FR2709349A1 - Procédé d'identification d'une substance immunologique au moyen d'un système multimembranaire. - Google Patents

Procédé d'identification d'une substance immunologique au moyen d'un système multimembranaire. Download PDF

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Abstract

La présente invention à trait à un procédé d'identification qui comprend la distribution (i) d'un mélange aqueux d'un échantillon liquide susceptible de contenir une substance immunologique à identifier [i.e. X] avec un conjugué [anti(X)] de ladite substance immunologique couplé à un marqueur [E*], ledit mélange étant tel que la réaction (CF DESSIN DANS BOPI) ait pu se déclencher et aboutir à la production d'une quantité relativement importante de complexe X-anti(X)-E*, sur (ii) une phase sélective constituée par une membrane poreuse comprenant un réactif immunologique immobilisé qui est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec le conjugué [anti(X)] et le conjugué couplé à un marqueur [anti(X)-E*], mais ne réagissant pas avec le produit de la réaction précité [X-anti(X)-E*], ou (b) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec ladite substance immunologique et le produit de la réaction précité [X-anti(X)-E*], mais ne réagissant pas avec ledit conjugué [anti(X)] et ledit conjugué couplé à un marqueur [anti(X)-E*].

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION D'UNE SUBSTANCE IMMUNOLOGIQUE
AU MOYEN D'UN SYSTEME MULTIMEMBRANAIRE
DOMAINE DE L 'INVENTION
La présente invention a trait à un nouveau procédé d'identification d'une substance immunologique choisie parmi l'ensemble constitué par les antigènes et les anticorps, ledit procédé mettant en oeuvre un système multimembranaire pour séparer et détecter visuellement le produit d'une réaction immunologique
antigène + anticorps ---- > antigène-anticorps
Elle concerne également, en tant que produits industriels nouveaux ledit système multimembranaire, d'une part, et les trousses ou nécessaires de dosage renfermant ledit système multimembranaire, d'autre pan.
ART ANTERIEUR
On connaît des solutions techniques pour l'identification d'une substance immunologique choisie parmi l'ensemble constitué par les antigènes et les anticorps, qui mettent en oeuvre un système de couches lamellaires poreuses.
Le brevet délivré US-A4 446 232 (Lance A. LIOTTA) préconise un dispositif multimembranaire pour l'identification d'un antigène, qui comprend
- une première zone poreuse qui contient un antigène et un anticorps couplé
à un enzyme de marquage, lesdits antigènes et anticorps étant capables de
réagir immunologiquement entre eux, ladite première zone comportant au
moins deux couches : une couche supérieure contenant l'anticorps couplé à
un enzyme, et une couche inférieure contenant l'antigène immobilisé
spécifique dudit anticorps, et
- une seconde zone poreuse contenant le substrat de l'enzyme de marquage et
son révélateur.
Selon US-A-4 446 232, l'anticorps couplé à un enzyme, qui est une substance immunologique comportant deux sites actifs, I'un de ces sites étant utilisé pour le couplage avec l'enzyme de marquage, I'autre pour la liaison avec l'antigène susceptible d'être présent dans l'échantillon liquide à analyser, étant tel qu'il (i) traverse la première zone quand il a réagi avec l'antigène à identifier si ce dernier est présent dans ledit échantillon ou (ii) ne traverse pas ledite première zone en raison de sa fixation sur l'antigène immobilisé quand il n'a pas réagi avec l'antigène à identifier si ce dernier n'est pas présent dans ledit échantillon.
Ce dispositif multimembranaire est également utile, selon US-A-4 446 232, pour l'identification d'un anticorps quand on remplace dans la première zone, d'une part l'anticorps couplé à un enzyme par un antigène couplé à l'enzyme de marquage, et d'autre part, l'antigène non immobilisé par un anticorps non immobilisé.
US-A-4 446 232 signale en outre que les deux zones poreuses peuvent être chacune constituées de papier, notamment un papier de nitrocellulose ou un papier dit diazobenzyloxylé (voir colonne 4 lignes 40-47 et exemple 1).
Le principal inconvénient du dispositif multimembranaire selon le brevet
US-A-4 446 232 réside dans le fait que ce dispositif présente une sensibilité médiocre. En premier lieu, I'échantillon liquide contenant l'antigène à identifier passe trop rapidement à travers la première zone, en particulier à travers la membrane de nitrocellulose où est présent le matériau anticorps couplé à un enzyme; en conséquence la réaction dudit antigène à identifier avec ledit anticorps couplé à un enzyme soit est incomplète, soit n'a pas pu se réaliser. En deuxième lieu, eu égard aux modalités opératoires fournies à l'exemple 1 de US-A-4 446 232, une partie non négligeable de l'anticorps couplé à l'enzyme de marquage est immobilisée par adsorption sur la ou les membranes de la première zone.
Une autre solution technique est décrite dans la demande de brevet publiée
FR-A-2 666 896 (Jacques TOLEDANO). Elle met en oeuvre un dispositif multimembranaire pour l'identification d'un antigène (ou inversement d'un anticorps) susceptible d'être contenu dans un échantillon liquide aqueux, ledit dispositif, dans lequel est prévu une pluralité de membranes, retardant le passage dudit échantillon.
Plus précisément, selon les indications fournies dans la description de FR
A-2 666 896 (voir page 3 lignes 13-50), ce dispositif multimembranaire comprend
- un filtre (A), notamment en cellulose, polyamide ou polycarbonate, destiné
à recevoir l'échantillon liquide à analyser et susceptible de contenir un
antigène à identifier,
- une double membrane perméable (B) qui est sous-jacente au filtre (A) et est
formée d'un premier feuillet (B1) comprenant un réactif (R1) mobile ou
immobilisé reconnaissant ledit antigène à identifier, d'une part, et d'un
second feuillet (B2) qui est sous-jacent au premier feuillet (B1) et comprend
un réactif (R2) complémentaire de (R1), le contact dudit antigène à identifier
avec le réactif (R1) transmettant un signal au réactif (R2) qui active à son
tour les mécanismes des couches sous-jacentes, d'autre part,
- une pellicule (M1) à lyse programmée, qui est sous-jacente au feuillet (B2),
cette pellicule (M1) étant au départ imperméable vis-à-vis de l'échantillon
liquide à analyser servant ici d'éluant, puis étant dégradée par ledit
échantillon liquide de façon à permettre son passage vers la couche suivante,
- une couche ou zone (C), qui est sous-jacente à la pellicule (M1) et contient
une association de réactifs aptes à devenir actifs en présence du signal
véhiculé par ledit échantillon liquide ayant traversé (M1),
- une pellicule (M2) à lyse programmée, qui est sous-jacente à la couche ou
zone (C) et similaire à la pellicule (M1) sus-visée, et
- une zone poreuse (D) comportant les moyens de révélation de la présence
ou de l'absence de l'antigène dans l'échantillon liquide à analyser.
La solution technique de FR-A-2 666 896 permet de remédier, grâce aux pellicules M1 et M2, à l'inconvénient majeur précité de la solution technique de
US-A-4 446 232 en ce qui concerne l'achèvement de la réaction de l'antigène à identifier avec un anticorps couplé à un enzyme non immobilisé, ou une évolution suffisante de ladite réaction. Cette solution technique qui met en oeuvre une membrane supportant un anticorps couplé à un enzyme de marquage et non immobilisé et un anticorps anti-enzyme immobilisé sur une autre membrane, présente l'inconvénient de donner lieu à des réactions parasitaires avec des enzymes contenus dans l'échantillon à analyser, soit au niveau de la réaction immunologique du type antigène-anticorps précitée, soit (surtout) au niveau de la révélation de l'enzyme de marquage. D'un autre côté, quand on n'utilise pas lesdites membranes M1 et M2, la solution technique du système multimembranaire de FR-A-2 666 896 est défectueuse eu égard à la faible épaisseur (inférieure à 0,1 mm) de la membrane (Bt ou B2) qui comporte le réactif immunologique immobilisé (R1 ou R2). Quand on n'emploie pas les membranes M1 et M2, le passage du liquide à travers une membrane poreuse d'épaisseur inférieure à 0,1 mm est tellement rapide que la réaction immunologique se fait mal et que ladite membrane poreuse est utilisée au mieux à 0,01 à 0,1 % de sa capacité. Par exemple 50 à 100 yg de DDi immobilisé ne retiennent que 3 à 5 ng de conjugué anticorps monoclonal anti (DDi) couplé à la peroxydase.
Il existe donc un besoin d'améliorer la sensibilité et la fiabilité de ces solutions techniques en évitant plus particulièrement les phénomènes non souhaités que constituent (i) l'immobilisation par adsorption de chaque matériau immunologique qui doit rester mobile, (ii) le relargage de chaque réactif immunologique qui doit rester immobilisé, et (iii) les réactions parasitaires.
BUT DE L 'INVENTION
Selon l'invention on se propose de fournir une nouvelle solution technique différente des solutions antérieurement connues qui soit plus sensible et plus fiable.
Selon un premier aspect de l'invention on se propose de fournir un procédé d'identification d'une substance immunologique appartenant à l'ensemble des antigènes et des anticorps et susceptible d'être contenue dans un échantillon liquide à analyser.
Selon un second aspect de l'invention on se propose de fournir un dispositif multimembranaire, en tant que produit industriel nouveau, pour la mise en oeuvre dudit procédé.
Selon un autre aspect de l'invention on se propose de fournir un nécessaire, kit ou trousse de dosage contenant ledit dispositif multimembranaire avec le cas échéant (i) un ou plusieurs réactifs complémentaires, et/ou (ii) un milieu de dilution.
OBJET DE L 'INVENTION
La nouvelle solution technique que l'on préconise selon l'invention comprend la distribution (i) d'un mélange aqueux d'un échantillon liquide susceptible de contenir une substance immunologique à identifier [i.e. X] avec un conjugué [anti(X)] de ladite substance immunologique couplé à un enzyme [E*], ledit mélange étant tel que la réaction
X + anti(X)-E* --- > X-anti(X)-E* ait pu se déclencher et aboutir à la production d'une quantité relativement importante de complexe X-anti(X)-E*, sur (ii) une phase sélective constituée par une membrane poreuse comprenant un réactif immunologique immobilisé qui est choisi parmi l'ensemble constitué par
(a) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec le
conjugué [anti(X)] et le conjugué couplé à un enzyme [anti(X)-E*], mais
ne réagissant pas avec le produit de la réaction précité [X-anti(X)-E*], ou
(b) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec
ladite substance immunologique et le produit de la réaction précité [X
anti(X)-E*], mais ne réagissant pas avec ledit conjugué [anti(X)] et ledit
conjugué couplé à un enzyme [anti(X)-E*].
Le terme conjugué, tel qu'utilisé ici, est conforme à la définition donnée ciaprès au début du chapitre intitulé "Description détaillée de l'invention".
Selon l'invention, on préconise donc un procédé d'identification d'une substance immunologique (X) appartenant à l'ensemble des antigènes et des anticorps et susceptible d'être présente dans un échantillon liquide à analyser, ledit procédé, qui met en oeuvre la réaction de ladite substance immunologique avec l'un de ses conjugués [anti(X)] et l'utilisation d'un système multimembranaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1 ) mettre en contact l'échantillon liquide susceptible de contenir ladite
substance immunologique (X) à identifier avec l'un de ses conjugués couplé
à un enzyme de formule
anti(X)-E*
où anti(X) représente un conjugué bifonctionnel et E* un enzyme de
marquage, de façon à obtenir le produit de réaction de formule
X-anti(X)-E*
quand ladite substance immunologique est présente ; et, (2 ) faire passer le milieu réactionnel ainsi obtenu sur un dispositif
multimembranaire comprenant - une première zone comportant une membrane poreuse pourvue d'un réactif immunologique immobilisé qui est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec le conjugué (anti(X)) et le conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E*), mais ne réagissant pas avec le produit de la réaction précité (X-anti(X)-E*), ou (b) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec ladite substance immunologique et le produit de la réaction précité (X-anti(X)-E*), mais ne réagissent pas avec ledit conjugué (anti(X)) et ledit conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E*), le rapport "quantité pondérale dudit réactif immunologique immobilisé/surface de la membrane poreuse pourvue dudit réactif immunologique" étant compris entre
10 et 150 yg/cm2, et les sites actifs de ladite membrane non utilisés pour immobiliser ledit réactif immunologique étant bloqués; et, - une deuxième zone comportant au moins une membrane poreuse, qui est sousjacente à la membrane contenant ledit réactif immunologique immobilisé et qui contient un substrat spécifique de l'enzyme de marquage (E*) pour la révélation de la présence dudit enzyme.
On préconise également une variante de ce procédé selon laquelle on prépare à l'étape (1 ) un mélange de l'échantillon à analyser susceptible de contenir la substance immunologique X à identifier avec un conjugué dirigé contre anti(X) et couplé à l'enzyme de marquage, ce conjugué étant un complexe répondant à la formule anti [anti(X)] -E* et tel que (a) en l'absence de X, il réagit avec anti(X), et (b) en présence de X, il ne peut réagir avec anti(X) qu'après la fixation complète de X par anti(X), puis fait réagir à l'étape (2 ) ledit mélange avec le composé anti(X) immobilisé au niveau d'une membrane poreuse, avant de procéder à la révélation du conjugué complexe anti [anti(X)] -E* non retenu par le réactif immobilisé anti(X) du fait de la présence de X (généralement en excès).
