JP6999158B2 - 分析方法 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 （１）公益社団法人電気化学会発行の「公益社団法人電気化学会第８４回大会講演予稿集」発表番号１Ｑ２９にて、平成２９年３月１７日に公開 （２）公益社団法人電気化学会発行の「２０１７年電気化学秋季大会講演予稿集」発表番号１Ａ１９にて、平成２９年８月２８日に公開 （３）ＭＤＰＩ ＡＧ発行の「Ｅｕｒｏｓｅｎｓｏｒｓ２０１７ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ」Ｖｏｌｕｍｅ１、Ｉｓｓｕｅ４、要旨番号５００番にて、平成２９年９月６日に公開

本発明は、抗原等の生体分子を定量的に検出する分析方法に関する。

抗原の抗原決定基と抗体との特異的結合反応、および抗体または抗原に標識した酵素による呈色反応を組み合わせて用いる免疫学的測定法（イムノアッセイ）の一種として、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ；酵素結合免疫吸着法）が知られている。ＥＬＩＳＡ法では、特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色をシグナルに変換して測定するため、高感度で検出でき、定量性にも優れている。また、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）に比べて安全性が高く、安価で簡便である。そのため、ＥＬＩＳＡ法は、抗体、インフルエンザウイルス、血漿タンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ、ペプチド、リガンドなどの生体関連物質；食品などに含まれる残留農薬や環境ホルモンなどの化学物質；糖尿病、癌などの診断に用いられる血糖、腫瘍マーカーなどの診断用物質など、様々な被験物質の検出や定量に汎用されている。

ＥＬＩＳＡ法は、酵素標識抗体などによって発色した色素を、比色計を用いて分光測定するものであるが、分光測定には回折格子、光学フィルター、高感度検出器など複数の装置が必要であり、装置が大型化し、高価であるという問題がある。

そこで、ＥＬＩＳＡ法に適用可能であり、従来の分光測定法に代替し得る新規な検出技術として、例えば、走査光源による導波管に基づく光学的検出システム（特許文献１）、円盤型分析チップ（特許文献２）、光導波路型抗体チップ（特許文献３）などが提案されている。

特表２０１２－５２５５９５号公報 特開２０１２－２１５５１５号公報 特開２００８－２２４５２４号公報

上述したようにＥＬＩＳＡ法は、抗原抗体反応と標識酵素を利用し、微量の被験物質を定量的に検出、分析可能な手段として極めて有用である。しかし、酵素反応に基づく発色物質の吸光度の測定は、溶媒のｐＨや温度等による影響を受けやすく取扱いが難しいことなどの課題があり、また測定時間が長いという問題を抱えている。

上記の問題は、ＥＬＩＳＡ法などのイムノアッセイに限定されず、酵素反応によって生成する発色物質の吸光度を測定してグルコースなどの被験物質を検出する方法（酵素を用いるという意味で、広義の酵素アッセイに含まれる。）においても同様に見られる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗原等の生体分子を定量的に検出する方法にあたり、該生体分子を迅速且つ感度良く定量的に検出可能な方法を提供することにある。

上記課題を解決し得た本発明の方法は、表面に第１の生体分子が形成されている金ナノ粒子と、前記第１の生体分子と特異的結合をする第２の生体分子を含む溶液とを準備する第１ステップと、前記溶液中で発生する活性酸素種を検出する第２ステップと、を含む点に特徴を有する。

本発明の方法において、前記第１の生体分子が抗体であり、前記第２の生体分子が抗原であることが好ましい。

本発明の方法において、前記抗原が、反応容器に固定されていることが好ましく、また、一部の金ナノ粒子が前記抗原に結合されており、他の一部の金ナノ粒子が前記抗原に結合されておらず、前記第１ステップと前記第２ステップとの間に、前記抗原に結合されていない金ナノ粒子を除去するステップを含むことが好ましい。

本発明の方法において、前記溶液が、アミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を含むことが好ましく、前記化合物が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリ（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルフォン酸から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

本発明の方法において、前記溶液に対する前記化合物の濃度が１ｍＭ以上であることが好ましく、また、前記溶液のｐＨ濃度が８以上であることが好ましい。

本発明の方法において、前記金ナノ粒子の粒径が１ｎｍ以上であることが好ましい。

本発明の方法において、前記第２ステップがルミノールを用いた電気化学発光法により行うことが好ましく、また、ペルオキシダーゼを用いた蛍光法により行うことが好ましい。

また、上記課題を解決し得た本発明の活性酸素種の製造方法は、金ナノ粒子にアミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を混合する点に特徴を有する。

本発明の方法によれば、金ナノ粒子を担体に固定することなく室温、水溶液中で過酸化水素等の活性酸素種を生成し、検出することができることから、被験物質を迅速且つ感度良く定量的に検出することができる。

