JP7237388B2 - ナノポア構造体、ナノポア構造体を含む塩基配列解析装置 - Google Patents

ナノポア構造体、ナノポア構造体を含む塩基配列解析装置 Download PDF

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Description

本発明の一実施形態は、ナノスケールの貫通孔が金属の薄膜で形成されたナノポア構造体、及びナノポア構造体を含むＤＮＡ及びＲＮＡ等における塩基配列を解析する装置に関する。
ナノポアと呼ばれるナノスケールの細孔を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基配列を解析するための装置及び方法の開発が進められている。例えば、環状のタンパク質によりナノポアを形成し、当該ナノポアをＤＮＡ鎖が通過するときのイオン電流を計測して塩基配列を解読する塩基配列解析装置（ＤＮＡシーケンサ）が開示されている（特許文献１参照）。
特開２０１５－５３５１７９号公報
特許文献１に開示されたナノポアは、タンパク質を用いているため機械的な耐久性、安定性、耐熱性に問題がある。また、タンパク質により形成されたナノポアは、一度解析に使用すると再利用できないという問題がある。これに対し、ナノポアを金属材料や半導体材料を用いて形成する試みもなされているが、最先端の微細加工技術によっても１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアの製造は困難であり、実用化には至っていない。
このような課題に鑑み、本発明は、従来技術とは異なるアプローチによって作製される新たな構造を有するナノポア構造体を提供することを目的の一つとする。また、本発明は新たな構造を有するナノポア構造体を用いた塩基配列解析装置を提供することを目的の一つとする。
本発明は、フォトリソグラフィーやエッチングといった微細加工技術のみによらず、電気化学的方法を適用することで、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアおよびこれを用いた塩基配列解析装置を実現することを可能としている。
本発明の一実施形態に係るナノポア構造体は、薄膜状であり、貫通孔を有する第１金属部材と、貫通孔の孔径を狭窄するように設けられた第２金属部材と、を有し、第１金属部材と第２金属部材とによって、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアを含む。
本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置は、シスチャンバとトランスチャンバと、シスチャンバと前記トランスチャンバとの間のナノポア構造体と、シスチャンバに設けられた第１電極（作用電極）と、トランスチャンバに設けられた第２電極（対電極）、及び第３電極（参照電極２）と、を有する。ナノポア構造体は、薄膜状であり、シスチャンバとトランスチャンバとを連通させる貫通孔が設けられた第１金属部材と、貫通孔の孔径を狭窄するように設けられた第２金属部材と、を含み、第１金属部材と第２金属部材とによって、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアが形成されている。
本発明の一実施形態によれば、複数種の金属材料を組み合わせることによって、無機材料で形成されたナノポア構造体を提供することができる。具体的には、第１金属部材の貫通孔の開孔端部に無電解めっきの反応によって第２金属部材を設けることで、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアを有するナノポア構造体を提供することができる。また、これを用いた塩基配列解析装置を提供することができる。
本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の平面図を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面図を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の平面図を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面図を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示し、自己組織化単分子膜が第１金属部材及び第２金属部材に形成される形態を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示し、自己組織化単分子膜が第２金属部材のナノポア部分に形成される形態を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の平面構造を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の断面構造を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係るナノポア構造体の作製方法を示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の構成を示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の測定モードを説明する図であり、イオン電流の測定原理を模式的に示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の測定モードを説明する図であり、トンネル電流の測定原理を模式的に示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の構成を示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の構成を示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置における複数のナノポア付き電極と、その接続先を切り替える選択回路の一例を示す。 本発明の一実施形態に係る塩基配列解析装置の動作を説明するタイミングチャートを示す。 実施例１で作製された試料のＳＥＭ像を示す。 実施例２で評価された試料のＳＥＭ像を示す。
以下、本発明の実施の形態を、図面等を参照しながら説明する。但し、本発明は多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に例示する実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。図面は説明をより明確にするため、実際の態様に比べ、各部の幅、厚さ、形状等について模式的に表される場合があるが、あくまで一例であって、本発明の解釈を限定するものではない。また、本明細書と各図において、既出の図に関して前述したものと同様の要素には、同一の符号（又は数字の後にａ、ｂなどを付した符号）を付して詳細な説明を適宜省略することがある。さらに各要素に対する「第１」、「第２」と付記された文字は、各要素を区別するために用いられる便宜的な標識であり、特段の説明がない限りそれ以上の意味を有しない。
１．ナノポア構造体
本発明の一実施形態に係るナノポア構造体は、貫通孔を有する第１金属部材と、当該貫通孔を狭窄するように設けられた第２金属部材とにより形成される。以下、このようなナノポア構造体の詳細を説明する。
１－１．第１の実施形態