En d'autres termes, selon cette variante on fournit un procédé qui comprend les étapes consistant à (1") mettre en contact l'échantillon liquide susceptible de contenir ladite
substance immunologique (X) à identifier avec un conjugué complexe de
formule anti[anti(X)]-E *
où E* et anti(X) sont définis comme indiqué ci-dessus, ledit conjugué
complexe réagissant avec le conjugué [anti(X)] dirigé contre ladite
substance immunologique (X) en l'absence de ladite substance (X) mais ne
réagissant pas avec ledit conjugué en présence de ladite substance (X)
libre ; et, (2 ) faire passer ledit mélange de l'échantillon à analyser avec ledit anti(X)
complexe sur un dispositif multimembranaire comprenant
- une première zone comportant une membrane poreuse comportant le
conjugué [anti(X)] en tant que réactif immunologique,
le rapport quantité pondérale dudit réactif immunologique
immobilisé/surface de la membrane poreuse pourvue dudit réactif
immunologique étant compris entre 10 et 150 yg/cm2, et les sites actifs de
ladite membrane non utilisés pour immobiliser ledit réactif immunologique
étant bloqués; et,
- une deuxième zone comportant au moins une membrane poreuse, qui est
sous-jacente à la membrane contenant ledit réactif immunologique
immobilisé et qui contient un substrat spécifique de l'enzyme de marquage
(E*) pour la révélation de la présence dudit enzyme.
Selon l'invention l'on préconise en outre un système multimembranaire qui comprend les première et deuxième zones sus-visées.
Enfin selon l'invention, I'on préconise également un nécessaire, kit ou trousse de dosage pour l'identification d'une substance immunologique conformément au procédé sus-visé, ledit nécessaire, kit ou trousse de dosage étant caractérisé en ce qu'il comprend ledit système multimembranaire et, le cas échéant, des réactifs complémentaires et/ou un milieu de dilution.
ABREVIATIONS
Par commodité, les abréviations suivantes ont été utilisées dans la présente invention.
AEC désigne le 3-amino-9-éthylcarbazole bCG désigne la gonadotropine du chorion bovine
BCIP désigne le phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle
BSA désigne l'albumine sérique bovine (de l'anglais : "bovine serum albumin")
CMV désigne un cytomégalovirus
D désigne un fragment monomère particulier appartenant à l'ensemble
des FnDP;
DDi désigne un fragment D dimère particulier appartenant à l'ensemble
des FnDP;
EIA désigne un essai enzymo-immunologique (de l'anglais "enzymeimmunoassay")
F(ab) désigne un fragment d'un anticorps du type Ig comportant les
branches a et b et obtenu par clivage dudit anticorps par la papaine
F(ab')2 désigne un fragment d'un anticorps du type Ig comportant les
branches a et b et obtenu par clivage dudit anticorps par la pepsine
Fc désigne un fragment d'un anticorps du type Ig essentiellement
constitué par la branche c et obtenu par clivage chimique ou
enzymatique ; les fragments Fc sont homologues mais
structurellement différents selon le mode de clivage [voir à cet effet
les indications fournies dans la publication FR-A-2 645 647 en ce
qui concerne les Fc séparés de F(ab) et F(ab')2]
FDP désigne les produits de dégradation du type FgDP ou FnDP
FgDP désigne les produits de dégradation du fibrinogène;
FnDP désigne les produits de dégradation de la fibrine
GMV désigne un virus de la rubéole (de l'anglais : "German measles virus")
HBcAb désigne un anticorps de noyau du virus de l'hépatite B (en anglais
"hepatitis B core antibody")
HBcAg désigne un antigène de noyau du virus de l'hépatite B (en
anglais :"hepatitis B core antigen")
HBsAb désigne un anticorps de surface du virus de l'hépatite B (en anglais:
hepatitis B surface antibody")
HBsAg désigne un antigène de surface du virus de l'hépatite B (en anglais:
"hepatitis B surface antigen") hCG désigne la gonadotropine du chorion humaine (en anglais : "human
chorionic gonadotropin") HCV désigne un virus de l'hépatite C
HIV désigne un virus d'immunodéficience humaine (en anglais : "human
immunodeficiency virus") HSV désigne un virus de l'herpès (en anglais : "herpes simplex virus")
Ig désigne une immunoglobuline;
IVA désigne un virus de la grippe de type A (en anglais : "influenza A virus")
IVB désigne un virus de la grippe de type B (en anglais : "influenza B virus")
MES désigne l'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique
MPB désigne le méthoxynaphtyl-galactoside
NTB désigne le bleu de tétrazonium (en anglais : "nitro-blue tetrazonium")
OD désigne la densité optique PAI désigne un inhibiteur des activateurs du plasminogène
PAI-1 désigne 1' inhibiteur 1 des activateurs du plasminogène, substance
formant des complexes (tPA-PAI-1) et (uPA-PAI-1) avec tPA et
respectivement uPA
PBS désigne une solution physiologique de tampon phosphate (en
anglais: "phosphate-buffered saline")
PVP désigne la polyvinylpyrrolidone
RF désigne le facteur rhumatoïde;
RIA désigne un essai radio-immunologique (de l'anglais " radioimmunoassay " );
RSV désigne un virus de la syncinésie respiratoire (en anglais
"respiratory sincitial virus")
RT désigne la température ambiante (15-25"C), de préférence RT sera
compris entre 18 et 250C
TMB désigne la 3,3' ,5,5 ' -tétraméthylbenzidine; tPA désigne tout activateur du plasminogène de type tissulaire (de
l'anglais : "tissue plasminogen activator") et comprend les sctPA
(activateur du plasminogène de type tissulaire de structure
monocaténaire, en anglais : "single-chain tissue plasminogen
activator") et tctPA (activateur du plasminogène de type tissulaire
de structure bicaténaire, en anglais : "two-chain tissue plasminogen activator")
TV désigne un virus de la toxoplasmose; uPA désigne tout activateur du plasminogène de type urokinase (de
l'anglais : "urokinase plasminogen activator") et comprend les
scuPA (activateur du plasminogène de type urokinase de structure
monocaténaire, en anglais : "single-chain urokinase plasminogen
activator", également appelé prourokinase) et tcuPA (activateur du
plasminogène de type urokinase de structure bicaténaire, en anglais:
: two-chain urokinase plasminogen activator", également dénommé urokinase) 9C3 anticorps monoclonal spécifique du DDi commercialisé par la
société dite DIAGNOSTICA STAGO) 2F7 anticorps monoclonal spécifique du DDi commercialisé par la
société dite DIAGNOSTICA STAGO) 7D4 anticorps monoclonal spécifique du PAI-1 (commercialisé par la
société dite DIAGNOSTICA STAGO) 7F5 anticorps monoclonal spécifique du PAI-1 (commercialisé par la
société dite DIAGNOSTICA STAGO).
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Dans les dessins annexés, nullement limitatifs,
- les figures 1-5 illustrent schématiquement des systèmes multimembranaires selon l'invention, dans lesquels le réactif immunologique est immobilisé essentiellement sur la surface supérieure et/ou dans la masse de la membrane poreuse le comportant
- les figures la-4a et respectivement lb-4b illustrent les mécanismes réactionnels qui interviennent dans les systèmes multimembranaires des figures 1-4 correspondants, quand ces derniers sont utilisés dans un essai "négatif" (absence de substance immunologique X dans l'échantillon à analyser) et respectivement dans un essai "positif" (présence de ladite substance immunologique dans l'échantillon à analyser)
- les figures 5a et Sb illustrent schématiquement les mécanismes qui interviennent dans le système multimembranaire de la figure 5, quand la concentration de la substance immunologique X, présente dans l'échantillon à analyser est inférieure (figure Sa : essai "négatif") ou supérieure (figure 5b : "essai positif") à une concentration prédéterminée ; et,
- les figures 6, 7 et 8 illustrent schématiquement en coupe des systèmes multimembranaires selon l'invention, dans lesquels le réactif immunologique immobilisé est disposé essentiellement dans la masse de la membrane poreuse le comportant.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Par l'expression "substance immunologique" on entend ici tout élément d'un couple (antigène/anticorps) intervenant dans une réaction immunologique
antigène + anticorps --------- > antigène-anticorps
Les couples (antigène/anticorps) englobent ici non seulement les couples (substance antigénique/anticorps) mais encore les couples immunologiques (agoniste/antagoniste) ou (conjugué/anticonjugué) tels que les couples (biotine/avidine) et (activateur/inhibiteur) [notamment les couples (tPA/PAI)].
Par "substances antigéniques" on entend ici les antigènes proprement dits, d'une part. et les substances à partir desquelles on peut générer des anticorps, d'autre part. Parmi ces dernières substances, on peut notamment citer les haptènes, les peptides, les médicaments comportant au moins un fragment peptidique, les alcaloïdes et d'une manière générale toute substance présentant une structure immunologique.
Par "conjugué" d'une substance donnée (X ou respectivement anti-X) on entend un partenaire [anti-X ou respectivement anti(anti-X)] spécifique de ladite substance dans une réaction immunologique. Suivant cette définition, le terme "conjugué n'implique pas nécessairement que ledit partenaire soit couplé à un marqueur, de type enzyme par exemple.
Les couples (antigène/anticorps) préférés selon l'invention sont les couples (substance antigénique/anticorps) et (anticorps/anti(anticorps)).
La substance immunologique à identifier peut être une substance antigénique, telle que notamment DDi, FgDP, FnDP, Protéine C, Protéine S, a1antitrypsine, hCG, bCG, PAI (en particulier PAI-1), tPA (notamment sctPA et tctPA), uPA (notamment scuPA et tcuPA), un antigène d'origine bactérienne ou virale tel que HBcAg, HBsAg, antigène de IVA, antigène de IVB ou antigène de
RSV, ou un anticorps présent dans ou dirigé contre une portion d'enveloppe ou noyau de bactérie, moisissure ou virus tel que HBcAb, HBsAb, anticorps de
CMV, GMV, HCV, HIV (notamment HIV-1, HIV-2 ou HIV-3), HSV, MCV,
RCV ou TV.
De façon pratique, ladite substance immunologique est ici un matériau immunologique intervenant (i) dans les mécanismes de l'hémostase, (ii) dans le domaine bactériologique ou virologique. (iii) dans les mécanismes de la fécondation/nidation, ou encore (iv) le domaine agro-alimentaire (recherche notamment de la présence d'un antigène ou anticorps spécifique des souches de
Neisseria).
Le conjugué de ladite substance immunologique est avantageusement ici un anticorps monoclonal dirigé contre (en anglais : "raised against") ladite substance immunologique. Ledit anticorps monoclonal tel qu'utilisé selon l'invention est un matériau hautement purifié et bifonctionnel. Le conjugué anticorps monoclonal couplé à un enzyme de formule anti(X)-E* tel qu'utilisé ici doit être purifié. Il est en effet important que cet anticorps couplé à un enzyme soit essentiellement dépourvu d'enzyme libre pour éviter une coloration parasitaire du révélateur de l'enzyme de marquage.
L'échantillon susceptible de contenir la substance immunologique à identifier est un liquide aqueux, en particulier un liquide corporel tel que notamment le sang (principalement le plasma, et le cas échéant le sérum), I'urine, la salive, la sueur, le lait, ou un milieu liquide aqueux, synthétique ou semisynthétique contenant un produit, notamment alimentaire, d'origine végétale ou animale, sous forme liquide ou broyée.
Dans la phase sélective, le réactif immunologique immobilisé est disposé sur la surface supérieure de la membrane poreuse et/ou dans la masse de ladite membrane poreuse.
Dans une première variante, le réactif immunologique immobilisé au niveau de la phase sélective est choisi parmi les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec ledit conjugué anti(X) et ledit conjugué couplé à un enzyme anti(X)-E* mais ne réagissent pas avec le produit de la réaction de l'étape (1 ) à savoir X-anti(X)-E*.
Dans cette variante le réactif immunologique immobilisé est alors
- la substance immunologique (X) elle-même,
- un conjugué dudit conjugué, à savoir (i) un anticorps [anti(anti(X))] dirigé
contre l'anticorps [anti(X)] de l'étape (1"), ou (ii) une protéine ou un peptide
réagissant spécifiquement vis-à-vis dudit conjugué [anti(X)].
Le réactif anti [anti(X)], qui est immobilisé au niveau de la membrane poreuse de la première zone, sera avantageusement un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre un fragment ou un site actif de l'anticorps anti(X), à savoir notamment - un anticorps anti[F(ab')2] - un anticorps anti-chaîne kappa, ou - un anticorps anti-idiotype.
L'utilisation d'une protéine, d'un peptide ou d'un composé peptidominétrique de la portion anti-idiotype, réagissant spécifiquement avec anti(X) et anti(X)-E* mais ne réagissant pas avec X-anti(X)-E* permet d'améliorer, comme les réactifs anti[anti(X)] particuliers précités, la sensibilité de la détermination de la substance immunologique X.
Selon cette première variante les résultats négatifs (absence de X) se traduisent par une absence de coloration, et les résultats positifs (présence de X dans l'échantillon à analyser) se traduisent par le développement d'une coloration.
Dans une seconde variante le réactif immunologique immobilisé est choisi parmi les anticorps dirigés contre la substance immunologique à identifier, et avantageusement spécifiques d'un épitope différent de l'épitope contre lequel a été généré l'anticorps anti(X) intervenant dans la réaction de l'étape (1 ).
Selon cette seconde variante les résultats négatifs (absence de X) se traduisent par le développement d'une coloration, et les résultats positifs (présence de X dans l'échantillon à analyser) se traduisent par une absence de coloration.
