JP3622532B2 - 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素免疫測定法に用いられる標識酵素存在下で、発色物質とその基質である過酸化水素で構成された発色液により発色する酵素免疫分析用試薬及びをれを用いた分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ある特定のタンパクの定量方法として、定量したいタンパクを抗原とし、その抗原と特異的に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により生化学的に定量する方法が行われてきた。この免疫分析法は標識として用いられる抗体に標識される物質により異なる。ラジオアイソトープで標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析するラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光物質を標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する蛍光免疫分析法（ＦＩＡ）、酵素を標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する酵素免疫分析法（ＥＩＡ）の３つの方法がある。これらの方法にはそれぞれ特徴があるが、簡便で、広く一般的に使用されている方法として酵素免疫分析法がある。
【０００３】
なお以上は抗原について説明したが、抗体を抗原、抗原を抗体に置き換えても全く同様であり、以下修飾したタンパクが抗原の場合を説明するが、抗体を定量する場合も同様であり、詳細については省略する。
【０００４】
これら代表的な酵素免疫分析法の一つであるサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を例に挙げ酵素免疫分析法について説明する。
【０００５】
まず抗原を捕まえる為の抗体を免疫測定に用いられるポリプロピレンのプレートに非特異的吸着により固定して固相化する。これに測定したいタンパクを含むサンプル溶液を注入して抗原と抗体の特異的な結合により測定したいタンパクを捕捉する。さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗体を抗原と反応させることにより、抗原量に応じた標識抗体が結合する。ここにあらかじめ溶液化した発色剤にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の基質物である過酸化水素を加えた発色試薬を作成しておき、標識抗体結合後プレートに添加する。一定時間反応後、反応を停止させ測定を行う。使用した発色剤の最大吸収波長で吸光度の測定を行い測定対象のタンパクの定量を行うものである。
【０００６】
【発明は解決しようとする課題】
上記従来の酵素免疫分析用試薬及び分析方法では、発色溶液を作成するにあたり、発色物質の他に過酸化水素を標識酵素の基質物として別途加える必要がある。しかし過酸化水素は溶液の形態でしか存在せず、安定性にも欠け、また微量の添加をするためには専用の器具が必要となり、作業工程を増やす要因になっているため、熟練した者が操作を行わなくてはならないが、利便性と分析の正確性を欠けるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供、及び簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために本発明の酵素免疫分析用試薬及び分析方法は次の構成からなる。
【０００９】
本発明の酵素免疫分析用試薬は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有する発色層と、を備えた酵素免疫分析用試薬であって、
前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の間に積層されている構成を有している。
【００１０】
この構成により、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供することができる。
【００１１】
また、本発明の酵素免疫分析方法は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有している。
【００１２】
この構成により、抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度を測定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載の発明は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有する発色層と、を備えた酵素免疫分析用試薬であって、前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の間に積層されている構成を有している。
【００１４】
これにより、過酸化水素を発生できる酵素や酵素に特異的に反応する基質物及び発色物質を１つの錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に発色溶液の作成ができ、酵素層と基質層と発色層が積層構造で形成されることにより、酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の変質反応を防ぐことができるという作用を有する。
【００１５】
ここで、過酸化水素を発生できる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、スクロースオキシダーゼ、アスクコルビン酸オキシダーゼ、コレスラロ−ルオキシダーゼが用いられる。
【００１６】
酵素に特異的に反応する基質物としては、グルコース、ガラクトース、スクロース、アスクコルビン酸、コレスラロールが用いられる。
【００１７】
酵素層としては、酵素を安定するため、タンパク質が媒体として用いられる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、カゼインが用いられる。過酸化水素を発生できる酵素の量をａとし、タンパク質の量をｂとすると、ａ：ｂは１：７〜１１、好ましくは１：８〜１０の割合で好適に用いられる。ａとｂが所定割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固めたものが用いられる。ａ：ｂは１：８より小さくなるにつれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また１：１０よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００１８】
発色層としては、発色物質の固めたものが用いられる。
基質層としては、酵素に特異的に反応する基質物を安定するため、糖類が媒体として用いられる。糖類としては、ラクトース、マルトース、トレハロース、フルクトースが用いられる。基質物の量をｃとし、糖類の量をｄとすると、ｃ：ｄは１：８５〜１１０、好ましくは１：９０〜１００の割合で好適に用いられる。ｃとｄを混合して圧力をかけて圧着されたものが用いられる。ｃ：ｄは１：９０より小さくなるにつれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また１：１００よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００１９】
酵素層が試薬全量に対して１ｗｔ％〜２５ｗｔ％、好ましくは４ｗｔ％〜１８ｗｔ％に形成される。酵素層が４ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また１８ｗｔ％よりも多くなるにつれ、同じく吸光度の低下という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２０】
発色層が試薬全量に対して０．５ｗｔ％〜５ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜３ｗｔ％に形成される。発色層が２ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また３ｗｔ％よりも多くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２１】