本発明の実施の形態に係る方法の概要図である。 本発明の実施の形態に係る抗原抗体反応イメージ図である。 本発明の実施の形態に係る電気化学発光法の発光原理と装置の概念図である。 本発明の実施の形態に係る蛍光法の発光原理の概念図である。 本発明の実施の形態に係る金ナノ粒子濃度に伴う電気化学発光強度の経時変化を示した図である。 本発明の実施の形態に係るＴｒｉｓ溶媒濃度に伴う電気化学発光強度の経時変化を示した図である。 本発明の実施の形態に係る溶媒構造の相違による電気化学発光強度の経時変化を示した図である。 本発明の実施の形態に係る種々の溶媒における電気化学発光強度の経時変化を示した図である。 本発明の実施の形態に係る種々の溶媒における電気化学発光強度の経時変化を示した図である。 本発明の実施の形態に係る種々の溶媒のｐＨ濃度相違による電気化学発光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る金ナノ粒子の粒径相違による電気化学発光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る残留酸素による電気化学発光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る窒素置換前後における電気化学発光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る金ナノ粒子の表面状態相違による電気化学発光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る蛍光法を用いた場合の蛍光強度を示した図である。 本発明の実施の形態に係る抗原抗体反応を行った場合の電気化学発光強度を示した図である。

本発明者らは、従来知られている金ナノ粒子の触媒活性に基づき、金ナノ粒子を担体に固定することなく、室温、水溶液中で過酸化水素等の活性酸素種を生成するための反応条件を種々検討した結果、当該水溶液中において時間経過と共に活性酸素種を生成する方法を見出した。また、この触媒反応に関して、活性酸素種が明所、暗所にかかわらず室温状況下で発現することも見出した。これにより、表面に第１の生体分子が形成されている金ナノ粒子と、該第１の生体分子と特異的結合をする第２の生体分子を含む溶液の中で発生する活性酸素種を、該第２の生体分子の量に応じて定量的に検出することが可能となった。本発明の方法により、従来、酵素や蛍光材料等の標識材を用いて生体分析を行っていたものに代わり、金ナノ粒子の触媒活性を活用することが可能となり、例えば蛍光や発光を用いた高感度な分析方法等に用いることができる。

本発明の方法は、表面に第１の生体分子が形成されている金ナノ粒子と、前記第１の生体分子と特異的結合をする第２の生体分子を含む溶液とを準備する第１ステップと、前記溶液中で発生する活性酸素種を検出する第２ステップと、を含む。本発明の方法は、従来のように、金ナノ粒子の触媒活性が担体との相乗効果により出現するものではなく、室温、水溶液中で過酸化水素等の活性酸素種を生成する触媒反応に基づくものである。したがって、従来のように、安定したナノクラスターを生成するための高度な技術を必要としない。具体的には、金ナノ粒子単体の粒径を２ｎｍ程度まで制御する必要がなく、室温、水溶液中で容易に過酸化水素等の活性酸素種を生成することができる。ここで、本明細書で記載する「ナノ粒子」とは、物質をナノメートルのオーダー（１ｎｍ以上１０００ｎｍ未満）の粒子にしたものである。また、本明細書で記載する「活性酸素種」とは、大気中に含まれる酸素分子がより反応性の高い化合物に変化したものの総称であり、一般的に、スーパーオキシドアニオンラジカル(通称スーパーオキシド)、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素の４種類とされるものである。

本発明の活性酸素種の製造方法は、金ナノ粒子にアミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を混合する点に特徴を有する。本発明の製造方法によれば、金ナノ粒子にアミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を混合する操作を行うことにより、比較的容易に活性酸素種を生成することができる。

なお、本発明における第１生体分子と第２生体分子は特異的結合をすることに特徴を有するものであり、第１生体分子と第２生体分子との結合する部位が決まっており、選択的または特異的に高い親和性を発揮するものである。具体的には、例えば、第１生体分子が
抗体、第２生体分子が抗原である抗原－抗体反応を挙げることができる。また、他の例としては、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質等のシグナル物質とその受容体等のような組み合わせで代表される特定の受容体（レセプター）と特異的に結合するリガンド、特定のＤＮＡ－ＤＮＡ、特定のＤＮＡ－ＲＮＡ等がある。本明細書の実施の形態では、第１生体分子として抗体，第２生体分子として抗原を例にして、以下説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。

