CN110192096B - 生物体物质检测用设备和检测装置、离子电流的测定方法以及生物体物质的识别方法 - Google Patents

生物体物质检测用设备和检测装置、离子电流的测定方法以及生物体物质的识别方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题是提供一种延长样品通过通孔的时间的生物体物质检测用设备。能够通过如下生物体物质检测用设备来解决课题，该生物体物质检测用设备的特征在于，包括：基板；通孔，形成于该基板，并且用于受检生物体物质的通过；分子，形成于该通孔，并且与通过的受检生物体物质相互作用；第一腔室部件，与该基板的一个面侧的至少包含通孔的面一同形成用于填充电解液的第一腔室；以及第二腔室部件，与该基板的另一个面侧的至少包含通孔的面一同形成用于填充电解液的第二腔室，根据受检生物体物质通过通孔时的离子电流的波形(通过时间、形状等)来识别受检生物体物质。

Description

生物体物质检测用设备和检测装置、离子电流的测定方法以 及生物体物质的识别方法
技术领域
本发明涉及生物体物质检测用设备(以下，有时简单记载为“设备”)、生物体物质检测用检测装置(以下，有时简单记载为“检测装置”)、离子电流的测定方法(以下，有时简单记载为“测定方法”)、以及生物体物质的识别方法(以下，有时简单记载为“识别方法”)。尤其涉及通过在生物体物质等样品通过的通孔形成与样品相互作用的分子而延长样品通过通孔的时间，并能够识别样品的设备、检测装置、测定方法、以及识别方法。
背景技术
在基板形成通孔(纳米孔)、且检测样品通过该通孔时的离子电流的设备作为能够广泛应用于细菌、病毒、DNA、蛋白质等的感测的设备而备受瞩目。
图1示出样品的大小、数量等的检测方法的现有技术，通过检测样品通过形成于硅等基板上的细孔(微孔)时所产生的离子电流的变化，能够识别样品的体积(参照非专利文献1)。此外，还已知有通过使通孔的厚度做成比样品薄，能够测定与样品的形状对应的离子电流(参照专利文献1)。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/137209号公报。
非专利文献
非专利文献：Waseem A.et al.，Lab on a Chip，Vol.12，pp.2345-2352(2012)。
发明内容
在上述专利文献1和非专利文献1中记载的检测方法(设备)中，能够从离子电流的变化推测样品的尺寸和形状。然而，在专利文献1和非专利文献1中记载的方法中，当样品的尺寸和形状类似时，存在难以识别样品的问题。
本发明是为了解决上述现有的问题而做出的发明，进行深入研究的结果，新发现如下情况，并完成了本发明。
(1)通过在样品通过的通孔形成与样品相互作用的分子，使样品与分子相互作用的同时通过通孔，(2)因此，当与分子相互作用的样品通过通孔时，样品通过通孔的时间延长，测定的离子电流的波形变化，(3)其结果为，能够根据测定的离子电流的波形而识别样品。
即，本发明的目的在于提供在通孔形成与样品相互作用的分子的设备、检测装置、测定方法、以及识别方法。
本发明涉及以下所示的设备、检测装置、测定方法、以及识别方法。
(1)一种生物体物质检测用设备，其特征在于，包括：
基板；
通孔，形成于该基板，并且用于受检生物体物质的通过；
分子，形成于该通孔，并且与通过的受检生物体物质相互作用；
第一腔室部件，与该基板的一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第一腔室，所述第一腔室用于填充电解液；以及
第二腔室部件，与该基板的另一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第二腔室，所述第二腔室用于填充电解液，
根据受检生物体物质通过通孔时的离子电流的波形来识别受检生物体物质。
(2)根据(1)所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述受检生物体物质是细菌、病毒、DNA、蛋白质中的任何一者以上。
(3)根据(1)或(2)所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是肽、糖链或核酸。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是序列号2所示的鞭毛识别肽。
(5)根据(1)至(3)中任一项所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是选自序列号3至5的一种流感识别肽。
(6)根据(1)至(3)中任一项所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子包含流感识别糖链(6’-唾液酸乳糖)。
(7)根据(1)至(3)中任一项所述的生物体物质检测用设备，其中，
在所述通孔层压金属层，所述相互作用的分子被形成在金属层上。
(8)一种生物体物质检测用检测装置，包括：
