JP7398118B2 - サンプル識別方法、サンプル識別用デバイス、および、サンプル識別装置 - Google Patents
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Description
本明細書における開示は、サンプル識別方法、サンプル識別用デバイス、および、サンプル識別装置に関する。
基板に貫通孔（ナノポア）を形成し、該貫通孔をサンプルが通過する際のイオン電流を測定するデバイスは、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質等のセンシングに幅広く応用可能なデバイスとして注目されている。
関連する技術としては、例えば、シリコン等の基板上に形成した細孔（マイクロポア）をサンプルが通過する際に生じるイオン電流の変化を検出することで、サンプルの体積を識別できること（非特許文献１参照）、また、貫通孔の厚さをサンプルより薄くすることで、サンプルの形状に応じたイオン電流を測定できること（特許文献１参照）が知られている。また、基板上に貫通孔を２以上形成することも知られている（非特許文献２参照）。
Ｗａｓｅｅｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ， Ｖｏｌ．１２， ｐｐ．２３４５－２３５２ （２０１２）
Ｍａｋｕｓｕ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，"Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃａｐｔｕｒｅ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅｓ"，ＡＣＳ Ｓｅｎｓ．， Ａｒｔｉｃｌｅ ＡＳＡＰ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １３，２０１８，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｅｎｓｏｒｓ．８ｂ０１２１４
上記非特許文献２に記載のとおり、イオン電流を測定するデバイスとして、基板上に貫通孔を２以上形成することは知られている。そして、非特許文献２のＡＢＳＴＲＡＣＴの図に示されるように、基板に形成する貫通孔の数が多くなるほど、単位時間当たりのサンプル捕捉効率を向上させるためには、貫通孔の距離を短くした方が望ましいことが開示されている。
しかしながら、本発明者らは、基板に貫通孔を２以上形成したデバイスを用いて更なる研究を行ったところ、（１）分析対象サンプルの識別を行う場合、貫通孔の距離を短くすると、測定したイオン電流のピーク値に差が出にくくなり、その結果、サンプルの識別精度が低下し、特に、異なるサイズのサンプルの識別が困難になること、（２）貫通孔の距離を長くすると、短くした場合とは逆に測定したイオン電流のピーク値に差が出やすくなり、サンプルの識別精度が高くなること、を新たに見出した。
すなわち、本明細書における開示の目的は、基板にサンプルが通過する貫通孔を２以上形成したデバイスを用いたサンプルの識別の際に、識別精度を向上できるサンプル識別方法、サンプル識別用デバイス、および、サンプル識別装置を提供することである。
本明細書における開示は、以下に示す、サンプル識別方法、サンプル識別用デバイス、および、サンプル識別装置に関する。
（１）サンプル液中のサンプルの識別方法であって、
該識別方法は、
前記サンプルを、基板に形成した貫通孔を通過させるサンプル通過工程と、
前記サンプルが、前記貫通孔を通過する時のイオン電流の変化を測定するイオン電流測定工程と、
測定したイオン電流の値から、前記サンプル液中のサンプルを識別するサンプル識別工程と、
を少なくとも含み、
前記サンプルを識別するサンプル識別用デバイスが、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記基板には、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通する２以上の貫通孔が形成され、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、
サンプル識別方法。
（２）前記サンプル液には、サイズが異なるサンプルが含まれている、
上記（１）に記載のサンプル識別方法。
（３）サンプル液中のサンプルの識別方法に用いるデバイスであって、
該デバイスは、
基板と、
該基板に形成された２以上の貫通孔と、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記２以上の貫通孔は、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通し、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、
サンプル識別用デバイス。
（４）上記（３）に記載のサンプル識別用デバイスと、
前記第１チャンバーに形成された第１電極と、
前記第２チャンバーに形成された第２電極と、
サンプルが前記貫通孔を通過する時のイオン電流を計測するための電流計と、
を含む、
サンプル識別装置。
該識別方法は、
前記サンプルを、基板に形成した貫通孔を通過させるサンプル通過工程と、
前記サンプルが、前記貫通孔を通過する時のイオン電流の変化を測定するイオン電流測定工程と、
測定したイオン電流の値から、前記サンプル液中のサンプルを識別するサンプル識別工程と、
を少なくとも含み、