Quand enfin le conjugué complexe X-[anti(anti(X))]-E * intervient à l'étape (1 O) en mélange avec l'échantillon liquide à analyser, il sera avantageusement obtenu par couplage avec l'enzyme de marquage d'un anticorps particulier, à savoir - un anticorps monoclonal ou polyclonal anti[F(ab')2], - un anticorps monoclonal anti-chaîne kappa, ou - un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-idiotype, puis réaction avec la substance X provenant de l'échantillon à analyser.
D'une manière générale, le matériau anti(X), qui intervient selon l'invention, est une substance immunologique bifonctionnelle ou divalente, c'est-àdire une substance comprenant deux sites actifs : un premier site actif pour réagir avec X ou anti[anti(X)] et un second site actif servant à la liaison avec l'enzyme de marquage ou à l'immobilisation au niveau de la membrane poreuse de la phase sélective.
La membrane de la phase sélective a selon l'invention une épaisseur supérieure ou égale à 0,1 mm et en général inférieure ou égale à 10 mm. Une épaisseur de 0,1 mm constitue un seuil en-dessous duquel la membrane poreuse de la phase sélective perd graduellement ses capacités et est de ce f covalence, on peut notamment citer les membranes poreuses du type polymère ou copolymère telles que VERSAPORR (membranes acryliques commercialisées par la société dite GELMAN), LOPRODYNER (membranes polyamides commercialisées par la société dite PALL), TRUFFINR, SUPPORR et THERMAPORR (membranes de polysulfone commercialisées par la société dite
GELMAN).
Les membranes spécialement adaptées pour le domaine de I' immunodiagnostic et qui sont avantageuses selon l'invention, comprennent notamment les membranes de nitrocellulose, pour immobilisation par adsorption (en particulier les membranes de nitrocellulose commercialisées par la société dite SCHLEICHER & SCHUELL), et pour immobilisation par covalence les membranes IMMUNODYNER (membranes poreuses en polyamide commercialisées par la société dite PALL), IMMOBILONR (membranes poreuses en polyfluorocarbure hydrophile commercialisées par la société dite MILLIPORE) et ULTRABINDR (membranes poreuses en polysulfone commercialisées par la société dite GELMAN). Ces membranes peuvent être supportées. Le support (constitué par un matériau polymère, par exemple en polyamide, rendant les membranes plus manipulables et moins fragiles), est notamment incorporé dans les membranes de nitrocellulose et les membranes IMMUNODYNER (ce qui permet l'utilisation sur les deux faces, une des faces étant toutefois plus réactive que l'autre), ou lié à une des faces comme cela est le cas dans les membranes
ULTRABINDR (dans ce cas on ne peut utiliser pour l'immobilisation que l'autre face).
Le mélange réactionnel, qui est distribué au niveau de la membrane poreuse de la phase sélective traverse par (i) capillarité ou (ii) par capillarité et gravité, ladite membrane poreuse soit perpendiculairement (i.e. dans le sens de l'épaisseur, c'est-à-dire dans un sens perpendiculaire au plan de la membrane) soit, de façon plus avantageuse, longitudinalement (i.e. dans le sens de la longueur de la membrane).
Comme indiqué ci-dessus, la quantité pondérale de réactif immunologique immobilisé au niveau de la phase sélective, rapportée à l'unité de surface (i.e.
"densité surfacique" ou "concentration surfacique"), est comprise entre 10 et 150 yg/cm2. La surface de la membrane de la phase sélective est ici celle de la face supérieure ou inférieure ; ce n'est pas celle de la tranche de ladite membrane. De façon avantageuse, cette densité surfacique sera comprise entre 20 et 100 ,ug/cm2.
D'un point de vue pratique la densité surfacique est fonction du mode d'immobilisation retenu. Quand on procède à l'immersion d'une membrane dans un milieu liquide contenant le matériau immunologique que l'on veut immobiliser de telle façon que la hauteur du liquide s'étende jusqu'à environ 2 mm au-dessus de la surface de la membrane à traiter, on constate dans de nombreux cas que par covalence la densité surfacique du produit immobilisé augmente jusqu'à une certaine valeur et qu'elle diminue ou est constante au-delà de cette valeur; il y a là un phénomène de relargage ou de saturation avant même que tous les sites actifs de la membrane soient totalement saturés. En bref, par covalence on ne peut pas utiliser un liquide d'imprégnation contenant plus de 150 yg/ml de réactif immunologique. Quand on procède dans les mêmes conditions à l'immobilisation du réactif immunologique par adsorption on constate que l'immobilisation n'est plus fiable quand le liquide d'imprégnation contient plus de 400 yg/ml de réactif immunologique. Voir à cet effet les essais d'immobilisation sur membrane fournis ci-après.
D'une manière générale, l'immobilisation par adsorption fournit une concentration surfacique en général plus grande que l'immobilisation par covalence, toutefois l'immobilisation par adsorption est plus sensible aux phénomènes de relargage que l'immobilisation par covalence. Ceci explique pourquoi il convient de limiter la concentration surfacique en réactif immunologique immobilisé par covalence ou adsorption.
Enfin, il est particulièrement important que les sites actifs de la membrane de la phase sélective restant encore libres après l'immobilisation du réactif immunologique soient essentiellement tous bloqués. Ce blocage ou saturation est requis pour éviter toute immobilisation parasitaire lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Parmi les moyens qui conviennent pour bloquer lesdits sites actifs encore libres, on peut notamment mentionner ceux qui sont signalés dans US-A-4 175 112. Les moyens de blocage appropriés à cet effet sont, dans l'ordre de préférence croissant, le TWEENR 20, la polyvinylpyrrolidone, la caséine, I'albumine bovine sérique et la poudre de lait de régime. La poudre de lait de régime REGILAITR utilisée à la concentration de 1 à 5 % p/v s'est révélée être ici le moyen le plus efficace.
Selon une variante (variante A) de mise en oeuvre du procédé de l'invention on distribue une ou plusieurs gouttes du mélange (qui est constitué par l'échantillon liquide et le conjugué de la substance immunologique [X] couplé à un enzyme, de formule [anti(X)-E*], qui contient le produit de la réaction immunologique [X-anti(X)-E*] quand la substance immunologique X est présente dans ledit échantillon, et qui a été préparé dans un réacteur approprié notamment un flacon, une cuvette ou un tube) au niveau de la membrane de la phase sélective comportant le réactif immunologique immobilisé.
Selon une autre variante (variante B) ledit mélange est élaboré en versant une ou plusieurs gouttes de l'échantillon liquide, susceptible de contenir la substance immunologique à identifier, sur une autre membrane poreuse située audessus de la membrane de la phase sélective. Dans ce cas, cette autre membrane a ses sites actifs essentiellement saturés et comporte un dépôt sur sa face supérieure, soit en totalité soit par plot, du conjugué couplé à un enzyme de formule anti(X)
E* qui n'est pas immobilisé. Pour ralentir le passage de l'échantillon liquide sur ledit conjugué couplé à un enzyme, I'on recommande le cas échéant de disposer au-dessus (de préférence) et/ou au-dessous (à la rigueur) de la membrane poreuse supportant ledit dépôt [i.e. anti(X)-E* non immobilisé] une ou plusieurs membranes poreuses dont tous les sites actifs sont substantiellement bloqués et qui sont dépourvues de tout matériau immunologique.
Dans la variante B, il est essentiel que le conjugué couplé à un enzyme [i.e. le produit anti(X)-E*] soit déposé sans être immobilisé sur son support, la membrane poreuse.
De plus on préconise de façon avantageuse de revêtir ledit conjugué couplé à un enzyme d'un polymère perméable à l'eau ou d'une membrane en fibres de verre, afin de le protéger (après réticulation du polymère quand celui-ci est utilisé) pendant le stockage et les manipulations de l'utilisateur. D'une manière générale, en l'absence d'une protection, il ne faut pas toucher avec le doigt ledit conjugué couplé à un enzyme non immobilisé pour éviter de fausser le dosage par enlèvement dudit conjugué.
On procède également selon les modalités de la variante B ci-dessus quand on remplace à l'étape (1 ) le réactif immunologique non immobilisé de formule [anti(X)]-E* par le réactif non immobilisé de formule anti[anti(X)]-E* précité.
Par ailleurs, selon la variante B, I'on peut également prévoir au sommet du dispositif multimembranaire un anticorps supplémentaire comme illustré ci-après dans la description des figures 5, 5a et 5b, d'une part, et de la figure 8 d'autre part.
L'enzyme de marquage, notamment la peroxydase, une phosphatase alcaline, la 13-galactosidase ou l'uréase, est révélé au moyen de son substrat spécifique. Par exemple, quand l'enzyme de marquage est la peroxydase, le complexe révélateur comprendra un substrat, à savoir notamment le mélange Dglucose/glucose oxydase qui fournit l'eau oxygénée, selon le mécanisme
glucose
oxydase
D-glucose + 2H2O + 2 --------- > acide gluconique + H202 sur une membrane sous-jacente à celle de la phase sélective, et l'indicateur coloré, le TMB, sur une couche sous-jacente de celle contenant le substrat. En variante au lieu du système à deux membranes de révélation, on pourra utiliser un système comprenant trois membranes : une première membrane pour le D-glucose, une seconde membrane pour la glucose oxydase et une troisième membrane pour le
TMB. Le TMB peut également être remplacé par 1' AEC.
Quand l'enzyme de marquage est une phosphatase alcaline, le révélateur pourra être un mélange BCIP/NBT.
Quand l'enzyme de marquage est la B-galactosidase le révélateur coloré pourra être le MPB.
Il est judicieux de protéger de la lumière la membrane poreuse comprenant l'indicateur coloré surtout lorsque celui-ci est le TMB. Dans ce but, le dispositif multimembranaire selon l'invention sera logé dans une enveloppe opaque, ou bien la fenêtre de lecture devant faire apparaître la variation de couleur sera obturée pendant le stockage par un ruban antiadhérent opaque devant être pelé avant usage.
Le choix de l'enzyme de marquage est en général fonction du milieu liquide corporel susceptible de contenir la substance X à identifier. Ainsi, si ledit liquide corporel peut contenir de la peroxydase et/ou de la catalase (comme cela peut être le cas dans le domaine de l'identification des substances intervenant dans les mécanismes de l'hémostase), il est important de ne pas utiliser comme enzyme de marquage la peroxydase. En effet la peroxydase ou la catalase présente dans l'échantillon réagirait alors avec le substrat de la peroxydase au niveau de la deuxième zone. De plus, comme la glucose oxydase utilisée pour la révélation de la peroxydase est également sensible à la catalase, il est important que ladite glucose oxydase soit substantiellement pure.
Par ailleurs, comme certains liquides corporels, tels que le sang, peuvent également contenir une phosphatase alcaline, I'enzyme de marquage préféré selon
I'invention sera une 13-galactosidase, c'est-à-dire un enzyme qui ne se trouve pas dans le sang, le plasma ni le sérum.
Si l'échantillon liquide susceptible de contenir la substance X à déterminer renferme un enzyme identique ou pouvant interférer avec le marqueur E*, il est possible de traiter ledit échantillon avec l'un des inhibiteurs dudit enzyme avant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention.
Par ailleurs l'enzyme de marquage peut être remplacé par un moyen de marquage équivalent. Ainsi E* peut représenter selon l'invention de l'or colloïdal, de l'argent colloïdal (notamment de l'or colloïdal dopé à l'argent) ou des particules de latex coloré de granulométrie inférieure à 0,1 ym (par exemple des particules de latex colorées ayant une granulométrie de 25-60 nm). dans ce cas la deuxième zone pourra soit être supprimée, soit être constituée d'une membrane poreuse dépourvue de substrat enzymatique et qui est de nature similaire ou analogue à la membrane de la phase sélective de la première zone.
Les membranes poreuses utilisables pour supporter le réactif immunologique non immobilisé auront une épaisseur et une porosité analogues à celles de la membrane poreuse de la phase sélective. D'un point de vue pratique, l'on préfère que la porosité de ces membranes soit supérieure à 1 m et avantageusement comprise entre 3 et 6 clam. Les membranes poreuses supplémentaires de ralentissement auront une porosité analogue à celles de la phase sélective immunologique.
Par commodité, dans les systèmes multimembranaires des figures 1-5, la 5a et lb-5b, I'enzyme de marquage est la peroxydase, d'une part, et la révélation de cet enzyme est réalisée au moyen d'un ensemble de deux membranes poreuses,
I'une comportant le générateur de H202 (substrat de la peroxydase), à savoir le mélange D-glucose/glucose oxydase, I'autre sous-jacente comportant le révélateur, à savoir TMB, d'autre part ; (on peut bien sûr utiliser ici un ensemble de trois membranes comme indiqué ci-dessus). Bien entendu, comme déjà indiqué cidessus, I'enzyme de marquage peut être différent de la peroxydase et la révélation peut être obtenue avec une ou plusieurs membranes pour l'ensemble substrat/révélateur coloré. Comme indiqué ci-dessus, quand l'enzyme de marquage est la phosphatase alcaline le révélateur coloré sera le mélange BCIP/NBT, et quand l'enzyme de marquage est la B-galactosidase le révélateur coloré sera le
MPB, la 13-galactosidase étant l'enzyme de marquage préféré selon l'invention pour les raisons données ci-dessus.
Toujours par commodité, dans lesdites figures 1-5, la-5a et lb-5b, la substance immunologique à identifier est présentée comme étant une substance antigénique.