权利要求1所述的生物体物质检测用设备；
第一电极，形成于所述第一腔室；
第二电极，形成于所述第二腔室；以及
电流计，用于测定样品通过所述通孔时的离子电流。
(9)一种离子电流的测定方法，其特征在于，
所述测定方法测定受检生物体物质通过形成于基板的通孔时的离子电流，
在所述通孔形成与受检生物体物质相互作用的分子，通过使受检生物体物质与所述分子相互作用的同时通过所述通孔，根据离子电流的波形的差异来识别受检生物体物质。
(10)根据(9)所述的离子电流的测定方法，其中，
所述受检生物体物质是细菌、病毒、DNA、蛋白质中的任何一者以上。
(11)根据(9)或(10)所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子是肽、糖链或核酸。
(12)根据(9)至(11)中任一项所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子是序列号2所示的鞭毛识别肽。
(13)根据(9)至(11)中任一项所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子是选自序列号3至5的一种流感识别肽。
(14)根据(9)至(11)中任一项所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子包含流感识别糖链(6’-唾液酸乳糖)。
(15)一种生物体物质的识别方法，其中，
根据通过(9)至(14)中所述的离子电流的测定方法测定的离子电流来识别受检生物体物质。
当使用本发明的设备时，在与分子相互作用的样品通过通孔的情况下，样品通过通孔的时间延长。因此，通过分析测定的离子电流的波形，能够识别大小类似的样品。
附图说明
图1是示出样品的大小和数量等的检测方法的现有技术的图；
图2是示出本发明的设备1的概要的图；
图3是用于说明在通孔3形成金属层的方法的图；
图4是用于说明在通孔3形成金属层的方法的图；
图5是示出设备1的其他实施方式的图；
图6是示出本发明的检测装置的一个例子的简要图；
图7是附图代替用照片，是通孔3附近的SEM图像；
图8是叠加了实施例3以及比较例2中测定的离子电流的波形的曲线图；
图9的(A)是叠加了实施例4中测定的离子电流的波形的曲线图，
图9的(B)是叠加了比较例3中测定的离子电流的波形的曲线图；
图10的(A)是叠加了实施例6中测定的离子电流的波形的曲线图，图10的(B)是叠加了比较例5中测定的离子电流的波形的曲线图；
图11的(A)是当使用序列号3时的叠加了实施例8中测定的离子电流的波形的曲线图，图11的(B)是当使用序列号4时的叠加了实施例8中测定的离子电流的波形的曲线图，图11的(C)是当使用序列号5时的叠加了实施例8中测定的离子电流的波形的曲线图，图11的(D)是叠加了比较例7中测定的离子电流的波的曲线图；
图12是叠加了实施例10以及比较例8中测定的离子电流的波形的曲线图。
具体实施方式
下面，对设备、检测装置、测定方法以及识别方法进行详细说明。
图2是示出本发明的设备1的概要的图。本发明的设备1至少包括基板2、形成于基板2且使样品通过的通孔3、形成于通孔3且与样品相互作用的分子(下面，有时简称为“分子”)4。图2中所示的设备1也可以作为使用公知的通孔的检测装置的检测用设备而包含。
基板2只要是在半导体制造技术领域中通常使用的绝缘性材料就没有特别限制。例如，可以举出Si、Ge、Se、Te、GaAs、GaP、GaN、InSb、InP、SiN等。此外，基板2可以使用SiN、SiO2、HfO2等材料，并使用称为固体膜的薄膜状或石墨烯、氧化石墨烯、二氧化钼(MoS2)、氮化硼(BN)等材料，由此形成为被称为二维材料的片状。样品的检测灵敏度是通孔3的体积越小越高，因此优选形成通孔3的基板2较薄。例如，优选为5μm以下，更优选为500nm以下，进一步优选为100nm以下，特别优选为50nm以下。此外，例如在可以由石墨烯制造1nm以下膜厚度度的基板2等那样的、作为基板2使用固体膜或二维材料的情况下，能够使膜厚度度非常薄。然而，当基板2的膜厚度非常薄时，可能难以在不破损的情况下使用。因此，基板2可以具有在由上述的绝缘性材料形成的支承板上层压固体膜或二维材料的层压结构。在具有层压结构的情况下，可以将固体膜或二维材料层压在形成有比通孔3更大孔的支承板上，并在固体膜或二维材料上形成通孔3即可。
通孔3以贯穿基板2的方式形成。在检测离子电流时，通孔3的体积越小灵敏度越高。因此，在使上述基板2变薄的同时，对通孔3的大小进行适当的调整以使其大于待测样品但不要过大。作为样品，可以举出细菌、细胞、病毒、DNA(脱氧核糖核酸，Deoxyribonucleicacid)、RNA(核糖核酸，Ribonucleic acid)、蛋白质、花粉等生物体，但是只要是与分子4相互作用就没有特别限制。例如，可以举出硫氧化物(SOx)、氮氧化物(NOx)、挥发性有机化合物(VOC)、氧化矿物(硅，铝，钛，铁等)等非生物体。