図１Ａは、本発明の一実施形態に係るナノポア構造体１００ａの平面模式図を示す。ナノポア構造体１００ａは、第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６を含み、第１金属部材１１０に貫通孔１１２が設けられた構造を有する。ナノポア構造体１００ａは、第２金属部材１１６が第１金属部材１１０の上に設けられ、貫通孔１１２を狭窄するように配置されることでナノポア１０２が形成されている。
第１金属部材１１０は薄膜であり、所定の厚さを有している。貫通孔１１２は第１金属部材１１０が除去された空孔であり、貫通孔１１２の側壁面は第１金属部材１１０が露出している。貫通孔１１２の形状は任意であり、平面視で、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形など様々な形状で設けることができる。貫通孔１１２の孔径は８ｎｍ～４０ｎｍの大きさを有し、この大きさは、貫通孔１１２が円形であれば直径を指し、正方形であれば対角線長を指すものとする。貫通孔１１２を単体として見れば、ＤＮＡ等の塩基配列を解析するためのナノポアとして機能させるのに適したサイズより比較的大きなサイズを有している。
第２金属部材１１６は、島状に孤立した構造、島状の構造が集合して連なった構造、膜状に連続する構造などいくつかの形状を有し得る。このような第２金属部材１１６として、図１Ａは第２金属部材１１６が島状の状態で設けられた態様を示す。第２金属部材１１６は、少なくとも１つが貫通孔１１２の開孔端部と重なるように設けられる。図１Ａに示すように、第２金属部材１１６は複数個が連接し、貫通孔１１２の開孔端部を囲むように設けられていてもよい。第２金属部材１１６は、貫通孔１１２の孔の部分にせり出すように設けられる。貫通孔１１２は、第２金属部材１１６により孔径が狭められることとなる。ナノポア１０２は、貫通孔１１２が第２金属部材１１６によって狭窄された部分に形成される。すなわち、ナノポア１０２は、第１金属部材１１０に設けられた貫通孔１１２と第２金属部材１１６とが複合することによって形成される。なお、第２金属部材１１６は、第１金属部材１１０の貫通孔１１２以外の表面の任意の箇所にも存在し得るがナノポア１０２と関係がないので図示しない。
このように、ナノポア構造体１００ａは、貫通孔１１２を有する第１金属部材１１０と、貫通孔１１２を狭窄するように設けられた第２金属部材１１６とによって形成されるナノポア１０２を有している。なお、本発明においてナノポアの孔径とは、第２金属部材によって形成される孔の直径を指す。ナノポアが、平面視で円形の場合にはその直径を指し、円形又は円形とみなせる形状以外の場合には、｛２×（第２金属部材によって形成される開孔の平面視における面積／円周率）｝１／２によって求められる、開孔の大きさを円に換算したときの直径をナノポアの孔径というものとする。ナノポア１０２の実質的な孔径は、１０ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ～５ｎｍの大きさを有する。
図１Ａに示すＡ１－Ａ２線に対応する断面構造を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すナノポア構造体１００ａは、第１金属部材１１０が絶縁膜１０６の上に設けられ、絶縁膜１０６は支持部材１０４によって支持された構造を有する。第１金属部材１１０に設けられた貫通孔１１２に対し、絶縁膜１０６には貫通孔１１２と重なり、略同一の孔径を有する貫通孔１１３が設けられている。支持部材１０４は、貫通孔１１３と重ならない位置で絶縁膜１０６に接して設けられている。
図１Ｂに示すように、第１金属部材１１０と絶縁膜１０６との間には、下地金属膜１０８が設けられていてもよい。ナノポア構造体１００ａにおいて、下地金属膜１０８は必須の構成とはならないが、第１金属部材１１０が絶縁膜１０６上で安定して支持されるように（すなわち、密着性を高めるために）、必要に応じて設けられる。
図１Ｂは、ナノポア構造体１００ａを断面視したとき、貫通孔１１２の一端に第２金属部材１１６ａが設けられ、一端に対向する他端に第２金属部材１１６ｂが設けられる形態を示す。第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、ナノスケールの島状構造を有し、外観形状が山型状であり球状表面を有している。このような形状を有している第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、第１金属部材１１０の上面から貫通孔１１２の側壁面（第１金属部材１１０の側面）に接するように設けられている。ここで、球状表面とは曲率半径が連続的に変化しつつ曲面が連続する曲面をいうものとし、真球表面のみに限定されるものではない。
ナノポア構造体１００ａは、第１金属部材１１０と第２金属部材１１６ａ、１１６ｂとが異なる金属材料で形成される。第１金属部材１１０を形成する好適な金属材料としては、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）等の遷移元素が例示される。また、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂを形成する好適な金属材料としては、金（Ａｕ）が例示される。
ナノポア構造体１００ａの作製方法は後述されるが、少なくとも第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、無電解めっき法により作製される。無電解めっき法を採用することにより、ナノスケールの大きさを有する第２金属部材１１６ａ、１１６ｂを、第１金属部材１１０の表面に選択的に形成することができる。すなわち、無電解めっき法を採用することにより、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂを、絶縁膜１０６及び下地金属膜１０８の表面に付着させることなく、第１金属部材１１０の表面に、かつ貫通孔１１２の孔径を狭窄するように設けることができる。
第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、結晶構造を有していてもよい。図１Ｂは、第１金属部材１１０が多結晶構造を有し、結晶粒１１４ａ、１１４ｂを含み、第２金属部材１１６ａが結晶領域１１８ａ、１１８ｂを含む態様を模式的に示している。ここで、結晶領域１１８ａは結晶粒１１４ａに対応し、結晶領域１１８ｂは結晶粒１１４ｂに対応するように設けられている。この場合において、第１金属部材１１０と第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは異種金属であるが、結晶領域１１８ａ、１１８ｂは、それぞれ結晶粒１１４ａ、１１４ｂからヘテロエピタキシャル成長した領域として形成されていることが好ましい。
結晶領域１１８ａ、１１８ｂが、結晶粒１１４ａ、１１４ｂからヘテロエピタキシャル成長するためには格子が整合する必要がある。具体的には、第１金属部材１１０の格子定数と、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの格子定数との格子不整合の割合は３５％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが望まれる。
例えば、第１金属部材１１０として例示される白金（Ｐｔ）の格子定数は０．３９２４２ｎｍ、パラジウム（Ｐｄ）の格子定数は０．３８９０７ｎｍであり、第２金属部材１１６として例示される金（Ａｕ）の格子定数は０．４０７８２ｎｍである。白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）と金（Ａｕ）、格子不整合の割合（ミスフィット率）はそれぞれ３．９％、４．６％となるので、白金（Ｐｔ）、あるいはパラジウム（Ｐｄ）で形成される結晶粒１１４の表面に金（Ａｕ）で形成される第２金属部材１１６をヘテロエピタキシャル成長することが可能となる。