前記サンプルを識別するサンプル識別用デバイスが、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記基板には、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通する２以上の貫通孔が形成され、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、
サンプル識別方法。
（２）前記サンプル液には、サイズが異なるサンプルが含まれている、
上記（１）に記載のサンプル識別方法。
（３）サンプル液中のサンプルの識別方法に用いるデバイスであって、
該デバイスは、
基板と、
該基板に形成された２以上の貫通孔と、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記２以上の貫通孔は、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通し、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、
サンプル識別用デバイス。
（４）上記（３）に記載のサンプル識別用デバイスと、
前記第１チャンバーに形成された第１電極と、
前記第２チャンバーに形成された第２電極と、
サンプルが前記貫通孔を通過する時のイオン電流を計測するための電流計と、
を含む、
サンプル識別装置。
本発明で開示するサンプル識別用デバイスを用いてサンプル識別方法を実施すると、サンプルの識別精度が向上し、サイズの異なるサンプルであっても識別ができる。
以下に、サンプル識別方法（以下、単に「識別方法」と記載することがある。）、サンプル識別用デバイス（以下、単に「デバイス」と記載することがある。）、および、サンプル識別装置（以下、単に「識別装置」と記載することがある。）について詳しく説明する。
（デバイスの第１の実施形態）
図１Ａ～図１Ｃを参照して、第１の実施形態に係るデバイス１ａについて説明する。図１Ａはデバイス１ａの上面図、図１Ｂおよび図１Ｃは図１ＡのＹ－Ｙ’断面図である。デバイス１ａは、基板２、２以上の貫通孔３を少なくとも含む。貫通孔３は、基板２の第１面２１から、該第１面２１の反対側の面である第２面２２の方向に、基板２を貫通するように形成されている。
図１Ａ～図１Ｃを参照して、第１の実施形態に係るデバイス１ａについて説明する。図１Ａはデバイス１ａの上面図、図１Ｂおよび図１Ｃは図１ＡのＹ－Ｙ’断面図である。デバイス１ａは、基板２、２以上の貫通孔３を少なくとも含む。貫通孔３は、基板２の第１面２１から、該第１面２１の反対側の面である第２面２２の方向に、基板２を貫通するように形成されている。
基板２は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている絶縁性の材料であれば特に制限は無い。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、ＳｉＮ等が挙げられる。また、基板２は、ＳｉＮ、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2等の材料を用い、固体メンブレンと呼ばれる薄膜状、または、グラフェン、酸化グラフェン、二酸化モリブデン（ＭｏＳ2）、窒化ホウ素（ＢＮ）等の材料を用い、２次元材料と呼ばれるシート状に形成してもよい。サンプルの検出感度は、貫通孔３の体積が小さいほど高くなることから、貫通孔３を形成する基板２は薄い方が好ましい。例えば、５μｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましい。なお、例えば、グラフェンは１ｎｍ以下の膜厚の基板２の作製が可能である等、基板２として固体メンブレンまたは２次元材料を用いた場合は、膜厚を非常に薄くできる。しかしながら、基板２の膜厚が非常に薄いと、破損せずに取り扱うことが困難な場合がある。そのため、基板２は、上記の絶縁性の材料で形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層した積層構造としてもよい。積層構造にする場合は、貫通孔３より大きな孔を形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層し、固体メンブレンまたは２次元材料に貫通孔３を形成すればよい。
貫通孔３は、基板２の第１面２１から、該第１面２１の反対側の面である第２面２２の方向に、基板２を貫通するように形成されている。イオン電流を検出する際には、貫通孔３の体積が小さいほど感度が高くなる。したがって、上記基板２を薄くするとともに、貫通孔３の大きさは、測定対象サンプルよりは大きいが、大き過ぎないように適宜調整すればよい。なお、貫通孔３の第１面２１と並行となる断面形状が円形の場合、貫通孔３の大きさと記載した場合は直径を意味する。貫通孔３の第１面２１と並行となる断面形状が円形でない場合、貫通孔３の大きさとは断面の外接円の直径を意味する。貫通孔３は、後述する実施例に示すとおり、エッチング等により形成すればよい。また、貫通孔３は、図１Ｂに示すように、第１面２１側の貫通孔３の第１開口３１と第２面２２側の貫通孔３の第２開口３２とが同じ形状となるように形成されていてもよい。或いは、図１Ｃに示すように、第１開口３１と第２開口３２の大きさが異なる、換言すると、貫通孔３が、基材２の中で第１面２１から第２面２２に向けて広がるように形成されていてもよい。
