la même solution tampon décrite ci-dessus et réaction du mélange à environ 4 à 37 C pendant
environ 0,5 à 16 h Après réaction complète, on préfère laver suffi-
samment le complexe résultant de manière semblable à ci-dessus.
Comme effecteur de marquage, on peut utiliser n'im-
porte quel matériau composite constitué d'une substance capable de se fixer spécifiquement sur un anticorps et diverses enzymes
ou fluorescéines Des exemples caractéristiques d'enzymes com-
prennent divers réactifs enzymatiques ordinaires, tels que per-
oxydase (POX), chymotrypsinogène, procarboxypeptidase, acide
glyc 4 raldéhyde-3-phosphorique déshydrogénase, amylase, phospho-
rylase, D-Nase, P-Nase, etc. Les fluorescéines sont illustrées par
les colorants fluorescents ordinaires, tels que fluorescéine-iso-
thiocyanate(FITC), tétraméthylrhodamine-isothiocyanate (TRITC),
rhodamine-isothiocyanate substitué (XRITC), Rhodamine B-isothio-
cyanate, dichlorotriazine-fluorescéine (DTAF), etc. Des exemples de substances capables de se fixer spécifiquement sur un anticorps comprennent la"Protéine A" (Pro A, de la Société Pharmacia Co) et les anticorps anti-immunoglobuline G humaine (ci-après Ig G), tels qu'anticorps de mouton anti-Ig G humaine, anticorps de lapin anti-Ig G humaine, anticorps de chèvre anti-Ig G humaine, anticorps de souris antiIg G humaine, anticorps de rat anti-Ig G humaine, etc. On trouve dans le commerce divers complexes des substances capables de se fixer spécifiquement sur un anticorps et
1 O de la substance de marquage et ils peuvent être utilisés comme effec-
teurs de marquage dans la présente invention.
D'autre part, ces complexes peuvent être préparés à l'état frais avant utilisation par une technique classique, comme
décrit par exemple par B F ERLANGER et col: Acta Endocrinol.
Suppl 168, page 206 ( 1972) et M H KAROL et col: Proc Nat Acad.
Sci Etats-Unis d'Amérique 57, page 713 ( 1967).
Plus particulièrement, lorsque l'on utilise une enzyme, cette enzyme et la Pro A ou l'anticorps anti-Ig G humaine sont couplés dans unesolution tampon (p H 4 à 6), en présence d'un agent oxydant approprié, tel que Na IO 4, à la température ambiante pendant 2 à 5 h, et ensuite on réduit avec
un agent réducteur approprié, tel que Na BH 4.
En ce qui concerne les quantités de réactifs utilisées, on préfère utiliser environ 1 à 3 moles de l'enzyme et environ 100 à 300 moles d'agent oxydant par mole de
Pro A ou d'anticorps anti-Ig G humaine De préférence, l'agent réduc-
teur est utilisé en quantité d'environ 1 à 2 moles par mole de l'agent oxydant. Lorsque l'on prépare des effecteurs en utilisant Are fluorescéine, la fluorescéine est ajoutée à l'eau ou au sérum physiologique à p H 6-8 et on fait réagir le mélange avec la Pro A Qu l'anticorps anti-Ig G humaine entre environ O C et la température ambiante, pendant environ 0,5 à 3 h, voir "Keiko Kotai Ho" (Fluorescent Antibody Method) Ikagaku Jikkenho Koza, n 4,
pages 263-270 ( 1972), lère édition, Nakayama Shoten Co, Ltd Tokyo).
On préfère que la quantité de fluorescéine à utiliser soit d'envi-
ron 1/50 partie en poids par partie en poids de Pro A ou d'anti-
corps anti-Ig G humaine Dans la présente invention, le complexe antigène insoluble échantillon de sérum (anticorps ATLA) effecteur de marquage peut être dosé de manière classique convenablement selon la substance de marquage dans l'effecteur de marquage utilisé, par détermination de l'activité du marqueur (c'est-à-dire activité
de l'enzyme ou fluorescence) De cette manière, on peut doser faci-
lement et rapidement une grande quantité d'échantillons de sérum
(anticorps ATLA).
