JP2020186971A - 微小物質検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プローブ分子が表面に固定された粒子を反応空間に均一に分布させて、微小物質の検出精度を高めることのできる微小物質検出方法を提供する。【解決手段】常磁性体を含む第一溶液に反磁性粒子２２を加えた反磁性粒子含有溶液を検出部１に添加する第一溶液添加工程と、第一溶液添加工程の後、第一溶液よりも常磁性体の濃度が高い第二溶液を検出部１に添加する第二溶液添加工程と、微小物質を含む検体溶液を検出部１に添加する微小物質添加工程と、電極１３から出力される電気信号に基づいて微小物質を検出する検出工程と、を備えている。【選択図】図４

Description

本発明は、検出対象となる微小物質と反磁性粒子の表面に固定されたプローブ分子との反応によって発生する電気信号を検知して微小物質を検出する微小物質検出方法に関する。

従来、検体溶液中の生体分子（微小物質の一例）を検出する方法として、電気化学測定方法が用いられている（例えば、特許文献１〜３参照）。この電気化学測定方法として、特許文献１に記載のように生体分子をセンシング部に接触させて電位変化を検出する方法や、特許文献２〜３に記載のように生体分子とプローブ分子との反応によって検体溶液に含まれる酸化還元物質を化学変化させて酸化還元電位を検出する方法が知られている。

特許文献１に記載の微小物質検出方法は、イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）のセンシング部（イオン感応膜）に凹部を形成すると共にＩＳＦＥＴの背面に磁石を配置し、抗体が表面に固定された磁性粒子を該凹部に吸引している。この状態でＩＳＦＥＴを検体溶液に浸漬して生体分子を抗体に結合させ、センシング部の電位変化を検出するものである。

特許文献２に記載の微小物質検出方法は、各検知電極が格子状の隔壁で区画された相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）で構成される複数のセンサセルに、生体分子を含む検体溶液とプローブ分子（特定分子とのみ反応する分子）が表面に固定された磁性粒子とを導入し、生体分子とプローブ分子との酵素反応による酸化物と還元物との濃度比を表す酸化還元電位を検知電極で検知するものである。

特許文献３に記載の微小物質検出方法は、各検知電極の周囲に磁性体を配置すると共に検知電極の背面に磁石を配置した相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）で構成される複数のセンサセルに、生体分子を含む検体溶液とプローブ分子が表面に固定された反磁性粒子とを導入して酸化還元電位を検知するものである。この微小物質検出方法は、検知電極の背面に磁石を配置することにより、磁石から発生する磁束を磁性体が配置される検知電極の周囲に流し、検知電極の中央部に形成された磁束密度の低い領域に反磁性粒子を接近させるものである。

特開２０１４−２３２０３２号公報 特開２０１５−２１０２３３号公報 特開２０１８−４０５８０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の微小物質検出方法にあっては、磁性粒子を磁石で強制的に吸引する構成であるため、センシング部の凹部に磁性粒子が密集したり、磁性粒子が凹部からはみ出して無秩序に積層したりするおそれがある。その結果、生体分子が固定された磁性粒子がセンシング部に適切に接触できないおそれがあり、センシング部の検出精度が低下する。これを防止するため、凹部の上面をスクレイプするとの記載もあるが、検出方法が煩雑化してしまう。

特許文献２〜３に記載の微小物質検出方法は、検体溶液に含まれる酸化還元物質を化学変化させて酸化還元電位を検出するので、特許文献１に記載のように生体分子とセンシング部とを接触させなくても良く、検出方法が簡便なものである。一方、格子状の隔壁で囲まれる反応空間に粒子を収容して、生体分子とプローブ分子との酵素反応を行わせる構成上、該反応空間に粒子を均一に収容することが重要となる。

しかしながら、特許文献２には磁性粒子を反応空間に収容する方法が開示されておらず、例えば特許文献１に記載のように単に磁性粒子を磁石で吸引する構成を採用したとしても、上述した理由によって反応空間に磁性粒子を均一に収容することはできない。しかも、反応空間に収容される前に磁性粒子が凝集してしまい、反応空間よりも磁性粒子の凝集体の容積が大きくなって磁性粒子が収容されないおそれがある。その結果、生体分子検出装置の検出精度が低下してしまう。

一方、特許文献３に記載の微小物質検出方法は、各検知電極の周囲に磁性体を配置すると共に検知電極の背面に磁石を配置することにより、検知電極の中央部に形成された磁束密度の低い領域に反磁性粒子を接近させることが可能であるが、全ての反応空間に反磁性粒子を均一に収容する上で改善の余地があった。

そこで、プローブ分子が表面に固定された反磁性粒子を反応空間に均一に分布させて、微小物質の検出精度を高めることのできる微小物質検出方法が望まれている。

本発明に係る微小物質検出方法の特徴は、検出対象となる微小物質と反磁性粒子の表面に固定されたプローブ分子との反応によって発生する電気信号を検知する電極と当該電極の周囲に配置される磁性体とを有する検出部と、当該検出部の背面に配置される磁石とを備えた微小物質検出装置を用いた微小物質検出方法であって、常磁性体を含む第一溶液に前記反磁性粒子を加えた反磁性粒子含有溶液を前記検出部に添加する第一溶液添加工程と、前記第一溶液添加工程の後、前記第一溶液よりも前記常磁性体の濃度が高い第二溶液を前記検出部に添加する第二溶液添加工程と、前記微小物質を含む検体溶液を前記検出部に添加する微小物質添加工程と、前記電極から出力される電気信号に基づいて前記微小物質を検出する検出工程と、を備えた点にある。