第１金属部材１１０からヘテロエピタキシャル成長した結晶領域を含む第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、ナノスケールの島状構造を有する。第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、断面視において球状の形状を有する。ナノスケールの島状構造を有する第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの大きさは、平面視において（第１金属部材１１０を上面から見た場合において）、一端から他端までの幅が５０ｎｍ以下、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以下の大きさを有する。また、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、第１金属部材１１０の表面から、４０ｎｍ以下、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以下の高さを有する。
なお、本発明において、ナノスケールの島状構造とは約５０ｎｍ以下の大きさを有する個体を指すものとする。第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、濡れ性の高い状態でヘテロエピタキシャル成長することにより、球状の突起を形成している。無電解めっきは、下地金属膜１０８表面では進行しないため、ナノスケールの第１金属部材１１０と下地金属膜１０８の境界を、第２金属部材の球状突起は端部として有する。したがって、第１金属部材１１０と下地金属膜１０８の界面を孔内に延長した直線に対する、第２金属部材の球状突起の角度を定義できる。正の角度は、第２金属部材の球状突起が、下地金属膜１０８側にせり出していない状況で、負の角度は、下地金属膜１０８側にせり出している状況である。この角度は正であることが好ましいが、負となってもよい。
第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、異なる結晶方位を有する結晶領域を含み、断面視において円形となっている。これは、曲率半径の逆数に比例する表面張力が、曲率半径が１５ｎｍ以下になると極めて大きくなり、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂを構成する原子は、表面自己拡散し表面エネルギーを最小にするように断面が円形になるためである。第２金属部材１１６ａ、１１６ｂを断面視したとき、その円形状は、下地金属膜１０８と第１金属部材１１０の界面を円の一部が通過する構造となる。
第１金属部材１１０が白金（Ｐｔ）であり、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂが金（Ａｕ）である場合、金（Ａｕ）の曲率半径が小さくなると、表面エネルギーを小さくするように金（Ａｕ）は球状になる。白金（Ｐｔ）は、金（Ａｕ）と比較すると、固く、表面自己拡散係数が桁違いに小さい。そのため、白金（Ｐｔ）上でヘテロエピタキシャル成長した金（Ａｕ）は、白金（Ｐｔ）と接している部分では、金（Ａｕ）原子が白金（Ｐｔ）原子によりピニングされて動きにくくなる。そのため、金（Ａｕ）の粒子は、白金（Ｐｔ）と接している部分で固定され、表面エネルギーを小さくするように曲率半径が小さな球状になる。
このような状態は、貫通孔１１２の孔径を狭窄するように設けられた第２金属部材１１６ａ、１１６ｂが安定的にナノポア１０２の形状を維持できることを意味している。例えば、図１Ａに示すように、球状表面を有する第２金属部材１１６で貫通孔１１２の周囲を囲むことにより、孔の形状を円形状に保った状態でナノポア１０２の構造を維持することが可能となる。
さらに、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの曲率半径が小さくなると、ナノポア１０２において、試料に近接する最近接の金属原子が１つとなり、その大きさは例えばＤＮＡの塩基間距離である０．３６ｎｍよりも小さいことにより、空間分解能を高くすることができ、後述するようにトンネル電流によってＤＮＡからナノポア１０２に電流が流れる際に、１塩基毎に流れる電流を読み取ることが可能となる。
また、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの曲率半径がＤＮＡの断面長と同等になると、ナノポアを介してトランスチャンバ－シスチャンバ間を流れるイオン電流が、塩基の影響を強く受けるようになり、塩基種の読み取り精度が向上する。
ところで、ナノポア構造体１００ａは、ナノポア１０２の孔径を精密に制御する必要がある。第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは、前述のように、無電解めっきによる化学的な成膜法で作製される。上述のように、第２金属部材１１６ａ、第２金属部材１１６ｂの狭窄によってナノポア１０２を形成しようとする場合、無電解めっきの制御が問題になると考えらえる。
仮に、無電解めっきにより、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの成長が無限に続くのであれば、貫通孔１１２を塞いでしまうので、反応を時間で制御する必要がある。その場合、ナノポア１０２の孔径は、製造ごとのばらつきが大きくなってしまうことが懸念される。
しかしながら、本実施形態で詳述される無電解めっきによれば、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの成長は無限に続くのではなく、自動的に停止する。図１Ｂに示すような構造において、第２金属部材１１６ａと第２金属部材１１６ｂの間隔が狭まるとヘルムホルツ層（電極表面に吸着した溶媒や溶質分子、溶質イオンの層）が形成される。ヘルムホルツ層が形成されると、無電解めっき液中の金属イオンが間隙の中に入っていけない状態となる。これにより、第２金属部材１１６ａと第２金属部材１１６ｂの相対する領域のめっき成長が自動的に停止する。
無電解めっき法では、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂは第１金属部材１１０の表面に選択的に成長し、他の分部（例えば、下地金属膜１０８）には成長しない。また、第１金属部材１１０に形成される貫通孔１１２の開孔端部は無電解めっき液の中で電界集中が起きて核生成確率が高くなるため、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂが確実に成長する。この場合、第１金属部材１１０の厚さは、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの曲率半径に影響を与える。
例えば、図２Ａに示すように、第１金属部材１１０の膜厚がｔ１であるとき、第２金属部材１１６ａの曲率半径がｒ１となる場合、ｔ１がｒ１と等しくなるとき、角度は０度となる。さらにめっきを進行させてｔ１＜ｒ１の状態をつくる際には、第２金属部材１１６の内部応力が大きくなるため、めっきの進行が、ｔ１＞ｒ１の場合と比較して遅くなり、めっきの進行を抑制することができる。このため、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの曲率半径ｒ１、ｒ２は、第１金属部材１１０の厚さｔ１と同等の値に制御することが可能である。なお、めっき時間を長くすると、さらにめっきは進行するため、ｔ１＜ｒ１の状態をつくることも可能である。