基質層が試薬全量に対して６０ｗｔ％〜９８ｗｔ％、好ましくは７５ｗｔ％〜９５ｗｔ％に形成される。基質層が７５ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また９５ｗｔ％よりも多くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２４】
ここで、酵素免疫分析用試薬が酵素層、発色層、基質層の順にそれぞれの割合で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にしたものが用いられる。
【００２５】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、酵素がグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であり、及び／又は前記酵素に特異的に反応する基質物がグルコースであった構成を有している。
【００２６】
これにより、請求項１により得られる作用の他、過酸化水素を発生できる酵素が長期で保存でき、安定性に優れるという作用を有する。
【００２７】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１又は２の内いずれか１項に記載の発明において、発色物質がオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）の少なくとも１種であった構成を有している。
【００２８】
これにより、請求項１又は２により得られる作用の他、各発色物質特有の発色を有することができるという作用を有する。
【００２９】
ここで、発色物質としては、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）が用いられるが、他の発色できるものでもよい。
【００３０】
吸光度を測定する波長としては、ＯＰＤとＡＳＡ発色物質に対して４９０ｎｍ、ＴＭＢ発色物質に対して４５０ｎｍ、ＡＢＴＳ発色物質に対して４０５ｎｍが用いられる。
【００３１】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の発明において、前記酵素層と前記発色層と前記基質層の間に少なくとも１層のでんぷん層が配設された構成を有している。
【００３２】
これにより、請求項１乃至３により得られる作用の他、吸湿による試薬の劣化を防ぐこ
とができるという作用を有する。
【００３３】
ここで、でんぷん層としては、酵素層と発色層と基質層の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に形成されている。
【００３４】
でんぷん層の量が発色層の半分で好適に用いられるが、酵素層と発色層と基質層を接着できる量でもよい。
【００３５】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有している。
【００３６】
これにより、抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定することができる。
【００３７】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗原と抗体が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗体濃度を測定した構成を有している。
【００３８】
これにより、抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度を測定することができる。
【００３９】
本発明の請求項７に記載の発明は、請求項５又は６の内いずれか１項に記載の発明において、標識物質がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であった構成を有している。
【００４０】
これにより、請求項５又は６により得られる作用の他、発色反応の触媒活性を向上できるという作用を有する。
【００４１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１の酵素免疫分析用試薬の斜視図である。
【００４２】
図１において、１は実施の形態１の酵素免疫分析用試薬、２は過酸化水素を発生できる酵素と酵素を安定するタンパク質は所定の割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固めた酵素層、３は発色物質をそのまま固めたもので最終的に酵素層２に隣接して圧着された発色層、４は過酸化水素を発生できる酵素に特異的に反応する基質物と糖類は所定の割合で混合して圧力をかけて最終的に発色層３に隣接して圧着された基質層である。
【００４３】
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１が酵素層２、発色層３、基質層４の順にそれぞれの試薬割合で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にしたものである。
【００４４】
次に実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて免疫分析について説明する。
【００４５】
ここでは最も一般的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて説明する。まず測定対象である抗原に特異的な抗体をプレートの上に非特異的吸着により固定化を行い、十分洗浄して吸着していない抗体をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液で液洗い流す。次に抗原などの非特異的な吸着を防ぐため、未吸着部分に非特異的吸着のブロッキング剤としてアルブミンを吸着させる。ここでも十分に洗浄を行い未吸着のアルブミンをｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む、Ｔｗｅｅｎ２０、関東化学株式会社製、商品名）で洗い流す。次に検量線を作成するために既知濃度の抗原を３倍希釈を繰り返して１０系列標準サンプルを作成する。同様に未知濃度の測定溶液についても３倍希釈で１０系列測定試料を作成する。作成した１０系列の標準サンプル及び測定試料をアルブミンを洗い流したプレートに注入して抗原抗体反応を行わせる。一定時間後、十分にプレート上の未結合の抗原をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）で洗い流す。洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗体を注入して抗原抗体反応行わせる。洗浄を行い未反応の標識抗体をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）で洗い流す。ここまで終了した時点で抗原が２つの抗体に挟まれた形でプレートに固定化されている。
【００４６】
次に発色反応をさせるために、酵素層２のグルコースオキシダーゼ、基質層４のグルコース、発色層３のオルトフェニレンジアミンを含有した本実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１をｐＨ５．０のクエン酸緩衝液に溶かして３０分間放置する。このとき溶液中では以下の反応（１）が起こり過酸化水素が発生する。
【００４７】
グルコース＋グルコースオキシダーゼ＋Ｈ２Ｏ→Ｈ２Ｏ２＋グルコノラクトン （１）
３０分後、洗浄を行ったプレートに酵素免疫分析用試薬を溶液したものを定量注入を行い１５分間反応を起こさせる。ここでプレートに固定化されたペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を触媒として以下の反応（２）が起こる。
【００４８】
Ｈ２Ｏ２＋オルトフェニレンジアミン→Ｈ２Ｏ＋オルトニトロアニリン（発色） （２）
１５分後、硫酸を注入して酵素を失活させて反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸収光の測定をおこなう。得られた検量線のデータから線形的に変化している濃度範囲を抜き出して抗原濃度と吸光度の関係から検量線を作成する。測定試料で吸光度が検量線の範囲に入っているものを選んで、検量線の式から逆算して抗原濃度を算出することができる。