図１に本発明方法の概要図を示す。本発明の第１ステップでは、表面に第１の生体分子である抗体が形成されている金ナノ粒子と、該第１の生体分子と特異的結合をする第２の生体分子である抗原を含む溶液を準備する。続いて第２ステップでは、第１ステップで準備された金ナノ粒子に前記溶液を加えることで、第１の生体分子と第２の生体分子が特異的結合をする。この特異的結合において前記溶液中で活性酸素種が発生し、第２ステップではこの活性酸素種を検出する。

次に、本発明の方法について、第１の生体分子を抗体、第２の生体分子を抗原とした場合を例にして、抗原抗体反応のイメージ図を用いて詳細に説明する。図２（ａ）～図２（ｆ）は、本発明における抗原抗体反応イメージ図である。図２（ａ）～図２（ｅ）は本発明の第１ステップ、図２（ｆ）は本発明の第２ステップをそれぞれ説明したものである。

図２（ａ）に示すように、反応容器（図示せず）内において磁性粒子１に抗体２を結合させた後、図２（ｂ）に示すように、抗原３を含む溶液を反応容器に加えることで、磁性粒子１の表面に形成された抗体２と抗原３との抗原抗体反応が起こり、該抗体２に該抗原３を結合させる。次に、図２（ｃ）に示すように、抗体２、及び抗原３が結合した磁性粒子１を磁石４により所定の箇所に集めて洗浄する。このようにすることで、抗体２と結合する抗原３のみを残し、磁性粒子１の表面等に付着している抗原３（抗体２と結合しない未反応の抗原３）を除去することができる。次に、図２（ｄ）に示すように、表面に抗体２が形成されている金ナノ粒子５を加える。このようにすることで、金ナノ粒子５の表面に形成された抗体２と、磁性粒子１の表面に形成された抗体２に結合した抗原３との抗原抗体反応が起こり、金ナノ粒子５の表面に形成された抗体２と該抗原３を結合させる。次に、図２（ｅ）に示すように、磁性粒子１、抗原２、金ナノ粒子５を磁石４により所定の箇所に集めて洗浄する。このようにすることで、磁性粒子１の抗体２と結合する抗原３に対して特異的結合する金ナノ粒子５のみを残し、抗原３に対して結合していない余剰の金ナノ粒子５を除去することができる。次に、図２（ｆ）に示すように、金ナノ粒子５に対して電子供与性、及び親水性を付与する溶液６を加えることにより、金ナノ粒子５の表面が電子リッチな状態になり、金ナノ粒子５の触媒作用により活性酸素種の過酸化水素７が発生する。この過酸化水素７に発光物質であるルミノール８を加えると、ルミノール８が励起状態となり、この励起状態から基底状態に戻る際に発光現象が起こる。本発明では、この発光現象に基づき、印刷電極９にルミノール８を滴下して抗原濃度の変化に伴う電気化学発光強度の変化を求めることにより、金ナノ粒子５の触媒活性を用いた抗原抗体反応に要する抗原量を定量することができる。

本発明の実施の形態において、抗原３が反応容器に固定されていることが好ましい。すなわち、本発明において、一部の金ナノ粒子５が容器に固定されている抗原３に結合されており、他の一部の金ナノ粒子５が前記抗原３に結合されておらず、第１ステップと第２ステップとの間に、抗原３に結合されていない金ナノ粒子５を除去するステップを含んでもよい。このように構成することで、抗原３と結合しない余剰の金ナノ粒子５を容器外へ除去して、抗原３と結合する金ナノ粒子５のみを容器内に残し、実際の抗原抗体反応を起こす抗原３の量を定量することができる。抗原３に結合されていない金ナノ粒子５を除去するステップとは、具体的には、溶液６中で浮遊する金ナノ粒子５を洗浄水にて洗浄し、反応容器外に排出するようにすればよい。

また、本発明の実施の形態において、抗体２が二種類存在してもよい。すなわち、本発明において、予め抗原３を捕獲するための抗体（以下、抗体２Ａという）を存在させておき、該抗体２Ａに対して抗原３を添加して抗原抗体反応により該抗体２Ａと該抗原３を結合させ、次に、抗体２Ａとは異なる抗体（以下、抗体２Ｂという）を添加して、前記抗原抗体反応とは異なる部位で反応させてもよい。このようにすることで、抗体２Ａ－抗原３－抗体２Ｂのサンドイッチ構造が形成され、二種類の抗体２Ａ、抗体２Ｂを用いて抗原３を検出することができることから、一種類の抗体２を用いて検出する方法よりも特異性が高くなり、検出感度をより一層向上させることができる。