上記微小物質検出装置のように、電極の周囲に磁性体を配置し、検出部の背面に磁石を配置すれば、磁石から発生する磁束は磁性体が配置される電極の周囲に流れ、電極の中央部に磁束密度の低い領域が形成される。本方法では、常磁性体を含む第一溶液に反磁性粒子を加えた反磁性粒子含有溶液を検出部に添加しているので、反磁性粒子は磁束密度の低い電極の中央部に向かって流動し、次第に電極に接近することとなり、磁束に囲まれた磁束密度の低い領域にトラップされた状態となる。

次いで、本方法のように第一溶液よりも常磁性体の濃度が高い第二溶液を添加すれば、溶液中を浮遊している反磁性粒子には、反磁性粒子の磁化率（マイナス）と常磁性体の磁化率（プラス）との差に基づく上向きの磁力と、反磁性粒子の密度と第二溶液の密度との差に基づく下向きの重力と、が作用する。第二溶液の常磁性体の濃度が高いことから上向きの磁力が大きくなると共に下向きの重力が小さくなり、溶液中を浮遊している反磁性粒子が電極から次第に離れていく。これにより、電極の中央部にトラップされている反磁性粒子と、溶液中に浮遊している反磁性粒子とが明確に区分される。これにより、検出工程において、磁性体に囲まれた電極の中央部に形成される反応空間に反磁性粒子を均一に分布させることが可能となり、微小物質の検出精度を高めることができる。

他の特徴は、前記第二溶液添加工程により浮上した前記反磁性粒子を除去する除去工程をさらに備え、前記除去工程の後に前記微小物質添加工程を実行する点にある。

本方法のように、電極から離れるように浮上した反磁性粒子を除去すれば、電極の中央部（反応空間）にトラップされた反磁性粒子のみとなる。そして、微小物質を含む検体溶液を添加すれば、検体溶液に含まれる微小物質は、反応空間にある反磁性粒子のプローブ分子と反応して、電気信号を確実に検出することができる。

他の特徴は、前記第一溶液と前記第二溶液とが混合されて濃度勾配がなくなった条件下で、前記磁石と前記反磁性粒子との距離が所定の距離にあるとき、前記磁石により前記反磁性粒子に作用する磁力と前記反磁性粒子に作用する重力との合計が重力方向とは反対方向の力となるように前記第一溶液と前記第二溶液との濃度を設定する点にある。

本方法のように第一溶液と第二溶液との濃度勾配がなくなった条件下で、磁石に対して所定の距離にある反磁性粒子に上向きの力を作用させれば、電極の中央部にトラップされる反磁性粒子と、溶液中に浮遊している反磁性粒子とを明確に区分することができる。その結果、プローブ分子が表面に固定された反磁性粒子を反応空間に均一に分布させることができる。

他の特徴は、前記第一溶液と前記第二溶液とが混合されて前記常磁性体の濃度勾配がなくなった混合溶液の濃度は、０．１ｍоｌ／Ｌ以上０．２ｍоｌ／Ｌ以下である点にある。

本方法のように混合溶液の濃度を所定値に設定すれば、第一溶液と第二溶液の濃度設定が容易である。この混合溶液の濃度を０．１ｍоｌ／Ｌ以上に設定すれば、浮遊している反磁性粒子に上向きの力を確実に作用させ、０．２ｍоｌ／Ｌ以下に設定すれば、電極の中央部にトラップされている反磁性粒子に下向きの力を確実に作用させることができる。

他の特徴は、前記第一溶液及び前記第二溶液は、フェリシアン化カリウムを含む溶液であり、前記磁石はハルバッハ配列磁石である点にある。

本方法のように、第一溶液及び第二溶液をフェリシアン化カリウム溶液とし、ハルバッハ配列磁石のように磁気勾配の大きい磁石を用いれば、電極の中央部にトラップされる反磁性粒子と、溶液中に浮遊している反磁性粒子とを明確に区分することができる。その結果、プローブ分子が表面に固定された反磁性粒子を反応空間に均一に分布させることができる。

微小物質検出装置の概略斜視図である。 微小物質検出装置のセンサセルの概略断面図である。 センサセルでの磁束の流れを示す概略説明図である。 微小物質検出方法を示す概念図である。 磁束密度と磁石からの水平方向距離との関係を示す説明図である。 異なる磁石による磁束密度を示す説明図である。 反磁性粒子に作用する磁力と重力との関係を示す説明図である。 混合溶液の濃度と反磁性粒子に作用する力との関係を示す説明図である。 本実施例における反磁性粒子の配列状態を示す拡大写真である。 比較例における反磁性粒子の配列状態を示す拡大写真である。

以下に、本発明に係る微小物質検出装置を用いた微小物質検出方法の実施形態について、図面に基づいて説明する。本実施形態では、プローブ分子２１が固定された反磁性粒子２２を用いた酸化還元電位検出型ＣＭＯＳセンサアレイによって生体分子（微小物質の一例）を検出する一例を説明する。ただし、以下の実施形態に限定されることなく、その要旨を逸脱しない範囲内で種々の変形が可能である。なお、以下の説明において、重力方向を下、重力方向とは反対方向を上として説明する。

［微小物質検出装置］
図１には、本実施形態に係る微小物質検出装置Ａの概略斜視図が示される。また、図２には、微小物質検出装置ＡのセンサセルＣＥの概略断面図が示される。図１に示すように、ＣＭＯＳ集積回路基板１０には、制御信号線である複数本のワード線Ｗおよびビット線Ｂの各交点に配置された複数のセンサセルＣＥが、マトリックス状に配置されている。本実施形態のＣＭＯＳ集積回路基板１０は、６４×６４のセンサセルＣＥで構成されている。