【００４９】
尚、以上の手順で未知濃度の試料の抗原濃度の測定を行う。同様に未知濃度の抗体に関しては抗原と抗体を入れ替えて同様の手順で測定することができる。
【００５０】
（実施の形態２）
図２は本発明の実施の形態２の酵素免疫分析試薬の斜視図である。
【００５１】
図２において、５は実施の形態２の酵素免疫分析試薬、６は実施の形態１で形成した３層の試薬の境界に形成されたでんぷん層である。尚、実施の形態１と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
【００５２】
実施の形態２の酵素免疫分析試薬５が酵素層２と発色層３及び発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に設けられたものである。
【００５３】
酵素層２と発色層３又は発色層３と基質層４の間にでんぷん層を挟むことにより、ある程度の吸湿に対する緩衝作用を持ち、吸湿した場合に起こる過酸化水素発生酵素とこの酵素に特異的に反応する基質物の反応を押さえることができる。
【００５４】
実施の形態２の酵素免疫分析試薬５の使用方法は実施の形態１と同様であるので説明を省略する。
【００５５】
なお、以上の説明では、酵素層２と発色層３又は発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍのでんぷん層が設けられた例で説明したが、実施の形態１の酵素免疫分析試薬１の表面にでんぷんのスラリーを塗りかけて膜を形成したものについても同様に実施可能である。
【００５６】
また、以上の説明では、円柱状の酵素免疫分析試薬を用いて説明したが、他の多角柱状、板状、球状のものについても同様に実施可能である。
【００５７】
以上のように本実施の形態によれば、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供できると共に、抗原濃度又は抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度又は抗体濃度を測定することができる。
【００５８】
【実施例】
次に、本発明の具体例を説明する。
【００５９】
（実施例１）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて酵素免疫分析の確認実験を行った。
【００６０】
測定に使用する緩衝液は、クエン酸一水和物を２１ｇとクエン酸三ナトリウム二水和物２９．４ｇ秤量し、８００ｍｌ程度の蒸留水を加えて溶解した。その後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ５．０になるように調製した。調整後、蒸留水をさらに加えて１ｌにした。
【００６１】
作成したクエン酸緩衝液１０ｍｌに対してオルトフェニレンジアミンを４ｍｇを添加し、グルコースを１ｇ添加して発色溶液（黄色）の調製を行った。なお他の発色溶液の色は次のようになるＡＳＡ（淡黄色）、ＴＭＢ（深緑色）、ＡＢＴＳ（青色）。
【００６２】
作成したクエン酸緩衝液１ｍｌに対して５０００μｇの麹かび由来のグルコースオキシダーゼを添加する。作成したグルコースオキシダーゼ溶液を３００μｌ分注し、同様のクエン酸緩衝液を６００μｌ加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グルコースオキシダーゼ溶液を作成する。
【００６３】
０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。調製した発色溶液を１００μｌ添加する。さらに作成した希釈グルコースオキシダーゼ溶液をそれぞれセルに５０μｌずつ添加する。添加後２分間反応を行い、２Ｎの硫酸５０μｌ添加して反応を停止させ、４９０ｎｍ（ＯＰＤ）の吸光度の測定を行った。なお、他の発色液を使用する場合は４９０ｎｍ（ＡＳＡ）、４５０ｎｍ（ＴＭＢ）、４０５ｎｍ（ＡＢＴＳ）の波長で測定を行う。同様の操作を行い反応時間１０，１５，２０，３０分間について測定を行った。その結果を図３に示す。
【００６４】
図３はグルコースオキシダーゼ濃度と、酵素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミンの発色の関係を示す図である。
【００６５】
図３において、曲線Ａは反応時間３０分間、曲線Ｂは反応時間２０分間、曲線Ｃは反応時間１０分間、曲線Ｄは反応時間５分間の吸光曲線を示している。
【００６６】
図３から明らかなように、グルコースオキシダーゼ量はすべての反応時間において１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲で、高いシグナルを示し、５０μｇ／ｍｌでこの時高感度の測定を可能とすることが分かった。
【００６７】
次に酵素量に対する最適なグルコース量を決定する。まず４ｇのグルコースを蒸留水に溶かして最終的にグルコース溶液を１０ｍｌ作成する。作成したグルコース溶液を１ｍｌ分注し、２ｍｌの蒸留水を加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グルコース溶液を作成する。
【００６８】
測定は、０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を０．００５μｇ／ｍｌ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。前記クエン酸緩衝液１０ｍｌに対してグルコースオキシダーゼを４００μｇ添加し、オルトフェニレンジアミンを４ｍｇ添加して作成した発色液をセルに１００μｌずつ添加する。さらにそれぞれの濃度のグルコース溶液をセルに５０μｌずつ添加して１５分間反応させる。反応終了後２Ｎの硫酸を加えて反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図４に示す。
【００６９】
図４はグルコース濃度と吸光度の関係を表すグラフである。
図４から明らかなように、グルコース量は１μｇ／ｍｌ以上が望ましく、この時高感度の測定を可能とすることが分かった。
【００７０】
次にグルコースオキシダーゼとグルコースの反応により発生する過酸化水素の適量に達する時間の決定を行った。
【００７１】
０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。実施の形態２で作成した発色液を１００μｌ加えて２，５，１０，１５，２０，３０，８０，１７０分間のそれぞれの時間反応させて、反応終了後２Ｎの硫酸を５０μｌ加えて停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図５に示す。
【００７２】
図５はオルトフェニレンジアミンの発色時間と吸光度の関係を表すグラフである。
【００７３】
図５から明らかなように、過酸化水素発生時間は３０分間が望ましく、この時高感度の測定を可能にすることが分かった。
【００７４】
（実施例２）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて酵素免疫分析の検量線実験を行った。
【００７５】
ペレットの形成はオルトフェニレンジアミン４ｍｇ、グルコース３０ｍｇ、グルコースオキシダーゼ３００μｇのそれぞれの物質について圧縮してペレット状に形成する。そして各ペレットをさらに圧着して１つのペレットに形成したものである。
【００７６】
１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６００μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬１を１錠添加して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定を行った。その結果を図６に示す。
【００７７】
図６は酵素免疫分析用試薬での検量線作成結果を表すグラフである。
図６から明らかなように、０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌの範囲で線形的な変化を示し、この範囲で測定できることが分かった。
【００７８】
（実施例３）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の安定性実験を行った。
【００７９】