分子4只要是与样品相互作用就没有特别限制。此外，本发明中的“相互作用”是指，通过分子4识别待测样品、或者分子4与待测样品相互影响，来在分子4与待测样品之间作用较弱的结合力，并且与在通孔3未形成分子4的情况相比，待测样品通过通孔3的时间变长的分子。作为相互作用，可以举出离子间相互作用、氢结合、电气相互作用等。因此，与待测样品牢固结合而不能分离的分子并不包含于本发明的分子4中。
作为分子4，可以举出肽、核酸、糖链、有机分子等。分子4只要检查对待测样品特异的肽、核酸序列、表面分子等，并确定与该特异的肽、核酸、表面分子等结合的肽或核酸序列、糖链等即可。作为弱结合的序列，例如在肽的情况下，可以举出识别待测样品的特异的肽的抗体序列的一部分序列、与待测样品的表面层分子相互作用的序列等。此外，在弱结合的序列为核酸的情况下，可以举出与待测样品的特异的核酸杂交的序列的一部分。肽以及核酸一旦确定了序列就通过公知的肽合成装置、核酸合成装置合成即可。或者，也可以利用肽/核酸的受托合成服务。此外，在弱结合的分子是糖链的情况下，只要选择对待测样品特异的肽、与表面分子相互作用的糖链即可。在待测样品是非生物体物质的情况下，例如检查表面电荷等，并选择与该电荷相互作用的电荷的有机分子即可。
另外，上述例示的分子4是预先确定了想要测定的样品时的例子，但也可以通过在通孔形成任意设计的核酸、肽、糖链等而筛选与该核酸相互作用的样品的情况。例如，假设筛选可能与人体细胞表面的蛋白质或糖链结合的细菌、病毒等的情况。在这种情况下，首先，从人体细胞表面选择任意的蛋白质、糖链，并基于该蛋白质、糖链来设计肽、糖链。然后，制作在通孔形成所设计的肽、糖链的设备、以及未形成的设备，并选择样品流过时离子电流的波形不同的样品即可。也就是说，“与样品相互作用的分子”可以是预先明确与确定与样品相互作用的分子，也可以是不明确相互作用的样品(有可能相互作用)的分子。如上所述，在通孔3形成的分子4可以是任意设计的核酸、肽、糖链、有机分子等。
分子4只要在通孔3形成就没有特别限制。例如，通过在通孔3中蒸镀金、铂、铝、铜、铁、钴、银、锡、铟、锌、镓、铬、钛等金属来形成金属层，并通过将基板2浸渍到包含分子4在内的水溶液中，来在金属层上形成分子4即可。在分子4是肽的情况下，设计序列以使得肽的一侧末端含有硫醇基，并吸附硫醇基与金属层即可。此外，在分子4是核酸的情况下，通过公知的方法将硫醇基导入到核酸中并吸附到金属层上即可。此外，在分子4是糖链的情况下，通过公知的方法将糖链的一部分置换为硫醇基即可。
图3以及图4是用于说明在通孔3形成金属层的方法的图。在图3所示的例子中，(1)通过溅射等将金属层21层压在基板2上，接着，通过溅射等将绝缘层22层压在金属层21上。作为绝缘层22，可以举出SiO2、SiNx、SiON、Al2O3、Y2O3、Ta2O5、HfO2等，但只要是绝缘性材料就没有特别限制。(2)然后，通过电子线绘制方法对形成通孔3的部分进行绘制，并通过反应性离子蚀刻等形成通孔3即可。通过上述方法，能够向通孔3露出金属层21。
在图4所示的例子中，(1)首先在基板2形成通孔3。通孔3与上述同样地，通过电子线绘制方法进行绘制，并通过反应性离子蚀刻等来形成即可。(2)将电子线抗蚀剂23涂布在基板2上，并且通过电子线绘制方法用电子线抗蚀剂23覆盖通孔3的周围。电子线抗蚀剂23可以是负型也可以是正型。(3)通过溅射等将金属层21层压在通孔3以及电子线抗蚀剂23上。(4)能够通过揭开电子线抗蚀剂23，去除电子线抗蚀剂上的金属层21，并在通孔3形成金属层21。
另外，图3以及图4所示的例子中，将分子4的硫醇基吸附在金属层21上，但如果能够在通孔3形成分子4，则可以不设置金属层21。例如，在作为基板2的材料使用SiO2的情况下，可以通过硅烷偶联反应将氨基或羧基导入到分子4中，使分子4与基板2结合。此外，也可以用聚氨酯包覆基板2的通孔3部分，并且在聚氨酯表面上结合将修饰的聚多巴胺作为支架而具有的分子4。
图5是示出设备1的其他实施方式的图。图5所示的设备1至少包括第一腔室部件51和第二腔室部件61，该第一腔室部件51能够与基板2的一面侧的至少包含通孔3的面形成用于填充电解液的第一腔室5，该第二腔室部件61能够与基板2的另一面侧的至少包含通孔3的面形成用于填充电解液的第二腔室6。
第一腔室部件51和第二腔室部件61优选由电气和化学惰性的材料形成，例如，可以举出玻璃、蓝宝石、陶瓷、树脂、橡胶、弹性体、SiO2、SiN、Al2O3等。
只要第一腔室5和第二腔室6以夹着通孔3的方式形成，并以投入到第一腔室5的样品能够通过通孔3移动到第二腔室6的方式形成就没有特别限制。例如，单独制作第一腔室部件51和第二腔室部件61，并以液密方式粘附到基板2上即可。或者，也可以形成一个面开放状态的大致长方体的箱子部件，向箱子的中央插入/固定基板2，然后，将开放状态面液密地密封即可。在这种情况下，第一腔室部件51和第二腔室部件61并不意味着单独的部件，而是意味着以基板2为边界划分的箱子部件的一部分。另外，虽然未图示，但可以根据需要而在第一腔室部件51和第二腔室部件61形成用于填充/排出电解液以及样品液、插入电极和/或引线的孔。