また、本発明の実施の形態において、磁性粒子１に抗体２を結合させることと、金ナノ粒子５の表面に抗体２を結合させることをそれぞれ並行して行った後、両者を同一の容器に入れて抗原３を加えることで、磁性粒子１に結合した抗体２と抗原３、金ナノ粒子５に結合した抗体２と抗原３の各々の抗原抗体反応を同時に発生させるようにしてもよい。このようにすることで、前記抗原抗体反応に関与しない余剰の抗原３の量を抑えることができ、磁性粒子１の表面等に付着して抗体２と結合しない未反応の抗原３や、抗原３に対して結合していない余剰の金ナノ粒子５を減少させることができる。

以下、本発明の実施の形態に係る各構成要素について説明する。

金ナノ粒子５は、公知のクエン酸還元法により作製することができる。金ナノ粒子５の粒径は、２００ｎｍ以下が好ましく、１５０ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下がよりさらに好ましく、１ｎｍ以上が好ましく、２ｎｍ以上がより好ましく、５ｎｍ以上がよりさらに好ましい、粒径が小さいほど金ナノ粒子５の表面における触媒作用を高めることができ、金ナノ粒子５表面から発生する過酸化水素７の量を増加させることができる。

磁性粒子１は、均一粒子径のポリマーコア粒子に超常磁性体層を導入した構造のものを用いることができる。このような構造のものを用いることで、磁場によるＢ／Ｆ分離［抗原抗体複合体を形成している結合型(Ｂ：Ｂｏｕｎｄ)と抗原抗体複合体を形成していない遊離型(Ｆ：Ｆｒｅｅ)とに分離すること］、及び磁場を取り除いた後の再分散が容易であるという必要性から残留磁気をなくすことができる。

溶液６は、金ナノ粒子５表面より活性酸素種を発生できるものを用いる。具体的には、アミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を含むものを用いることが好ましい。アミノ基及びヒドロキシ基を含むことにより、結果的に、酸素から活性酸素種を生成する触媒活性を発現するための反応場（酸素が結合し、中間状態への安定化と活性酸素種の生成物への変換が行われる場）を提供することができるものと推察される。

本発明の方法に用いることができる溶液６の溶媒の一例を下記［化１］～［化１４］に示す。アミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を含むものとして、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリ（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルフォン酸、グリシン、グリシンアミド、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２メチル－１，３－プロパンジオール、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸、ビス－トリスメタン、ピペラジン－Ｎ，Ｎ―ビス（２－エタンスルフォン酸）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルフォン酸、ビス－トリスプロパン、トリエタノールアミン、２－［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－アミノ］エタンスルフォン酸が良い。特に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Ｔｒｉｓという）、トリ（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（以下、Ｔｒｉｃｉｎｅという）、及びトリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルフォン酸（以下
、ＴＡＰＳという）から選択される少なくとも１つを用いることがより好ましい。

溶液６に対する化合物の濃度は１ｍＭ以上であることが好ましく、５ｍＭ以上であることがより好ましく、１０ｍＭ以上であることがさらに好ましく、５０ｍＭ以上であることがよりさらに好ましい。当該濃度が１ｍＭ以上であれば、時間経過に伴う活性酸素種の発生量を増加させることができる。

溶液６のｐＨ濃度は８以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１２以上であることがさらに好ましい。溶液のｐＨ濃度が大きいほど活性酸素種の発生量を増加させることができる。

第２ステップにおいて、溶液６で発生する過酸化水素７を検出する方法として、ルミノールを用いた電気化学発光法や、ペルオキシダーゼを用いた蛍光法が好ましい。

図３に電気化学発光法の発光原理と装置の概念図を示す。図３（ａ）は全体図、図３（ｂ）は、（ａ）の点線部の拡大図である。電気化学発光法は電圧を印可することで酸化されたルミノールが過酸化水素等の活性酸素種と化学反応し、励起状態から基底状態に戻る際に発光する光をコンピュータに接続した光増幅器（フォトマルチプライヤーチューブ）で測定を行う方法である。この方法は、高い感度や実用性などに加え電極に印刷電極を用いることで少量のサンプルで計測が可能になるという利点を有する。

図４に、蛍光法の発光原理を示す。蛍光法は、過酸化水素存在下でＡｍｐｌｉｔｅ（基質）がペルオキシダーゼ（酵素）によって酵素反応し、この酵素反応後のＡｍｐｌｉｔｅ ^ＴＭ Ｒｅｄに５４０ｎｍの光を照射すると５９０ｎｍの蛍光を発することを利用して、この蛍光値を測定するものである。当該蛍光値により、物質内に過酸化水素がどの程度含まれているかがわかる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