グルコースとグルコースオキシダーゼが隣り合った酵素免疫分析用試薬と実施の形態１で作成したと酵素免疫分析用試薬１を湿度１００％の容器内で１時間保持して、１週間３℃の冷蔵庫で保管した後に測定に使用した。
【００８０】
１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６００μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬を１錠添加して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定を行った。その結果を図７に示す。
【００８１】
図７は酵素免疫分析用試薬の安定性を比較した結果を表したグラフである。
図７において、曲線Ａはグルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質がある場合、曲線Ｂはグルコースオキシダーゼとグルコースが隣り合っている場合の吸光曲線である。
【００８２】
図７から明らかなように、グルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質を挟むことにより吸湿による劣化を防ぐことができる。また測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用できることが分かった。
【００８３】
（実施例４）
実施の形態２の酵素免疫分析用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の保存安定性実験を行った。
【００８４】
図２に示すように、グルコースオキシダーゼ、グルコース、発色剤の層の間にでんぷん層を挟んだ構造のペレットを形成したものである。グルコースオキシダーゼ、グルコース、発色剤の割合は実施の形態２に示した数値と同様であり、間に挟んだでんぷん層の割合は各層の接着及び吸湿ができればどのような割合でもよい。ここで形成した発色溶液作成試薬を使用して発色溶液を調合し、この発色溶液を用いて測定を行った。なお比較を行うために作成した発色溶液作成試薬を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させたものと、そうでないものを１週間３℃の冷蔵庫で保存した後に使用した。
【００８５】
マイクロプレートに１μｇ／ｍｇのＤｅｒｆＩＩ抗体を５０μｌ注入し、２時間プレートに固定化する。その後洗浄を行い、２％のアルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｂ）を２００μｌ注入して３０分間反応させる。その後、界面活性剤を含んだＰＢＳ−Ｔで洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔに溶かしたＤｅｒｆＩＩ抗原を注入し２時間反応させ、さらに洗浄、そして０．５μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＤｅｒｆＩＩ抗体を５０μｌ添加して反応させる。洗浄後、作成した各発色溶液を１００μｌ添加して１５分間反応させ、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を止めて４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図８に示す。
【００８６】
図８は本発明の実施の形態２の酵素免疫分析試薬５の保存安定性を比較するグラフである。
【００８７】
図８において、曲線Ａは発色溶液作成試薬を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させたもの、曲線Ｂは全く水を吸湿させてないものを表している。
【００８８】
図８から明らかなように、でんぷんを各層の間に挟むことにより吸湿による劣化を抑えることができ、測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用できることが分かった。
【００８９】
【発明の効果】
以上のように本発明においては、以下の優れた効果を実現できる。
【００９０】
本発明の請求項１に記載の発明によれば、
（１）過酸化水素発生酵素、過酸化水素発生酵素に特異的に反応する基質物、発色物質を１つの錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に抗原濃度又は抗体濃度を測定することができ、酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、吸湿による試薬の変質を抑制することができる。
【００９２】
本発明の請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載の効果に加えて、
（２）酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、危険な過酸化水素を使用せず安定性に優れ、低原価で量産できる。
【００９３】
本発明の請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（３）酵素免疫分析用試薬が各発色物質特有の発色を有することにより、酵素免疫分析の正確性を向上する事ができる。
【００９４】
本発明の請求項４に記載の発明によれば、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（４）酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の劣化を防ぐことができる。
【００９５】
本発明の請求項５に記載の発明によれば、
（５）抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供できる。
【００９６】
本発明の請求項６に記載の発明によれば、
（６）抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の生成物の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供できる。
【００９７】
本発明の請求項７に記載の発明によれば、請求項５又は６の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（７）酵素免疫分析用試薬が発色反応の触媒活性を有することができ、酵素免疫分析の感度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１の酵素免疫分析用試薬の斜視図
【図２】本発明の実施の形態２の酵素免疫分析用試薬の斜視図
【図３】グルコースオキシダーゼ濃度と、酵素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミンの発色の関係を示す図
【図４】グルコース濃度と吸光度の関係を表すグラフ
【図５】オルトフェニレンジアミンの発色時間と吸光度の関係を表すグラフ
【図６】酵素免疫分析用試薬での検量線作成結果を表すグラフ
【図７】酵素免疫分析用試薬の安定性を比較した結果を表すグラフ
【図８】実施の形態２の酵素免疫分析試薬の保存安定性を比較するグラフ
【符号の説明】
１ 実施の形態１の酵素免疫分析用試薬
２ 酵素層
３ 発色層
４ 基質層
５ 実施の形態２の酵素免疫分析用試薬
６ でんぷん層
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素免疫測定法に用いられる標識酵素存在下で、発色物質とその基質である過酸化水素で構成された発色液により発色する酵素免疫分析用試薬及びをれを用いた分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ある特定のタンパクの定量方法として、定量したいタンパクを抗原とし、その抗原と特異的に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により生化学的に定量する方法が行われてきた。この免疫分析法は標識として用いられる抗体に標識される物質により異なる。ラジオアイソトープで標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析するラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光物質を標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する蛍光免疫分析法（ＦＩＡ）、酵素を標識した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する酵素免疫分析法（ＥＩＡ）の３つの方法がある。これらの方法にはそれぞれ特徴があるが、簡便で、広く一般的に使用されている方法として酵素免疫分析法がある。