On se réfère aux figures 1, la et lb. Le dispositif multimembranaire 1 selon l'invention comprend une première membrane poreuse 10 dont la surface supérieure 11 et au moins une portion de la masse comprennent lié par covalence (de préférence) ou par adsorption un antigène immobilisé 5 identique à la substance antigénique (X) à identifier et susceptible d'être contenue dans un échantillon 4a ou 4b de fluide corporel à tester, d'une part, et un ensemble de deux membranes poreuses 2 et 3, la membrane poreuse 2 comportant (dans sa masse) le substrat D-glucose/glucose oxydase, la membrane poreuse 3 comportant (dans sa masse) le révélateur coloré TMB, d'autre part.
En variante, le dispositif multimembranaire 1 peut comporter en outre une membrane poreuse 12 qui comporte déposé sur sa surface supérieure 13 un conjugué 14. Le conjugué 14 est un anticorps monoclonal 15 (dirigé contre la substance antigénique X, référencée 5, à identifier) couplé à l'enzyme de marquage 6, par exemple la peroxydase. Le conjugué 14, qui répond à la formule anti(X)-E*, est simplement déposé sur la surface supérieure 13 de la membrane 12 sans être immobilisé tant par covalence que par adsorption.
De façon pratique, les sites actifs encore libres de la membrane poreuse 10 et tous les sites actifs libres de la membrane poreuse 12, quand celle-ci est présente, sont totalement et préalablement saturés ou bloqués par un moyen approprié, de préférence au moyen de la poudre de lait de régime REGILAITR, afin d'éviter substantiellement toute immobilisation parasitaire.
Le dépôt du conjugué 14 de formule anti(X)-E* sur la surface 13 est effectué par zones (un ou plusieurs plots, en pratique un seul plot est suffisant) ou sur encore la totalité de ladite surface 13. Quand le dépôt en question est réalisé par plots, le ou les plots sont avantageusement repérés par un cartouche, notamment une circonférence, dessiné et matérialisé sur ladite surface 13.
Quand on utilise une membrane poreuse 12 en tant que support du conjugué anti(X)-E*, il est le cas échéant recommandé de disposer au moins une membrane poreuse supplémentaire (non représentée) au-dessus ou au-dessous de ladite membrane 12. La présence d'une ou plusieurs membranes poreuses supplémentaires identiques ou analogues à la membrane poreuse 12 (notamment une membrane poreuse en fibres de verre), à sites actifs bloqués ou saturés, mais dépourvues du conjugué 14 sert à ralentir le passage, à travers ladite membrane
12, de l'échantillon 4a ou 4b à analyser, et à assurer une production suffisante pour les étapes suivantes du complexe X-anti(X)-E* produit selon la réaction
X + anti(X)-E * > X-anti(X)-E*
La figure la illustre schématiquement les mécanismes réactionnels qui interviennent quand l'échantillon à analyser ne contient pas la substance antigénique X référencée 5 ; et, la figure lb illustre schématiquement les mécanismes réactionnels qui interviennent quand l'échantillon à analyser contient ladite substance antigénique X.
On distribue selon la flèche 7 sur la surface supérieure 11 de la membrane poreuse 10 un mélange (en général 1 goutte) de (i) I'échantillon à analyser 4a ne contenant pas la substance antigénique X ou 4b contenant ladite substance antigénique X à identifier avec (ii) le conjugué 14 de formule anti(X)-E*, le milieu réactionnel contenant soit ledit conjugué 14 (absence de la substance antigénique (X)) selon la figure la, soit ledit conjugué 14, la substance antigénique
X et le produit de réaction de formule X-anti(X)-E* (présence de la substance antigénique (X) dans l'échantillon à analyser) selon la figure lb.
En variante, on peut distribuer, sur au moins une portion (ou plot) de la surface supérieure 13 de la membrane poreuse 12 revêtue du conjugué 14 nonimmobilisé, I'échantillon 4a ou 4b, le milieu réactionnel résultant traversant ladite membrane 12 et s'écoulant ensuite selon la flèche 7.
Au niveau de la phase sélective que constitue la membrane 10 qui comporte la substance antigénique X référencée 5 immobilisée, les mécanismes qui interviennent sont les suivants.
Selon la figure la, le conjugué 14, qui n'a pas pu réagir avec la substance antigénique X absente et qui possède de ce fait une fonction réactive libre, se fixe sur la substance antigénique X, référencée 5, immobilisée et ne traverse pas la membrane 10. Ledit conjugué 14 ainsi capté ne peut pas être détecté par l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure la constitue un test négatif non coloré.
Selon la figure lb, le complexe X-anti(X)-E* formé et contenu dans le milieu réactionnel est entraîné sans être retenu par la substance antigénique X, référencée 5, en excès et immobilisée, dès lors que les deux fonctions réactives de l'anticorps anti(X), référencé 15 sont occupées dans ledit complexe X-anti(X)-E* par l'enzyme de marquage et la substance X. La substance X immobilisée fixe le conjugué 14 qui n'a pas réagi avec X. Le complexe X-anti(X)-E* ne réagissant pas avec la substance X immobilisée traverse la membrane poreuse 10 et son activité enzymatique est mise en évidence par l'action de l'enzyme de marquage sur l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure lb constitue un test positif coloré.
On se réfère aux figures 2, 2a et 2b. Le dispositif multimembranaire 20 selon l'invention comporte, comme le dispositif 1 de la figure 1, des membranes poreuses 10, 2 et 3. La membrane poreuse 10 comporte un conjugué anticorps monoclonal 15 de formule anti(X) dirigé contre la substance antigénique X référencée 5. Cet anticorps monoclonal est immobilisé par covalence (de préférence) ou par adsorption sur la surface supérieure 11 et au moins une portion de la masse de la membrane 10.
En variante, le dispositif multimembranaire 20 peut en outre comporter une membrane poreuse 12 disposée au-dessus de la membrane 10. Sur la surface supérieure 13 de ladite membrane 12 ou sur une portion de ladite surface 13, est déposé non-immobilisé un conjugué 24 du conjugué 15. Le conjugué 24, qui est du type anti[anti(X)]-E , est constitué ici par un anticorps monoclonal ou polyclonal anti[F(ab')2] référencé 25 dirigé contre le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal anti(X) 15 et couplé à l'enzyme de marquage 6. Le cas échéant, une ou plusieurs membranes poreuses supplémentaires de ralentissement sont disposées au-dessus et/ou au-dessous de la membrane poreuse 12 ; chaque membrane supplémentaire de ralentissement est identique ou différente de la membrane 12 mais est dépourvue de l'anticorps anti[F(ab')2].
Comme indiqué ci-dessus, le dépôt du conjugué 24 peut être effectué sur toute la surface supérieure 13 de la membrane 12 ou sur une portion de ladite surface 13.
Les sites actifs encore libres de la membrane 10 après immobilisation de anti(X) et les sites actifs des autres membranes (i.e. la membrane 12 et les membranes poreuses supplémentaires de ralentissement) quand celles-ci sont présentes, sont saturés, de préférence au moyen de REGILAITR, préalablement au montage ou assemblage du dispositif multimembranaire.
Le conjugué 25, à savoir l'anticorps de formule anti[F(ab')2] a été choisi en fonction de son affinité vis-à-vis de anti(X) par rapport à celle de X. En l'absence de X dans l'échantillon, anti[F(ab')2] se fixe sur anti(X). En présence de X dans l'échantillon, anti[F(ab')2] ne peut se fixer sur anti(X) qu'après la fixation de la substance X disponible sur anti(X). En d'autres termes, anti[F(ab')2] a une affinité vis-à-vis de anti(X) inférieure à celle de X. Ainsi, selon le dispositif multimembranaire illustré par les figures 2, 2a et 2b, lorsque le milieu réactionnel contient le conjugué anti[F(ab')2]-E* sans contenir la substance antigénique X,
I'anticorps monoclonal anti(X) fixe ledit conjugué anti[F(ab')2]-E* présent, et lorsque le milieu réactionnel contient simultanément l'antigène X et le conjugué anti[F(ab ' )2]-E*, ledit anticorps monoclonal anti(X) fixe préférentiellement l'antigène X. Il suffit alors d'avoir un excès de X pour ne pas fixer le conjugué anti[F(ab')2]-E* sur l'anticorps immobilisé, référencé 15, anti(X).
On distribue selon la flèche 7 sur la surface supérieure 11 de la membrane poreuse 10 un mélange (en général 1 goutte) de (i) I'échantillon à analyser référencé 4a ne contenant pas la substance antigénique X ou référencé 4b contenant ladite substance antigénique X à identifier avec (ii) le conjugué 24 de formule anti[F(ab')2]-E*, le milieu réactionnel résultant contenant soit ledit conjugué 24 (échantillon 4a dépourvu de X) soit le mélange dudit conjugué 24 et de ladite substance antigénique X (échantillon 4b contenant X).
En variante, on peut distribuer, sur au moins une portion (ou plot) de la surface supérieure 13 de la membrane poreuse 12 revêtue du conjugué 24 nonimmobilisé, I'échantillon 4a ou 4b, le milieu réactionnel résultant traversant ladite membrane 12 et s'écoulant ensuite selon la flèche 7.
Au niveau de la phase sélective que constitue la membrane 10 qui comporte sur sa surface supérieure et dans au moins une portion de sa masse l'anticorps immobilisé anti(X) référencé 15, les mécanismes qui interviennent sont les suivants.
Selon la figure 2a, la portion anti[F(ab')2] du conjugué anti[F(ab')2]-E* est reconnue par l'anticorps anti(X) immobilisé et l'enzyme de marquage 6 du complexe résultant ne peut pas être révélé au niveau des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 2a constitue un test négatif non coloré.
Selon la figure 2b, l'antigène X vient saturer l'anticorps monoclonal immobilisé anti(X) en empêchant la fixation du conjugué anti[F(ab')2]-E*. Par suite, anti[F(ab')2]-E* traverse la membrane poreuse 10 et son activité enzymatique est mise en évidence par son action sur l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 2b constitue un test positif coloré.
Le dispositif multimembranaire 30 illustré par les figures 3, 3a et 3b constitue une variante du dispositif 20 des figures 2, 2a et 2b, selon laquelle l'anticorps monoclonal anti(X) et l'anticorps monoclonal ou polyclonal anti[F(ab')2] ont été intervertis. Plus précisément, la phase sélective du dispositif 30 comprend un anticorps anti[F(ab')2] immobilisé sur la surface supérieure et dans au moins une portion de la masse de la membrane poreuse 10.
On distribue selon la flèche 7 sur la surface supérieure 11 de la membrane poreuse 10 un mélange (en général 1 goutte) de (i) I'échantillon à analyser 4a ne contenant pas la substance antigénique X ou l'échantillon 4b contenant ladite substance antigénique X à identifier avec (ii) le conjugué 34 de formule anti(X)
E*, qui est un anticorps monoclonal anti(X), référencé 15, dirigé contre la substance antigénique X, référencée 5, et couplé à l'enzyme de marquage 6. Le milieu réactionnel résultant contient notamment ledit conjugué 34 selon la figure 3a en l'absence de X, ou le complexe X-anti(X)-E* selon la figure 3b en présence de X.
En variante, comme indiqué ci-dessus pour le dispositif 20 de la figure 2, on peut distribuer, sur au moins une portion (ou plot) de la surface supérieure 13 de la membrane poreuse 12 revêtue du conjugué 34 non-immobilisé, I'échantillon 4a ou 4b, le milieu réactionnel résultant traversant ladite membrane 12 et s'écoulant ensuite selon la flèche 7.
Bien entendu, comme signalé plus haut, on peut prévoir une ou plusieurs membranes poreuses supplémentaires de ralentissement au-dessus et/ou au-dessous de la membrane poreuse 12 ; le dépôt du conjugué 34 peut être effectué sur toute la surface supérieure 13 de la membrane 12 ou sur une portion de ladite surface 13 ; et les sites actifs encore libres de la membrane 10 après immobilisation de anti(X) et les sites actifs des autres membranes (i.e. la membrane 12 et les membranes poreuses supplémentaires de ralentissement) quand celles-ci sont présentes, sont saturés, de préférence au moyen de REGILAITR, préalablement au montage ou assemblage du dispositif multimembranaire.
Au niveau de la phase sélective que constitue la membrane 10 qui comporte sur sa surface supérieure et dans au moins une portion de sa masse l'anticorps monoclonal ou polyclonal immobilisé anti[F(ab')2], référencé 25, les mécanismes qui interviennent sont les suivants.
Selon la figure 3a, du fait de l'absence de substance antigénique X dans l'échantillon 4a, le conjugué 34, qui est un anticorps monoclonal anti(X), référencé 15, couplé à l'enzyme de marquage 6, est retenu par l'anticorps monoclonal ou polyclonal immobilisé anti [F(ab')2] référencé 25. Ledit conjugué 34 ainsi immobilisé ne peut pas être révélé par l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 3a constitue un test négatif non coloré.
Selon la figure 3b, du fait de la présence de la substance X dans l'échantillon 4b, le complexe X-anti(X)-E* n'est pas reconnu par l'anticorps monoclonal ou polyclonal immobilisé anti[F(ab')2]. Ce complexe traverse donc la membrane poreuse 10 et son activité enzymatique est mise en évidence au niveau des membranes 2 et 3. Le dosage selon la figure 3b constitue un test positif coloré.
Dans les dispositifs 20 et 30, l'anticorps monoclonal ou polyclonal anti[F(ab')2] peut notamment être un anticorps de lapin ou de chèvre dirigé contre le fragment F(ab')2 d'un anticorps de souris.