（金ナノ粒子の作製）
濃度４０ｍＭのクエン酸５０ｍＬを７０℃に加熱し、この水溶液が０．２ｍＭとなるように調製した塩化金酸を加え、１０分間激しく攪拌して赤紫色の金コロイドを作製した。その後、遠心分離と蒸留水での洗浄を３回繰り返し、加熱炉で焼成することにより金ナノ粒子を作製した。なお、金ナノ粒子は上記クエン酸還元法により作製したもの以外に、市販の１５ｎｍ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、市販の５ｎｍ、１５ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ、及び１００ｎｍ（いずれも田中貴金属製）を用いた。

（トリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液の調製）
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）溶液は、所定のｐＨとなるように、蒸留水、塩酸（場合によって水酸化ナトリウム）の量により調製した。表１に、濃度１ＭのＴｒｉｓ溶液１Ｌの構成を示す。

（ルミノールの作製方法）
常温固体のルミノール（Ｗａｋｏ社製）１７．７１６ｍｇを０．１Ｍ－ＮａＯＨに溶解し、濃度１０ｍＭルミノールを作製した。その後、１ｍＬずつ分注し、－２０℃で冷凍保存した。電気化学発光確認時には、上記で冷凍した１０ｍＭ－ルミノールを解凍後、２００ｍＭ－Ｔｒｉｓ緩衝液、もしくは２００ｍＬ－ｂｏｒａｔｅ緩衝液で希釈し、０．２ｍＭ－ルミノールに調整後、発光試薬として用いた。

（電気化学発光法による測定）
印可電圧は、０～７００ｍＶの間を５０ｍＶずつ線形的に上げていくｌｉｎｅａｒ ｓｗｅｅｐ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ（ＬＳＶ）という方法を用いた。また、電気化学発光測定時はｐＨ８に揃え、発光は５００ｍｓｅｃに１回毎に光検出器でカウントした。

（蛍光法による測定）
蛍光試薬キットの指示通りに２０Ｕ／ｍｌ－ＨＲＰ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ、Ａｍｐｌｉｔｅ ｒｅｄ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｔｕｉｏｎを５０μＬ、アッセイバッファーを４．７５ｍＬ混合し、蛍光用試薬を作製した。９６ウェルのプレートリーダーに濃度５６ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を２５μＬと、濃度１ｍＭ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＰＢＳを２５μＬずつ加えた。その後、上記のサンプルに蛍光試薬（Ａｍｐｌｉｔｅ^ＴＭ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ^＊Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ^＊、－（－），ＡＢＤ社製）を５０μＬ加え、蛍光測定器で測定を行う。測定条件は、５４０ｎｍの光をあて、５９０ｎｍの光を測定するものである。一つの条件に対して３サンプルずつ用意し、測定を行った。

（基礎実験用サンプルの調製方法と測定・解析方法）
金ナノ粒子分散液５００μＬをＴｒｉｓなどの溶媒５００μＬに加えた後、数分待機し、金ナノ粒子から活性酸素種を生成させた。その後、この金ナノ粒子サンプル１００μＬに濃度０．２ｍＭのルミノール１００μＬを加え、電極上に２０μＬ滴下し、電気化学発光測定を行った。１サンプルにつき３回ずつ測定を行いＥＣＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）グラフが得られ、得られたグラフのピーク値をプロットし、解析した。

（抗原抗体反応用サンプルの調製方法）
（ａ）金ナノ粒子表面の抗体固定
濃度４０ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子（粒径１５ｎｍ）分散液１０ｍＬに、濃度１ｍｇ／ｍＬのＩｇＡ抗体（Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｕｆｉｅｄ、ＢＥＴ社製）１００μＬを加えて１日放置し、遠心分離後、濃度２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。その後、１．５ｍＬに濃縮して４℃に保存することによりＩｇＡ抗体を固定した。なお、遠心分離条件は、１５０００ｒｐｍ、３０分である。
（ｂ）磁性粒子の抗体固定
濃度２０ｍｇ／ｍＬの磁性粒子（粒径１８０ｎｍ±３０ｎｍ、ＮＨＳビーズ：多摩川精機製）の分散液２５０μＬに、濃度１ｍｇ／ｍＬのＩｇＡ抗体２５０μＬと濃度２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬを加えて１日放置し、遠心分離後、濃度２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１．５ｍＬに濃縮した。なお、遠心分離条件は、１２０００ｒｐｍ、１０分である。続いて、１Ｍのアミノエタノール２００μＬを加え一晩放置した後、遠心分離後、濃度２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、３ｍＬに希釈して４℃に保存してＩｇＡ抗体を固定した。なお、遠心分離条件は、１２０００ｒｐｍ、１０分である。