图6是示出本发明的检测装置1-1的一个例子的简要图。检测装置1-1除了设备1之外至少包括第一电极52、第二电极62和电流计7，该第一电极52形成在第一腔室5内的与电解液接触的位置，该第二电极62形成在第二腔室6内的与电解液接触的位置，该电流计7用于测定样品31a、31b通过通孔3时的离子电流。
此外，检测装置1-1可以根据需要而包括分析部8、显示部9、程序存储器10以及控制部11，分析部8分析由电流计7测定的离子电流，显示部9用于显示所测定的离子电流值和/或分析部8分析的结果，程序存储器10预先保存用于使分析部8、显示部9发挥功能的程序，控制部11用于读取保存于程序存储器10中的该程序而执行。程序可以预先存储在程序存储器10中，也可以记录在记录介质中，并使用安装手段而被保存到程序存储器10。
第一电极52和第二电极62能够由铝、铜、铂、金、银、钛等公知的导电性金属形成。第一电极52和第二电极62以夹着通孔3的方式形成，通过施加直流电流来传输电解液中的离子。因此，第一电极52只要形成在第一腔室5内的与电解液接触的位置即可，在基板2的表面上、第一腔室部件51的内表面、或者第一腔室5内的空间，经由引线53配置即可。第二电极62也与第一电极51同样地，只要形成在第二腔室6内的与电解液接触的位置即可，在基板2的表面上、第二腔室部件61的内表面、或者第二腔室6内的空间，经由引线63配置即可。另外，在图5所示的例子中，第一电极52形成在第一腔室部件51的内表面上，第二电极62形成在第二腔室部件61的内表面上，但第一电极52和第二电极62也可以从形成于第一腔室部件51和第二腔室部件61的孔插入。
第一电极52经由引线53与电源54、地线55连接。第二电极62经由引线63与电流计7、地线64连接。另外，在图6所示的例子中，电源54与第一电极52侧连接，电流计7与第二电极62侧连接，但电源54和电流计7也可以设置在同一电极侧。
电源54是只要能够将直流电流通电到第一电极52和第二电极62就没有特别限制。电流计7只要能够随时间测定在向第一电极52和第二电极62通电时所产生的离子电流就没有特别限制。另外，虽然在图6中未图示，但可以根据需要而设置噪声消除电路和电压稳定化电路等。
当样品通过本发明的检测装置1-1的通孔3时，流过通孔3的离子电流被样品断开，从而离子电流减小。该离子电流的减少量与通孔3内的样品的体积成比例。然而，在现有的检测装置中，当样品的体积基本相同时，根据离子电流的测定值难以识别到底是相同种类的样品还是不同种类的样品。在本发明中，即使样品的体积相同，对于与分子4相互作用的样品和不与分子4相互作用的样品而言，通过通孔3的时间明显不同。因此，通过分析离子电流的变化时间(样品进入通孔3至出来为止的时间)和波形，可以识别样品的种类。
此外，即使是相同的种类，也有如外来体(Exosomes)或DNA碱基序列那样形状不同的样品。在如图6所示的样品31a和31b中，由于通过通孔3时的通孔3内的体积变化不同，因此所测定的离子电流的波形不同。然而，在现有的检测装置1-1中，由于样品通过通孔3的速率快，因此难以精确地测定样品形状的不同。在本发明中，通过与分子4的相互作用，能够使样品通过通孔3的时间变长，因此能够期待相同种类样品的形状差异的测定。
分析部8分析由电流计7测定的离子电流的值(波形)。在样品不是球形的情况下，如图6所示那样，即使是相同种类的样品，如果进入通孔3时的方向不同，则存在测定的离子电流的波形(通过时间、形状等)不同的情况。在这种情况下，可以基于多次测定结果进行分析即可。
显示部9只要显示所测定的离子电流的值(波形)、由分析部8分析的结果即可，使用液晶显示器、等离子显示器、有机EL(Electroluminescence，电致发光)显示器等公知的显示装置即可。
接下来，对使用本发明的检测装置1-1的测定方法、以及识别方法进行说明。首先，测定方法可以按照以下顺序进行。
(1)向第一腔室5和第二腔室6填充电解液。电解液只要能够通电第一电极52和第二电极62就没有特别限制，可以使用TE缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、KCl水溶液等。此时，第一腔室5内与第二腔室6内之间经由通孔3获取液体接界(液络)。
(2)将样品添加到第一腔室5。
(3)通过电源54，使第一电极52和第二电极62通电。由电流计7随时间测定通过通电产生的离子电流的值。另外，细菌等样品具有表面电荷。因此，当使第一电极52和第二电极62通电时，除了通常的扩散之外，添加到第一腔室5的样品因电泳而通过形成于基板2的通孔3，并向第二腔室6移动，但也可以根据需要，通过泵等将压力施加到分散有样品的溶液中，使样品通过水流通过通孔3。
通过以上顺序，能够测定样品通过检测装置1-1的通孔3时的离子电流。然后，样品的识别方法只要根据通过离子电流的测定方法测定的结果来识别样品即可。具体而言，根据离子电流的测定值的下降程度，可以知道样品的大小。此外，即使在样品大小相同的情况下，能够根据从离子电流的测定值变化而恢复到稳定状态为止的时间和波形，知道样品是否与分子4相互作用，从而能够确定样品的种类。