図２Ｂに示すように第１金属部材１１０の膜厚をｔ１より小さいｔ２とすると、めっき条件を選択することにより第２金属部材１１６ａの曲率半径はｒ１からｒ２へと小さくなる。このように、本実施形態によれば、第１金属部材１１０の膜厚を調整することにより、第２金属部材１１６ａの曲率半径を制御することができる。
このように、ナノポア１０２の孔径は、上記のめっきの自動停止と、第１金属部材１１０の膜厚がｔ１と初期孔径の組み合わせによる制御という、２つの方法で制御できる。
第１金属部材１１０の厚さは、２０ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、さらに好ましくは５ｎｍ以下、さらにこのましくは３ｎｍ以下とすることができる。ただし、第１金属部材１１０を薄くする場合には、無電解めっきによる孔径の低減幅が制限されるため、貫通孔１１２の孔径（正方形の１辺の長さ、あるいは円孔の直径）の径は、第１金属部材１１０の膜厚とほぼ等しいことが好ましい。
第１金属部材１１０の膜厚ｔ１による曲率半径の制御は、めっき時間をさらに長くすると、めっきが再び進行し始め、ｒ１がｔ１を超えることがある。この際にも、イオン半径に起因した自己停止機能は、有効である。
第２金属部材１１６が球状の断面形状を有しているのは、無電解めっきにより第１金属部材１１０の表面に成長したことに起因している。例えば、斜め蒸着法のような物理的堆積法では、影とならない部分は一様に蒸着されるため、堆積される薄膜の膜厚は一様となり、第１金属部材１１０と下地金属膜１０８の境界に関係なく蒸着されるため、曲率半径は有しない構造となる。また、斜め蒸着法では、第１金属部材１１０のみでなく、下地金属膜１０８、さらには絶縁膜１０６の部分にも薄膜が形成され得る。
本実施形態では、無電解めっきで発現される自己停止機能を利用することで、ナノポア１０２の孔径を精密に制御することができる。別言すれば、ナノポア１０２の孔径は、フォトリソグラフィー及びエッチング等の微細加工技術によって制御するのではなく、無電解めっきの２つの反応律速によって制御されるため、１０ｎｍ以下の孔径を再現性良く精密に制御することができる。
なお、図１Ｂにおいて示す支持部材１０４、絶縁膜１０６、下地金属膜１０８の材料に限定はない。例えば、支持部材１０４としては、熱的に安定なシリコン基板（シリコンウェハ）を用いることができる。絶縁膜１０６としては、酸化シリコン膜、窒化シリコン膜、酸化アルミニウム膜等の無機絶縁材料を用いることができ、下地金属膜１０８としては、チタン（Ｔｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、クロム（Ｃｒ）等の金属材料を用いることができる。
このように、本実施形態に係るナノポア構造体１００ａは、第１金属部材１１０に形成された貫通孔１１２の孔径を狭窄するように、１つ以上のナノスケールの島状構造を有する第２金属部材１１６を設けることで、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポア１０２を得ることができる。
１－２．第２の実施形態
第１の実施形態は、第２金属部材１１６がナノスケールの島状構造を有しているのに対し、第２の実施形態は、第１金属部材１１０の上で第２金属部材１１６が連続する構造を有する。
図３Ａは、ナノポア構造体１００ｂの平面図を示す。ナノポア構造体１００ｂは、第１金属部材１１０上で第２金属部材１１６が連続する構造を有している点で第１の実施形態と相違する。ナノポア構造体１００ｂは、ナノポア１０２の孔径を含め、他の部材は第１の実施形態に係るナノポア構造体１００ａと同様である。
図３Ａに示すＡ３－Ａ４線に対応する断面構造を、図３Ｂに示す。第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６を形成する金属材料は、第１の実施形態で示すものと同様である。第１金属部材１１０は多結晶構造を有し、複数の結晶粒１１４を含む。図３Ｂは、第１金属部材１１０に結晶粒１１４ｃ、１１４ｄ、１１４ｅ、１１４ｆが含まれる形態を模式的に示す。
第２金属部材１１６は、結晶粒１１４ｃ、１１４ｄ、１１４ｅ、１１４ｆに対応してヘテロエピタキシャル成長した結晶領域１１８ｃ、１１８ｄ、１１８ｅ、１１８ｆを含む。このような結晶性を有する第２金属部材１１６は、無電解めっきにより作製される。
第１金属部材１１０は、また、アモルファス領域１１５が含まれていてもよい。無電解めっきでは、アモルファス領域１１５においても核生成が起こるため、第２金属部材１１６がその領域にも成長する。アモルファス領域１１５上に成長する第２金属部材１１６はアモルファス状態となる（アモルファス領域１１９）。また、第１金属部材１１０の上に第２金属部材１１６がヘテロエピタキシャル成長する場合、成長の途中で格子歪みなどが生じ、アモルファス領域が含まれる場合がある。このように、第２金属部材１１６は、ヘテロエピタキシャル成長した複数の結晶領域１１８ｃ、１１８ｄ、１１８ｅ、１１８ｆを含み、さらにアモルファス領域１１５を含み得る。
第１金属部材１１０と第２金属部材１１６とは、ヘテロエピタキシャル成長した界面を含むため、異種金属間で結晶の連続性が保たれた状態にあり、構造の熱的安定性が高い状態にある。そのためナノポア構造体１００ｂの形状を安定に保つことができる。
図３Ｂに示すように、第２金属部材１１６は、第１金属部材１１０の貫通孔１１２の開孔端部を連続的に囲むように設けられる。第２金属部材１１６は、第１金属部材１１０の上面から貫通孔１１２の側壁面にかけて連続し、貫通孔１１２の孔の部分にせり出すように設けられる。第１実施形態と同様に、第２金属部材１１６は、貫通孔１１２の孔の部分にせり出し、その孔径を狭窄するように設けられる。
第２金属部材１１６は、無電解めっきによって第１金属部材１１の上に形成される。第２金属部材１１６は、第１の実施形態が球状の島状構造であるのに対して、第２の実施形態は連続する構造を有している。このような構造の違いは無電解めっきの条件及び／又は前処理条件によって制御することができる。例えば、前処理によって第１金属部材１１０の表面状態を変化させ、核生成密度を高めるようにすることで、無電解めっきによって膜状に連続する構造の第２金属部材１１６を形成することができる。
図３Ａ及び図３Ｂに示す構造は、第１金属部材１１０からエピタキシャル成長した第２金属部材１１６が、結晶粒界を含みつつ繋がって貫通孔１１２の開孔端部を連続的に覆う構造を有している。ナノポア１０２は、所定の曲率半径を有する結晶粒が、連続する曲面で周を成すように繋がった表面を有している。表面張力は、半径の逆数に比例して大きくなるため、ナノポア１０２の内側表面は、球状の表面が繋がった周構造となる。
このように、第２の実施形態に係るナノポア構造体１００ｂは、第１金属部材１１０に形成された貫通孔１１２の孔径を狭窄するように、連続する構造を有する第２金属部材１１６を設けることで、１０ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ～５ｎｍの大きさを有するナノポア１０２を得ることができる。第２の実施形態では、第２金属部材１１６が、第１金属部材１１０の貫通孔１１２の周りを連続的に囲むので、ナノポア１０２の形状を円形に近い形状にすることができる。また、貫通孔１１２の形状が平面視で四角形であっても、第２金属部材１１６が囲むことにより円形に近い形状にすることができる。これにより、ナノポア１０２の形状及び孔径に関して、個体間のばらつきを低減することができる。