第１の実施形態に係るデバイス１ａは、基板２上に貫通孔３が２以上形成されているが、隣り合う貫通孔３同士の距離ｄ１が少なくとも２００ｎｍ以上離れるように配置されていることが特徴である。なお、本明細書において「隣り合う貫通孔同士の距離」とは、図１Ａに示すとおり、任意の貫通孔３の外縁とその隣の任意の貫通孔３の外縁とを結んだ線（図１Ａの矢印付の破線ｄ’、ｄ’’）の中で、最も短い距離（ｄ’）を意味する。また、隣り合う貫通孔３が複数あり、貫通孔３の外縁と外縁とを結んだ距離が異なる場合（図１Ａのｄ１、ｄ２）は、「隣り合う貫通孔同士の距離」とは、最も短い距離（ｄ１）を意味する。ただし、図１Ｃに示すように、第１面２１の第１開口３１と第２面２２の第２開口３２の大きさが異なる場合は、「隣り合う貫通孔同士の距離」とは、大きい方の開口（図１Ｃでは第１開口３１）の外縁とを結んだ距離を意味する。後述する実施例および比較例に示すとおり、貫通孔３（開口）の距離を短くすると、測定したイオン電流のピーク値が低くなるためサンプルの識別がし難くなる。そのため、隣り合う貫通孔同士の距離は、２００ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、１μｍ以上、２μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上等、所望の識別精度に応じて適宜調整すればよい。一方、隣り合う貫通孔同士の距離の上限は、サンプルの識別との観点では特に上限はないが、距離が長くなりすぎると、基板２の単位面積当たりの貫通孔３が少なくなり、測定効率が低下する。したがって、基板２の面積や所望の測定効率等を考慮して、適宜設定すればよい。
基板２上に形成する貫通孔３の配置形状は、上記のとおり、任意の貫通孔３と当該貫通孔３に最も近接する貫通孔３の距離が２００ｎｍ以上となるように配置されていれば、特に制限はない。例えば、貫通孔３はランダムに配置してもよいし、図１Ａに示す正方形等の所定の形状となるように配置してもよい。或いは、細密充填形状のように、隣り合う貫通孔同士の距離が全て同じとなるように配置してもよい。
サンプルとしては、体積を有するものであれば特に制限はなく、例えば、細菌、細胞、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、花粉等の生体物質、硫黄酸化物（ＳＯｘ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、酸化鉱物（ケイ素、アルミニウム、チタン、鉄等の非生体物質、等が挙げられる。
（デバイスの第２の実施形態）
図２を参照して、デバイスの第２の実施形態について説明する。図２は、第２の実施形態に係るデバイス１ｂの概略断面図である。図２に示すデバイス１ｂは、基板２の第１面２１の貫通孔３の第１開口３１を含む面とで電解液を充填する第１チャンバー５を形成できる第１チャンバー部材５１、および、基板２の第２面２２の貫通孔３の第２開口３２を含む面とで電解液を充填する第２チャンバー６を形成できる第２チャンバー部材６１、を少なくとも含んでいる。
図２を参照して、デバイスの第２の実施形態について説明する。図２は、第２の実施形態に係るデバイス１ｂの概略断面図である。図２に示すデバイス１ｂは、基板２の第１面２１の貫通孔３の第１開口３１を含む面とで電解液を充填する第１チャンバー５を形成できる第１チャンバー部材５１、および、基板２の第２面２２の貫通孔３の第２開口３２を含む面とで電解液を充填する第２チャンバー６を形成できる第２チャンバー部材６１、を少なくとも含んでいる。
第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は、電気的および化学的に不活性な材料で形成することが好ましく、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ2、ＳｉＮ、Ａｌ2Ｏ3などが挙げられる。
第１チャンバー５及び第２チャンバー６は、貫通孔３を挟むように形成され、第１チャンバー５に投入したサンプルが、貫通孔３を通り第２チャンバー６に移動できるように形成されていれば特に制限はない。例えば、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１を別々に作成し、基板２に液密となるように接着すればよい。又は、１つの面が解放状態の略直方体の箱部材を形成し、箱の中央に基板２を挿入・固定し、その後、解放状態の面を液密に封止してもよい。その場合、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は別々の部材を意味するのではなく、基板２を境に分けた箱部材の一部を意味する。なお、図示はしていないが、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１には、電解液及びサンプル液を充填・排出、電極及び／又はリードを挿入するための孔を必要に応じて形成してもよい。
（識別装置の実施形態）
図３を参照して、識別装置の実施形態について説明する。図３は識別装置１００の実施形態の概略断面図である。識別装置１００は、デバイス１ｂに加え、第１チャンバー５内の電解液と接する箇所に形成された第１電極５２、第２チャンバー６内の電解液と接する個所に形成された第２電極６２、サンプルＳ１、Ｓ２が貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定するための電流計７を少なくとも含んでいる。
図３を参照して、識別装置の実施形態について説明する。図３は識別装置１００の実施形態の概略断面図である。識別装置１００は、デバイス１ｂに加え、第１チャンバー５内の電解液と接する箇所に形成された第１電極５２、第２チャンバー６内の電解液と接する個所に形成された第２電極６２、サンプルＳ１、Ｓ２が貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定するための電流計７を少なくとも含んでいる。