ＣＭＯＳ集積回路基板１０には、電源装置から夫々のセンサセルＣＥに送信されるパルス信号を制御する制御部１１と、センサセルＣＥから出力される酸化還元電位を演算する演算部１２とが接続されている。これら制御部１１や演算部１２は、各種処理を実行するＣＰＵやメモリを中核としたハードウェア、ソフトウェア、又はハードウェアとソフトウェアとの協働により構成されている。

制御部１１は、一定周波数のクロック信号を発生するクロック回路、クロック信号に同期して所定のパルス信号を発生させるパルス信号発生器、および夫々のワード線Ｗに選択的にパルス信号を出力するデコーダを有している。演算部１２は、センサセルＣＥのビット線Ｂから出力されたデジタル信号のパルス幅に基づいて酸化還元電位を換算し、検体溶液Ｋに含まれる生体分子Ｓの量を演算する（図２も参照）。

図１〜図２に示すように、微小物質検出装置Ａは、収容部２と、収容部２の底部に配置される検出部１と、検出部１の背面に配置される磁石３とを備えている。

収容部２は、生体分子Ｓを含む検体溶液Ｋとプローブ分子２１が表面に固定された反磁性粒子２２とを収容可能に構成されている。この収容部２は、検出部１を囲む側壁部２３と蓋部材２４とを備えており、これら検出部１、側壁部２３および蓋部材２４で区画される空間に検体溶液Ｋおよび反磁性粒子２２が収容される。側壁部２３や蓋部材２４は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などが加硫されたシリコンゴムで構成されている。また、本実施形態の収容部２は、夫々のセンサセルＣＥを区画するように所定の間隔を保った隔壁２５を有している。隔壁２５は、エポキシ樹脂であるＳＵ−８などのネガティブフォトレジストで構成されている。なお、隔壁２５を省略しても良い。

蓋部材２４には、反磁性粒子２２を混合した検体溶液Ｋがシリンジ（不図示）などを用いて収容部２の収容空間に注液される注液口２６と、測定後の検体溶液Ｋを排出させる排出口２７とが設けられている。検出部１で生体分子Ｓの量を検出する直前に注液口２６から反磁性粒子２２を混合した検体溶液Ｋを注液し、検出部１で生体分子Ｓの量を検出する際は注液を停止する。そして、生体分子Ｓの検出が終了すると、検体溶液Ｋを排出口２７から排出させ、生体分子Ｓが固定された反磁性粒子２２を回収して再利用する。

生体分子Ｓは、糖、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質などで構成されている。プローブ分子２１は、酸化還元反応を触媒する分子であり、特定の生体分子Ｓと反応する酵素、ペプチド、抗体などで構成されている。検体溶液Ｋは、常磁性体を含む溶液で構成されており、常磁性体を含む溶液としてフェリシアン化カリウム、硫酸銅又は塩化マンガンを含む溶液、液体酸素等が挙げられる。また、検体溶液Ｋは、特定の生体分子Ｓとプローブ分子２１との反応に応じて電子の移動等が行われる酸化還元物質を含む溶液で構成されている。なお、反磁性粒子２２は、磁束密度の低い部分に吸着されるビーズであれば特に限定されず、例えばポリスチレン粒子で構成されている。

例えば、プローブ分子２１としてＨＫ（ヘキソキナーゼ）、Ｇ６ＰＤＨ（グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ）、Ｄｉａｐｈоｒａｓｅ（ディアフォラーゼ）の３種類の酵素を用い、酸化還元物質としてへキサシアノ鉄（III）酸イオンを含む検体溶液Ｋ（フェリシアン化カリウムをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させた溶液）に生体分子Ｓとしてのグルコースを混合させた場合、ヘキソキナーゼ法（ＨＫ法）の反応系によって、へキサシアノ鉄（III）酸イオンがへキサシアノ鉄（II）酸イオンに還元される。つまり、検体溶液Ｋに含まれる生体分子Ｓとプローブ分子２１との反応によって、酸化物と還元物との濃度比を得ることができる。

検出部１は、生体分子Ｓとプローブ分子２１との反応によって発生した電気信号を検出する。本実施形態では、上述した酵素反応による酸化物と還元物との濃度比を、ネルンストの式を用いて酸化還元電位として検出する。

図２〜図３に示すように、検出部１は、ＣＭＯＳ集積回路基板１０と、ＣＭＯＳ集積回路基板１０上に成膜された検知電極１３（電極の一例）と、検知電極１３の周囲に配置されて磁石３からの磁束が流れる磁性体１４と、磁性体１４を保護する保護膜１５とを備えている。また、本実施形態における検出部１は、ＣＭＯＳ集積回路基板１０と磁性体１４との間に酸化膜１６を備えている。

ＣＭＯＳ集積回路基板１０は公知であるので詳細な説明は省略するが、ＮＭＯＳＦＥＴおよびＰＭＯＳＦＥＴで構成され、制御部１１によってパルス信号がセンサセルＣＥに加えられ、ＮＭＯＳＦＥＴがオン状態となったときにデジタル信号が出力される。このセンサセルＣＥから出力されたデジタル信号のパルス幅に基づいて、検体溶液Ｋに含まれる生体分子Ｓの量を検出するものである。