ナノポア１０２を形成する第２金属部材１１６の形状は、無電解めっき及び／又は前処理条件によりいくつかの形状を有し得る。貫通孔１１２の開口端部領域において核生成密度が平坦な部分よりも高くなる場合には、貫通孔１１２を囲む部分において、第２金属部材１１６の円形状の部分の高さは、第２金属部材１１６の他の平坦な部分（第１金属部材１１０上の平坦な部分）よりも高くなる。また、第２金属部材１１６の円形状の部分は、第１の実施形態と同様に第１金属部材１１０のみを覆い、下地金属膜１０８表面には第２金属部材１１６は成長しない状態となる。
一方、図４に示すように、貫通孔１１２を囲む領域まで第２金属部材１１６が平坦部と同じ高さで成長し、先端部分の結晶領域１１８ｃが所定の曲率半径を有する球状表面を形成するようにすることもできる。このような形状違いは、無電解めっきのときに下地面となる第１金属部材１１０及び貫通孔１１２の開口端部の表面状態を制御することにより（すなわち、核生成密度を制御することにより）作り分けることができる。
１－３．第３の実施形態
第１の実施形態及び第２の実施形態として示したナノポア構造体において、第２金属部材１１６の表面に自己組織化単分子膜が設けられていてもよい。図５Ａ及び図５Ｂは、第１の実施形態において、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの表面に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）が設けられたナノポア構造体１００ｃの一例を示す。
自己組織化単分子膜１２６は、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂに化学吸着する第１官能基と、第１官能基に結合する第２官能基を含む。第１官能基は、チオール基、ジチオカルバメート基、キサンテート基の何れかの基である。第２官能基は、アルカン、アルケン、アルカン又はアルケンの水素分子の一部又は全部をフッ素に置換したもの、アミノ基、ニトロ基、アミド基、さらに下記の蛍光色素を含む基の何れかの基である。
例えば、自己組織化単分子膜１２６は、アルカンチオールを自己組織化させた単分子膜で形成される。自己組織化単分子膜１２６は、撥水性があり、表面を安定に保つように作用する。自己組織化単分子膜１２６のアルカンチオールの中に，少数のアルカンジチオール（Alkane dithiol）が混在されている。アルカンジチオールは，アルカン鎖の両端に硫黄（Ｓ）を含む結合基チオールを配置したものであり、アルカンチオール単分子膜の所々に硫黄（Ｓ）が存在する形となる。アルカンチオールの中にアルカンジチオールを混入させるには、アルカンジチオールの溶液にアルカンチオール自己組織化単分子膜１２６で被覆された電極を浸漬し、アルカンチオールの一部をアルカンジチオールで置換することにより実現される。
自己組織化単分子膜１２６は、１ｎｍ～５ｎｍの長さを有する。このような長さを有する自己組織化単分子膜１２６を第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの表面に設けることにより、ナノポア１０２の径をさらに狭めることができる。自己組織化単分子膜１２６が形成される範囲は、作製方法を制御することにより、自己組織化単分子膜材料を含む溶液に浸漬した支持部材１０４側から覗くことのできるナノポア１０２の最も狭い部分を超えて、染み出た部分にも形成することもでき、さらには、ナノポア１０２の最も狭い部分までは形成しないように形成することもできる。
自己組織化単分子膜は、自己組織化単分子膜を形成する分子を含む溶液に、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂ及び第１金属部材１１０を浸漬した際に、それらの表面に形成する。したがって、第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６ａ、１１６ｂが存在する側と、支持部材１０４側のいずれかのみに自己組織化単分子膜材料を含む溶液に浸漬すると、自己組織化単分子膜が形成される表面を制御することができる。すなわち、図５Ａに示すように、第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６ａ、１１６ｂが存在する側のみに浸漬すると、ナノポアを形成する第２金属部材１１６ａ、１１６ｂ及び第１金属部材表面に自己組織化単分子膜が形成される。一方、図５Ｂに示すように、支持部材１０４側にのみ自己組織化単分子膜材料を含む溶液に浸漬すると、支持部材側から覗くことのできるナノポア部のみに自己組織化単分子膜を形成することができる。このように自己組織化単分子膜を片側のみに形成する際には、逆側は自己組織化単分子膜材料を含まない溶媒又は溶液とするか、逆側は、溶液に浸漬しない。
片側にのみ自己組織化単分子膜材料を含む溶液に浸漬することによりナノポア狭窄部上面を含む第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの表面及び第１金属部材１１０表面に自己組織化単分子膜１２６が形成されている状況と、ナノポア狭窄部下面と狭窄部表面にのみ自己組織化単分子膜１２６が形成されている状況を作ることができる。
自己組織化単分子膜材料を含む溶液に、構造体全体を浸漬した際には、第２金属部材１１６表面全体及び第１金属部材１１０表面全体に自己組織化単分子膜１２６を形成することもできる。
自己組織化単分子膜１２６は、ＤＮＡ及びＲＮＡに含まれる特定の塩基を標識する蛍光体分子が含まれていてもよい。例えば、ＤＮＡに含まれる４種類の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）のそれぞれに異なる蛍光体を対応させるように、自己組織化単分子膜１２６のそれぞれに異なる蛍光体が含まれるようにすることができる。このような蛍光色素を有する自己組織化単分子膜１２６を設けることで、ナノポア１０２を用いて試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の塩基配列を時系列的な光学シグナルとして解読する際に蛍光分析を行うことができる。
蛍光色素を含む自己組織化単分子膜を形成する際には、絶縁膜１０６の貫通孔１１３側のナノポア狭窄部下面と狭窄部表面にのみ自己組織化単分子膜１２６が形成されていることが好ましい。これにより、シスチャンバ側のナノポア部にのみ、蛍光色素を含む自己組織化単分子膜が形成される。
ＤＮＡ、ＲＮＡにインターカレートする蛍光体としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素などを用いることができる。
蛍光分析を行う際には、励起光はトランスチャンバ側から照射することが好ましいが、シスチャンバから照射しても構わない。蛍光色素はナノポア１０２の部分のみに存在するように自己組織化単分子膜を作製すると、ＤＮＡの塩基との組み合わせで変化する蛍光を、ＳＮ比よく検出することができる。蛍光の検出は、励起光を照射する光学系とハーフミラーなどを利用して、入射側から受光することが好ましい。ナノポア１０２部は金（Ａｕ）を含み、金（Ａｕ）の表面は表面プラズモン増強により、励起光強度が増幅する。これにより、励起光のフォトンは、効率良く蛍光色素を励起することができる。励起光を検出する際に、色素近傍に金属が存在すると消光する場合がある。自己組織化単分子膜により、色素とナノポア部の距離を適度に制御すると、この消光を抑制することができる。