Les exemples suivants illustrent l'invention sais
toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
Préparation de l'antigène insoluble.
On centrifuge dans un "Ficoll Pac'k" (produit de la Société Pharmacia Japan Co) 20 ml desangrecueilli chez un patient âgé de 50 ans atteint d'ATL,vivant à Nagasaki, pour obtenir
5.107 cellules de lymphocytes de sang périphérique.
Ces cellules sont cultivées à 37 C pendant 3 jours dans le milieu RPMI 1640 à 10 % de sérum de veai(de la Société Flow
Laboratories Co) à une concentration en cellules de 3 105 cellules/ml.
On homogénéise une portion des cellules ainsi obtenues ( 6 108 cellules) dans une solution tampon au phosphate 0,05 M (contenant Na Cl 0,14 M, à p H 7,4, ci-après dénommée PBS) et on centrifuge pendant 1 h à 000 g On recueille le liquide surnageant et on règle sa teneur en protéine par le PBS à 120/g/ml (la teneur en protéine est déterminée par une méthode colorimétrique en utilisant un réactif pour la détermination quantitative des protéines totales fabriqué par la Société Otsuka Assay Laboratories, Co, Ltd sous le nom
de "Tonein TP") pour obtenir une solution de SCP.
A la solution de SCP ( 140 ml), on ajoute 700 billes de polystyrène (diamètre: 6,4 mm, fabriquées par la Société Precision Plastic Co, Ltd, Etats-Unis d'Amérique), lavées au
préalable en série par une solution aqueuse de HG 1 0,1 N, une solu-
tion aqueuse de Na OH 0,1 N et l'éthanol et on laisse reposer le mélange pendant 6 h à la température ambiante sous le vide de la
trompe à eau, puis on filtre pour obtenir l'antigène insolubilisé.
On conserve celui-ci dans une solution tampon au phosphate 0,05 M
contenant 0,2 % de gélatine (p H 7,4) à 4 C.
EXEMPLE 2
Préparation de l'antigène insoluble.
( 1) On cultive des cellules ATL (cellules Kyo-Ya fournies par l'Institut de Recherches sur les Virus de l'Université de Kyoto) à 37 C pendant 4 jours dans le milieu RPMI 1640/sérum de veau à 10 % + 50 g/ml d'Id Urd (Société Flow Laboratories Co) à une concentration en cellules de 3 105 cellules/ml Le liquide de culture est centrifugé à 1500 tr/min pendant 10 min pour séparer
les cellules et le milieu de culture, que l'on recueille séparément.
( 2) A une portion des cellules ATL cultivées ( 5 10 cellules) obtenues en ( 1) ci-dessus, on ajoute 30 ml de sérum physiologique et on homogénéise le mélange, puis on centrifuge à 000 g pendant 1 h On recueille le liquide surnageant et on règle sa teneur en protéines de la méme manière qu'à l'exemple 1, pour préparer une solution de SCP ayant une teneur en protéines de 120 pg/ml, à partir de laquelle on prépare de la même manière qu'à l'exemple 1 un antigène insoluble, c'est-à-dire l'antigène adsorbé sur billes de polystyrène On laisse reposer l'antigène ainsi obtenu pendant une nuit dans une solution tampon au phosphate 0,05 M contenant 0,2 % de gélatine (p H 7,4), on lave à l'eau, on
sèche et on conserve jusqu'à l'emploi.
( 3) On centrifuge 500 ml du milieu de culture obtenu en ( 1) ci-dessus à 40 000 g pendant 1 h et on recueille le bouton formé On soumet le bouton de centrifugation à la centrifugation avec gradient de densité de 25 à 60 % de sucre et on recueille les fractions correspondant aux densités de 1, 15 à 1,16 Ces fractions sont solubilisées avec 1,5 ml d'une solution aqueuse de Na Cl 0,8 M contenant O,5 % de "Triton X-100 " à 4 VC pendant 60 min, pour
recueillir le liquide surnageant.