ＣＭＯＳ集積回路基板１０の配線１７はアルミニウムで構成されており、イオン化傾向が大きいため検体溶液Ｋに露出させると腐食してしまう。そこで、本実施形態では、配線１７に接続される検知電極１３として、イオン化傾向の小さな金属（例えば、金や白金）を用いている。また、ＣＭＯＳ集積回路基板１０の配線１７や絶縁層と金で構成される検知電極１３との密着性を確保するため、ＣＭＯＳ集積回路基板１０と検知電極１３との間にクロムなどの金属を介在させている。

ところで、酸化還元反応に起因する検体溶液Ｋと検知電極１３との間でリーク電流が流れたり、チオール基を有する生体分子Ｓであれば検知電極１３に化学吸着されて再利用できないおそれがある。そこで、本実施形態では、露出した検知電極１３を保護する自己組織化単分子膜１８として、１１−ＦＥＴ（１１−Ｆｅｒｒоｃｅｎｙｌ−１−Ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉоｌ）などのフェロセン誘導体を検知電極１３の表面に被覆（修飾）している。これによって、繰り返し検出部１を使用した場合でも、安定して酸化還元電位を検出することができる。

磁性体１４は、鉄、コバルト、ニッケルやガドリニウムなどの強磁性体材料を含んでいる。また、ＣＭＯＳ集積回路基板１０と磁性体１４との間に配置される酸化膜１６は、検知電極１３と磁性体１４とを絶縁する二酸化ケイ素などの絶縁膜で構成されている。本実施形態では、磁性体１４と酸化膜１６との間に密着性を促進させるためにチタンなどの密着促進材料１９を配置している（図３参照）。詳細は後述するが、ＣＭＯＳ集積回路基板１０の上に検知電極１３を成膜してパターニング加工し、酸化膜１６、密着促進材料１９、磁性体１４の順番で成膜した後にパターニング加工を施している。その結果、検知電極１３の中央が露出されると共に、検知電極１３の周囲が酸化膜１６、密着促進材料１９、磁性体１４の順番で覆われることとなる。このとき、磁性体１４の間隔Ｌは、反磁性粒子２２の粒径Ｄ（例えば３０μｍ）以下に設定されるのが好ましい（図３参照）。ここで、磁性体１４の間隔Ｌとは、磁性体１４の中央に孔部が形成されるようにパターニング加工した場合における該孔部の直径のことである。

保護膜１５は、磁性体１４のイオンが検体溶液Ｋに溶出しないように保護する樹脂などで構成されている。本実施形態では、保護膜１５をポリイミド樹脂で構成しているが、酸化還元反応に悪影響を及ぼさない保護材料であれば特に限定されない。詳細は後述するが、磁性体１４および検知電極１３の上に保護膜１５を成膜し、パターニング加工を施している。その結果、検知電極１３の中央が露出されると共に、磁性体１４の上面および内周側が保護膜１５で覆われることとなる。これによって、保護膜１５と検知電極１３とで囲まれる領域に溝部２０が形成されることとなる。この溝部２０の深さは、反磁性粒子２２の粒径Ｄ（例えば３０μｍ程度）に比べて十分に小さい、例えば所定値（例えば５μｍ程度）に設定されている。なお、溝部２０の深さは、反磁性粒子２２と検知電極１３との距離が、生体分子Ｓやプローブ分子２１の種類に応じて予め定められた一定値となるように設定されるのが好ましい。

検出部１の背面に配置される磁石３は、外部に磁場を形成するものであれば特に限定されず、永久磁石、電磁石、超電導磁石などで構成されており、ハルバッハ配列磁石のように磁束密度の大きい磁石が好ましい。図３の一点鎖線で示すように、磁石３から発生する磁束は磁性体１４が配置される検知電極１３の周囲に流れ、収容部２に収容された検体溶液Ｋの中で、検知電極１３の露出した部位に磁束密度の低い領域を形成するように磁束の流れが形成される。その結果、反磁性粒子２２は、この磁束の流れに反発するように流動し、次第に検知電極１３に接近することとなる。このように、磁石３で磁性ビーズを強制的に吸引するものではなく、磁束の流れに沿って次第に反磁性粒子２２を反発移動させるので、検知電極１３に対向する位置に反磁性粒子２２を均一に移動させることができる。その結果、生体分子Ｓと反磁性粒子２２に固定されたプローブ分子２１とが適正に反応するので、検出部１によって電気信号を確実に検出することができる。

また、上述したように保護膜１５と検知電極１３とで囲まれる領域に溝部２０を形成しているので、検知電極１３の周囲にある磁性体１４に磁束が集中し、溝部２０には磁束密度が極めて低い空間が形成される。その結果、反磁性粒子２２を検知電極１３により接近させることが可能となるので、生体分子Ｓの検出精度を高めることができる。

しかも、磁性体１４の間隔Ｌを反磁性粒子２２の粒径Ｄ以下に設定すれば、複数の反磁性粒子２２が凝集して検知電極１３に接近することが防止される。その結果、反磁性粒子２２を均一に分布させて生体分子Ｓの検出精度をより高めることができる。

［微小物質検出装置の製造方法］
図２に示すように、本実施形態における微小物質検出装置Ａの製造方法は、ＣＭＯＳ集積回路基板１０の上に検知電極１３を成膜してパターニング加工する工程と、検知電極１３の上に酸化膜１６を成膜する工程と、酸化膜１６の上に磁性体１４を成膜する工程と、酸化膜１６および磁性体１４をパターニング加工する工程と、磁性体１４および検知電極１３の上に保護膜１５を成膜してパターニング加工する工程と、を備えている。