【０００３】
なお以上は抗原について説明したが、抗体を抗原、抗原を抗体に置き換えても全く同様であり、以下修飾したタンパクが抗原の場合を説明するが、抗体を定量する場合も同様であり、詳細については省略する。
【０００４】
これら代表的な酵素免疫分析法の一つであるサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を例に挙げ酵素免疫分析法について説明する。
【０００５】
まず抗原を捕まえる為の抗体を免疫測定に用いられるポリプロピレンのプレートに非特異的吸着により固定して固相化する。これに測定したいタンパクを含むサンプル溶液を注入して抗原と抗体の特異的な結合により測定したいタンパクを捕捉する。さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗体を抗原と反応させることにより、抗原量に応じた標識抗体が結合する。ここにあらかじめ溶液化した発色剤にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の基質物である過酸化水素を加えた発色試薬を作成しておき、標識抗体結合後プレートに添加する。一定時間反応後、反応を停止させ測定を行う。使用した発色剤の最大吸収波長で吸光度の測定を行い測定対象のタンパクの定量を行うものである。
【０００６】
【発明は解決しようとする課題】
上記従来の酵素免疫分析用試薬及び分析方法では、発色溶液を作成するにあたり、発色物質の他に過酸化水素を標識酵素の基質物として別途加える必要がある。しかし過酸化水素は溶液の形態でしか存在せず、安定性にも欠け、また微量の添加をするためには専用の器具が必要となり、作業工程を増やす要因になっているため、熟練した者が操作を行わなくてはならないが、利便性と分析の正確性を欠けるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供、及び簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために本発明の酵素免疫分析用試薬及び分析方法は次の構成からなる。
【０００９】
本発明の酵素免疫分析用試薬は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有する発色層と、を備えた酵素免疫分析用試薬であって、
前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の間に積層されている構成を有している。
【００１０】
この構成により、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供することができる。
【００１１】
また、本発明の酵素免疫分析方法は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有している。
【００１２】
この構成により、抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度を測定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載の発明は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有する発色層と、を備えた酵素免疫分析用試薬であって、前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の間に積層されている構成を有している。
【００１４】
これにより、過酸化水素を発生できる酵素や酵素に特異的に反応する基質物及び発色物質を１つの錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に発色溶液の作成ができ、酵素層と基質層と発色層が積層構造で形成されることにより、酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の変質反応を防ぐことができるという作用を有する。
【００１５】
ここで、過酸化水素を発生できる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、スクロースオキシダーゼ、アスクコルビン酸オキシダーゼ、コレスラロ−ルオキシダーゼが用いられる。
【００１６】
酵素に特異的に反応する基質物としては、グルコース、ガラクトース、スクロース、アスクコルビン酸、コレスラロールが用いられる。
【００１７】
酵素層としては、酵素を安定するため、タンパク質が媒体として用いられる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、カゼインが用いられる。過酸化水素を発生できる酵素の量をａとし、タンパク質の量をｂとすると、ａ：ｂは１：７〜１１、好ましくは１：８〜１０の割合で好適に用いられる。ａとｂが所定割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固めたものが用いられる。ａ：ｂは１：８より小さくなるにつれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また１：１０よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００１８】
発色層としては、発色物質の固めたものが用いられる。
基質層としては、酵素に特異的に反応する基質物を安定するため、糖類が媒体として用いられる。糖類としては、ラクトース、マルトース、トレハロース、フルクトースが用いられる。基質物の量をｃとし、糖類の量をｄとすると、ｃ：ｄは１：８５〜１１０、好ましくは１：９０〜１００の割合で好適に用いられる。ｃとｄを混合して圧力をかけて圧着されたものが用いられる。ｃ：ｄは１：９０より小さくなるにつれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また１：１００よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００１９】
酵素層が試薬全量に対して１ｗｔ％〜２５ｗｔ％、好ましくは４ｗｔ％〜１８ｗｔ％に形成される。酵素層が４ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また１８ｗｔ％よりも多くなるにつれ、同じく吸光度の低下という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２０】
発色層が試薬全量に対して０．５ｗｔ％〜５ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜３ｗｔ％に形成される。発色層が２ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また３ｗｔ％よりも多くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２１】
基質層が試薬全量に対して６０ｗｔ％〜９８ｗｔ％、好ましくは７５ｗｔ％〜９５ｗｔ％に形成される。基質層が７５ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低下という傾向が認められ、また９５ｗｔ％よりも多くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００２４】
ここで、酵素免疫分析用試薬が酵素層、発色層、基質層の順にそれぞれの割合で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にしたものが用いられる。
【００２５】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、酵素がグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であり、及び／又は前記酵素に特異的に反応する基質物がグルコースであった構成を有している。