On dialyse le surnageant ainsi obtenu contre une solution tampon de trisH Cl 0,02 M contenant Na Cl 0,3 M (p H 7,5) en utilisant une membrane de"Cellophane" pendant 5 h pour séparer l'agent solubilisant et ajuster la concentration en sels On fait passer la solution de VAP ainsi obtenue à travers une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec la même solution tampon tris-H Cl que ci-dessus, pour-obtenir la fraction qui passe à travers la colonne sanss'arrêter On ajoute à cette fraction de l'eau distillée pour régler sa teneur en protéines à 2,81 g/m I A une portion de ml de cette solution, on ajoute 80 billes de polystyrène, comme décrites à l'exemple 1, lavées au préalable comme à l'exemple 1 et on laisse reposer pendant 6 h à la température ambiante pour obtenir l'antigène insoluble On laisse reposer celui-ci pendant une nuit dans une solution tampon au phosphate 0,05 M contenant 0,2 % de gélatine (p H 7,4), on lave à l'eau, on sèche et on conserve
jusqu'à l'emploi.
EXEMPLE 3
Préparation de l'échantillon de sérum.
On recueille des échantillons de sang sur un patient atteint d'ATL et sur un adulte sain en utilisant de l'héparine et
on laisse reposer pendant 3 h à la température ambiante pour recueil-
lir les liquides surnageants On centrifuge chaque liquide surnageant
pendant 10 min à 2 000 tr/min, pour recueillir les liquides sur-
nageants qui sont utilisés comme échantillons de sérum.
EXEMPLE 4
Dosage de l'anticorps anti-ATLA.
On prépare une série de sérums dilués ( 80 x, 160 x, 320 x, 640 x, 1 280 x) par double dilution de chaque
échantillon de sérum préparé à l'exemple 3 avec un tampon au phos-
phate 0,05 M contenant 0,2 % de gélatine (p H 7,4) A 0,5 ml de chaque
échantillon de sérum dilué, on ajoute un morceau de l'antigène inso-
luble (antigène adsorbé sur bille de polystyrène) préparé à l'exemple 1
et on laisse reposer à 370 C pendant 2 h On sépare le mélange de.
réaction par essorage à la trompe à eau, on lave la bille avec 2 ml de sérum physiologique et on sépare le liquide de lavage par essorage
à la trompe à eau On répète trois fois ce mode opératoire.
En outre, on ajoute la bille ainsi traitée à 0,55 ml de Protéine A marquée à la peroxydase (produit de la Société E Y Laboratories Co) diluée 44 000 x par le même tampon phosphate que ci-dessus et on laisse reposer à 37 C pendant 2 h,
puis on lave suffisamment de la même manière que ci-dessus.
En outre, on ajoute en agitant H 202 à 20 ml de
solution tamponde McLevin 0,2 M contenant 60 mg de o-phénylène-
diamine (p H 5,8) pour régler sa concentration finale à 0,02 % en
volume, pour préparer un agent colorant.
Dans un tube à essais, on place 2 ml de sérum physiologique et 0,5 ml de l'agent colorant et on y ajoute une bille préparée comme décrit ci-dessus Après avoir laissé reposer à la température ambiante pendant 30 min, on ajoute 1 ml d'acide chlorhydrique 3 N pour arrêter la réaction enzymatique et on mesure
la densité optique du mélange de réaction à 492 nm.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le
tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Dilution de l'échantillon de sérum x 80 x 160 x 320 x 640 x 1280 Patients atteints d'ATL
A 0,789 0,748 0,646 0,550 0,410
B 0,701 0,624 0,550 0,423 0,356
C 0,558 0,449 0,367 0,291 0,222
Personnes saines
D 0,166 0,114 0,081 0,047 0,028
E 0,114 0,089 0,054 0,037 0,027
F 0,142 0,089 0,063 0,037 0,023
On répète les mêmes modes opératoires que ci-dessus, sauf qu'au lieu de l'antigène insoluble préparé à l'exemple 1 on
utilise l'antigène insoluble (antigène adsorbé sur billes de poly-
styrène) préparé à l'exemple 2-( 2) et à l'exemple 2-( 3),respective-
ment,pour les sérums aux dilutions 80 x ou 100 x.