Bien entendu, l'anticorps anti[F(ab')2] peut être remplacé ici par un anticorps anti[anti(X)] équivalent eu égard à l'affinité relative par rapport à X visà-vis de anti(X). Parmi les anticorps anti[anti(X)] qui conviennent à cet effet on peut mentionner en particulier les anticorps monoclonaux (notamment de rat) antichaîne kappa (notamment de souris), d'une part, et les anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-idiotype d'un anticorps monoclonal (notamment de souris) produits chez un autre animal (notamment chèvre ou lapin), d'autre part.
On se réfère aux figures 4, 4a et 4b. Le dispositif multimembranaire 40 est conçu pour mettre en oeuvre une méthode EIA sandwich au moyen de deux anticorps monoclonaux réagissant sur des sites distincts de la substance antigénique
X.
Le dispositif 40 de la figure 4 comprend, comme celui de la figure 2, une phase sélective constituée d'une membrane poreuse 10 comportant sur sa surface supérieure il et dans au moins une portion de sa masse un anticorps monoclonal immobilisé 15 de formule anti(X)1, d'une part, et une zone de révélation constituée ici des membranes poreuses 2 et 3 pour l'ensemble substrat/révélateur, d'autre part. Ledit anticorps monoclonal anti(X)1, référencé 15, est dirigé contre un premier site actif ou épitope de la substance antigénique X référencée 5.
Le mélange de l'échantillon à analyser (échantillon 4a dépourvu de substance X, ou échantillon 4b contenant ladite substance X) avec un conjugué 44, qui est un anticorps monoclonal de formule anti(X)2, référencé 45, dirigé contre un second site actif ou épitope de la substance antigénique X et couplé à l'enzyme de marquage 6, est distribué selon la flèche 7 sur la surface supérieure 11 de la phase sélective. Ce mélange contient, quand la substance X à identifier est présente dans l'échantillon à analyser, le produit de la réaction immunologique
X + anti(X)2-E* ---- > X-anti(X)2-E*
En variante, on peut distribuer, sur au moins une portion (ou plot) de la surface supérieure 13 de la membrane poreuse 12 revêtue du conjugué 44 nonimmobilisé, I'échantillon 4a ou 4b, le milieu réactionnel résultant traversant ladite membrane 12 et s'écoulant ensuite selon la flèche 7.
Le cas échéant on peut disposer, comme indiqué ci-dessus, une ou plusieurs membranes poreuses supplémentaires de ralentissement au-dessus et/ou au-dessous de la membrane poreuse 12.
Comme indiqué ci-dessus, le dépôt du conjugué 44 peut être effectué sur toute la surface supérieure 13 de la membrane 12 ou sur une portion de ladite surface 13. De plus, les sites actifs encore libres de la membrane 10 après immobilisation de anti(X)1 et les sites actifs des autres membranes (i.e. la membrane 12 et les membranes poreuses supplémentaires de ralentissement) quand celles-ci sont présentes, sont saturés, de préférence au moyen de REGILAITR, préalablement au montage ou assemblage du dispositif multimembranaire.
Au niveau de la phase sélective, les mécanismes qui interviennent sont les suivants.
Selon la figure 4a, le conjugué 44, qui n'a pas pu réagir avec la substance
X, du fait de l'absence de X dans l'échantillon 4b, n'est pas reconnu par l'anticorps monoclonal immobilisé 15 ; il traverse donc la membrane poreuse 10 de la phase sélective et son activité enzymatique est révélée par l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 4a constitue un test négatif coloré.
Selon la figure 4b, du fait de la présence de la substance X dans l'échantillon 4b, le complexe formé X-anti(X)2-E* est reconnu et fixé par l'anticorps immobilisé anti(X)1 selon le mécanisme EIA sandwich
Fanti(X)l + X-anti(X)2-E* --- > Fanti(X)1-X-anti(X)2-E* où le symbole F représente l'immobilisation par covalence ou adsorption au niveau de la membrane poreuse 10.
Du fait de la capture du complexe X-anti(X)2-E*, I'activité enzymatique de l'enzyme de marquage 6 de celui-ci ne peut pas être révélée par l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 4b constitue un test positif non coloré.
Les figures 5, Sa et Sb illustrent une technique particulière d'identification d'un substance antigénique X, référencée 5, qui met en oeuvre les modalités décrites ci-dessus en ce qui concerne le dispositif 1 de la figure 1.
En bref, les modalités opératoires envisagées avec le dispositif multimembranaire 50 de la figure 5 comprennent, pour la détermination d'une quantité supérieure à la normale d'une substance antigénique X naturellement présente dans un échantillon de fluide corporel (ce cas se présente notamment dans le domaine de l'identification du DDi dans le plasma), (a) la mise en contact de l'échantillon à analyser 54a (qui contient la substance
X à une concentration naturellement normale) ou 54b (qui contient ladite substance
X à une concentration supérieure à la normale) avec un conjugué 55 qui est anticorps monoclonal de formule anti(X)1 dirigé contre la substance antigénique X référencée 5, pour former un complexe de formule X-anti(X)1 (b) la mise en contact du milieu réactionnel résultant avec un second conjugué de formule anti(X)2-E* et référencé 14, qui est un anticorps monoclonal 15 de formule anti(X)2-E* couplé à l'enzyme de marquage 6, I'anticorps monoclonal 15 qui est identique ou différent de l'anticorps monoclonal 55 fixant l'excès de X (par rapport à la concentration normale) ; et, comme indiqué dans la description des figures 1, la et lb ci-dessus, (c) la distribution, selon la flèche 7, du milieu réactionnel résultant sur la phase sélective constituée par la membrane poreuse 10 dont la surface supérieure 11 et au moins une portion de la masse comportent la substance X immobilisée par covalence ou adsorption ; puis, (d) la révélation de l'enzyme de marquage 6 du complexe X-anti(X)2-E*, non reconnu ni retenu par la membrane 10 de ladite phase sélective, au moyen de l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3.
Les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées dans un flacon, microcuvette ou tube. Elles peuvent aussi être réalisées directement dans le dispositif multimembranaire, dans ce cas, on prévoit au-dessus de la membrane 10 un ensemble de deux couches, à savoir (i) une seconde phase sélective constituée par une membrane poreuse 510 comportant l'anticorps anti(X)2, référencé 55, immobilisé sur sa surface supérieure 511 et dans au moins une portion de sa masse, et (ii) une membrane poreuse 12 comportant le conjugué 14, qui est un anticorps monoclonal anti(X)2, référencé 15, couplé à l'enzyme de marquage 6 et répondant à la formule anti(X)2-E*, ledit conjugué 14 étant déposé sur la surface supérieure 13 de ladite membrane 12 et non immobilisé sur ladite surface 13.
Les étapes (c) et (d), qui comprennent (i) le passage du milieu réactionnel ayant traversé la membrane 12 ou ayant été préparé dans un réacteur (flacon, microcuvette ou tube) extérieur au dispositif multimembranaire, à travers la phase sélective de la membrane 10, puis (ii) la révélation de l'enzyme de marquage 6, sont réalisées comme indiqué ci-dessus (voir description des figures 1, la et lb).
En bref, les mécanismes qui interviennent sont les suivants.
Selon la figure Sa, I'antigène X existant dans l'échantillon 54a est capté par l'anticorps monoclonal immobilisé 55 de formule anti(X)1, et le conjugué 14 de formule anti(X)2-E* est retenu lors de son passage sur la phase sélective par l'antigène X immobilisé sur la surface supérieure 11 et dans au moins une portion de la masse de la membrane poreuse 10. Par suite, il n'y a aucune révélation de l'activité enzymatique de l'enzyme de marquage 6 au niveau des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 5a constitue un test négatif non coloré.
Selon la figure 5b, une partie de la quantité totale de l'antigène X est retenue par l'anticorps monoclonal immobilisé 55, le reste se combine au conjugué 14 qui diffuse à travers la membrane poreuse 10 sans être immobilisé. L'activité enzymatique est alors mise en évidence par son action sur l'ensemble substrat/révélateur des membranes poreuses 2 et 3. Le dosage selon la figure 5b constitue un test positif coloré.
D'un point de vue pratique, pour l'identification des facteurs intervenant dans les mécanismes de l'hémostase, on peut utiliser l'un quelconque des dispositifs 1, 20, 30, 40 et 50 des figures 1, 2, 3, 4 et 5 ; pour l'identification des matériaux antigéniques (ou d'anticorps) d'origine bactérienne ou virale, I'on recommande plutôt d'utiliser les dispositifs multimembranaires 20, 30 et 40 des figures 2, 3 et 4 pour éviter tout risque de contamination du personnel en contact avec lesdits dispositifs multimembranaires, par un antigène (ou anticorps) X, qui serait immobilisé au niveau de la membrane 10.
Sans sortir du cadre de l'invention, les phases sélectives des dispositifs multimembranaires des figures 1, la et lb à 5, 5a et 5b peuvent comporter le réactif immunologique immobilisé soit dans leurs masses, soit sur leurs faces supérieures.
Les figures 6 à 8 ont trait à des dispositifs multimembranaires qui comportent chacun une phase sélective traversée longitudinalement par le mélange constitué par l'échantillon à tester et le conjugué anti(X) ou anti[anti(X)] couplé à un enzyme non-immobilisé.
On se réfère à présent à la figure 6 qui illustre un dispositif multimembranaire 60 selon l'invention. Ce dispositif 60 comprend - un puits 66 ménagé dans une feuille de recouvrement 67 et dans lequel on introduit une ou plusieurs gouttes (1 à 5 y1) de l'échantillon à analyser, susceptible de contenir la substance immunologique X à identifier et préalablement mélangé à un conjugué couplé à un enzyme, par exemple anti(X)-E* ou anti[anti(X)]-E*, en variante ledit conjugué couplé à un enzyme peut être déposé non immobilisé sur une membrane poreuse support logée dans ledit puits 66 - une membrane poreuse (dite d'affinité) 61 intervenant en tant que phase sélective, qui contient dans sa masse un réactif immunologique immobilisé, qui est en relation capillaire par l'une de ses extrémités 63 avec le puits 66 et qui est alimentée en liquide (mélange échantillon à tester/conjugué couplé à un enzyme non immobilisé) par ledit puits 66 quand il a été chargé en dit liquide - une ou plusieurs membranes poreuses 62 pour la révélation de l'enzyme de marquage, cette ou ces membranes poreuses de révélation étant observables par l'intermédiaire d'une ouverture 68 ménagée du côté opposé 69 de la feuille de recouvrement 67 et longitudinalement décalée par rapport au puits 66, la ou lesdites membranes poreuses 62 étant en relation capillaire par l'autre extrémité 65 de la membrane poreuse 61 de ladite phase sélective et étant alimentée en milieu réactionnel liquide par ladite membrane poreuse 61.
Dans la réalisation de la figure 6, le dispositif multimembranaire 60 est avantageusement logé à l'intérieur d'une enceinte sensiblement monobloc après montage, constitué de deux ensembles 167 et 169 complémentaires l'un de l'autre et solidarisables l'un à l'autre, lors de l'assemblage notamment au moyen d'un système d'encliquetage, par exemple du type tenon/mortaise non représenté, et qui est pourvu d'un puits 66 et d'une ouverture ou fenêtre de lecture 68. La traversée de la membrane poreuse 61 qui constitue la phase sélective et qui est sensiblement horizontale, s'effectue ici longitudinalement.
Quand le conjugué couplé à un enzyme selon le dispositif multimembranaire 60 est le produit anti(X)-E*, il se forme, en présence de la substance antigénique X un complexe de formule X-anti(X)-E* qui n'est pas retenu par la membrane poreuse 61 de la phase sélective, qui est entraîné par le flux liquide et qui atteint par capillarité la ou les membranes poreuses de révélation 62 où l'enzyme de marquage est révélé. La membrane poreuse 61 contient ici dans sa masse le réactif immunologique immobilisé qui est dans ce cas soit X soit anti(X) comme indiqué ci-dessus.
Quand le conjugué couplé à un enzyme est le produit anti[anti(X)]-E*, la membrane poreuse 61 de la phase sélective, qui contient le réactif immunologique immobilisé de formule anti(X), fixe ledit produit anti[anti(X)]-E * si la substance antigénique X n'est pas présente dans l'échantillon à tester, et ne fixe pas ledit produit anti[anti(X)]-E * si la substance antigénique X est présente dans ledit échantillon. Dans ce dernier cas le produit de la réaction X-anti[anti(X)]-E* non retenu atteint par capillarité la ou les membranes poreuses de révélation 62 où l'enzyme de marquage est révélé.
On se réfère à la figure 7 qui illustre un dispositif multimembranaire 70 selon l'invention analogue à celui de la figure 6, avec la différence que la membrane poreuse 71 n'est plus sensiblement horizontale mais est plutôt sensiblement verticale et est traversée par gravité et capillarité. Les autres références de la figure 7 sont celles décrites ci-dessus en ce qui concerne la figure 6.