ＣＭＯＳ集積回路基板１０の上に検知電極１３を成膜する工程は、スパッタリングや蒸着等によってクロム（例えば膜厚５０ｎｍ），金（例えば膜厚３５０ｎｍ）の順に成膜する。次いで、検知電極１３をパターニング加工する工程では、例えば感光性エポキシ樹脂などのレジストを塗布して光を照射するフォトリソグラフィ技術を用いて所定のパターンが形成し、不要な部分をイオンミリング法などによってエッチング処理する。

次に、検知電極１３の上に酸化膜１６を成膜する工程は、スパッタリングや蒸着等によって、酸化膜１６としての二酸化ケイ素（例えば膜厚１μｍ）を金で構成される検知電極１３の上に成膜する。同様に、酸化膜１６の上に磁性体１４を成膜する工程は、スパッタリングや蒸着等によって、密着促進材料１９としてのチタン（例えば膜厚５０ｎｍ），磁性体１４としての鉄（例えば膜厚０．５μｍ）の順に二酸化ケイ素で構成される酸化膜１６の上に成膜する。次いで、酸化膜１６および磁性体１４をパターニング加工する工程では、上述したフォトリソグラフィ技術を用いて、検知電極１３の周囲を酸化膜１６および磁性体１４が覆うと共に検知電極１３の中央が露出するようにパターンが形成され、不要な部分をイオンミリング法などによってエッチング処理する。

次に、磁性体１４および検知電極１３の上に保護膜１５を成膜してパターニング加工する工程は、鉄で構成される磁性体１４と金で構成される検知電極１３との上にポリイミド樹脂（例えば膜厚３μｍ）を塗布して成膜し、不要な部分をイオンミリング法などによってエッチング処理する。その結果、保護膜１５は、磁性体１４の内周側を覆うと共に検知電極１３の中央が露出することとなり、保護膜１５と検知電極１３とで囲まれる領域に溝部２０が形成される。そして、この保護膜１５の上に、例えばＳＵ−８などのネガティブフォトレジストを塗布し、光を照射するフォトリソグラフィ技術を用いて隔壁２５（例えば５０μｍ）を形成する。その結果、プローブ分子２１が表面に固定された反磁性粒子２２が、隔壁２５、保護膜１５、および検知電極１３で囲まれた収容部２に収容可能となる。そして、１１−ＦＥＴのフェロセン誘導体をエタノールに溶解させた溶液を検知電極１３の上に滴下して固定化させた後に洗浄して、検知電極１３の上に１１−ＦＥＴを修飾させる。

［微小物質検出方法］
図４に示すように、本実施形態に係る微小物質検出方法は、第一の検体溶液Ｋ（常磁性体を含む第一溶液の一例）に反磁性粒子２２を加えた反磁性粒子含有溶液を検出部１に添加する第一溶液添加工程と、第一溶液添加工程の後、第一の検体溶液Ｋよりも常磁性体の濃度が高い第二の検体溶液Ｋ（常磁性体を含む第二溶液の一例）を検出部１に添加する第二溶液添加工程と、第二溶液添加工程により浮上した反磁性粒子２２を第三の検体溶液Ｋを用いて除去する除去工程と、除去工程の後、生体分子Ｓを含む第四の検体溶液Ｋ（検体溶液の一例）を添加する微小物質添加工程と、検知電極１３から出力される電気信号に基づいて生体分子Ｓを検出する検出工程と、を備えている。

まず、微小物質検出方法における検出原理を説明する。図５には、隔壁２５の高さを３０μｍとし、保護膜１５の高さを３μｍとし、磁石３にハルバッハ配列磁石を用いた微小物質検出装置Ａにおける磁束分布のシミュレーション結果が示される。同図は、磁性体１４の間隔Ｌ＝１５μｍ，３０μｍ，４５μｍとした３パターンにおいて、任意に選択した一対の磁性体１４間の中心を原点としたときの水平方向距離Ｘ（μｍ）を横軸とし、磁束密度（Ｔ）を縦軸としている。同図に示すように、保護膜１５の表面からの高さ方向の距離が、３μｍ（破線），１８μｍ（一点鎖線），３３μｍ（実線）と離れるほど、磁束密度の低い領域と高い領域との差がなくなることが理解される。また、検知電極１３に近い領域（３μｍ（破線））において、図３の一点鎖線で示すように、磁石３から発生する磁束は磁性体１４が配置される検知電極１３の周囲に流れ、収容部２に収容された検体溶液Ｋの中で、検知電極１３の露出した部位に磁束密度の低い領域を形成するように磁束の流れが形成されることが理解される。その結果、反磁性粒子２２を検知電極１３に接近させ、隔壁２５間にトラップすることが可能となる。

図６には、磁石３に用いられるハルバッハ配列磁石とネオジム磁石との磁石表面からの距離（ｍｍ）と磁束密度（Ｔ）との関係を示している。同図から理解されるように、ハルバッハ配列磁石は、磁石表面から遠ざかるほど急峻に磁束密度が低下していることから磁気勾配が大きい。つまり、磁石３から遠ざかるほど反磁性粒子２２に作用する磁場の力（磁力）が低下する。図７には、反磁性粒子２２に作用する重力と磁力との関係（磁気アルキメデスの原理）が示されている。反磁性粒子２２の体積磁化率Ｘ_１はマイナスであり、常磁性体を含む検体溶液Ｋの体積磁化率Ｘ_２はプラスであるので、反磁性粒子２２には上向きの磁力が作用し、下向きの重力が作用する。つまり、ハルバッハ配列磁石の場合、磁石３から遠ざかるほど反磁性粒子２２に作用する磁力が低下するので、磁力と重力とが均衡する磁石３と反磁性粒子２２との距離が存在することとなる。その結果、検知電極１３に接近して隔壁２５間にトラップされた反磁性粒子２２以外の浮遊している反磁性粒子２２を所定の位置で滞留させることができる。