【００２６】
これにより、請求項１により得られる作用の他、過酸化水素を発生できる酵素が長期で保存でき、安定性に優れるという作用を有する。
【００２７】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１又は２の内いずれか１項に記載の発明において、発色物質がオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）の少なくとも１種であった構成を有している。
【００２８】
これにより、請求項１又は２により得られる作用の他、各発色物質特有の発色を有することができるという作用を有する。
【００２９】
ここで、発色物質としては、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）が用いられるが、他の発色できるものでもよい。
【００３０】
吸光度を測定する波長としては、ＯＰＤとＡＳＡ発色物質に対して４９０ｎｍ、ＴＭＢ発色物質に対して４５０ｎｍ、ＡＢＴＳ発色物質に対して４０５ｎｍが用いられる。
【００３１】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の発明において、前記酵素層と前記発色層と前記基質層の間に少なくとも１層のでんぷん層が配設された構成を有している。
【００３２】
これにより、請求項１乃至３により得られる作用の他、吸湿による試薬の劣化を防ぐこ
とができるという作用を有する。
【００３３】
ここで、でんぷん層としては、酵素層と発色層と基質層の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に形成されている。
【００３４】
でんぷん層の量が発色層の半分で好適に用いられるが、酵素層と発色層と基質層を接着できる量でもよい。
【００３５】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有している。
【００３６】
これにより、抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定することができる。
【００３７】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗原と抗体が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗体濃度を測定した構成を有している。
【００３８】
これにより、抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度を測定することができる。
【００３９】
本発明の請求項７に記載の発明は、請求項５又は６の内いずれか１項に記載の発明において、標識物質がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であった構成を有している。
【００４０】
これにより、請求項５又は６により得られる作用の他、発色反応の触媒活性を向上できるという作用を有する。
【００４１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１の酵素免疫分析用試薬の斜視図である。
【００４２】
図１において、１は実施の形態１の酵素免疫分析用試薬、２は過酸化水素を発生できる酵素と酵素を安定するタンパク質は所定の割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固めた酵素層、３は発色物質をそのまま固めたもので最終的に酵素層２に隣接して圧着された発色層、４は過酸化水素を発生できる酵素に特異的に反応する基質物と糖類は所定の割合で混合して圧力をかけて最終的に発色層３に隣接して圧着された基質層である。
【００４３】
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１が酵素層２、発色層３、基質層４の順にそれぞれの試薬割合で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にしたものである。
【００４４】
次に実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて免疫分析について説明する。
【００４５】
ここでは最も一般的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて説明する。まず測定対象である抗原に特異的な抗体をプレートの上に非特異的吸着により固定化を行い、十分洗浄して吸着していない抗体をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液で液洗い流す。次に抗原などの非特異的な吸着を防ぐため、未吸着部分に非特異的吸着のブロッキング剤としてアルブミンを吸着させる。ここでも十分に洗浄を行い未吸着のアルブミンをｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む、Ｔｗｅｅｎ２０、関東化学株式会社製、商品名）で洗い流す。次に検量線を作成するために既知濃度の抗原を３倍希釈を繰り返して１０系列標準サンプルを作成する。同様に未知濃度の測定溶液についても３倍希釈で１０系列測定試料を作成する。作成した１０系列の標準サンプル及び測定試料をアルブミンを洗い流したプレートに注入して抗原抗体反応を行わせる。一定時間後、十分にプレート上の未結合の抗原をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）で洗い流す。洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗体を注入して抗原抗体反応行わせる。洗浄を行い未反応の標識抗体をｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）で洗い流す。ここまで終了した時点で抗原が２つの抗体に挟まれた形でプレートに固定化されている。
【００４６】
次に発色反応をさせるために、酵素層２のグルコースオキシダーゼ、基質層４のグルコース、発色層３のオルトフェニレンジアミンを含有した本実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１をｐＨ５．０のクエン酸緩衝液に溶かして３０分間放置する。このとき溶液中では以下の反応（１）が起こり過酸化水素が発生する。
【００４７】
グルコース＋グルコースオキシダーゼ＋Ｈ２Ｏ→Ｈ２Ｏ２＋グルコノラクトン （１）
３０分後、洗浄を行ったプレートに酵素免疫分析用試薬を溶液したものを定量注入を行い１５分間反応を起こさせる。ここでプレートに固定化されたペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を触媒として以下の反応（２）が起こる。
【００４８】
Ｈ２Ｏ２＋オルトフェニレンジアミン→Ｈ２Ｏ＋オルトニトロアニリン（発色） （２）
１５分後、硫酸を注入して酵素を失活させて反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸収光の測定をおこなう。得られた検量線のデータから線形的に変化している濃度範囲を抜き出して抗原濃度と吸光度の関係から検量線を作成する。測定試料で吸光度が検量線の範囲に入っているものを選んで、検量線の式から逆算して抗原濃度を算出することができる。
【００４９】
尚、以上の手順で未知濃度の試料の抗原濃度の測定を行う。同様に未知濃度の抗体に関しては抗原と抗体を入れ替えて同様の手順で測定することができる。
【００５０】
（実施の形態２）
図２は本発明の実施の形態２の酵素免疫分析試薬の斜視図である。
【００５１】
図２において、５は実施の形態２の酵素免疫分析試薬、６は実施の形態１で形成した３層の試薬の境界に形成されたでんぷん層である。尚、実施の形態１と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
【００５２】
実施の形態２の酵素免疫分析試薬５が酵素層２と発色層３及び発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に設けられたものである。
【００５３】
酵素層２と発色層３又は発色層３と基質層４の間にでんぷん層を挟むことにより、ある程度の吸湿に対する緩衝作用を持ち、吸湿した場合に起こる過酸化水素発生酵素とこの酵素に特異的に反応する基質物の反応を押さえることができる。