下面举出实施例来具体说明本发明，但提供该实施例仅仅为了说明本发明，为了该具体方式的参考而提供。这些示例用于说明本发明的确定的具体方式，但不表示限定或限制本申请中所公开的发明的保护范围。
实施例
设备1的制作
实施例1
首先，在两个表面上将具有50nm氮化硅膜的面取向(100)的硅晶片(E&M株式会社(E&M CO.,LTD)制)切割成29mm的正方形。在基板的一个面上覆盖形成有约500μm正方形区域的孔的蚀刻防止用金属掩模，并通过RIE装置(RIE-10NR，莎姆克(SAMCO CO.,Ltd)制)仅去除形成有孔的500μm正方形区域的氮化硅膜，以露出硅表面。之后，在125℃的热板(Hotplate NINOS ND-1，亚速旺(As One CO.,Ltd)制)上用氢氧化钾溶液(和光纯药株式会社)仅对露出部分的硅部分选择性地进行了约3小时的湿法蚀刻。通过该操作，对硅进行蚀刻直到到达基板的另一面的氮化硅膜为止。到达了氮化硅膜的硅孔约为150μm正方形。
接下来，在覆盖上述约150μm正方形的硅孔的氮化硅膜的大致中央，通过电子线绘制方法绘制了通孔3的图案。随后，浸入显影液中进行显影，通过RIE装置进行反应离子蚀刻，从而在氮化硅膜形成了直径约2μm的圆筒状通孔3。
接下来，使用旋转涂布机(日本MIKASA公司制造的MS-B100)而将电子线抗蚀剂(日本ZEON公司制造的ZEP520A)涂覆在氮化硅上。在热板上以180℃烘烤之后，通过电子线绘制装置法去除了通孔3周围的抗蚀剂。接下来，使用由三宇电子公司(SANYU Electronic Co.)制造的SVC-700LRF在通孔3蒸镀金。图7是通孔3附近的SEM图像。确认到金被蒸镀到去除电子线抗蚀剂的通孔3的周围。尽管从照片难以分辨，但可确认到金也被蒸镀到通孔3内表面上。
接下来，通过以下的顺序，将与大肠杆菌相互作用的肽形成于通孔3。
(1)设计了与大肠杆菌表面的糖链相互作用的肽。所设计的肽的氨基酸序列如下所示。
GRHIFWRRGGGC(序列号1)
(2)通过常规方法合成所设计的氨基酸序列的肽，并将其溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中直到变成1mM为止，并制备肽溶液。
(3)将上述(2)中制备的肽溶液滴入到设备1的通孔3中，并在室温下静置2小时。
(4)用PBS冲洗肽溶液数次。通过上述顺序制作设备1。
检测装置1-1的制作
实施例2
接下来，在实施例1中制作的设备1的基板2的上下液密地贴附设有孔的由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造的聚合物块(TORAY公司制造)，所述孔用于投入电极、电解液以及样品，从而制作了第一腔室5和第二腔室6。第一腔室5和第二腔室6的容量各为约10μl。第一电极52和第二电极62使用银氯化银电极，并从设置于聚合物块的孔插入到第一腔室5和第二腔室6。作为电源54而使用电池驱动的偏压电源(AxisNet公司制)，并经由引线连接到第一电极52。电流计7中使用电流放大器和具有1MHz的高时间分辨率的数字转换器(NI5922，美国国家仪器有限公司(National Instruments))进行数据的获取，所获取的数据存储在RAID驱动器HDD(HDD-8263，美国国家仪器有限公司)。
比较例1
除了不对实施例1中制作的设备进行金蒸镀和肽结合以外，以与实施例2相同的顺序制作了检测装置。
离子电流的测定以及识别
接下来，使用制作的检测装置1-1测定了样品通过通孔3时的离子电流。样品调整和测定方法如下。
(1)样品调整
作为样品使用了大肠杆菌(JM109；日本TaKaRa Bio株式会社)和枯草芽孢杆菌(25975；ATCC)。枯草芽孢杆菌的大小为0.7-0.8×3.0μm，大肠杆菌的大小为0.5×1.0～3.0μm，大小几乎相同。通过常规方法培养了样品。通过离心分离沉淀培养液，用2.5％的LB培养基(LB Broth miller，西格玛-奥尔德里奇公司(SIGMA-ALDRICH,Co.LLC.))洗涤离心沉淀物之后，再次通过离心分离进行沉淀。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释离心沉淀物以使其为5×107细胞/mL，并制备大肠杆菌悬浮液。
(2)离子电流的测定
在实施例2和比较例1中制作的检测装置1-1的第二腔室6中填充电解液(缓冲液：和光纯药公司制造)。接下来，将上述(1)中调整的样品用PBS缓冲液稀释100倍的10μl的溶液添加到第一腔室5，并将50mV的电压施加给第一电极52和第二电极62，并测定了离子电流I离子。
实施例3
使用大肠杆菌作为样品，并使用在实施例2中制作的检测装置1-1来进行了离子电流的测定。
比较例2
除了代替实施例2中制作的检测装置1-1而使用比较例1中制作的检测装置1-1以外，以与实施例3相同地进行了离子电流的测定。