底面５０ｍｍ四方×高さ２０ｍｍで構成されるハルバッハ配列磁石の上に透明容器を配置し、該透明容器に反磁性粒子２２を含む濃度調整したフェリシアン化カリウム溶液を注入し、反磁性粒子２２の挙動を観察した。フェリシアン化カリウム溶液の濃度を、０ｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌ、０．０４ｍｏｌ／Ｌ、０．０８ｍｏｌ／Ｌ、０．１２ｍｏｌ／Ｌ、０．１６ｍｏｌ／Ｌの６種類に調製した。ハルバッハ配列磁石を配置しない場合は全ての濃度において反磁性粒子２２がすぐに沈降し、ハルバッハ配列磁石を配置した場合でも、０ｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌ、０．０４ｍｏｌ／Ｌの低濃度のフェリシアン化カリウム溶液は反磁性粒子２２がすぐに沈降した。一方、ハルバッハ配列磁石を配置した場合において、０．０８ｍｏｌ／Ｌの中濃度のフェリシアン化カリウム溶液は、溶液中に反磁性粒子２２が浮遊しており、０．１２ｍｏｌ／Ｌ、０．１６ｍｏｌ／Ｌの高濃度のフェリシアン化カリウム溶液は、反磁性粒子２２が液面近くまで浮上した。これらにより、検体溶液Ｋの濃度を高めることにより、反磁性粒子２２に作用する磁力が重力を上回り、反磁性粒子２２が浮上することが理解できる。

図４に戻り、第一溶液添加工程では、図１〜図２に示す排出口２７を閉じた微小物質検出装置Ａの注液口２６から第一の検体溶液Ｋに反磁性粒子２２を混合した反磁性粒子含有溶液を注液することにより、収容部２の収容空間には、常磁性体を含む第一の検体溶液Ｋ（例えば、フェリシアン化カリウム溶液）と反磁性粒子２２とが収容される。つまり、検出部１に第一の検体溶液Ｋに反磁性粒子２２を加えた反磁性粒子含有溶液が添加され、磁石３及び磁性体１４により検知電極１３の露出した部位に磁束密度の低い領域が形成されるため、反磁性粒子２２が検知電極１３に接近し、隔壁２５間にトラップされる。このとき、第一の検体溶液Ｋの濃度は、反磁性粒子２２に作用する上向きの磁力よりも下向きの重力の方が大きくなるように、低く調整することが好ましい。具体的には、図８に示すように、第一の検体溶液Ｋの濃度を０．１０ｍｏｌ／Ｌ未満とすることで、反磁性粒子２２が検知電極１３に向かって円滑に移動する。また、第一の検体溶液Ｋの濃度は、反磁性粒子２２が検体溶液Ｋ中で移動できるように、下向きの重力が大きくなり過ぎない程度に低く調整することが好ましい。具体的には、図８に示すように、第一の検体溶液Ｋの濃度を０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、反磁性粒子２２が検体溶液Ｋ中で円滑に移動する。

第二溶液添加工程では、第一溶液添加工程の後、排出口２７を閉じた微小物質検出装置Ａの注液口２６から第一の検体溶液Ｋよりも濃度が高い常磁性体を含む第二の検体溶液Ｋ（例えば、フェリシアン化カリウム溶液）を注液し、収容部２の収容空間には、常磁性体を含む第一の検体溶液Ｋ及び第二の検体溶液Ｋと反磁性粒子２２とが収容される。つまり、検出部１には、第一の検体溶液Ｋ及び反磁性粒子２２に加えて第二の検体溶液Ｋが添加され、添加直後には反磁性粒子２２に作用する大きな上向きの磁力により、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２が浮上する。このとき、第二の検体溶液Ｋの濃度は、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２に作用する下向きの重力よりも上向きの磁力が大きくなるように、高く調整することが好ましい。具体的には、図８に示すように、第二の検体溶液Ｋの濃度を０．１０ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、反磁性粒子２２が円滑に浮上する。また、第二の検体溶液Ｋの濃度は、反磁性粒子２２が検体溶液Ｋ中で浮遊できるように、上向きの磁力が大きくなり過ぎない程度に高く調整することが好ましい。具体的には、図８に示すように、第一の検体溶液Ｋの濃度を０．２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、反磁性粒子２２が検体溶液Ｋ中に円滑に浮遊する。

さらに、第一の検体溶液Ｋと第二の検体溶液Ｋとが混合されて常磁性体の濃度勾配がない状態となったとき、隔壁２５間にトラップされている反磁性粒子２２は検知電極１３に接近した状態が維持され、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２が浮遊する。このとき、第一の検体溶液Ｋと第二の検体溶液Ｋとが混合されて常磁性体の濃度勾配がなくなった混合溶液の濃度は、隔壁２５間にトラップされている反磁性粒子２２に作用する上向きの磁力よりも下向きの重力の方が大きくなり、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２に作用する下向きの重力よりも上向きの磁力の方が大きくなるように調整することが好ましい。つまり、第一の検体溶液Ｋと第二の検体溶液Ｋとが混合されて常磁性体の濃度勾配がなくなった条件下で、磁石３と反磁性粒子２２との距離が所定の距離（例えば、隔壁２５の外部として磁石３の表面から５０μｍ）にあるとき、磁石３により反磁性粒子２２に作用する磁力と反磁性粒子２２に作用する重力との合計が重力方向とは反対方向の力となるように第一の検体溶液Ｋと第二の検体溶液Ｋとの濃度を予め設定しておく。具体的には、図８に示すように、第一の検体溶液Ｋ及び第二の検体溶液Ｋの混合溶液の濃度を０．１０ｍｏｌ／Ｌ以上０．２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、隔壁２５間にトラップされている反磁性粒子２２が検知電極１３の近傍に位置し、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２が円滑に浮遊する。