【００５４】
実施の形態２の酵素免疫分析試薬５の使用方法は実施の形態１と同様であるので説明を省略する。
【００５５】
なお、以上の説明では、酵素層２と発色層３又は発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍのでんぷん層が設けられた例で説明したが、実施の形態１の酵素免疫分析試薬１の表面にでんぷんのスラリーを塗りかけて膜を形成したものについても同様に実施可能である。
【００５６】
また、以上の説明では、円柱状の酵素免疫分析試薬を用いて説明したが、他の多角柱状、板状、球状のものについても同様に実施可能である。
【００５７】
以上のように本実施の形態によれば、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理することができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供できると共に、抗原濃度又は抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度又は抗体濃度を測定することができる。
【００５８】
【実施例】
次に、本発明の具体例を説明する。
【００５９】
（実施例１）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて酵素免疫分析の確認実験を行った。
【００６０】
測定に使用する緩衝液は、クエン酸一水和物を２１ｇとクエン酸三ナトリウム二水和物２９．４ｇ秤量し、８００ｍｌ程度の蒸留水を加えて溶解した。その後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ５．０になるように調製した。調整後、蒸留水をさらに加えて１ｌにした。
【００６１】
作成したクエン酸緩衝液１０ｍｌに対してオルトフェニレンジアミンを４ｍｇを添加し、グルコースを１ｇ添加して発色溶液（黄色）の調製を行った。なお他の発色溶液の色は次のようになるＡＳＡ（淡黄色）、ＴＭＢ（深緑色）、ＡＢＴＳ（青色）。
【００６２】
作成したクエン酸緩衝液１ｍｌに対して５０００μｇの麹かび由来のグルコースオキシダーゼを添加する。作成したグルコースオキシダーゼ溶液を３００μｌ分注し、同様のクエン酸緩衝液を６００μｌ加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グルコースオキシダーゼ溶液を作成する。
【００６３】
０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。調製した発色溶液を１００μｌ添加する。さらに作成した希釈グルコースオキシダーゼ溶液をそれぞれセルに５０μｌずつ添加する。添加後２分間反応を行い、２Ｎの硫酸５０μｌ添加して反応を停止させ、４９０ｎｍ（ＯＰＤ）の吸光度の測定を行った。なお、他の発色液を使用する場合は４９０ｎｍ（ＡＳＡ）、４５０ｎｍ（ＴＭＢ）、４０５ｎｍ（ＡＢＴＳ）の波長で測定を行う。同様の操作を行い反応時間１０，１５，２０，３０分間について測定を行った。その結果を図３に示す。
【００６４】
図３はグルコースオキシダーゼ濃度と、酵素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミンの発色の関係を示す図である。
【００６５】
図３において、曲線Ａは反応時間３０分間、曲線Ｂは反応時間２０分間、曲線Ｃは反応時間１０分間、曲線Ｄは反応時間５分間の吸光曲線を示している。
【００６６】
図３から明らかなように、グルコースオキシダーゼ量はすべての反応時間において１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲で、高いシグナルを示し、５０μｇ／ｍｌでこの時高感度の測定を可能とすることが分かった。
【００６７】
次に酵素量に対する最適なグルコース量を決定する。まず４ｇのグルコースを蒸留水に溶かして最終的にグルコース溶液を１０ｍｌ作成する。作成したグルコース溶液を１ｍｌ分注し、２ｍｌの蒸留水を加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グルコース溶液を作成する。
【００６８】
測定は、０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を０．００５μｇ／ｍｌ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。前記クエン酸緩衝液１０ｍｌに対してグルコースオキシダーゼを４００μｇ添加し、オルトフェニレンジアミンを４ｍｇ添加して作成した発色液をセルに１００μｌずつ添加する。さらにそれぞれの濃度のグルコース溶液をセルに５０μｌずつ添加して１５分間反応させる。反応終了後２Ｎの硫酸を加えて反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図４に示す。
【００６９】
図４はグルコース濃度と吸光度の関係を表すグラフである。
図４から明らかなように、グルコース量は１μｇ／ｍｌ以上が望ましく、この時高感度の測定を可能とすることが分かった。
【００７０】
次にグルコースオキシダーゼとグルコースの反応により発生する過酸化水素の適量に達する時間の決定を行った。
【００７１】
０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分注する。実施の形態２で作成した発色液を１００μｌ加えて２，５，１０，１５，２０，３０，８０，１７０分間のそれぞれの時間反応させて、反応終了後２Ｎの硫酸を５０μｌ加えて停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図５に示す。
【００７２】
図５はオルトフェニレンジアミンの発色時間と吸光度の関係を表すグラフである。
【００７３】
図５から明らかなように、過酸化水素発生時間は３０分間が望ましく、この時高感度の測定を可能にすることが分かった。
【００７４】
（実施例２）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１を用いて酵素免疫分析の検量線実験を行った。
【００７５】
ペレットの形成はオルトフェニレンジアミン４ｍｇ、グルコース３０ｍｇ、グルコースオキシダーゼ３００μｇのそれぞれの物質について圧縮してペレット状に形成する。そして各ペレットをさらに圧着して１つのペレットに形成したものである。
【００７６】
１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６００μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬１を１錠添加して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定を行った。その結果を図６に示す。
【００７７】
図６は酵素免疫分析用試薬での検量線作成結果を表すグラフである。
図６から明らかなように、０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌの範囲で線形的な変化を示し、この範囲で測定できることが分かった。
【００７８】
（実施例３）
実施の形態１の酵素免疫分析用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の安定性実験を行った。
【００７９】
グルコースとグルコースオキシダーゼが隣り合った酵素免疫分析用試薬と実施の形態１で作成したと酵素免疫分析用試薬１を湿度１００％の容器内で１時間保持して、１週間３℃の冷蔵庫で保管した後に測定に使用した。
【００８０】
１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６００μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬を１錠添加して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定を行った。その結果を図７に示す。
【００８１】
図７は酵素免疫分析用試薬の安定性を比較した結果を表したグラフである。
図７において、曲線Ａはグルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質がある場合、曲線Ｂはグルコースオキシダーゼとグルコースが隣り合っている場合の吸光曲線である。