Les résultats obtenus sont indiqués dans les
tableau II et III ci-dessous.
TABLEAU II
Antigène insoluble préparé d l'exemple 2-( 2) Densité optique à 492 nm Sérum dilué 100 x Patients atteints d'ATL G H 1,154 1,012 0,879 Personnes saines J K
O, 108
0,094 0,011 L
TABLEAU III
Antigène insoluble préparé à l'exemple 2-( 3) Densité optique à 492 rn Sérum dilué 80 x Patients atteints d'ATL M N Personnes saines P Q 0,826 0, 722
O, 611
0,234 0,329
EXEMPLE 5
Pour le dosage de l'anticorps ATLA, on répète les mêmes modes opératoires qu'à l'exemple 4, sauf que l'on utilise comme antigène insoluble l'antigène adsorbé sur billes de polystyrène
préparé à l'exemple 2-( 2) et comme effecteur de marquage l'anti-
corps de chèvre anti-Ig G humaine marque à la peroxydase, à la dilu-
tion 600 x (produit de la Société E Y Laboratories Co) On
obtient pour chaque dilution de sérum la densité optique à 492 nm.
Les résultats obtenus sont indiqués dans la
figure unique du dessin annexé, dans laquelle la courbe 1 repré-
sente la teneur en anticorps ATLA pour les patients atteints d'ATL
et la courbe 2 celle pour les personnes saines.
Comme il ressort clairement des résultats indiqués dans les tableau I, Il et III et la figure, selon le procédé de la présente invention, l'anticorps ATLA peut être dosé facilement par une mesure de densité optique et, par conséquent, la présente invention est intéressante pour le diagnostic et la sélection de
patients atteints d'ATL.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux
modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra-
tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit
de l'invention.
Claims (19)
1 Antigène insolubilisé, caractérisé en ce qu'il comprend un support insoluble sur lequel est immobilisé un antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte choisi parmi les protéines cytoplasmiques solubles des cellules de leucémie des cellules T de l'adulte et les protéines solubilisées de virus de
leucémie des cellules T de l'adulte.
2 Antigène insolubilisé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte est ladite protéine cytoplasmique soluble immobilisée sur ledit support insoluble choisi parmi le polystyrène,
le verre, le polycarbonate et le polypropylène.
3 Antigène insolubilisé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit support insoluble consiste en billes
de polystyrène.
4 Antigène insolubilisé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite protéine cytoplasmique soluble consiste en le liquide surnageant de centrifugation d'homogénéisat
desdites cellules de leucémie des cellules T de l'adulte.
5 Antigène insolubilisé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites cellules de leucémie des cellules T de l'adulte sont des cellules isolées du sang périphérique ou des
ganglions lymphatiques recueillis chez un patient atteint de leucé-
mie des cellules T de l'adulte.
6 Antigène insolubilisé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites cellules de leucémie des cellules T de l'adulte consistent en une lignée établie de cellules de leucémie
des cellules T de l'adulte.
7 Antigène insolubilisé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites cellules de leucémie des cellules T de l'adulte sont des cellules transformées par co-culture de cellules de leucémie des cellules T de l'adulte isolées du sang périphérique ou des ganglions lymphatiques recueillis chez un patient atteint
de leucémie des cellules T de l'adulte avec des cellules T humaines.
8 Antigène insolubilisé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites cellules T humaines sont dérivées
du sang périphérique,de la moelle osseuse, des ganglions lympha-
tiques, de la rate,des amygdales ou du thymus.