自己組織化単分子膜１２６は、０．３ｎｍ～５ｎｍの長さを有するため、その長さの分だけナノポア１０２の有効な孔径が小さくなる。また、自己組織化単分子膜１２６とＤＮＡ塩基の親和力により、ナノポア１０２の表面が金属の場合と比較すると、第２金属部材１１６と蛍光色素間のクエンチを防ぐことができるので好ましい。
１－４．第４の実施形態
本実施形態に係るナノポアは、金属材料で形成される。そのため、複数の個別電極（電気的に分離された電極）の中にナノポアを作り込むことができる。
図６は、第４の実施形態に係るナノポア構造体１００ｄの平面図を示す。ナノポア構造体１００ｄは、ナノポア１０２を含む電極が絶縁表面に複数個配列された構造を有している。図６は、一例として６個のナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｆが配列された態様を例示している。ナノポア付き電極１２０ａは、ナノポア１０２が略中央部に設けられ、配線１２２によりナノポア構造体１００ｄの周辺部に設けられた電極パッド１２４と接続されている。他のナノポア付き電極１２０ｂ～１２０ｆも同様の構成を有している。
図６に示すＡ５－Ａ６線に対応する断面構造を図７に示す。ナノポア付き電極１２０ａは、絶縁膜１０６上に設けられた第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６によって形成される。ナノポア１０２を形成する第１金属部材１１０、第２金属部材１１６は、第１乃至第３の実施形態で説明した構造を適宜用いることができる。なお、図７には示されないが、配線１２２及び電極パッド１２４は第１金属部材１１０と同じ金属材料で形成することができ、さらにその表面に第２金属部材１１６が形成されていてもよい。
第１金属部材１１０は金属の薄膜で形成されるため、絶縁膜１０６上で複数の領域にパターニングすることができ、それによりナノポア１０２が設けられたナノポア付き電極１２０を集積化することができる。ナノポア１０２が形成されたナノポア付き電極１２０が集積化されたナノポア構造体１００ｃは、後述されるようにＤＮＡシーケンサに用いることができる。ナノポア１０２が設けられたナノポア付き電極１２０は、ＤＮＡシーケンサの中で個々に独立して電位を制御し、ＤＮＡ解読の用途に用いることができる。
絶縁膜１０６の貫通孔１１３を、マイクロ流路として、一本鎖ＤＮＡのからまりをほどく作用を利用する際には、図７の下部をシスチャンバ、上部をトランスチャンバとし、上下反転させて利用することができる。
１－５．ナノポア構造体の作製方法
本実施形態は、無電解金メッキ(Electro-less Au Plating：ＥＬＧＰ)と、電子線ビームリソグラフィ（Electron Beam Lithography：ＥＢＬ）とを組み合わせた作製方法を示す。
基板として、表面に絶縁膜１３１、１３２が形成されたシリコン基板（シリコンウェハ）１３０を用いる。シリコン基板１３０は両面研摩されたものが好ましい。絶縁膜１３１、１３２は、例えば、シリコン基板１３０を熱酸化して形成された酸化シリコン膜である。シリコン基板１３０の厚さは３００μｍ～６００μｍ程度であり、絶縁膜１３１、１３２の厚さは１００ｎｍ～５００ｎｍ、例えば３００ｎｍである。
図８Ａは、シリコン基板１３０の裏面側にフォトレジスト膜１４０を形成する段階を示す。ナノポアを有する電極は、シリコン基板１３０の表面側すなわち絶縁膜１３２の表面）に形成されるので、絶縁膜１３２の表面にもフォトレジスト膜１４０が形成されていてもよい。
図８Ｂは、フォトレジスト膜１４０を露光して現像し、レジストマスク１４１を形成し、裏面の絶縁膜１３１をエッチングする段階を示す。エッチングは、フッ酸などを用いたウェットエッチング、又は反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching：ＲＩＥ）で行われる。レジストマスク１４１の開口部のパターンの大きさは任意であるが、例えば、一辺の長さが１００μｍから５００μｍの大きさで形成される。
図８Ｃは、異方性エッチングによりシリコン基板１３０を裏面からエッチングして、表面側の絶縁膜１３２を露出させる段階を示す。シリコン基板１３０に対しては、例えば、ＣＦ４－Ｏ２系又はＳＦ６－Ｏ２系のエッチングガスにより、誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング（Inductive Coupled Plasma Reactive Ion Etching：ＩＣＰ－ＲＩＥ）により異方性エッチングが行われる。また、シリコン基板１３０は、ある程度の深さまで、ＫＯＨ（水酸化カリウム）、ＴＭＡＨ（水酸化テトラメチルアンモニウム）、ＥＤＰ（エチレンジアミン・ピロかテール）などのアルカリ性水溶液でウェットエッチングをして、その後異方性エッチングを行ってもよい。このエッチングでは、シリコン基板１３０の裏面に残存する絶縁膜１３１をハードマスクとして用いている。
この異方性エッチングにより、シリコン基板１３０には、絶縁膜１３２が裏面側に露出する開口部１３４が形成される。開口部１３４を囲むシリコン基板１３０、絶縁膜１３１は支持部材１０４として用いられる。
次に、図９Ａに示すように、絶縁膜１３２の上面にフォトレジスト膜１４２を形成する。そして、フォトレジスト膜を露光して、図９Ｂに示すようにレジストパターン１４３を形成する。例えば、フォトレジストとして電子ビーム露光用のポジレジストを用い、電子ビーム描画装置を用いて露光を行い、レジストパターン１４３を形成する。レジストパターン１４３の部分はナノポアが形成される部分となる。レジストパターン１４３の平面的な形状は円形であってよいし、正方形であってもよい。
図９Ｃに示すように、レジストパターン１４３が形成された絶縁膜１３２上に第１金属部材１１０となる金属膜を形成する。金属膜は、電子ビーム蒸着又はスパッタリングにより成膜する。金属膜は、２層構造を有していてもよい。例えば、チタン（Ｔｉ）膜と白金膜（Ｐｔ）の２層構造を有していてもよい。金属膜は３ｎｍ～２０ｎｍの膜厚で形成する。例えば、１ｎｍ～３ｎｍのチタン（Ｔｉ）膜の上に、４０ｎｍ以下、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以下、３ｎｍ以上の白金（Ｐｔ）膜を形成する。
その後、図１０Ａに示すように、リフトオフプロセスによりレジストを剥離すると、第１金属部材１１０に貫通孔１１２が形成され、絶縁膜１３２が露出する構造が形成される。なお、図１０Ａには示されないが、この段階で、金属膜をパターニングして、電極パッド及び配線を形成してもよい。
次いで、図１０Ｂに示すように、絶縁膜１３２に貫通孔１１３を形成する。リフトオフによりパターニングされた第１金属部材１１０をマスクとして、反応性イオンエッチングにより、絶縁膜１３２をエッチングして貫通孔１１３を形成する。なお、図１０Ｂに示す絶縁膜１３２及び貫通孔１１３は、図１Ｂ及び図３Ｂに示す絶縁膜１０６及び貫通孔１１３に対応する構成である。
図１０Ｃに示すように、第１金属部材１１０の表面を覆うように第２金属部材１１６を形成する。第２金属部材１１６は無電解めっきにより形成する。第２金属部材１１６は、貫通孔１１３の開口端部を覆い孔径を狭めるように形成される。このような工程により、ナノポア１０２を有するナノポア構造体１００が作製することができる。
なお、図８Ｂ及び図８Ｃに示す、絶縁膜１３１及びシリコン基板１３０を除去して開口部１３４を形成する工程は、ナノポア１０２を形成した後に行ってもよい。
また、図９Ｂに示すレジストパターン１４３を形成せずに、絶縁膜１３２の全面に第１金属部材１１０を形成する金属膜を形成し、集束イオンビーム（Focused Ion Beam：ＦＩＢ）を用いて金属膜及び絶縁膜１３２を部分的に除去する加工を行い、図１０Ｂに示す構造を形成してもよい。