また、識別装置１００は、必要に応じて、電流計７で測定したイオン電流を解析する解析部８、測定したイオン電流値及び／または解析部８が解析した結果を表示するための表示部９、予め解析部８や表示部９を機能させるためのプログラムを格納したプログラムメモリ１０、プログラムメモリ１０に格納されているこのプログラムを読み出し実行するための制御部１１を含んでいてもよい。プログラムは、予めプログラムメモリ１０に記憶しておいても良いし、記録媒体に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ１０に格納されるようにしてもよい。
第１電極５２及び第２電極６２は、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の導電性金属で形成することができる。第１電極５２及び第２電極６２は、貫通孔３を挟むように形成し、直流電流を印加することで電解液中のイオンを輸送する。したがって、第１電極５２は、第１チャンバー５内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第１チャンバー部材５１の内面、又は第１チャンバー５内の空間にリード５３を介して配置すればよい。第２電極６２も第１電極５１と同様に、第２チャンバー６内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第２チャンバー部材６１の内面、又は第２チャンバー６内の空間にリード６３を介して配置すればよい。なお、図３に示す例では、第１電極５２は第１チャンバー部材５１の内面に、第２電極６２は第２チャンバー部材６１の内面にそれぞれ形成されているが、第１電極５２及び第２電極６２は、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１に形成した孔から挿入してもよい。
第１電極５２は、リード５３を介して電源５４、アース５５に接続している。第２電極６２は、リード６３を介して電流計７、アース６４に接続している。なお、図３に示す例では、電源５４は第１電極５２側に、電流計７は第２電極６２側に接続しているが、電源５４と電流計７は、同じ電極側に設けてもよい。
電源５４は、第１電極５２及び第２電極６２に直流電流を通電できるものであれば特に制限はない。電流計７は、第１電極５２及び第２電極６２に通電した際に、発生するイオン電流を経時的に測定できるものであれば特に制限はない。なお、図３には図示していないが、必要に応じてノイズ除去回路や電圧安定化回路等を設けてもよい。
識別装置１００の貫通孔３にサンプルが通過すると、貫通孔３を流れているイオン電流がサンプルにより遮断され、イオン電流が減少する。このイオン電流の減少量が貫通孔３内のサンプルの体積に比例する。しかしながら、貫通孔３（開口）の距離が短すぎると識別精度が低下し、図３に示すように、サンプルＳ１、Ｓ２のサイズが異なる場合であっても、測定したイオン電流のピーク値に差がでにくくなる。一方、実施形態に係る識別装置１００では、隣り合う貫通孔３（開口）の距離を２００ｎｍ以上となるように配置している。そのため、測定したイオン電流のピーク値に差がでることから、貫通孔３を通過するサンプルＳ１、Ｓ２のサイズに応じて、サンプルの識別ができる。なお、貫通孔３の体積が小さい程、イオン電流の測定感度が向上することから、基板２の厚さ（第１面２１と第２面２２との距離）は薄い方が好ましい。なお、サンプル液中のサンプル濃度（個数）および基板２上に形成する貫通孔３の数にもよるが、サンプルが貫通孔３を同時に通過する確率は極めて低い。したがって、仮に、数個のサンプルが同時に貫通孔３を通過したとしても、特異的なピークとして認識されるに過ぎず、サンプル液中にどのようなサンプルが含まれているのか識別するには影響を与えるものではない。
解析部８は、電流計７で測定したイオン電流の値（ピーク値）を解析する。上記のとおり、サンプルのサイズに応じてイオン電流の値が変わる。したがって、測定したイオン電流の値に基づき解析部８でデータ解析をすることで、サンプルを識別できる。
表示部９は、測定したイオン電流の値（ピーク値）、解析部８で解析した結果を表示できればよく、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなど、公知の表示装置を用いればよい。
（サンプル識別方法の実施形態）
次に、図４を参照して、識別装置１００を用いたサンプル識別方法について説明する。図４は、サンプル識別方法のフローチャートである。サンプル識別方法の実施形態は、サンプル通過工程（ＳＴ１）、イオン電流測定工程（ＳＴ２）、サンプル識別工程（ＳＴ３）を含んでいる。
次に、図４を参照して、識別装置１００を用いたサンプル識別方法について説明する。図４は、サンプル識別方法のフローチャートである。サンプル識別方法の実施形態は、サンプル通過工程（ＳＴ１）、イオン電流測定工程（ＳＴ２）、サンプル識別工程（ＳＴ３）を含んでいる。
サンプル通過工程（ＳＴ１）では、サンプルを、基板２に形成した貫通孔３を通過させる。なお、サンプル通過工程を実施する前に、サンプル準備工程を含んでいてもよい。サンプル準備工程は、以下の手順で行うことができる。
（１）第１チャンバー５及び第２チャンバー６に、電解液を充填する。電解液は、第１電極５２及び第２電極６２が通電できれば特に制限は無く、ＴＥバッファー、ＰＢＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＫＣｌ水溶液等を用いればよい。このとき、第１チャンバー５内と第２チャンバー６内との間は、貫通孔３を介して液絡が取れている。
（２）サンプルを第１チャンバー５に添加する。
なお、上記（１）と（２）は、別々に行ってもよいが、サンプルが既に含まれている電解液を第１又は第２チャンバーに充填してもよい。