9 Antigène insolubilisé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite co-culture est effectuée dans un milieu RPMI 1640 ou un milieu essentiel d'Eagle minimal modifié
par du sérum de foetus bovin ou du sérum de veau.
Antigène insolubilisé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites cellules de leucémie des cellules T de l'adulte consistent en une lignée établie de cellules de leucémie
des cellules T de l'adulte.
11 Antigène insolubilisé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte est ladite protéine solubilisée immobilisée sur ledit support insoluble choisi parmi le polystyrène, le verre,
le polycarbonate et le polypropylène.
12 Antigène insolubilisé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit support insoluble consiste en billes
de polystyrène.
13 Antigène insolubilisé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit virus de leucémie des cellules T de l'adulte est un virus purifié par centrifugation par gradient de densité. 14 Antigène insolubilisé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite protéine solubilisée est une protéine obtenue par solubilisation du virus de leucémie des cellules T de
l'adulte avec un agent solubilisant.
Antigène insolubilisé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit agent solubilisant est un tensioactif non ionique, tel que digitonine ou urée ou un tensioactif anionique
tel que dodécylsulfate de sodium.
16 Procédé pour préparer un antigène insolubilisé comprenant un support insoluble sur lequel est insolubilisé un antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte choisi parmi les protéines cytoplasmiques solubles de cellules de leucémie des cellules T de l'adulte et les protéines solubilisées de virus de leucémie des cellules T adultes, caractérisé en ce que l'on mélange un antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte avec un support insoluble dans un milieu aqueux, on les fait réagir et on sature facultativement les centres d'adsorption résiduels du-
dit support insoluble et on lave à l'eau l'antigène résultant.
17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte est ladite protéine cytoplasmique soluble immobilisée sur ledit support insoluble choisi parmi le polystyrène, le verre,
le polycarbonate et le polypropylène.
18 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte est ladite protéine solubilisée insolubilisée sur ledit
support insoluble choisi parmi le polystyrène, le verre, le poly-
carbonate et le polypropylène.
19 Procédé pour doser un anticorps dirigé contre l'antigène associé à la leucémie des cellules T de l'adulte par dosage immunologique de fluorescence ou dosage immunologique enzymatique, caractérisé en ce que l'on fait réagir un antigène
insolubilisé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15,
avec un échantillon de sérum et on détermine le complexe antigène-
anticorps résultant -
Procédé selon la revendication 19, caractérisé
en ce qu'il comprend en outre la réaction dudit complexe antigène-
anticorps avec un effecteur de marquage capable de se fixer spé-
cifiquement sur un anticorps.
21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit effecteur de marquage est une substance marquée par une enzyme ou par une substance fluorescente, capable de se fixer spécifiquement sur un anticorps, choisie parmi la protéine A, l'anticorps de mouton antiimmunoglobuline G humaine, l'anticorps de lapin anti-immunoglobuline G humaine, l'anticorps de chèvre
anti-immunoglobuline G humaine, l'anticorps de souris anti-
immunoglobuline G humaine et l'anticorps de rat anti-immunoglobuline G humaine. 22 Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit effecteur de marquage est un effecteur de marquage enzymatique, ladite enzyme étant choisie parmi la peroxydase, le
chymotrypsinogène, la procarboxypeptidase, l'acide glycéraldéhyde-3-
phosphorique-déshydrogénase, l'amylase, la phosphorylase, la D-Nase,
et la P-nase.
23 Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit effecteur de marquage est un effecteur de marquage du type fluorescéine, ladite fluorescéine étant choisie parmi le fluorescéine-isothiocyanate, le tétraméthylrhodamine-isothiocyanate, le rhodamine-isothiocyanate substitué, le Rhodamine B-isothiocyanate
et la dichlorotriazine-fluorescéine.
24 Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit effecteur de marquage est la protéine A marquée
par la peroxydase.
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