除去工程では、第一の検体溶液Ｋ及び第二の検体溶液Ｋの混合溶液の濃度と同程度の第三の検体溶液Ｋ（例えば、フェリシアン化カリウム溶液）を、排出口２７を開口した微小物質検出装置Ａの注液口２６から注液する。その結果、第二溶液添加工程により隔壁２５間の外部に浮遊している反磁性粒子２２が、排出口２７から排出される。その結果、収容部２の収容空間には、隔壁２５間にトラップされていない反磁性粒子２２が除去され、隔壁２５間にトラップされている反磁性粒子２２が残存する。

微小物質添加工程では、微小物質検出装置Ａの排出口２７を閉じた状態で、生体分子Ｓを含む第四の検体溶液Ｋ（例えば、フェリシアン化カリウム溶液）を、注液口２６から注液する。この第四の検体溶液Ｋの濃度は、特に限定されないが第三の検体溶液Ｋと同程度の濃度が好ましい。そして、検出工程では、生体分子Ｓと反磁性粒子２２のプローブ分子２１との反応によって発生した電気信号が検出部１から出力され、制御部１１が、デジタル信号のパルス幅に基づいて酸化還元電位を換算し、検体溶液Ｋに含まれる生体分子Ｓの量を演算する。

上述した微小物質検出方法では、常磁性体を含む第一の検体溶液Ｋに反磁性粒子２２を加えた反磁性粒子含有溶液を検出部１に添加しているので、反磁性粒子２２には、常磁性体の磁化率と反磁性粒子２２の磁化率との差に基づく上向きの磁力が磁石３から離れるほど小さくなり、該磁力に比べて反磁性粒子２２の密度と第一の検体溶液Ｋの密度との差に基づく下向きの重力の方が大きくなるため、反磁性粒子２２は検知電極１３に近付いた状態となっている。換言すると、反磁性粒子２２は磁束密度の低い検知電極１３の中央部に向かって流動し、次第に検知電極１３に接近することとなり、磁束に囲まれた磁束密度の低い領域にトラップされた状態となっている。

また、第一の検体溶液Ｋよりも常磁性体の濃度が高い第二の検体溶液Ｋを添加すれば、検知電極１３の中央部にトラップされた反磁性粒子２２以外の第一の検体溶液Ｋ内を浮遊している反磁性粒子２２には、第二の検体溶液Ｋの常磁性体の濃度が高いことから上向きの磁力が大きくなると共に下向きの重力が小さくなり、電極から次第に離れていく。これにより、検知電極１３の中央部にトラップされている反磁性粒子２２と、溶液中に浮遊している反磁性粒子２２とを明確に区分することができる。その結果、検出工程において、磁性体１４に囲まれた検知電極１３の中央部に形成される反応空間に反磁性粒子２２を均一に分布させることが可能となり、生体分子Ｓ（微小物質）の検出精度を高めることができる。

さらに、除去工程において、検知電極１３から離れるように浮上した反磁性粒子２２を除去すれば、検知電極１３の中央部（反応空間）にトラップされた反磁性粒子２２のみとなる。そして、生体分子Ｓを含む第四の検体溶液Ｋを添加すれば、検体溶液Ｋに含まれる生体分子Ｓは、反応空間にある反磁性粒子２２のプローブ分子２１と反応して、電気信号を確実に検出することができる。

［実施例］
続いて、図９〜図１０を用いて、上述した微小物質検出方法により、反磁性粒子２２が均一に分布するか否かを検証する。

本実施例では、図２〜図３に示すように、ケイ素基板に二酸化ケイ素の酸化膜１６を１μｍの膜厚で成膜し、その酸化膜１６の上に膜厚５０ｎｍのチタン（密着促進材料１９）、膜厚０．５μｍの鉄（磁性体１４）の順でスパッタリングによって成膜した。そして、フォトリソグラフィ技術によって、密着促進材料１９および磁性体１４の層に間隔Ｌ＝３０μｍの直径を有するホール部分が構築される所定のパターンを形成し、イオンミリング法によってエッチング処理した後にレジストを除去した。次いで、ポリイミド樹脂で構成される膜厚３μｍの保護膜１５を、磁性体１４および酸化膜１６の上に塗布し、平面視において、磁性体１４が存在しないホール部分を形成した。次いで、保護膜１５の上にＳＵ−８を塗布し、フォトリソグラフィ技術を用いて高さ３０μｍの隔壁２５を形成し、隔壁２５間のホール径が５０μｍとなるようにイオンミリング法によってＳＵ−８のエッチング処理を施して検出部１を作製した。そして、検出部１の背面にハルバッハ配列磁石（磁束密度１．１５Ｔ）で構成される磁石３（底面５０ｍｍ四方×高さ２０ｍｍ）を配置して、本実施例に係る微小物質検出装置Ａを用意した。なお、比較例として、隔壁２５及び磁石３のない微小物質検出装置も用意した。