本実施形態において、ナノポア１０２の孔径は、フォトリソグラフィー及びエッチングによる第１金属部材１１０の加工のみによらず、無電解めっきにより第２金属部材１１６を形成することにより制御される。次に、この無電解めっきの詳細について示す。
１－６．無電解めっき
以下に、第２金属部を形成する無電解めっきについて説明する。
１－６－１．無電解めっき液
無電解金めっき液として、金イオン（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）、酸化剤としてのハロゲン元素のイオン、還元剤を含む溶液が用いられる。無電解金めっきにより、白金（Ｐｔ）上に金（Ａｕ）をヘテロエピタキシャル成長させるためには、白金（Ｐｔ）表面に存在する白金酸化物（ＰｔＯ）を還元する必要がある。無電解めっき液は、この還元作用を発現するためにハロゲン元素のイオンと還元剤の組み合わせとして、適切なものを選択している。さらに、還元剤を過剰に含ませることにより還元反応に律速されて金（Ａｕ）が析出するようにしている。さらに、このような無電解金めっき液を多量の純水で希釈して金（Ａｕ）の還元速度を制御し、無電解めっき液中で金（Ａｕ）粒子が析出しないように制御している。
本実施形態で用いられる無電解めっき液は、金（Ａｕ）を溶解させたヨードチンキと、還元剤として用いられるＬ（＋）－アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）とを組み合わせた無電解金めっき液を用いている。このような無電解金めっき液により、白金（Ｐｔ）の結晶表面上への金（Ａｕ）のヘテロエピタキシャル成長を可能としている。無電解金めっき液は、ヨードチンキ由来のヨウ素イオン（Ｉ－、Ｉ３ －）とＬ（＋）－アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）とを含むことで、白金酸化物（ＰｔＯ又はＰｔＯ２）の還元反応を生じさせていると考えられる。
１－６－２．無電解金めっきの方法
無電解めっきは、第１金属部材１１０としての白金（Ｐｔ）膜を無電解金めっき液に浸漬させることにより行われる。第１金属部材１１０としての白金（Ｐｔ）膜を無電解金めっき液に浸漬させると、白金（Ｐｔ）膜の結晶粒の表面に優先的に核生成され、金イオン（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）から還元された金（Ａｕ）が成長する。無電解金めっき液は、前述のように純水で１００倍、好ましくは５００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上に希釈されたものが用いられる。また、無電解めっき液は、還元剤が過剰に含まれている。
本実施形態に係る無電解金めっき液は、希釈前の溶液で還元剤を過剰にいれているため、金（Ａｕ）イオンは、３価の金イオン（Ａｕ３＋）から１価の金イオン（Ａｕ＋）に還元されている。
１価の金イオン（Ａｕ＋）から金（Ａｕ）への、あるいは３価の金イオン（Ａｕ３＋）から１価の金イオン（Ａｕ＋）への還元電位（標準水素電極を基準、２５℃、１０５Ｐａ）は、
Ａｕ＋＋ｅ－→ Ａｕ：１．８２Ｖ
Ａｕ３＋＋２ｅ－→ Ａｕ＋：１．４１Ｖ
Ａｕ３＋＋３ｅ－→ Ａｕ：１．５２Ｖ
である。
また、白金イオン（Ｐｔ）から白金（Ｐｔ）への還元電位は、
Ｐｔ２＋＋２ｅ－→ Ｐｔ：１．１８８Ｖ
である。
３価の金イオン（Ａｕ３＋）から１価の金イオン（Ａｕ＋）に還元されると、金（Ａｕ）への還元電位は高くなり、１価の金イオン（Ａｕ＋）は、３価の金イオン（Ａｕ３＋）と比較すると還元されにくくなっている。純水による希釈により、純水に溶けにくいヨウ素（Ｉ２）は、溶けやすいヨウ素イオン（Ｉ－、Ｉ３ －）に平衡が移り、ヨウ素に対するヨウ素イオンの割合が高くなる。ヨウ素イオンは、金（Ａｕ）をエッチングする作用があるため、過剰に入れた還元剤は、エッチングを抑える効果がある。白金イオン（Ｐｔ２＋）の還元電位（１．１８８Ｖ）と比較して、３価の金イオン（Ａｕ３＋）及び１価の金イオン（Ａｕ＋）の還元電位はそれぞれ１．５２Ｖ、１．８２Ｖと高くなっており、還元されにくい。過剰な還元剤は、白金と金の電気化学的置換反応を、その還元作用により促進するために有効である。
また、本実施形態に係る無電解金めっき液は、純水で１００倍以上、好ましくは５００倍以上に希釈されることにより、金（Ａｕ）を白金（Ｐｔ）等の第１金属部材の上にヘテロエピタキシャル成長させることができる。希釈する割合が小さいと、無電解金めっきの成長速度が速くなり、ヘテロエピタキシャル成長ができなくなり、めっき浴中で核が生成して金ナノ粒子として成長し、その金ナノ粒子が、第１金属部材の表面に物理吸着する可能性が高くなってしまう。１０００倍に希釈したときには、金（Ａｕ）をヘテロエピタキシャル成長させることを可能とする成長速度が得られる。したがって、金（Ａｕ）をヘテロエピタキシャル成長させるためには、上記のように希釈の倍率で、めっきの成長速度を制御するため、純水の希釈割合は重要である。
無電解めっき液に浸漬された第１金属部材１１０としての白金（Ｐｔ）膜やパラジウム（Ｐｄ）膜は、前述のように表面に金（Ａｕ）をヘテロエピタキシャル成長させつつ、無電解金めっき液中では金イオン（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）が還元され析出しそれが第１金属部材１１０の表面に沈積する前に無電解めっき液から取り出される。このような処理を少なくとも１回、好ましく複数回繰り返すことで、第２金属部材１１６としての金（Ａｕ）の領域を形成する。浸漬時間は、無電解金めっき液の濃度、温度によって適宜設定される。例えば、第１金属部材１１０を無電解金めっき液に浸漬させる１回当たりの時間は、３秒～３０秒、例えば１０秒間となるように制御される。
具体的に、金（Ａｕ）を溶解させたヨードチンキと、還元剤として用いられるＬ（＋）－アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）とを組み合わせた無電解金めっき液は、白金（Ｐｔ）膜の表面に形成された白金酸化物（ＰｔＯ）を、ヨードチンキ由来のＩ３ －イオンと還元剤（ここではアスコルビン酸を使用）の組み合わせにより発現される還元反応により白金を還元し、電気化学的置換反応（ＳＬＲＲ）により、金イオン（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）が還元され、白金（Ｐｔ）が白金酸化物（ＰｔＯ）に酸化されることにより、金（Ａｕ）を白金（Ｐｔ）表面でヘテロエピタキシャル成長することが可能な状態を生じさせている。
白金（Ｐｔ）の結晶粒の表面に付着した金（Ａｕ）原子は、ヘテロエピタキシャル成長していることから分かるように、金属－金属結合により動かない。一方、金（Ａｕ）表面で還元された金（Ａｕ）はレイリー不安定性により表面自己拡散し、エネルギーの安定な曲率半径の大きい球形になろうとする。また、２層目以降の金（Ａｕ）原子は堆積した表面でマイグレーションし、エネルギー的に安定な結晶状態を形成する。それにより、白金（Ｐｔ）の結晶粒の表面に、ナノスケールの島状構造を有する金（Ａｕ）の単結晶領域が形成される。
パラジウム（Ｐｄ）の結晶粒の表面に付着した金（Ａｕ）原子は、ヘテロエピタキシャル成長しつつ、金（ＡＵ）はパラジウム（Ｐｄ）膜中に、またパラジウム（Ｐｄ）は無電解めっきされた金（Ａｕ）の中に相互拡散する。また、金（Ａｕ）表面で還元された金（Ａｕ）はレイリー不安定性により表面自己拡散し、エネルギーの安定な曲率半径の大きい球形になろうとする。また、２層目以降の金（Ａｕ）原子は堆積した表面でマイグレーションし、エネルギー的に安定な結晶状態を形成する。それにより、パラジウム（Ｐｄ）の結晶粒中に金は拡散し、ナノスケールの島状構造を有する金（Ａｕ）にはＰｄが拡散した合金からなる結晶領域が形成される。