（１）第１チャンバー５及び第２チャンバー６に、電解液を充填する。電解液は、第１電極５２及び第２電極６２が通電できれば特に制限は無く、ＴＥバッファー、ＰＢＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＫＣｌ水溶液等を用いればよい。このとき、第１チャンバー５内と第２チャンバー６内との間は、貫通孔３を介して液絡が取れている。
（２）サンプルを第１チャンバー５に添加する。
なお、上記（１）と（２）は、別々に行ってもよいが、サンプルが既に含まれている電解液を第１又は第２チャンバーに充填してもよい。
サンプル通過工程（ＳＴ１）は、上記準備工程で電解液を充填した第１チャンバー５及び第２チャンバー６に配置した第１電極５２及び第２電極６２を通電させることで実施できる。細菌等のサンプルは表面電化を有する。したがって、第１電極５２及び第２電極６２に通電すると、通常の拡散に加え、第１チャンバー５に添加したサンプルは電気泳動により基板２に形成した貫通孔３を通過し、第２チャンバー６に移動するが、必要に応じて、サンプルが分散している溶液にポンプ等で圧力を加え、水流によってサンプルが貫通孔３を通過するようにしてもよい。
イオン電流測定工程（ＳＴ２）では、通電により発生するイオン電流の値を電流計７で経時的に測定する。そして、サンプル識別工程（ＳＴ３）では、イオン電流測定工程（ＳＴ２）により測定したイオン電流のピーク値から、サンプルを識別すればよい。具体的には、イオン電流の測定値の低下の程度によりサンプルの大きさを識別できる。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
〔デバイスの作製〕
先ず、両表面に５０ｎｍの窒化シリコン膜を持つ面方位（１００）のシリコンウエハー（Ｅ＆Ｍ ＣＯ．，ＬＴＤ）を２５ｍｍ四方に切った。基板の一方の面に約５００μｍ四方の領域の孔が形成されているエッチング防止用のメタルマスクをかぶせ、ＲＩＥ装置（ＲＩＥ－１０ＮＲ、ＳＡＭＣＯ ＣＯ．，Ｌｔｄ）によって、孔が形成されている５００μｍ四方の領域のみ窒化シリコン膜を除去し、シリコン表面をむき出しにした。その後、むき出しにした部分のシリコンのみを選択的に水酸化カリウム水溶液（和光純薬株式会社）によって、約３時間かけて１２５℃のホットプレート（Ｈｏｔ ｐｌａｔｅ ＮＩＮＯＳ ＮＤ－１、Ａｓ Ｏｎｅ ＣＯ．，Ｌｔｄ）上でウェットエッチングを行った。この操作により、基板の他方の面の窒化シリコン膜に到達するまでシリコンをエッチングした。窒化シリコン膜に到達したシリコンの孔は約１５０μｍ四方であった。
先ず、両表面に５０ｎｍの窒化シリコン膜を持つ面方位（１００）のシリコンウエハー（Ｅ＆Ｍ ＣＯ．，ＬＴＤ）を２５ｍｍ四方に切った。基板の一方の面に約５００μｍ四方の領域の孔が形成されているエッチング防止用のメタルマスクをかぶせ、ＲＩＥ装置（ＲＩＥ－１０ＮＲ、ＳＡＭＣＯ ＣＯ．，Ｌｔｄ）によって、孔が形成されている５００μｍ四方の領域のみ窒化シリコン膜を除去し、シリコン表面をむき出しにした。その後、むき出しにした部分のシリコンのみを選択的に水酸化カリウム水溶液（和光純薬株式会社）によって、約３時間かけて１２５℃のホットプレート（Ｈｏｔ ｐｌａｔｅ ＮＩＮＯＳ ＮＤ－１、Ａｓ Ｏｎｅ ＣＯ．，Ｌｔｄ）上でウェットエッチングを行った。この操作により、基板の他方の面の窒化シリコン膜に到達するまでシリコンをエッチングした。窒化シリコン膜に到達したシリコンの孔は約１５０μｍ四方であった。
次に、上記約１５０μｍ四方のシリコンの孔を覆っている窒化シリコン膜のほぼ中央に、電子線描画法により貫通孔３のパターンの描画を行った。次いで、像液に浸して現像を行い、ＲＩＥ装置によって反応性エッチングにより、窒化シリコン膜に円筒状の貫通孔３を形成した。デバイスは、貫通孔３の数が１～７個、直径が３００ｎｍ～３．４μｍ、隣り合う貫通孔同士の距離が３０ｎｍ～１０μｍ、となるように、各種実施形態を組合わせて作製した。なお、貫通孔３の長さは約５０ｎｍであった。
［識別装置の作製］
次に、［デバイスの作製］で作製した基板２の上下に、電極、電解液及びサンプル投入用の孔を設けたジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）製のポリマーブロック（ＴＯＲＡＹ社製）を液密に貼り付け、第１チャンバー５及び第２チャンバー６を作製した。第１チャンバー５及び第２チャンバー６の容量は、各々約１０μｌであった。第１電極５２及び第２電極６２には銀塩化銀電極を用い、ポリマーブロックに設けた孔から第１チャンバー５及び第２チャンバー６に挿入した。電源５４として電池駆動のバイアス電源（アクシスネット）を用い、リードを介して第１電極５２に接続した。電流計７には、電流アンプと１ＭＨｚの高時間分解能を持つデジタイザ（ＮＩ５９２２， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの取得を行い、取得したデータは、ＲＡＩＤドライブＨＤＤ（ＨＤＤ－８２６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）に格納した。
次に、［デバイスの作製］で作製した基板２の上下に、電極、電解液及びサンプル投入用の孔を設けたジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）製のポリマーブロック（ＴＯＲＡＹ社製）を液密に貼り付け、第１チャンバー５及び第２チャンバー６を作製した。第１チャンバー５及び第２チャンバー６の容量は、各々約１０μｌであった。第１電極５２及び第２電極６２には銀塩化銀電極を用い、ポリマーブロックに設けた孔から第１チャンバー５及び第２チャンバー６に挿入した。電源５４として電池駆動のバイアス電源（アクシスネット）を用い、リードを介して第１電極５２に接続した。電流計７には、電流アンプと１ＭＨｚの高時間分解能を持つデジタイザ（ＮＩ５９２２， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの取得を行い、取得したデータは、ＲＡＩＤドライブＨＤＤ（ＨＤＤ－８２６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）に格納した。