以下、実験例１～実験例９は金ナノ粒子の触媒機構確認のための基礎実験例であり、実施例１～実施例２は抗原抗体反応による実施例である。

（実験例１）
（金ナノ粒子の濃度に伴う電気化学発光強度への影響）
濃度が０．５６ｍｇ／Ｌ、５．６ｍｇ／Ｌ、５６ｍｇ／Ｌの各金ナノ粒子の分散液５００μＬに、それぞれ２００ｍＭ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を５００μＬ加え、Ｔｒｉｓを加えた時間から０分後、１５分後、３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを濃度０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。なお、金ナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。

図５に、各金ナノ粒子の電気化学発光強度の経時変化を示す。図５に示すように、金ナノ粒子の濃度が大きいほど電気化学発光強度が増加することが確認された。

（実験例２）
（Ｔｒｉｓ溶媒濃度に伴う電気化学発光強度への影響）
濃度５６ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子の分散液５００μＬに、０．０１ｍＭ－Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ－Ｔｒｉｓ、１ｍＭ－Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ－Ｔｒｉｓを５００μＬそれぞれ加えた後（Ｔｒｉｓは全てｐＨ８を使用）、Ｔｒｉｓを加えた時間から０分後、３０分後、６０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを濃度０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。なお、金ナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。

図６に、各Ｔｒｉｓ溶媒濃度における電気化学発光強度の経時変化を示す。図６に示すように、Ｔｒｉｓ溶媒濃度が大きいほど、電気化学発光強度が増大する傾向にあることが
わかった。

（実験例３）
（金ナノ粒子の溶媒種に伴う電気化学発光強度への影響１）
Ｔｒｉｓと類似の構造を持つ溶媒を２種用いて、金ナノ粒子から活性酸素種が生成されるかどうか検討した。なお、Ｔｒｉｓと類似の構造を持つ溶媒は、ヒドロキシ基のみを有する１，１，１－トリスエタン、アミノ基のみを有する２－アミノ－２メチルプロパンを用いた。［化１５］に１，１，１－トリスエタン、［化１６］に２－アミノ－２メチルプロパンの溶媒構造図を示す。金ナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。まず、濃度５６ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子の分散液５００μＬに、１ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭの１，１，１－トリスエタン、１ｍＭの２－アミノ－２メチルプロパンをそれぞれ加えた後、Ｔｒｉｓ等を加えた時間から０分後、１５分後、３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを濃度０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。なお、比較実験として、アミノ基を有する化合物とヒドロキシ基を有する化合物を混合した溶媒を使用した場合の効果を確認するため、１ｍＭの１，１，１－トリスエタンと１ｍＭの２－アミノ－２メチルプロパンを混合した溶媒について、上記と同様の方法で電気化学発光測定を行った。

図７に、各溶媒における電気化学発光強度の経時変化を示す。図７に示すように、アミノ基とヒドロキシ基の両方の構造を持つＴｒｉｓ溶媒のみに電気化学発光強度の増加が認められ、アミノ基とヒドロキシ基の構造が活性酸素種の生成に寄与しているのが示唆された。なお、上記アミノ基及びヒドロキシ基のうち一方のみの基を有する化合物を含む溶媒や、両者を単純に混合した溶媒では電気化学発光強度の増加は確認されなかった。

（実験例４）
（金ナノ粒子の溶媒種に伴う電気化学発光強度への影響２）
アミノ基とヒドロキシ基の構造が金ナノ粒子からの活性酸素種生成に関連していることをさらに調べるために上記の構造を有するＴｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳと、上記の構造を有さないＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ｂｏｒａｔｅ、ＫＣｌの６種類の溶媒で検討した。この６種類は緩衝液として一般的に用いられるものである。なお、金ナノ粒子には１５ｎｍ金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。

まず、濃度５６ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子の分散液５００μＬに濃度１００ｍＭのＴｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＰＢＳ、ｂｏｒａｔｅ、ＫＣｌをそれぞれ５００μＬ加えた後、Ｔｒｉｓなどの溶媒を加えた時間から０分後、１０分後、２０分後、３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。

図８に、各溶媒における電気化学発光強度の経時変化を示す。図８に示すように、アミノ基とヒドロキシ基の両方の構造を持つＴｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳのみ時間変化に伴う電気化学発光強度の増加が確認され、アミノ基とヒドロキ基の構造が活性酸素種の生成に寄与しているのが示唆された。

（実験例５）
（金ナノ粒子の溶媒種に伴う電気化学発光強度への影響３）
アミノ基とヒドロキシ基の構造が金ナノ粒子からの活性酸素種生成に関連していることをさらに調べるために、Ｔｒｉｓと類似する構造を有する７種類の溶媒について検討した。この７種類は、［化６］の２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール（以下、ＡＭＰという）、［化７］の２－アミノ－２メチル－１，３－プロパンジオール（以下、ＡＭＰＤという）、［化１３］のトリエタノールアミン（以下、ＴＥＡという）、［化１１］のビス－トリスメタン、［化１２］のビス－トリスプロパン、［化８］の４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）、［化１０］の及び４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＰＳという）である。