【００８２】
図７から明らかなように、グルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質を挟むことにより吸湿による劣化を防ぐことができる。また測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用できることが分かった。
【００８３】
（実施例４）
実施の形態２の酵素免疫分析用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の保存安定性実験を行った。
【００８４】
図２に示すように、グルコースオキシダーゼ、グルコース、発色剤の層の間にでんぷん層を挟んだ構造のペレットを形成したものである。グルコースオキシダーゼ、グルコース、発色剤の割合は実施の形態２に示した数値と同様であり、間に挟んだでんぷん層の割合は各層の接着及び吸湿ができればどのような割合でもよい。ここで形成した発色溶液作成試薬を使用して発色溶液を調合し、この発色溶液を用いて測定を行った。なお比較を行うために作成した発色溶液作成試薬を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させたものと、そうでないものを１週間３℃の冷蔵庫で保存した後に使用した。
【００８５】
マイクロプレートに１μｇ／ｍｇのＤｅｒｆＩＩ抗体を５０μｌ注入し、２時間プレートに固定化する。その後洗浄を行い、２％のアルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｂ）を２００μｌ注入して３０分間反応させる。その後、界面活性剤を含んだＰＢＳ−Ｔで洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔに溶かしたＤｅｒｆＩＩ抗原を注入し２時間反応させ、さらに洗浄、そして０．５μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＤｅｒｆＩＩ抗体を５０μｌ添加して反応させる。洗浄後、作成した各発色溶液を１００μｌ添加して１５分間反応させ、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反応を止めて４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果を図８に示す。
【００８６】
図８は本発明の実施の形態２の酵素免疫分析試薬５の保存安定性を比較するグラフである。
【００８７】
図８において、曲線Ａは発色溶液作成試薬を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させたもの、曲線Ｂは全く水を吸湿させてないものを表している。
【００８８】
図８から明らかなように、でんぷんを各層の間に挟むことにより吸湿による劣化を抑えることができ、測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用できることが分かった。
【００８９】
【発明の効果】
以上のように本発明においては、以下の優れた効果を実現できる。
【００９０】
本発明の請求項１に記載の発明によれば、
（１）過酸化水素発生酵素、過酸化水素発生酵素に特異的に反応する基質物、発色物質を１つの錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に抗原濃度又は抗体濃度を測定することができ、酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、吸湿による試薬の変質を抑制することができる。
【００９２】
本発明の請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載の効果に加えて、
（２）酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、危険な過酸化水素を使用せず安定性に優れ、低原価で量産できる。
【００９３】
本発明の請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（３）酵素免疫分析用試薬が各発色物質特有の発色を有することにより、酵素免疫分析の正確性を向上する事ができる。
【００９４】
本発明の請求項４に記載の発明によれば、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（４）酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の劣化を防ぐことができる。
【００９５】
本発明の請求項５に記載の発明によれば、
（５）抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供できる。
【００９６】
本発明の請求項６に記載の発明によれば、
（６）抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとともに、発色物質の生成物の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供できる。
【００９７】
本発明の請求項７に記載の発明によれば、請求項５又は６の内いずれか１項に記載の効果に加えて、
（７）酵素免疫分析用試薬が発色反応の触媒活性を有することができ、酵素免疫分析の感度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１の酵素免疫分析用試薬の斜視図
【図２】本発明の実施の形態２の酵素免疫分析用試薬の斜視図
【図３】グルコースオキシダーゼ濃度と、酵素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミンの発色の関係を示す図
【図４】グルコース濃度と吸光度の関係を表すグラフ
【図５】オルトフェニレンジアミンの発色時間と吸光度の関係を表すグラフ
【図６】酵素免疫分析用試薬での検量線作成結果を表すグラフ
【図７】酵素免疫分析用試薬の安定性を比較した結果を表すグラフ
【図８】実施の形態２の酵素免疫分析試薬の保存安定性を比較するグラフ
【符号の説明】
１ 実施の形態１の酵素免疫分析用試薬
２ 酵素層
３ 発色層
４ 基質層
５ 実施の形態２の酵素免疫分析用試薬
６ でんぷん層
Claims (7)
- 過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有する発色層と、を備えた酵素免疫分析用試薬であって、
前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の間に積層されていることを特徴とする酵素免疫分析用試薬。 - 前記酵素がグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であり、及び／又は前記酵素に特異的に反応する基質物がグルコースであることを特徴とする請求項１に記載の酵素免疫分析用試薬。
- 前記発色物質が、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）の少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬。
- 前記酵素層と前記発色層と前記基質層の間に少なくとも１層のでんぷん層が配設されていることを特徴とする請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬。
- 請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測定することを特徴とする酵素免疫分析方法。
- 請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗原と抗体が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗体濃度を測定することを特徴とする酵素免疫分析方法。
- 前記標識物質がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であることを特徴とする請求項５又は６に記載の酵素免疫分析方法。
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