［サンプルの識別方法の実施例１］
１．サンプル液の調整
サンプルには、直径７８０ｎｍのカルボキシ基修飾ポリスチレン粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を用い、電解液（ＴＥバッファー：ニッポンジーン社製ＴＥ（ｐＨ ８．０））１ｍｌにポリスチレン粒子懸濁液１μｌを懸濁することでサンプル液を作製した。
１．サンプル液の調整
サンプルには、直径７８０ｎｍのカルボキシ基修飾ポリスチレン粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を用い、電解液（ＴＥバッファー：ニッポンジーン社製ＴＥ（ｐＨ ８．０））１ｍｌにポリスチレン粒子懸濁液１μｌを懸濁することでサンプル液を作製した。
２．イオン電流の測定
作製した識別装置の第２チャンバー６に、電解液（ＴＥバッファー：ニッポンジーン社製ＴＥ（ｐＨ ８．０））を充填した。次に、上記１．で調整したサンプル液を第１チャンバー５に加え、第１電極５２及び第２電極６２に８００ｍＶの電圧を印加し、イオン電流Ｉｉｏｎを測定した。
作製した識別装置の第２チャンバー６に、電解液（ＴＥバッファー：ニッポンジーン社製ＴＥ（ｐＨ ８．０））を充填した。次に、上記１．で調整したサンプル液を第１チャンバー５に加え、第１電極５２及び第２電極６２に８００ｍＶの電圧を印加し、イオン電流Ｉｉｏｎを測定した。
図５Ａ～図５Ｅは、イオン電流の測定結果を示すチャートである。イオン電流値が大幅に低下している箇所は、ポリスチレン粒子が貫通孔３を通過したことを示している。図５Ｂ～図５Ｄは、直径１．２μｍの貫通孔３を略正方形となるように４個配置したデバイスを用いており、貫通孔３の距離が、図５Ｂは１００ｎｍ、図５Ｃは１μｍ、図５Ｄは１０μｍとなるように配置した。また、図５Ａ及び図５Ｅは、比較用のデバイスを用いた例を示しており、図５Ａは直径１．２μｍの４個の貫通孔を足した大きさと同じである直径２．４μｍの貫通孔３を一個配置した。また、図５Ｅは、図５Ｂ～図５Ｄと同じ直径１．２μｍの貫通孔３を一個配置した。
図５Ｂ～図５Ｄから明らかなように、隣り合う貫通孔３の距離を短くする程、貫通孔３の大きさは同じであるにもかかわらず、イオン電流のピーク値が小さくなった。そして、図５Ａおよび図５Ｂを参照すると、図５Ｂでは貫通孔３を４個配置しているが、隣り合う貫通孔３の距離は１００ｎｍと短いため、測定したイオン電流のピーク値は、図５Ｂの４個の貫通孔を足した大きさの貫通孔３を一個形成した図５Ａのイオン電流のピーク値と近い値となった。一方、図５Ｄおよび図５Ｅを参照すると、図５Ｄでは貫通孔３を４個配置しているが、隣り合う貫通孔３の距離は１０μｍと離れているため、測定したイオン電流のピーク値は、同じ大きさの貫通孔３を一個形成した図５Ｅのイオン電流のピーク値とほぼ同じであった。
［サンプルの識別方法の実施例２］
次に、サンプルとして直径９００ｎｍのポリスチレン粒子を用い、貫通孔３を７個配置したデバイスを用いた実験を行った。図６Ａ～図６Ｅは、イオン電流の測定結果を示すチャートである。図６Ｂ～図６Ｄは、直径１．２μｍの貫通孔３を７個配置しており、隣り合う全ての貫通孔３の距離が、図６Ｂは１００ｎｍ、図６Ｃは１μｍ、図６Ｄは１０μｍとなるように配置した。また、図６Ａ及び図６Ｅは、比較用のデバイスを用いた例を示しており、図６Ａは直径１．２μｍの７個の貫通孔と同じ面積である直径３．２μｍの貫通孔３を一個配置した。また、図６Ｅは、図６Ｂ～図６Ｄと同じ直径１．２μｍの貫通孔３を一個配置した。サンプルのサイズと貫通孔３の配置以外は、［サンプルの識別方法の実施例１］と同様の手順でイオン電流の測定を行った。以下の実施例においても、サンプルとデバイスの配置以外は、イオン電流の測定手順は同じである。
次に、サンプルとして直径９００ｎｍのポリスチレン粒子を用い、貫通孔３を７個配置したデバイスを用いた実験を行った。図６Ａ～図６Ｅは、イオン電流の測定結果を示すチャートである。図６Ｂ～図６Ｄは、直径１．２μｍの貫通孔３を７個配置しており、隣り合う全ての貫通孔３の距離が、図６Ｂは１００ｎｍ、図６Ｃは１μｍ、図６Ｄは１０μｍとなるように配置した。また、図６Ａ及び図６Ｅは、比較用のデバイスを用いた例を示しており、図６Ａは直径１．２μｍの７個の貫通孔と同じ面積である直径３．２μｍの貫通孔３を一個配置した。また、図６Ｅは、図６Ｂ～図６Ｄと同じ直径１．２μｍの貫通孔３を一個配置した。サンプルのサイズと貫通孔３の配置以外は、［サンプルの識別方法の実施例１］と同様の手順でイオン電流の測定を行った。以下の実施例においても、サンプルとデバイスの配置以外は、イオン電流の測定手順は同じである。
図６Ａ～図６Ｅから明らかなように、貫通孔３の数を４個→７個に変更した場合でも、イオン電流のピーク値については、図５Ａ～図５Ｅと同様の傾向が見られた。しかしながら、図６Ａおよび図６Ｂから明らかなように、７個の貫通孔３を１００ｎｍの距離に配置した場合のイオン電流のピーク値は、図６Ａとほぼ同じであった。換言すると、貫通孔３を７個形成しているにもかかわらず、同等の開口面積を有する貫通孔を一つ形成した場合と同じ測定精度となった。また、図６Ｄおよび図６Ｅから明らかなように、７個の貫通孔３を１０μｍの距離に配置した場合のイオン電流のピーク値は、図６Ｅのイオン電流のピーク値よりやや低い値となった。
［サンプルの識別方法の実施例３］