On se réfère à la figure 8 qui illustre un dispositif multimembranaire 80 selon l'invention comprenant deux puits 86a et 86b sur sa partie supérieure. Ce dispositif comprend - un puits 86a ménagé dans une feuille de recouvrement 67 et dans lequel on introduit une à plusieurs gouttes (20 à 250 cul1) de l'échantillon à analyser, - une première phase sélective en liaison capillaire par l'une de ses extrémités 83a avec le puits 86a et alimentée par celui-ci quand il a été chargé en liquide (ici l'échantillon aqueux à tester), ladite première phase sélective étant constituée par une première membrane poreuse 81a comportant dans sa masse un premier réactif immunologique immobilisé, par exemple anti(X)1, la quantité dudit premier réactif immunologique immobilisé étant telle qu'elle correspond à la fixation d'une quantité prédéterminée de substance antigénique X, - un second puits 86b ménagé dans la feuille de recouvrement, longitudinalement décalé par rapport au premier puits 86a, en liaison capillaire avec l'autre extrémité 83b de la membrane poreuse 81a de la première phase sélective, alimenté en flux liquide par ladite première phase sélective et comportant dans son fond un conjugué couplé à un enzyme de marquage non-immobilisé, par exemple anti(X)2
E*, ledit conjugué couplé à un enzyme de marquage non-immobilisé pouvant se présenter notamment sous la forme d'une pastille microporeuse (i) dont la surface supérieure est protégée par une membrane de fibres de verre et (ii) qui est disposée dans le puits 86b avant le dosage, - une seconde phase sélective en liaison capillaire par l'une de ses extrémités 85a avec le puits 86b, alimentée par celui-ci en flux liquide (milieu réactionnel ayant traversé la première phase sélective et ayant été mis en contact avec ledit conjugué couplé à un enzyme de marquage non-immobilisé présent dans ledit puits 86b) et constituée d'une seconde membrane poreuse 81b comportant dans sa masse un second réactif immunologique immobilisé, par exemple X, ladite seconde membrane poreuse 81b fixant ledit conjugué couplé à un enzyme non immobilisé en l'absence de substance antigénique X dans le milieu réactionnel sortant de la première phase sélective, mais ne fixant pas ledit conjugué couplé à un enzyme ayant réagi en présence de la substance antigénique X présente dans ledit milieu réactionnel sortant de ladite première phase sélective, et - une ou plusieurs membranes poreuses 62 pour la révélation de l'enzyme de marquage, cette ou ces membranes poreuses de révélation étant observables dans une ouverture 68 ménagée du côté opposé 69 à la feuille de recouvrement 67 et longitudinalement décalée par rapport aux puits 86a et 86b, la ou les membranes poreuses de révélation 62 étant en relation capillaire avec l'autre extrémité 85b de la seconde membrane poreuse 81b et étant alimentées en milieu réactionnel liquide par ladite seconde membrane poreuse 81b.
Le dispositif multimembranaire 80 de la figure 8, ainsi que celui de la figure 7, peut être constitué de deux ensembles 167 et 169 complémentaires et solidarisables l'un à l'autre, comme indiqué ci-dessus dans la description du dispositif multimembranaire 60 de la figure 6.
D'une manière générale pour réaliser un dispositif multimembranaire monobloc (notamment en matière plastique), il suffit qu'un conduit soit ménagé à l'interface des ensembles 167 et 169 pour le logement de chacune des membranes poreuses 61, 71, et 81b entre un puits 66 ou 86b et une ouverture 68 ou encore entre deux puits 86a et 86b. De plus les logements destinés aux membranes poreuses sensiblement horizontales 61, 81a et 81b peuvent être inclinés de façon à permettre un passage par capillarité et gravité à travers lesdites membranes. De même le logement de la membrane poreuse 71 de la figure 7 peut être incliné par rapport à la verticale.
Bien entendu le matériau des ensembles 167 et 169 ne doit pas donner lieu à des immobilisations parasitaires par covalence ou adsorption. Si nécessaire il sera traité au niveau des puits, ouvertures de lecture et logements des membranes poreuses des phases sélectives grâce à un moyen approprié tel que la poudre de lait
REGILAITR précitée.
Le dispositif multimembranaire 80 de la figure 8 est particulièrement efficace pour le dosage du DDi susceptible d'être présent dans le plasma à une concentration supérieure à la normale. L'échantillon de plasma à analyser est déposé dans le puits 86a ; I'échantillon migre longitudinalement à travers la membrane 81a contenant dans sa masse un anticorps monoclonal anti(DDi), ici l'anticorps monoclonal 9C3, pour retenir une quantité donnée de DDi ; le milieu réactionnel résultant atteint le puits 86b où se trouve un anticorps monoclonal anti(DDi) couplé à un enzyme de marquage, ici l'anticorps monoclonal 2F7 couplé à la 8-galactosidase ; le milieu réactionnel résultant migre longitudinalement à travers la membrane 81b contenant dans sa masse l'antigène DDi immobilisé, cette membrane 8 lob (i) retenant le conjugué 2F7-(B-galactosidase) quand tout le DDi présent dans l'échantillon de plasma a été fixé sur la membrane 81a et (ii) ne retenant pas le produit DDi-2F7-(B-galactosidase) résultant de la réaction dudit conjugué 2F7-(ss-galactosidase) avec le DDi libre ayant traversé ladite membrane 81 a ; le mélange réactionnel résultant atteint ensuite la ou les membranes de révélation 62 contenant le MPB
MEILLEUR MODE
Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à faire appel à un dispositif selon les figures 1-4 et 6-7. Le mélange de l'échantillon liquide à analyser susceptible de contenir la substance immunologique X avec un conjugué couplé à un enzyme de marquage est préparé à l'extérieur du système multimembranaire puis distribué sur une membrane mince constituée par une nappe non-tissée de fibres de verre, cette nappe étant située au-dessus de la phase sélective sous-jacente contenant le réactif immunologique immobilisé dans sa masse, une ou plusieurs membranes poreuses de révélation étant sous-jacentes à ladite phase sélective.
Le meilleur mode comprend également la mise en oeuvre d'un dispositif multimembranaire selon la figure 5 et mieux la figure 8 pour la détermination d'une teneur en substance immunologique susceptible d'être supérieure à la teneur normale. Dans ce cas, l'échantillon liquide à analyser est distribué sur une membrane constituée d'une nappe non-tissée de fibres de verre située au-dessus de la première phase sélective.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'essais comparatifs et d'exemples de réalisation. Bien entendu l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est fourni à titre d'illustration. Dans lesdits exemples de réalisation les sites actifs encore libres des membranes utilisées ont été saturés notamment au moyen de la poudre de lait
REGILAITR.
ESSAIS D'IMMOBILISATION SUR MEMBRANE POREUSE
On immerge une membrane poreuse de 20 cm x 20 cm, ou de nitrocellulose (porosité 0,45 ym) dans un tampon aqueux de 100 ml contenant le matériau immunologique à immobiliser par covalence sur membrane de polyfluorocarbone hydrophile (IMMOBILONR : porosité 0,45 clam), de polyamide (IMMUNODYNER : porosité 0,65 ,um), ou de polysulfone (ULTRABINDR porosité 0,45 zm), ou par adsorption sur membrane de nitrocellulose (porosité 0,45 ym) après traitement avec une solution aqueuse d'activation de CH3COOH 0,1M + NaH2SO4 0,5M, en laissant une hauteur de liquide de 2 mm environ au dessus de ladite membrane poreuse. L'incubation a lieu pendant 18 h à une température comprise entre 4"C et RT.
On utilise à cet effet des concentrations croissantes (5 à 500 Hg/ml) de matériau immunologique dans le tampon et mesure, après séchage à 40"C, le cas échéant sous pression réduite, la quantité de matériau fixé par chaque membrane.
La même série d'essais a été réalisée en faisant varier le tampon.
L'ensemble des résultats obtenu figurent dans les tableaux I à IV ci-après, et met en évidence (i) le risque de relargage lors de la fixation par covalence quand la concentration du matériau immunologique passe de 100 à 200 ,ug/ml, d'une part, et est supérieure à 200,ug/ml, d'autre part, et (ii) l'intérêt de KH2P04 en tant que tampon.
TABLEAU I
CAPACITE DE FIXATION SUR MEMBRANE
matériau immunologique : DDi
tampon : carbonate pH8
Figure img00330001
<tb> <SEP> Quantités <SEP> fixées <SEP> (ym/cm2) <SEP>
<tb> Concentration
<tb> dans <SEP> le <SEP> bain <SEP> IMMOBILON <SEP> ULTRABTND <SEP> IMMUNO- <SEP> NITROCEL
<tb> <SEP> (yg/ml) <SEP> DYNER <SEP> LULOSER
<tb> <SEP> (1) <SEP> (1) <SEP> (1) <SEP> (2)
<tb> <SEP> 5 <SEP> 1,32 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> 10 <SEP> 1,8 <SEP> 4,89 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> <SEP> 20 <SEP> 3,2 <SEP> 9,75 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> <SEP> 100 <SEP> 29,32 <SEP> 33 <SEP> 32 <SEP> 50
<tb> <SEP> 200 <SEP> 21,5 <SEP> 14 <SEP> 33 <SEP> 96
<tb> Notes
<tb> (1) <SEP> membrane <SEP> poreuse <SEP> pour <SEP> immobilisation <SEP> par <SEP> covalence <SEP>
<tb> (2) <SEP> membrane <SEP> poreuse <SEP> pour <SEP> immobilisation <SEP> par <SEP> adsorption.
<tb>
TABLEAU II
CAPACITE DE FIXATION SUR MEMBRANE
materiau immunologique : DDi
tampon : carbonate pH8
Figure img00340001
<tb> <SEP> Quantités <SEP> fixées <SEP> (ym/cm2) <SEP>
<tb> Concentration
<tb> dans <SEP> le <SEP> bain <SEP> ULTRABINDR <SEP> IMMUNODYNE <SEP> NITROCEL
<tb> <SEP> (yg/ml) <SEP> LULOSER
<tb> <SEP> (1) <SEP> (1) <SEP> (2)
<tb> <SEP> 5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 3,8 <SEP> 12,5
<tb> <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 2,9 <SEP> 25
<tb> <SEP> 100 <SEP> 12,5 <SEP> 7,5 <SEP> 50
<tb> <SEP> 200 <SEP> 22,5 <SEP> 13 <SEP> 100
<tb> Notes
<tb> <SEP> (1) <SEP> membrane <SEP> poreuse <SEP> pour <SEP> immobilisation <SEP> par <SEP> covalence
<tb> (2) <SEP> membrane <SEP> poreuse <SEP> pour <SEP> immobilisation <SEP> par <SEP> adsorption.
<tb>
TABLEAU III
CAPACITE DE FIXATION SUR MEMBRANE SELON LE TAMPON
membrane poreuse : ULTRABINDR
matériau immunologique : 2F7
Figure img00350001
<tb> <SEP> Concentration <SEP> Quantité <SEP> fixée <SEP> ( g/cm) <SEP>
<tb> <SEP> dans <SEP> le <SEP> bain <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon
<tb> (Ug/ml) <SEP> PO4 <SEP> <SEP> PO43- <SEP> Cc32- <SEP> Cc32 <SEP> KH2PO4
<tb> <SEP> pH <SEP> 6,5 <SEP> pH <SEP> 7,5 <SEP> pH <SEP> 8 <SEP> pH9
<tb> <SEP> 50 <SEP> 10,25 <SEP> 8,5 <SEP> 11,1 <SEP> 9,2 <SEP> 12,2
<tb> <SEP> 100 <SEP> 15 <SEP> 14,5 <SEP> 18,5 <SEP> 16,75 <SEP> 26,75
<tb> <SEP> 500 <SEP> 13 <SEP> 27 <SEP> 40,5 <SEP> 32 <SEP> 54
<tb>
TABLEAU IV
CAPACITE DE FIXATION SUR MEMBRANE SELON LE TAMPON
membrane poreuse : ULTRABINDR
matériau immunologique : D.DI
Figure img00350002
<tb> Concentration <SEP> Quantité <SEP> fixée <SEP> ( g/cm) <SEP>
<tb> dans <SEP> le <SEP> bain <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon <SEP> tampon
<tb> <SEP> ( g/ml) <SEP> PO4 <SEP> 3- <SEP> CO3- <SEP> CO3- <SEP> Cc32 <SEP> KH2PO4
<tb> <SEP> pH <SEP> 6,5 <SEP> pH <SEP> 7,5 <SEP> pH <SEP> 8 <SEP> pH9
<tb> <SEP> 50 <SEP> 11,52 <SEP> 10,62 <SEP> 8,25 <SEP> 8,75 <SEP> 11,6
<tb> <SEP> 100 <SEP> 18,37 <SEP> 20,45 <SEP> 11,62 <SEP> 20,35 <SEP> 20
<tb> <SEP> 200 <SEP> 11,52 <SEP> 23,37 <SEP> 18,5 <SEP> 18,25 <SEP> 28,5
<tb> <SEP> 500 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 16,25
<tb>
PREPARATION I
Obtention de la membrane support
On immerge une membrane IMMUNODYNER (porosité 5 m , référence "BIAO50HC5) ou VERSAPORR (porosité : 3 ym) pendant 0,25-0,50 h dans un tampon PBS à pH 7 constitué de (i) 16 parties en volume d'un mélange de
NaH2PO4 à 13,8 g/l et de NaCI à 9 g/l (solution A) et de (ii) 84 parties en volume d'un mélange de Na2HPO4 à 14,19 g/l et de NaCI à 9 g/l (solution B), ledit tampon contenant en outre 5 % p/v de PVP (PM 10 000) ou de
REGILAITR. On rince abondamment avec de l'eau distillée froide (2-8"C) puis enfin avec de l'eau distillée tiède (37"C). On sèche à l'étuve à 37-40"C. On obtient une membrane à sites actifs saturés destinée au support du conjugué non immobilisé couplé à l'enzyme de marquage, par exemple le conjugué 14 (figures 1 et 5) ou 34 (figure 3) de formule anti(X)-E*, le conjugué 24 (figure 2) de formule anti[anti(X)]-E*, ou le conjugué 44 (figure 4) de formule anti(X)1-E*. Dans le cas d'espèce, l'enzyme de marquage est la peroxydase.
On dépose sur ladite membrane séchée 1 à 5 yl (par plots matérialisés chacun par un cartouche de préférence circulaire) d'une solution de tampon PBS à pH 7 (tel que défini ci-dessus) contenant 1 ,ug/ml dudit conjugué.