まず、５ｎｍ金ナノ粒子（田中貴金属製）濃度０．０４ｍｇ／ｍＬと溶液（１００ｍＭ、ｐＨ１２）を１：１の割合で混合した後、０分後、１０分後、２０分後にルミノール（２００μＭ、ｐＨ９のホウ酸緩衝液で希釈）と１：１の割合で混合して電気化学発光強度測定を行った。

図９に、各溶媒における電気化学発光強度の経時変化を示す。図９に示すように、アミノ基とヒドロキシ基の両方の構造を持つ上記７種類の溶媒全てにおいて、経時変化に伴う電気化学発光の増幅が確認された。

（実験例６）
（溶媒のｐＨの違いに伴う電気化学発光強度への影響）
金ナノ粒子から生成される活性酸素種量についてのＴｒｉｓ溶媒のｐＨ依存性を調べた。なお、金ナノ粒子には３０ｎｍ金ナノ粒子（田中貴金属製）を用いた。

まず、濃度４０ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子の分散液５００μＬに、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９、ｐＨ１０、ｐＨ１１、ｐＨ１２の２００ｍＭ濃度のＴｒｉｓ５００μＬをそれぞれ加えた後、Ｔｒｉｓ溶媒を加えた時間から１０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬ（ｐＨ８のｂｏｒａｔｅ緩衝液で希釈）と混合し、電気化学発光測定を行った。

図１０に各溶媒のｐＨにおける電気化学発光強度の値を示す。図９に示すように、溶媒のｐＨ濃度が大きいほど、電気化学発光強度の値が増加することが確認された。

（実験例７）
（金ナノ粒子の粒子径に伴う電気化学発光強度への影響）
金ナノ粒子の粒径と発光強度の関係を調べた。なお、金ナノ粒子は５ｎｍ、１５ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ（田中貴金属製）を用いた。

まず、濃度４０ｍｇ／Ｌの各金ナノ粒子の分散液５００μＬに、それぞれ濃度２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を５００μＬ加えた後、溶媒を加えた時間から３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを濃度０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。

図１１に各金ナノ粒子における電気化学発光強度の値を示す。図１１に示すように、金ナノ粒子の粒径が小さくなるほど電気化学発光強度が大きくなる傾向が確認された。

（実験例８）
（溶存酸素による電気化学発光強度への影響）
金ナノ粒子からの活性酸素種生成における溶存酸素の影響について調べるために窒素置換を行いながら測定した。なお、金ナノ粒子は１５ｎｍ（田中貴金属製）を用いた。

まず、濃度４０ｍｇ／Ｌの金ナノ粒子の分散液５００μＬに濃度１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を５００μＬ加えた後、同サンプルを２つ調製し、片方は窒素置換を行いながら、０分後、１０分後、２０分後、３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬと混合し、電気化学発光測定を行った。

図１２に、窒素置換に伴う電気化学発光強度の経時変化、図１３に、窒素置換前後における電気化学発光強度の経時変化を示す。図１２に示すように、窒素置換を行わない場合、時間の経過と共に電気化学発光強度の増加が認められた。一方、窒素置換を行った場合、電気化学発光強度の増加は確認されなかった。また、図１３に示すように、３０経過時点で窒素置換を中止し、さらに時間を置くと電気化学発光強度の増加が確認された。以上の結果より、金ナノ粒子からの活性酸素種の生成には溶存酸素が必要であることが示唆された。

（実験例９）
（金ナノ粒子表面状態による電気化学発光強度への影響）
金ナノ粒子の表面をＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ウシ血清アルブミン）でブロッキングすることにより、金ナノ粒子表面状態による電気化学発光強度への影響を調べた。なお、金ナノ粒子はクエン酸還元法によって作製したものを用いた。

まず、濃度１ｍｇ／ｍＬの金ナノ粒子の分散液１０ｍＬに濃度が０ｍｇ／Ｌ、０．６６ｍｇ／Ｌ、６６ｍｇ／Ｌ、６６００ｍｇ／ｍＬとなるようＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製、分子量～６６００）を加え、４℃で１時間置き、金ナノ粒子の表面をＢＳＡでブロッキングした。その後、遠心分離と洗浄を３回繰り返し、ＢＳＡブロッキングした金ナノ粒子を作製した。この作製したＢＳＡブロッキング金ナノ粒子５００μＬに２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を５００μＬ加えた後、Ｔｒｉｓ等の溶媒を加えた時間から０分後、１５分後、３０分後の金ナノ粒子サンプル１００μＬを０．２ｍＭ－ルミノール１００μＬをと混合し、電気化学発光測定を行った。