次に、サンプルとして直径２００ｎｍのポリスチレン粒子を用い、貫通孔３の直径を３００ｎｍ、貫通孔３の数を１～７個、貫通孔３の距離を１００ｎｍとなるように配置したデバイスを用いた実験を行った。図７Ａ～図７Ｅは、イオン電流の測定結果を示すチャートである。図７Ａ～図７Ｅから明らかなように、貫通孔３の数を多くするほど、イオン電流のピーク値は小さくなった。一方、貫通孔３の数が多い程、単位時間当たりのピークの数、換言すると、単位時間当たりに貫通孔３を通過するサンプルの数が多くなることを確認した。
次に、サンプルとして直径２００ｎｍのポリスチレン粒子を用い、貫通孔３の直径を３００ｎｍ、貫通孔３の数を１～７個、貫通孔３の距離を１００ｎｍとなるように配置したデバイスを用いた実験を行った。図７Ａ～図７Ｅは、イオン電流の測定結果を示すチャートである。図７Ａ～図７Ｅから明らかなように、貫通孔３の数を多くするほど、イオン電流のピーク値は小さくなった。一方、貫通孔３の数が多い程、単位時間当たりのピークの数、換言すると、単位時間当たりに貫通孔３を通過するサンプルの数が多くなることを確認した。
以上の結果より、基板２上に形成する貫通孔３の数を多くするほど、隣り合う貫通孔３の距離を長くした方がイオン電流のピーク値が大きくなることから、識別精度（測定感度）が向上すること、および、貫通孔３の数を多くするほど、単位時間当たりに貫通孔３を通過するサンプルの数が多くなることからが明らかとなった。したがって、形成する貫通孔３の数と識別精度を考慮し、単位面積当たりに形成する貫通孔３の数と距離を適宜調整すればよい。
［サンプルの識別方法の実施例４］
次に、貫通孔３の距離を更に詳細に検討する実験を行った。サンプルとして直径７８０ｎｍのポリスチレン粒子を用い、直径は１．２μｍの貫通孔３を２個配置し、貫通孔３の距離を３０ｎｍ（図８Ｂ）、５０ｎｍ（図８Ｃ）、１００ｎｍ（図８Ｄ）、２００ｎｍ（図８Ｅ）、４００ｎｍ（図８Ｆ）、６００ｎｍ（図８Ｇ）、１０００ｎｍ（図８Ｈ）、と変化させた。比較対象として、直径１．４４μｍの貫通孔３を１個配置したデバイス（図８Ａ）でも実験を行った。なお、図８Ａ～図８Ｈは、複数のサンプルが貫通孔３を通過した際のイオン電流の測定値を重ね合わせたグラフであり、横軸はイオン電流のピーク値、縦軸は該当するイオン電流のピーク値を示したサンプルの数を表す。
次に、貫通孔３の距離を更に詳細に検討する実験を行った。サンプルとして直径７８０ｎｍのポリスチレン粒子を用い、直径は１．２μｍの貫通孔３を２個配置し、貫通孔３の距離を３０ｎｍ（図８Ｂ）、５０ｎｍ（図８Ｃ）、１００ｎｍ（図８Ｄ）、２００ｎｍ（図８Ｅ）、４００ｎｍ（図８Ｆ）、６００ｎｍ（図８Ｇ）、１０００ｎｍ（図８Ｈ）、と変化させた。比較対象として、直径１．４４μｍの貫通孔３を１個配置したデバイス（図８Ａ）でも実験を行った。なお、図８Ａ～図８Ｈは、複数のサンプルが貫通孔３を通過した際のイオン電流の測定値を重ね合わせたグラフであり、横軸はイオン電流のピーク値、縦軸は該当するイオン電流のピーク値を示したサンプルの数を表す。
図８Ａに示す通り、サンプルサイズに比較して貫通孔３のサイズが比較的大きい場合には、イオン電流のピーク値の分布は大きく二つに分かれた。これは、サンプルが貫通孔３を通過する際に、貫通孔３の中央付近を通過した場合と、貫通孔３の周辺部分を通過した場合では、その瞬間に生じる電場の不均一性が異なるため、中央付近を通過した時には周辺部分を通過した時に比して小さなイオン電流の減少が起きることから、粒子のポア通過位置に応じたイオン電流の分布が観測されたためと考えられる。一方、図８Ｂに示すように、貫通孔３の距離が３０ｎｍと非常に短い場合は、図８Ａと同様、イオン電流のピーク値の分布は大きく２つに分かれたが、図８Ｃ～図８Ｈから明らかなように、貫通孔３の距離が長くなるにしたがってイオン電流のピーク値の２つの異なる分布の差は小さくなった。そして、図８Ｅに示すように、貫通孔３の距離を２００ｎｍとした場合には、イオン電流のピーク値の明確な２つの分布は見られなくなり、加えて、分布のピーク位置がそれ以上ポア間の距離を離しても変わらず一定であった。以上の結果より、貫通孔３を少なくとも２以上形成する場合は、貫通孔３の距離を２００ｎｍ以上とすることが好ましいことが明らかとなった。
［サンプルの識別方法の実施例５］
次に、サンプルとして直径５１０ｎｍ、７８０ｎｍ、９００ｎｍの３種類のポリスチレン粒子を用い、直径が１．２μｍの貫通孔３を７個配置したデバイスを用いてサンプルの識別実験を行った。図９Ａは、貫通孔３の距離が全て１０μｍの場合のイオン電流のピーク値の分布を示すグラフ、図９Ｂは貫通孔３の距離が全て１００ｎｍの場合のイオン電流のピーク値の分布を示すグラフである。図９Ｂのグラフから明らかなように、貫通孔３の距離を１００ｎｍとした場合には、サンプルのサイズが７８０ｎｍと９００ｎｍのイオン電流のピークが重なり、サンプルの識別は困難であった。一方、図９Ａのグラフから明らかなように、貫通孔３の距離を長くした場合には、サンプルのサイズに応じたイオン電流のピーク分布が得られ、サイズが異なるサンプルであっても、識別をすることができた。
次に、サンプルとして直径５１０ｎｍ、７８０ｎｍ、９００ｎｍの３種類のポリスチレン粒子を用い、直径が１．２μｍの貫通孔３を７個配置したデバイスを用いてサンプルの識別実験を行った。図９Ａは、貫通孔３の距離が全て１０μｍの場合のイオン電流のピーク値の分布を示すグラフ、図９Ｂは貫通孔３の距離が全て１００ｎｍの場合のイオン電流のピーク値の分布を示すグラフである。図９Ｂのグラフから明らかなように、貫通孔３の距離を１００ｎｍとした場合には、サンプルのサイズが７８０ｎｍと９００ｎｍのイオン電流のピークが重なり、サンプルの識別は困難であった。一方、図９Ａのグラフから明らかなように、貫通孔３の距離を長くした場合には、サンプルのサイズに応じたイオン電流のピーク分布が得られ、サイズが異なるサンプルであっても、識別をすることができた。