图8是叠加了实施例3和比较例2中测定的每一个样品的离子电流的波形的曲线图。从图8中可以看出，由于降低的离子电流的值(Ip)在实施例3和比较例2中相同，因此表示在实施例3和比较例2的测定中准确地测定了大肠杆菌的大小。另一方面，在实施例3中，从样品进入通孔3而离子电流值下降至样品从通孔3出来而离子电流值恢复到稳定状态为止的时间(td)明显长于比较例2。此外，由于样品通过通孔3的时间变长，如图中的虚线箭头所示，可以看到在以往的测定中无法观察到的波形。由于离子电流值的下降与通孔3中的样品量成比例，因此认为通过本发明的测定方法更精确地测定样品的形状。
实施例4
除了将通孔3的直径设为约3μm以外，以与实施例3相同的顺序进行了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的离子电流的测定。图9的(A)是在实施例4中测定的结果的曲线图。
比较例3
除了将通孔3的直径设为约3μm以外，以与比较例2相同的顺序进行了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的离子电流的测定。图9的(B)是在比较例3中测定的结果的曲线图。
如图9的(B)所示，在使用未在通孔3中形成分子的检测装置的情况下，测定大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的离子电流的波形几乎相同，两者无法区分。另一方面，如图9的(A)所示，在使用在通孔3中形成分子的检测装置的情况下，通过与分子的相互作用，测定大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的离子电流的波形明显不同。从以上结果可以看出，通过在通孔3中形成与样品相互作用的分子，即使是大小几乎相同的样品，也能够识别样品。
接下来，通过改变相互作用的分子的种类以及样品的种类进行各种实验。
带鞭毛大肠杆菌和不带鞭毛大肠杆菌的识别，分子：肽
实施例5
除了将通孔3的直径设为约300nm、并使用被设计成与大肠杆菌的鞭毛相互作用的肽用作分子4之外，以与实施例1相同的顺序制作设备1，接着，与实施例2相同的顺序制作了检测装置1-1。所设计的肽的氨基酸序列如下所示。
FLLRVPHLGGGC(序列号2)
比较例4
除了在通孔中未形成序列号2所示的肽以外，以与实施例5相同的顺序制作的了设备、以及检测装置。
实施例6(有分子)和比较例5(无分子)
接下来，除了使用在实施例5和比较例4中制作的检测装置、作为样品而使用带鞭毛的大肠杆菌[Escherichia coli，BW25113(国家生物资源项目(National BioResourceProject)，KEIO collection)]、以及通过使构成鞭毛的主要蛋白质的FliC缺损而失去鞭毛的大肠杆菌[Escherichia coli,ΔfliC(国家生物资源项目(National BioResourceProject)，KEIO collection)]以外，以与上述离子电流的测定以及识别相同的顺序调制样品，并进行了离子电流的测定。此外，除了鞭毛的有无之外，大肠杆菌的大小几乎相同。
图10的(A)是叠加了实施例6中测定的每一个样品的离子电流的波形的曲线图。从图10的(A)可以看出，在通过使识别大肠杆菌的鞭毛的肽与通孔结合的实施例5的检测装置来测定离子电流的值(Ip)的情况下，根据鞭毛的有无，离子电流值的波形明显不同。另一方面，图10的(B)是叠加了比较例5中测定的每一个样品的离子电流的波形的曲线图。从图10的(B)可以看出，在肽未与通孔结合的比较例5的检测装置中，波形几乎相同，无法识别带鞭毛大肠杆菌和不带鞭毛大肠杆菌。
流感病毒的识别，分子：肽
实施例7
除了代替序列号2而分别使用了被设计成识别流感病毒的以下三种类肽之外，以与实施例5相同的顺序制作了设备1和检测装置1-1。
ASHRVGSTYIAGGGC(序列号3)
ASHRVGSTYIGGGC(序列号4)
RVGSTYGGGC(序列号5)
实施例8(有分子)和比较例6、7(无分子)
接下来，除了使用在实施例7和比较例4中制作的检测装置、作为样品而使用A型流感病毒[Influenza A virus(H1N1)，A/PR/8/34(American Type Culture Collection，VR-95)]和B型流感病毒[Influenza B virus，B/Lee/40(American Type CultureCollection,VR-1535)]并以下面记载的顺序调制样品以外，以与实施例6相同的顺序进行了离子电流的测定。
病毒的调整方法
病毒通过孵化鸡蛋内培养法的常规方法培养。即，将在37℃、湿度60％以上的孵卵器中边翻蛋边培养10～11天的卵进行检查之后，将流感病毒接种到浆尿膜内，并再培养3天。在气室中破碎卵壳膜而吸入并收集浆尿液。