On obtient ainsi la membrane 12 contenant sur sa surface supérieure 13 ledit conjugué non immobilisé. Cette membrane est découpée en bandes contenant chacune un plot de conjugué non immobilisé.
PREPARATION II
Obtention de la phase sélective
On immerge une membrane poreuse en nitrocellulose de porosité 0,40-0,50 ,um (par exemple une membrane commercialisée par la société dite SCHLEICHER & SCHUELL de porosité 0,45 ym, référence:439196) pendant 0,25-0,50 h, dans une solution aqueuse d'activation contenant 0,1 M de CH3COOH et 0,5 M de NaMSO4. On sèche à 40"C sans rinçage.
On procède à la fixation du réactif immunologique référencé 5 (figures 1 et 5), 15 (figures 2 et 4) ou 25 (figure 3), en immergeant pendant au moins 1 h et au plus 48 h la membrane de nitrocellulose (ainsi activée et séchée) dans un tampon (i) carbonate à pH 8 (contenant 0,012 M de CO32- et 0,15 M de NaCI) ou (ii)
PBS à pH 7 (comme dans la Préparation I ci-dessus), ledit tampon contenant 50 à 150 mg/ml dudit réactif immunologique. On obtient ainsi l'immobilisation du réactif immunologique dans la masse de la membrane selon une concentration surfacique de 100 yg/cm2.
On sature ensuite les sites actifs de la membrane encore libres, soit comme indiqué dans la Préparation I avec PVP ou (de préférence) REGILAITR, et on fixe au moyen d'eau distillée contenant 10 % p/v de CH3COOH et 25 % p/v d'isopropanol (à la rigueur). On rince abondamment avec le MES 0,05 M ou le
PBS à pH 7 précité. On absorbe le liquide restant en plaçant la membrane entre deux feuilles de papier filtre puis en tapotant avec précaution. On sèche ensuite à l'étuve à une température de 30-37"C, pendant au moins 1 nuit.
La membrane ainsi obtenue peut être conservée telle quelle ou découpée en bandes de dimensions identiques à celles des bandes de la membrane supportant le conjugué non immobilisé de la Préparation I ci-dessus, pendant plusieurs mois à 2-8"C.
PREPARATION III
Obtention d'une membrane comportant le mélange D-glucose/zlucose oxydase (a) On immerge pendant 0,25-0,50 h, dans une solution aqueuse de TWEENR à 5 % p/v, une membrane de cellulose (désignée "filtre No 122") commercialisée par la société dite MEDIAS FILTRANTS, référence 011220013, de porosité 0,5 m). On sèche pendant une nuit à l'étuve à 40"C. On immerge ensuite la membrane dans un bain aqueux contenant 10 % p/v de D-glucose, écarte le liquide surnageant puis sèche à l'étuve à 40"C pendant 1 nuit.
(b) On place 1 yl de glucose oxydase purifiée (titre 500 UI/ml) sur la membrane puis sèche à 37"C à l'étuve.
Si nécessaire, les sites actifs de la membrane qui sont encore libres sont saturés comme indiqué dans la Préparation I.
Cette membrane est découpée en bandes de dimensions identiques à celles des bandes de la Préparation I ci-dessus.
PREPARATION IIIbis
Obtention d'une membrane comportant le D-glucose et d'une membrane comportant la glucose oxvdase.
On prépare une membrane comportant le D-glucose co préférence circulaire, une quantité de 2,5 l par plot d'une composition alcoolique (éthanol) contenant 5 g/l de TMB. On conserve la membrane telle quelle ou découpée en bandes de dimensions identiques à celles des bandes de la
Préparation I ci-dessus, à l'abri de la lumière.
PREPARATION V (a) Selon un procédé similaire à celui de la préparation I on prépare une membrane poreuse support du conjugué non immobilisé où la peroxydase est remplacée par une phosphatase alcaline ou respectivement la 13-galactosidase.
(b) Selon un procédé similaire à celui de la Préparation IV, on prépare une membrane poreuse où le TMB est remplacé par le mélange BCIP/NBT ou respectivement le méthoxynaphtyl-galactoside. Dans ce cas, le dispositif multimembranaire selon l'invention ne comporte pas la membrane 2 devenue superflue eu égard au choix de l'enzyme de marquage du conjugué non immobilisé.
EXEMPLE 1
Identification du DDi
On prépare à partir de bandes prédécoupées, conformément à la figure 1 ou à la figure 6, un dispositif multimembranaire comprenant un assemblage de - une phase sélective selon la préparation II ci-dessus comportant en tant que réactif immunologique immobilisé une substance antigénique X, - une membrane poreuse 2 selon la préparation III ci-dessus comportant un mélange D-glucose/glucose oxydase (en variante, la membrane poreuse 2 peut être remplacée par une membrane comportant le D-glucose et une membrane comportant la glucose oxydase obtenues selon la préparation IIIbis), et - une membrane poreuse 3 selon la préparation IV ci-dessus comportant le TMB.
On fait réagir dans un flacon un échantillon contenant 0 à 10 yg/ml de DDi avec l'anticorps monoclonal couplé à la peroxydase (9C3-peroxydase). Le mélange réactionnel résultant est distribué sur une nappe de fibre de verre disposée audessus de la membrane poreuse de la phase sélective.
Avec le dispositif de la figure 1, selon lequel la phase sélective est traversée perpendiculairement, on observe que (i) l'essai est négatif pour les concentrations en DDi dans l'échantillon inférieures ou égales à 0,2 ,ug/ml, (ii) l'essai est douteux pour les concentrations en DDi dans l'échantillon compris entre 0,2 ,ug/ml et 0,4 yg/ml, et (iii) l'essai est positif pour les concentrations en DDi dans l'échantillon supérieures ou égales à 0,4 yg/ml.
En bref le dispositif de la figure 1 est fiable pour toute concentration en
DDi supérieure ou égale à 0,4 yg/ml.
Avec le dispositif de la figure 6, selon lequel la phase sélective est traversée longitudinalement, les résultats montrent que la sensibilité est de 1 pg/ml (i.e. concentration minimale détectable de façon fiable en DDi dans l'échantillon de 1 picogramme par millilitre).
EXEMPLE 2
Identification du PAI-I
On prépare un dispositif multimembranaire selon la figure 7 en utilisant - comme phase sélective une membrane poreuse en nitrocellulose (épaisseur 0,35 mm ; porosité : 0,45 yg) contenant dans sa masse un anticorps monoclonal anti(PAI-1), à savoir 7D4, - comme membranes poreuses de révélation 62 une première membrane contenant le mélange D-glucose/glucose oxydase (en variante on peut utiliser une membrane contenant le D-glucose et une membrane contenant la glucose oxydase) et une seconde membrane contenant le TMB.
On introduit dans le puits 66 le mélange d'un échantillon aqueux contenant 0 à 10 ssg/ml de PAI-1 et l'anticorps monoclonal anti(PAI-1) couplé à la peroxydase, i.e.
7F5-peroxydase.
Les résultats obtenus montrent que ledit dispositif présente pour le dosage de PAI-1 une sensibilité de 1 pg/ml.
EXEMPLE 3
Identification du DDi
On utilise un dispositif multimembranaire selon la figure 6 ou 7 fonctionnant selon le principe des figures 2, 2a et 2b, avec - comme phase sélective une membrane de nitrocellulose identique à celle de l'exemple 2 et contenant dans sa masse l'anticorps monoclonal 2F7, - comme membranes poreuses de révélation une membrane contenant le mélange
D-glucose/glucose oxydase (en variante on peut utiliser une membrane contenant le D-glucose et une membrane contenant la glucose oxydase) et une membrane contenant le TMB.
Par le puits 66 on introduit un mélange constitué d'un échantillon aqueux contenant 0 à 1 yg/ml de DDi et un anticorps monoclonal ou polyclonal antiidiotype dirigé contre 2F7 et couplé à la peroxydase.
Selon les résultats obtenus, on constate que le seuil de sensibilité pour la détermination du DDi est de 0,1 yg/ml.
EXEMPLE 4
Identification du DDi
On utilise un dispositif multimembranaire selon la figure 8 fonctionnant selon les principes des figures 5, Sa et 5b, avec - comme première phase sélective, une membrane ULTRABINDR (épaisseur 0,2 mm ; porosité : 0,45 ,um) contenant dans sa masse une quantité prédéterminée de l'anticorps monoclonal 9C3 [i.e. anticorps monoclonal anti(DDi)] - cette quantité prédéterminée correspond à la teneur normale en DDi dans le plasma -, - comme charge disposée dans le puits 86b, l'anticorps monoclonal 2F7 couplé à la peroxydase ou à la B-galactosidase, - comme seconde phase sélective, la membrane ULTRABINDR précitée contenant dans sa masse le DDi immobilisé, et - comme membranes poreuses de révélation, soit une membrane contenant le mélange D-glucose/glucose oxydase (en variante on peut utiliser une membrane contenant le D-glucose et une membrane contenant la glucose oxydase) et une membrane contenant le TMB, soit une membrane contenant le MPB.
L'échantillon de plasma contenant le DDi (d'une concentration inférieure à la normale à une concentration supérieure à la normale) est introduit dans le puits 86a.
Les résultats obtenus, mettent en évidence que la sensibilité de la détermination de l'excès de DDi par rapport à la normale est de 0,1 pg/ml.
EXEMPLE 5
Identification du PAI-1
On procède comme indiqué à l'exemple 4 ci-dessus en remplaçant les produits DDi, 2F7-peroxydase (ou 2F7-galactosidase) et respectivement 9C3 par les produits PAl-i, 7D4-peroxydase (ou 7D4-galactosidase) et respectivement 7F5. Le seuil de sensibilité est également de 0,1 pg/ml.
EXEMPLE 6
Identification de 1'a1-antitrypsine
On sait que l'inflammation du pis de la vache se traduit par la présence d'inhibiteurs trypsiques dans le lait, parmi lesquels I 'o' -antitrypsine est prépondérante et caractéristique. La détermination de l'absence de antitrypsine dans le lait est donc particulièrement intéressante pour la santé du cheptel et l'hygiène du consommateur.
Dans ce but on utilise un dispositif selon la figure 1 ou la figure 6 avec - une phase sélective contenant dans sa masse l'a1-antitrypsine en tant que substance immunologique immobilisée, et - une membrane poreuse de révélation contenant le MPB.
On distribue sur la nappe non-tissée de fibre de verre, située au-dessus de la face 11 de la membrane 10 ou au fond du puits 66, un mélange constitué par un échantillon de lait et un anticorps anti(a1-antitrypsine) couplé à la 8-galactosidase.
La sensibilité de la détermination est de 0,5 ssg/ml avec le dispositif de la figure 1 et de 2 yg/ml avec celui de la figure 6.
EXEMPLE 7
Idenhificahon de HBsAg
On fait appel à un dispositif selon la figure 6 ou 7 fonctionnant selon le principe des figure 3, 3a et 3b, avec - une phase sélective constituée d'une membrane IMMOBILONR (épaisseur : 0,2 mm ; porosité 0,65 ym) contenant dans sa masse, en tant que réactif immunologique immobilisé, un anticorps monoclonal anti[F(ab')2] dirigé contre le fragment F(ab')2 d'un anticorps anti(HBsAg), et - une membrane poreuse contenant le mélange D-glucose/glucose oxydase (en variante on peut utiliser une membrane contenant le D-glucose et une membrane contenant la glucose oxydase) et une membrane poreuse contenant le TMB.
Par le puits 66 on introduit un mélange aqueux constitué d'un échantillon contenant de 0 à 1 yg/ml de HBsAg et d'un anticorps monoclonal dirigé contre
HBsAg et couplé à la peroxydase.
La sensibilité de la détermination de HBsAg est de 1 pg/ml.
EXEMPLE 8
Idenflflcation de HBsAg
On utilise un dispositif multimembranaire selon la figure 6 ou 7 fonctionnant selon le principe des figure 4, 4a et 4b, avec - une phase sélective identique à celle de l'exemple 7 ci-dessus et contenant dans sa masse un premier anticorps monoclonal dirigé contre premier épitope de
HBsAg, et - les membranes poreuses de révélation de l'exemple 7 ci-dessus.
On introduit dans le puits 66 un mélange aqueux comprenant un échantillon contenant 0 à 1 yg/ml de HBsAg et un second anticorps monoclonal dirigé contre un second épitope de HBsAg et couplé à la peroxydase.
La sensibilité de la détermination de HBsAg est de 2 pg/ml.
EXEMPLE 9
Idenafication d'anticorps anh(HlV)
On prépare selon l'exemple 3 des dispositifs multimembranaires pour la détermination des anticorps anti(HIV1), anti(HIV2) et anti(HIV3). La sensibilité de la détermination qui est de 0,5 pg/ml permet l'identification de chacun de ces anticorps dans la salive.
EXEMPLE 10
Identification de Neisseria
On prépare selon l'exemple 8 un dispositif multimembranaire pour l'identification de souches de Neisseria dans le liquide de conserves de légumes.
La sensibilité est de 2 pg/ml.
EXEMPLE 11
Identification du PAI-I
On procède comme indiqué à l'exemple 4 ci-dessus en remplaçant les produits DDi, 2F7-peroxydase (ou 2F7-galactosidase) et respectivement 9C3 par les produits PAl- 1, 7D4-latex coloré et respectivement 7F5, le latex coloré sous forme de particules submicroniques ayant un diamètre moyen de 40-45 nm remplaçant l'enzyme de marquage E* précité, d'une part, et en utilisant en tant qu'ensemble 62 une ou deux membranes dépourvues de révélateur d'enzyme, d'autre part. Dans ce cas la membrane 81b de la phase sélective n'est pas située dans la lumière de la fenêtre 68. La sensibilité de la détermination de l'excès de
PAI-1 par rapport à la normale est de 0,1 pg/ml.