［サンプルの識別方法の実施例６］
次に、サンプルとして７８０ｎｍのポリスチレン粒子を用い、直径が１．２μｍの貫通孔３を２個配置したデバイスを用いてイオン電流の測定を行った。図１０Ａは貫通孔３の距離が１００ｎｍ、図１０Ｂは貫通孔３の距離が１μｍ、図１０Ｃは貫通孔３の距離が１０μｍで、図１０Ａ～図１０Ｃの上段はイオン電流測定の際のベース電流の変化を示すグラフ、下段は個々のサンプルが貫通孔３を通過する際のイオン電流のピーク値の変化をドットとして示したグラフである。上段の矢印で示した箇所は、貫通孔３にサンプルが詰まったため、ベース電流が大幅に変化した箇所（時間）を表している。下段の矢印も、貫通孔３にサンプルが詰まった箇所（時間）を表している。図１０Ａに示す通り、貫通孔３の距離が短い場合は、貫通孔３が詰まった後では、検出するイオン電流のピーク値に顕著な変化が見られた。一方、図１０Ｂ及び図１０Ｃから明らかなように、貫通孔３の距離を長くするほど、詰まった後のイオン電流のピーク値の変化は小さくなった。以上の結果から、貫通孔３の距離を長くするほど、仮に、貫通孔３の何れかがサンプルにより目詰まりを起こしても、測定結果に影響を及ぼしにくいという顕著な効果を奏することが明らかとなった。
次に、サンプルとして７８０ｎｍのポリスチレン粒子を用い、直径が１．２μｍの貫通孔３を２個配置したデバイスを用いてイオン電流の測定を行った。図１０Ａは貫通孔３の距離が１００ｎｍ、図１０Ｂは貫通孔３の距離が１μｍ、図１０Ｃは貫通孔３の距離が１０μｍで、図１０Ａ～図１０Ｃの上段はイオン電流測定の際のベース電流の変化を示すグラフ、下段は個々のサンプルが貫通孔３を通過する際のイオン電流のピーク値の変化をドットとして示したグラフである。上段の矢印で示した箇所は、貫通孔３にサンプルが詰まったため、ベース電流が大幅に変化した箇所（時間）を表している。下段の矢印も、貫通孔３にサンプルが詰まった箇所（時間）を表している。図１０Ａに示す通り、貫通孔３の距離が短い場合は、貫通孔３が詰まった後では、検出するイオン電流のピーク値に顕著な変化が見られた。一方、図１０Ｂ及び図１０Ｃから明らかなように、貫通孔３の距離を長くするほど、詰まった後のイオン電流のピーク値の変化は小さくなった。以上の結果から、貫通孔３の距離を長くするほど、仮に、貫通孔３の何れかがサンプルにより目詰まりを起こしても、測定結果に影響を及ぼしにくいという顕著な効果を奏することが明らかとなった。
なお、サンプルの識別方法の実施例１～６では、貫通孔３と貫通孔３の距離が１０μｍまでの例で実施したが、測定結果から、貫通孔３と貫通孔３の距離を長くした方が、識別精度との観点では望ましいことは明らかである。したがって、必要に応じて、貫通孔３と貫通孔３との距離を、１０μｍより長く、例えば、１１μｍ以上、１２μｍ以上、１３μｍ以上、１４μｍ以上、としてもよい。
本明細書で開示するデバイスを用いてサンプル識別方法を実施すると、サンプルの識別精度が向上し、サイズの異なるサンプルであっても識別ができる。したがって、分析機器産業における分析装置の開発に有用である。
１、１ａ、１ｂ…サンプル識別用デバイス、２…基板、３…貫通孔、５…第１チャンバー、６…第２チャンバー、７…電流計、８…解析部、９…表示部、１０…プログラムメモリ、１１…制御部、２１…第１面、２２…第２面、３１…第１開口、３２…第２開口、５１…第１チャンバー部材、５２…第１電極、５３…リード、５４…電源、５５…アース、６１…第２チャンバー部材、６２…第２電極、６３…リード、６４…アース、１００…識別装置、Ｓ１、Ｓ２…サンプル
Claims (4)
- サンプル液中のサンプルの識別方法であって、
該識別方法は、
前記サンプルを、基板に形成した貫通孔を通過させるサンプル通過工程と、
前記サンプルが、前記貫通孔を通過する時のイオン電流の変化を測定するイオン電流測定工程と、
測定したイオン電流の値から、前記サンプル液中のサンプルを識別するサンプル識別工程と、
を少なくとも含み、
前記サンプルを識別するサンプル識別用デバイスが、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記基板には、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通する２以上の貫通孔が形成され、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、前記サンプル識別用デバイスを用いるサンプル識別方法。 - 前記サンプル液には、サイズが異なるサンプルが含まれている、
請求項１に記載のサンプル識別方法。 - サンプル液中のサンプルの識別方法に用いるデバイスであって、
該デバイスは、
基板と、
該基板に形成された２以上の貫通孔と、
前記基板の第１面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材と、
前記基板の第２面側の少なくとも前記貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材と
を含み、
前記２以上の貫通孔は、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間を貫通し、隣り合う前記貫通孔同士の距離が１０μｍより長く離れるように配置されている、
サンプル識別用デバイス。 - 請求項３に記載のサンプル識別用デバイスと、
前記第１チャンバーに形成された第１電極と、
前記第２チャンバーに形成された第２電極と、
サンプルが前記貫通孔を通過する時のイオン電流を計測するための電流計と、
を含む、
サンプル識別装置。
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