图11的(A)是当使用序列号3的分子时的叠加了一个样品的离子电流的波形的曲线图，图11的(B)是当使用序列号4的分子时的叠加了一个样品的离子电流的波形的曲线图，图11的(C)是当使用序列号5的分子时的叠加了一个样品的离子电流的波形的曲线图。从图11的(A)～(C)可以看出，在使被设计成识别流感病毒的肽与通孔结合的实施例8中，能够识别出A型、B型流感病毒。此外，还确认了测定的离子电流的波形根据肽序列的不同而大大不同。另一方面，在肽未结合的比较例6中，流感病毒被吸附在通孔的周围，无法测定离子电流。此外，认为流感病毒被吸附在通孔的周围的原因是金蒸镀。因此，将通孔的直径设为300nm，并且根据实施例1、2中记载的顺序制作没有金蒸镀且分子未结合的检测装置，并进行了离子电流的测定(比较例7)。图11的(D)是叠加了比较例7中测定的每一个样品的离子电流的波形的曲线图。如图11的(D)所示，仅通过形成通孔不能识别流感病毒。从以上结果可知，不仅能够识别流感病毒，通过使相互作用的分子与通孔结合，能够测定流感病毒。
流感病毒的识别，分子：糖链
实施例9
除了代替序列号2的肽、将用于识别流感病毒的下述糖链(6’-唾液酸乳糖；东京化成公司制造)通过以下的结合方法与通孔结合的以外，以与实施例5相同的顺序，制作了设备1和检测装置1-1。
结合方法
针对具有氧基氨基的十一烷二硫化物(H2N-O-(CH2)11-S-S-(CH2)11-OH，H2N-O-(CH2)11-S-S-(CH2)11-NH2)(0.1mmol/L)，参照Park等人的文献(Langmuir,2008,Vol.24,6201-6207)而进行了合成。将所获得的中间层形成材料形成材料溶解在乙醇中，制备自组装单分子膜(SAM，Self-Assembled Monolayer)形成用溶液。将具有金层的通孔浸入SAM形成用溶液中，通过放置1小时以形成用于固化糖的SAM。糖在pH5.3的乙酸溶液中调制成浓度为0.1mmol/L，并通过将通孔浸渍15分钟来进行了糖的固化。
[化学式1]
Figure BDA0001834956800000171
实施例10(有分子)和比较例8(无分子)
接下来，使用在实施例9和比较例4中制作的检测装置，并且作为样品而使用无害化的流感病毒，以与实施例6相同的顺序进行了离子电流的测定。此外，通过下面记载的顺序调整了无害化的流感病毒。
无害化病毒调制方法
作为试品溶液的原液，用0.05％多聚甲醛溶液调制了含有无害化的A型流感病毒H1N1(HA值256)的溶液。
图12是叠加了实施例10和比较例8中测定的每一个样品的离子电流的波形的曲线图。从图12可以看出，当通过使识别流感病毒的糖链与通孔结合的实施例9的检测装置测定离子电流的值(Ip)时，与通过糖链未结合的比较例4的检测装置测定的离子电流值的波形明显不同。因此，很明显能够通过在通孔中形成糖链来识别流感病毒。
其他实施方式
此外，本发明能够采用以下的样品检测用设备、样品检测装置、离子电流的检测方法以及样品识别方法的实施方式。此外，也可以与上述例示的实施方式适当组合。
(1)一种样品检测用设备，包括：
基板；
通孔，形成于该基板，并且用于样品的通过；以及
分子，形成于该通孔，并且与通过的样品相互作用。
(2)根据(1)所述的样品检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是肽或核酸。
(3)根据(1)或(2)所述的样品检测用设备，其中，
在所述通孔层压金属层，所述相互作用的分子被形成在金属层上。
(4)根据(1)至(3)中任何一者所述的样品检测用设备，包括：
第一腔室部件，与所述基板的一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第一腔室，所述第一腔室用于填充电解液；以及
第二腔室部件，与所述基板的另一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第二腔室，所述第二腔室用于填充电解液。
(5)一种样品检测装置，包括：
上述(4)所述的样品检测用设备；
第一电极，形成于所述第一腔室；
第二电极，形成于所述第二腔室；以及
电流计，用于测定样品通过所述通孔时的离子电流。
(6)一种离子电流的测定方法，测定样品通过形成于基板的通孔时的离子电流，其中，
在所述通孔形成与样品相互作用的分子，通过使样品与所述分子相互作用的同时通过所述通孔，延长样品通过所述通孔的时间。
(7)根据(6)所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子是肽或核酸。
(8)一种样品的识别方法，其中，
根据通过上述(7)或(7)所述的离子电流的测定方法测定的离子电流来识别样品。
工业应用性
通过使用本发明的设备1，即使样品大小几乎相同，也能够进行识别。因此，能够用作测定离子电流的机器的检查装置的测定部，对检测装置的开发是有用的。
Figure IDA0001974463450000011
Figure IDA0001974463450000021

Claims (17)

1.一种生物体物质检测用设备，其特征在于，包括：
基板；
第一腔室部件，与所述基板的一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第一腔室，所述第一腔室用于填充电解液；