本実施例では、まず、濃度０．０４ｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウムを５μＬの純水に溶解させた検体溶液Ｋを１０μＬ調製し、検出部１に滴下した。次いで、第一溶液添加工程として、蛍光ポリスチレン微粒子（平均粒子径２５±２．５μｍ）の反磁性粒子２２を含む濃度０．０４ｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム溶液（第一の検体溶液Ｋ）を３０μＬ調製し、検出部１に滴下した。次いで、第二溶液添加工程として、濃度０．２０ｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム溶液（第二の検体溶液Ｋ）を２０μＬ調製し、検出部１に滴下した。次いで、除去工程として、マイクロピペットを用いて濃度０．１０ｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム溶液（第三の検体溶液Ｋ）を流入させて、浮遊している蛍光ポリスチレン微粒子を除去した。本実施例において、除去工程まで終了したときの検出部１における拡大写真が図９に示される。本実施例では、ホール部分（隔壁２５間において露出した検知電極１３に対向する位置）に反磁性粒子２２が均一に収容されていることが検証された。

一方、図１０に示す比較例では、本実施例における第二溶液添加工程及び除去工程を省略しており、ほとんどの反磁性粒子２２がホール部分に分布せずに、特定の領域に凝集し、一部積層していた。これらから、本実施形態における微小物質検出方法は、第一溶液添加工程及び第二溶液添加工程を含むことにより、ホール部分に反磁性粒子２２が均一に分布させることができる点が検証された。

［その他の実施形態］
（１）上述した実施形態では、第一溶液添加工程，第二溶液添加工程及び除去工程の後に、生体分子Ｓを含む第四の検体溶液Ｋを添加したが、第一溶液添加工程又は第二溶液添加工程と同時に生体分子Ｓを添加しても良く、生体分子Ｓを添加するタイミングは特に限定されない。また、除去工程を省略しても良い。
（２）上述した実施形態における第一の検体溶液Ｋから第四の検体溶液Ｋは、同一の種類の検体溶液Ｋであっても良いし、異なる種類の検体溶液Ｋであっても良い。
（３）上述した実施形態における微小物質検出方法で検出される微小物質として生体分子Ｓを例示したが、該微小物質検出方法は、細菌ウイルスや汚染化学物質等の微小物質の検出に用いることができる。
（４）上述した実施形態では、検知電極１３の中央を露出させたが、検知電極１３の中央から端部に向かって偏倚した表面の一部を露出させても良い。また、保護膜１５と検知電極１３とで囲まれる領域に溝部２０を形成せずに、保護膜１５で覆っても良い。
（５）上述した実施形態では、酵素反応による酸化物と還元物との濃度比を酸化還元電位として検出したが、例えば、検知電極１３の上にイオン感応膜を修飾させ、界面電荷量の変化を電位変化として検出しても良い。この場合、生体分子Ｓとイオン感応膜との反応による検体溶液ＫのｐＨ変化量を界面電荷量の変化として検出する。また、検知電極１３に生体分子Ｓを直接付着させて電荷を検出しても良い。これらの場合でも、本実施形態のように、検知電極１３の周囲に磁石３からの磁束が流れる磁性体１４を配置し、生体分子Ｓを補足する抗体などが表面に固定された反磁性粒子２２を用いれば、検知電極１３に対向する位置に反磁性粒子２２が均一に移動するので、生体分子Ｓの検出精度を高めることができる。
（６）センサセルＣＥは整列させずに不規則に配置しても良いし、センサセルＣＥを６４×６４ではなく、１２８×１２８で配列するなど、検出対象に応じて形状、配置を変更しても良い。

本発明は、生体分子等の微小物質を検出する微小物質検出方法に利用可能である。

１ 検出部
３ 磁石
１３ 検知電極（電極）
１４ 磁性体
２１ プローブ分子
２２ 反磁性粒子
Ａ 微小物質検出装置
Ｋ 検体溶液（第一溶液、第二溶液）
Ｓ 生体分子（微小物質）

Claims (5)

1. 検出対象となる微小物質と反磁性粒子の表面に固定されたプローブ分子との反応によって発生する電気信号を検知する電極と当該電極の周囲に配置される磁性体とを有する検出部と、当該検出部の背面に配置される磁石とを備えた微小物質検出装置を用いた微小物質検出方法であって、
   常磁性体を含む第一溶液に前記反磁性粒子を加えた反磁性粒子含有溶液を前記検出部に添加する第一溶液添加工程と、
   前記第一溶液添加工程の後、前記第一溶液よりも前記常磁性体の濃度が高い第二溶液を前記検出部に添加する第二溶液添加工程と、
   前記微小物質を含む検体溶液を前記検出部に添加する微小物質添加工程と、
   前記電極から出力される電気信号に基づいて前記微小物質を検出する検出工程と、を備えた微小物質検出方法。
2. 前記第二溶液添加工程により浮上した前記反磁性粒子を除去する除去工程をさらに備え、
   前記除去工程の後に前記微小物質添加工程を実行する請求項１に記載の微小物質検出方法。
3. 前記第一溶液と前記第二溶液とが混合されて前記常磁性体の濃度勾配がなくなった条件下で、前記磁石と前記反磁性粒子との距離が所定の距離にあるとき、前記磁石により前記反磁性粒子に作用する磁力と前記反磁性粒子に作用する重力との合計が重力方向とは反対方向の力となるように前記第一溶液と前記第二溶液との濃度を設定する請求項１又は２に記載の微小物質検出方法。
4. 前記第一溶液と前記第二溶液とが混合されて濃度勾配がなくなった混合溶液の濃度は、０．１ｍоｌ／Ｌ以上０．２ｍоｌ／Ｌ以下である請求項３に記載の微小物質検出方法。
5. 前記第一溶液及び前記第二溶液は、フェリシアン化カリウムを含む溶液であり、前記磁石はハルバッハ配列磁石である請求項１〜４の何れか一項に記載の微小物質検出方法。
   

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