図１４にＢＳＡ濃度による電気化学発光強度の値を示す。図１４に示すように、ＢＳＡ
の濃度が大きいほど電気化学発光強度の値の上昇が小さくなり、金ナノ粒子の表面を覆うと電気化学発光強度の値が下がることが確認された。この結果から、金ナノ粒子の表面で活性酸素種が生成されていることが示唆された。

（実験例１０）
（ペルオキシダーゼを用いた蛍光法による活性酸素種の検出）
電気化学発光法以外の活性酸素種の検出方法として、蛍光法を用いて確認した。図１５に各溶媒における金ナノ粒子からの活性酸素種生成に伴う蛍光強度の値を示す。図１５に示すように、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳと金ナノ粒子の混合液において、蛍光強度値の増加が確認され、ルミノールを用いた電気化学発光法による結果と同様であった。この結果より、活性酸素種の検出としてルミノールを用いた電気化学発光法と同様に、ペルオキシダーゼを用いた蛍光法が有用であることがわかった。

（実施例１）
（抗原抗体反応における金ナノ粒子の活性酸素種の検出）
抗体固定した磁性粒子（ＮＨＳビーズ、多摩川精機製）９０μＬに抗原（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ、ＡＲＴ社製）を濃度が０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬをそれぞれ１０μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。次に、磁性粒子を磁石で集めて２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、抗体固定後の金ナノ粒子を２００μＬ加えた。続いて、磁性粒子、抗原、金ナノ粒子を磁石で集めて２００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１２）を２００μＬ加え、１５分放置した。次に、Ｔｒｉｓを加えた後のサンプル１００μＬにルミノール１００μＬを加え、このうち２０μＬを電極に滴下して電気化学発光測定を行った。

図１６に各ＩｇＡ抗原濃度における電気化学発光強度の値を示す。図１６に示すように、抗原抗体反応において１ｎｇ／ｍＬのＩｇＡ抗原濃度のレベルまで電気化学発光強度を検出できることが確認できた。この結果より、抗原抗体反応に用いるバイオセンサへの適用の有用性が示唆された。

（実施例２）
（ＥＭ－ＣＣＤカメラによる発光測定）
電気化学発光強度の測定について、光増幅器（フォトマルチプライヤーチューブ）の代わりにＥＭ－ＣＣＤカメラを用いて測定を行い、測定方法の違いによる影響を検討した。実施例１と同様の方法で、濃度１０μｇ／ｍＬの抗原で抗原抗体反応を行った後のサンプルからの発光をＥＭ－ＣＣＤカメラによって測定した。その結果、金ナノ粒子の存在する部分でのみ発光が確認された。この結果より、ＥＭ－ＣＣＤカメラによる発光測定も有効であることが確認され、この技術を生体イメージング等の検査技術にも応用可能なことが示唆された。

１ 磁性粒子
２ 抗体
３ 抗原
４ 磁石
５ 金ナノ粒子
６ 溶液
７ 過酸化水素
８ ルミノール
９ 印刷電極

Claims (11)

1. 生体分子を定量的に検出する方法であって、
   表面に第１の生体分子が形成されている金ナノ粒子と、第２の生体分子と、アミノ基およびヒドロキシ基を有する化合物とを含む溶液を準備する第１ステップと、ここで、前記第２の生体分子は、前記第１の生体分子と特異的結合をするものであり且つ定量的に検出すべきものであり、
   前記溶液中で発生する活性酸素種を検出することにより、前記第２の生体分子を定量的に検出する第２ステップと、を含むことを特徴とする方法。
2. 前記第１の生体分子が抗体であり、前記第２の生体分子が抗原である請求項１に記載の方法。
3. 前記抗原が、反応容器に固定されている請求項２に記載の方法。
4. 一部の金ナノ粒子が前記抗原に結合されており、他の一部の金ナノ粒子が前記抗原に結合されておらず、
   前記第１ステップと前記第２ステップとの間に、前記抗原に結合されていない金ナノ粒子を除去するステップを含む請求項２または３に記載の方法。
5. 前記化合物が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリ（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルフォン酸から選択される少なくとも１つである請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. 前記溶液に対する前記化合物の濃度が１ｍＭ以上である請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 前記溶液のｐＨ濃度が８以上である請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記金ナノ粒子の粒径が１ｎｍ以上である請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. 前記第２ステップがルミノールを用いた電気化学発光法により行う請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. 前記第２ステップがペルオキシダーゼを用いた蛍光法により行う請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 水溶液中、金ナノ粒子にアミノ基及びヒドロキシ基を有する化合物を混合することを特徴とする活性酸素種の製造方法。

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