第二腔室部件，与所述基板的另一个面侧的至少包含通孔的面一同形成第二腔室，所述第二腔室用于填充电解液；
圆筒状通孔，在垂直于所述基板的上下方向上贯穿所述基板，以使所述第一腔室和所述第二腔室夹着所述通孔，从而投入到所述第一腔室的受检生物体物质能够通过所述通孔移动到所述第二腔室；以及
分子，形成于该通孔，并且与通过的受检生物体物质相互作用，
所述相互作用的分子通过下述(1)～(3)来形成于所述通孔，
(1)在所述通孔层压金属层，所述相互作用的分子被形成在层压于所述通孔的所述金属层上；
(2)使导入了氨基或羧基的所述相互作用的分子与所述通孔结合；或者
(3)通过聚氨酯包覆所述通孔，在聚氨酯表面上结合将修饰的聚多巴胺作为支架而具有的所述相互作用的分子，
所述生物体物质检测用设备根据受检生物体物质通过通孔时的离子电流的波形来识别受检生物体物质。
2.如权利要求1所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述基板由绝缘性材料形成，在所述基板之上形成金属层，在该金属层之上还形成绝缘层，所述相互作用的分子形成于向所述通孔露出的所述金属层上。
3.如权利要求1或2所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述受检生物体物质是细菌、病毒、DNA、蛋白质中的任何一者以上。
4.如权利要求1或2所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是肽、糖链或核酸。
5.如权利要求1或2所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是序列号2所示的鞭毛识别肽。
6.如权利要求1或2所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子是选自序列号3至5的一种流感识别肽。
7.如权利要求1或2所述的生物体物质检测用设备，其中，
所述相互作用的分子包含流感识别糖链(6’-唾液酸乳糖)。
8.一种生物体物质检测用检测装置，包括：
权利要求1所述的生物体物质检测用设备；
第一电极，形成于第一腔室；
第二电极，形成于第二腔室；以及
电流计，用于测定受检生物体物质通过通孔时的离子电流。
9.一种离子电流的测定方法，其特征在于，
所述测定方法测定受检生物体物质通过形成于基板的圆筒状通孔时的离子电流，其中，所述通孔在垂直于所述基板的上下方向上贯穿所述基板，以使用于填充电解液的第一腔室和用于填充电解液的第二腔室夹着所述通孔，从而投入到所述第一腔室的受检生物体物质能够通过所述通孔移动到所述第二腔室，
在所述通孔形成与受检生物体物质相互作用的分子，通过使受检生物体物质与所述分子相互作用的同时通过所述通孔，根据离子电流的波形的差异来识别受检生物体物质。
10.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述受检生物体物质是细菌、病毒、DNA、蛋白质中的任何一者以上。
11.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子是肽、糖链或核酸。
12.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述通孔中形成序列号2所示的鞭毛识别肽，所述序列号2所示的鞭毛识别肽是与受检生物体物质相互作用的分子。
13.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述通孔中形成选自序列号3至5的一种流感识别肽，所述选自序列号3至5的一种流感识别肽是与受检生物体物质相互作用的分子。
14.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述通孔中形成包含流感识别糖链(6’-唾液酸乳糖)的分子，所述包含流感识别糖链(6’-唾液酸乳糖)的分子是与受检生物体物质相互作用的分子。
15.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述相互作用的分子通过下述(1)～(3)来形成于所述通孔，
(1)在所述通孔层压金属层，所述相互作用的分子被形成在层压于所述通孔的所述金属层上；
(2)使导入了氨基或羧基的所述相互作用的分子与所述通孔结合；或者
(3)通过聚氨酯包覆所述通孔，在聚氨酯表面上结合将修饰的聚多巴胺作为支架而具有的所述相互作用的分子。
16.如权利要求9所述的离子电流的测定方法，其中，
所述基板由绝缘性材料形成，在所述基板之上形成金属层，在该金属层之上还形成绝缘层，所述相互作用的分子形成于向所述通孔露出的所述金属层上。
17.一种生物体物质的识别方法，其中，
根据通过权利要求9至16中任一项所述的离子电流的测定方法测定的离子电流来识别受检生物体物质。
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