D'une manière générale, quand le moyen de marquage E* est constitué par de l'or colloïdal, de l'argent colloïdal, de l'or colloïdal dopé à l'argent, ou un latex coloré qui se présente sous la forme de microbilles d'un diamètre inférieur à 0,1 ym, il est important que la phase sélective 61 (selon la figure 6) ou 81b (selon la figure 8) n'occupe pas toute la lumière de la fenêtre 68 (figure 6 ou 8), de façon que l'observation de l'éventuelle coloration de l'ensemble 62 ne soit pas perturbée par la coloration de ladite phase sélective. Une configuration selon la figure 7 convient en ce sens qu'une portion seulement (ici la tranche) de la membrane 61 de la phase sélective est présente sous l'ensemble 62.
EXEMPLE 12
Identification de HBsAb
On fait appel à un dispositif selon la figure 7 fonctionnant selon le principe des figures 3, 3a et 3b avec - une phase sélective constituée d'une membrane IMMOBILONR (épaisseur : 0,2 mm ; porosité 0,65 zm) contenant dans sa masse, en tant que réactif immunologique immobilisé, un anticorps monoclonal anti[F(ab')2] dirigé contre le fragment F(ab')2 d'un anticorps anti(HBsAb), et - une ou deux membranes poreuses selon la préparation IV ci-dessus mais dépourvues de TMB.
* Par le puits 66 on introduit un mélange aqueux constitué d'un échantillon contenant de 0 à 1 yg/ml de HBsAb et d'un anticorps monoclonal dirigé contre
HBsAb et couplé à de l'or colloïdal.
La sensibilité de la détermination de HBsAb est de 2 pg/ml.
EXEMPLE 13
Identification du DDi
On utilise un dispositif multimembranaire selon la figure 6 ou 7 fonctionnant selon le principe des figures 2, 2a et 2b, avec - comme phase sélective une membrane de nitrocellulose identique à celle de l'exemple 2 et contenant dans sa masse l'anticorps monoclonal 2F7, - comme membranes poreuses de révélation une membrane contenant le mélange
BCIP/NTB.
Par le puits 66 on introduit un mélange constitué d'un échantillon aqueux contenant 0 à 1 ,ug/ml de DDi et un anticorps monoclonal anti-chaîne kappa dirigé contre 2F7 et couplé à la phosphatase alcaline.
Selon les résultats obtenus, on constate que le seuil de sensibilité pour la détermination du DDi est de 0,1 yg/ml.

Claims (21)

  1. multimembranaire comprenant - une première zone comportant une membrane poreuse pourvue d'un réactif immunologique immobilisé qui est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec le conjugué (anti(X)) et le conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E*), mais ne réagissant pas avec le produit de la réaction précité (X-anti(X)-E*), ou (b) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec ladite substance immunologique et le produit de la réaction précité (X-anti(X)-E*), mais ne réagissent pas avec ledit conjugué (anti(X)) et ledit conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E*), le rapport quantité pondérale dudit réactif immunologique immobilisé/surface de la membrane poreuse pourvue dudit réactif immunologique étant compris entre 10 et 150 ssg/cm2, et les sites actifs de ladite membrane non utilisés pour immobiliser ledit réactif immunologique étant bloqués; et, - une deuxième zone comportant au moins une membrane poreuse, qui est sousjacente à la membrane contenant ledit réactif immunologique immobilisé et qui contient un substrat spécifique de l'enzyme de marquage (E*) pour la révélation de la présence dudit enzyme.
    quand ladite substance immunologique est présente ; et, (2 ) faire passer le milieu réactionnel ainsi obtenu sur un dispositif
    X-anti(X)-E*
    marquage, de façon à obtenir le produit de réaction de formule
    où anti(X) représente un conjugué bifonctionnel et E* un enzyme de
    anti(X)-E*
    couplé à un enzyme de formule
    substance immunologique (X) à identifier avec l'un de ses conjugués
    REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification d'une substance immunologique (X) appartenant à l'ensemble des antigènes et des anticorps et susceptible d'être présente dans un échantillon liquide à analyser, ledit procédé, qui met en oeuvre la réaction de ladite substance immunologique avec l'un de ses conjugués [anti(X)] et l'utilisation d'un système multimembranaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1") mettre en contact l'échantillon liquide susceptible de contenir ladite
  2. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare à l'étape (1 ) un mélange de l'échantillon à analyser susceptible de contenir la substance immunologique X à identifier avec un conjugué dirigé contre anti(X) et couplé à l'enzyme de marquage, ce conjugué étant un complexe répondant à la formule anti [anti(X)] -E* et tel que (a) en l'absence de X, il réagit avec anti(X), et (b) en présence de X, il ne peut réagir avec anti(X) qu'après la fixation complète de X par anti(X), puis fait réagir à l'étape (2 ) ledit mélange avec le composé anti(X) immobilisé au niveau d'une membrane poreuse, avant de procéder à la révélation du conjugué complexe anti [anti(X)] -E* non retenu par le réactif immobilisé anti(X) du fait de la présence de X.
  3. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1") mettre en contact l'échantillon liquide susceptible de contenir ladite
    substance immunologique (X) à identifier avec un conjugué complexe de
    formule anti[anti(X)] -E *
    où E* et anti(X) sont définis comme indiqué ci-dessus, ledit conjugué
    complexe réagissant avec le conjugué [anti(X)] dirigé contre ladite
    substance immunologique (X) en l'absence de ladite substance (X) mais ne
    réagissant pas avec ledit conjugué en présence de ladite substance (X)
    libre ; et, (2 ) faire passer ledit mélange de l'échantillon à analyser avec ledit anti(X)
    complexe sur un dispositif multimembranaire comprenant
    - une première zone comportant une membrane poreuse comportant le
    conjugué [anti(X)] en tant que réactif immunologique,
    le rapport quantité pondérale dudit réactif immunologique
    immobilisé/surface de la membrane poreuse pourvue dudit réactif
    immunologique étant compris entre 10 et 150 ,ug/cm2, et les sites actifs de
    ladite membrane non utilisés pour immobiliser ledit réactif immunologique
    étant bloqués ; et,
    - une deuxième zone comportant au moins une membrane poreuse, qui est
    sous-jacente à la membrane contenant ledit réactif immunologique
    immobilisé et qui contient un substrat spécifique de l'enzyme de marquage
    (E*) pour la révélation de la présence dudit enzyme.
  4. 4. Procédé suivant la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que l'étape (1 O) est effectuée à l'extérieur du système multimembranaire.
  5. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que l'étape (1 ) est effectuée dans le système multimembranaire, l'échantillon susceptible de contenir ladite substance immunologique étant distribué sur un dépôt de conjugué couplé à un enzyme disposé non-immobilisé sur une membrane poreuse support située audessus de la membrane comportant sur sa face supérieure ledit réactif immunologique immobilisé.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la membrane poreuse supportant le conjugué couplé à un enzyme est surmontée d'une ou plusieurs membranes dépourvues de tout matériau immunologique.
  7. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que les sites actifs libres de la membrane de ladite deuxième zone au niveau de laquelle est immobilisé le réactif immunologique sont substantiellement bloqués.
  8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 7, caractérisé en ce que les sites actifs libres de chacune des membranes sont bloqués.
  9. 9. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que ledit réactif immunologique immobilisé au niveau de sa membrane a une concentration rapportée à la surface de ladite membrane, comprise entre 20 et 100 yg/cm2.
  10. 10. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la membrane poreuse comportant le réactif immunologique immobilisé a une épaisseur supérieure ou égale à 0,1 mm, notamment comprise entre 0,1 et 10 mm et de préférence comprise entre 0,2 et 1 mm.
  11. 11. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane poreuse comportant le réactif immunologique immobilisé est traversée par le flux liquide perpendiculairement à son plan.
  12. 12. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la membrane poreuse comportant le réactif immunologique immobilisé est traversée par le flux liquide longitudinalement.
  13. 13. Procédé suivant la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend à l'étape (1 ) l'utilisation de deux membranes poreuses comportant chacune un réactif immunologique immobilisé dans sa masse et l'utilisation d'un conjugué non immobilisé de formule
    anti(X)-E* ou anti[anti(X)]-E * disposé sur un support poreux entre les deux dites membranes poreuses.
  14. 14. Procédé suivant la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le réactif immunologique immobilisé est choisi parmi l'ensemble constitué par
    - la substance immunologique (X) elle-même, et
    - un conjugué dudit conjugué.
  15. 15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le conjugué du conjugué est choisi parmi l'ensemble constitué par
    (i) un anticorps [anti(anti(X))] dirigé contre l'anticorps [anti(X)], et
    (ii) une protéine ou un peptide réagissant spécifiquement vis-à-vis dudit
    conjugué [anti(X)].
  16. 16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que le produit anti[anti(X)] est choisi parmi l'ensemble constitué par les anticorps anti[F(ab')2], les anticorps anti-chaîne kappa et les anticorps anti-idiotype.
  17. 17. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1-6 et 13, caractérisé en ce que l'enzyme de marquage E* est remplacé par un marqueur choisi parmi l'or colloïdal, l'argent colloïdal, l'or colloïdal dopé à l'argent et un latex coloré.
  18. 18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le latex coloré se présente sous la forme de particules ayant une granulométrie inférieure à 0,1 ssm et de préférence comprise entre 25 et 60 nm.
  19. 19. Système multimembranaire pour l'identification d'une substance immunologique (X) susceptible d'être contenue dans un échantillon liquide à analyser, ledit système étant caractérisé en ce qu'il comprend
    - une première zone comportant une membrane poreuse comportant un
    réactif immunologique immobilisé qui est choisi parmi l'ensemble constitué
    par
    (a) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec le
    conjugué (anti(X)) et le conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E*), mais
    ne réagissent pas avec le produit de la réaction précité (X-anti(X)-E*), ou
    (b) les matériaux immunologiques qui réagissent spécifiquement avec
    ladite substance immunologique et le produit de la réaction précité
    (X-anti(X)-E*), mais ne réagissant pas avec ledit conjugué (anti(X)) et
    ledit conjugué couplé à un enzyme (anti(X)-E *),
    la concentration surfacique dudit réactif immunologique immobilisé étant
    comprise entre 10 et 150 yg/cm2, et les sites actifs de ladite membrane non
    utilisés pour immobiliser ledit réactif immunologique étant bloqués; et,
    - une deuxième zone comportant au moins une membrane poreuse, qui est
    sous-jacente à la membrane contenant ledit réactif immunologique
    immobilisé et qui contient un substrat spécifique pour la révélation de
    l'enzyme de marquage.
  20. 20. Système multimembranaire suivant la revendication 19, caractérisé en ce que l'enzyme de marquage E* est remplacé par un marqueur choisi parmi l'or colloïdal, l'argent colloïdal, l'or colloïdal dopé à l'argent et un latex coloré et en ce que ladite deuxième zone est dépourvue de substrat d'enzyme.
  21. 21. Nécessaire de dosage d'une substance immunologique (X), caractérisé en ce qu'il comprend (a) un système multimembranaire suivant la revendication 19 ou 20 et (b) au moins un conjugué complexe anti(X)-E* ou anti [anti(X)] -E * ou E* est un enzyme de marquage de l'or colloïdal, de l'argent colloïdal, de l'or colloïdal dopé à l'argent ou un latex coloré.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4418513A1 (de) * 1994-05-27 1995-11-30 Bayer Ag Immuntest zum Nachweis hochmolekularer Antigene
CA2273798A1 (fr) * 1996-12-05 1998-06-11 Idego Aps Stratifies pour capteur et dispositifs d'apport de liquide a sections multiples pour la detection, par immuno-essai, de molecules cibles dans des liquides biologiques
JP3622532B2 (ja) * 1998-10-13 2005-02-23 松下電器産業株式会社 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法
JP5100541B2 (ja) * 2008-07-04 2012-12-19 古河電気工業株式会社 標識粒子として、蛍光粒子と着色粒子とを含有するイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップおよび検査方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2514511A1 (fr) * 1981-10-13 1983-04-15 Liotta Lance Dispositif et procede pour determiner la presence d'antigenes
EP0280211A2 (fr) * 1987-02-23 1988-08-31 Roche Diagnostics GmbH Procédé pour déterminer des anticorps
FR2667943A1 (fr) * 1990-10-11 1992-04-17 Toledano Jacques Dispositif et procede pour la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand dans un fluide.

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2666898A1 (fr) 1990-09-18 1992-03-20 Toledano Jacques Dispositif et procede de dosage rapide de recepteurs membranaires ou de leurs ligands.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2514511A1 (fr) * 1981-10-13 1983-04-15 Liotta Lance Dispositif et procede pour determiner la presence d'antigenes
US4446232A (en) * 1981-10-13 1984-05-01 Liotta Lance A Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens
EP0280211A2 (fr) * 1987-02-23 1988-08-31 Roche Diagnostics GmbH Procédé pour déterminer des anticorps
FR2667943A1 (fr) * 1990-10-11 1992-04-17 Toledano Jacques Dispositif et procede pour la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand dans un fluide.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.J.GRIBNAU ET AL.: "Particle-labelled immunoassays: a review", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, BIOMEDICAL APPLICATIONS, vol. 376, 1986, AMSTERDAM NL, pages 175 - 189 *

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