１－６－３．無電解めっきの前処理
無電解めっきを行う前に、酸化された状態にある第１金属部材１１０の表面を、還元する前処理が行われてもよい。前処理としては、酸化剤と還元剤を含む前処理液が用いられる。具体的には、酸化剤としてヨードチンキ由来のヨウ素イオン（Ｉ－、Ｉ３ －）を用い、還元剤としてＬ（＋）－アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）との組み合わせたものが用いられる。前処理は、このような前処理液の中に第１金属部材１１０を浸漬することで行われる。この前処理により、第１金属部材１１０の表面に形成された白金酸化物（ＰｔＯ）が還元され、白金（Ｐｔ）の表面を形成することができ、無電解めっき処理において核生成密度を高めることが可能となる。
２．塩基配列解析装置
本節では、ナノポア構造体を用いた装置の一例を示す。具体的には、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を解析する装置の一例を示す。ナノポア構造体１００は導電性を有するため、このような解析装置において電極として用いることができる。
２－１．第５の実施形態
図１１は、塩基配列解析装置２００ａの断面構造を模式的に示す。塩基配列解析装置２００ａは、試料となる溶液が入れられるシスチャンバ２０２及びトランスチャンバ２０４を有する。シスチャンバ２０２及びトランスチャンバ２０４は、分析対象となる試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含む液体が充填される。図１１には示されないが、シスチャンバ２０２には試料溶液を導入する導入管、トランスチャンバ２０４には試料溶液を流出させる流出管が設けられていてもよい。また、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４との間は、ナノポア構造体１００を挟んで試料溶液が循環するように流路が設けられていてもよい。
ナノポア構造体１００は、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４を区分するように両者の間に設けられる。ナノポア構造体１００は、第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６が形成された面が、シスチャンバ２０２の側に面するように配置される。シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４とは、ナノポア１０２で連通されている。なお、ナノポア構造体１００は、本実施形態に示す第１乃至第４の実施形態のいずれの実施形態も適用することができる。
試料溶液は、イオンを含む液体が用いられる。試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）はイオンを含む液体の中に含まれる。溶液としては、電離度の高い電解質を溶解した水溶液が好ましく、塩類溶液、例えば塩化カリウム水溶液などが使用される。例えば、１Ｍ ＫＣｌ（又はＮａＣｌ、ＬｉＣｌその他等、均等な塩）及びｐＨ緩衝系（例えば、使用されているタンパク質、例えば、タンパク質ナノポア、ヌクレアーゼその他が変性されないことを確実にする）を、本発明（ナノポアにわたる電位を変動させることにより移動スピードを制御するための）により用いることができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用して、６．８～８．８の範囲内の値に実質的に一定にｐＨを維持することができる。
ナノポア構造体１００の表面（第１金属部材１１０及び第２金属部材１１６の表面）は、試料溶液の濡れ性を高めるために表面処理がされていてもよい。表面処理は、酸素プラズマ処理、又はＵＶオゾン処理を適用することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡはリン酸と結合しているＯＨ基が電離するためＤＮＡ、ＲＮＡ全体としては負に帯電する。
シスチャンバ２０２には第１電極（作用電極）２０６が設けられる。トランスチャンバ２０４には第２電極（対電極）２０８、及び第４電極（参照電極２）２１２が設けられる。ナノポア構造体１００は、第３電極（参照電極１）２１０として用いられる。
第１電極（作用電極）２０６と第２電極（対電極）２０８との間には、第１バイアス回路２２０、第１電流測定回路２２４が接続される。第３電極（参照電極１）２１０と第２電極（対電極）２０８との間には、第２バイアス回路２２２、第２電流測定回路２２６が接続される。また、第１電極（作用電極）２０６と第４電極（参照電極２：例えばＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極）２１２との間にはインピーダンスが極めて大きく第４電極２１２と第１電極２０６間には電流は流さない電圧測定回路２２８が接続される。塩基配列解析装置２００ａは、第１電極（作用電極）２０６、第２電極（対電極）２０８、第３電極（参照電極１）を所定の電位に制御して、溶液中の試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をシスチャンバ２０２から、ナノポア１０２を通過させてトランスチャンバ２０４へ移動させる過程で塩基配列を解読する機能を有する。
一部の実施形態では、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４間の電圧測定回路２２８で測定される電圧差は、７０ｍＶ～２００ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態では、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４間の電圧差は、８０ｍＶ～１５０ｍＶの範囲内であってもよい。操作に適切な電圧は、従来の測定技法を使用して選択することができる。ナノポア１０２にわたる電流（又は電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定することができる。
一本鎖ＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の移動スピードは、一部には、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４間の電圧差（又は電場強度）、及びポリヌクレオチドが導入されるシスチャンバ２０２の反応混合物（例えば、シスチャンバ２０２の１つの壁を構成する固相膜に配置される）又はｐＨ緩衝系によるｐＨに依存する。ナノポア１０２によるポリヌクレオチド捕捉速度は、斯かるポリヌクレオチドの濃度に依存する。一部の実施形態では、塩基配列決定のための従来の反応混合物条件やポリヌクレオチドの移動スピードが所望の範囲内となるように、シスチャンバとトランスチャンバ間の電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満のスピードを含む。他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０～８００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０～６００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００～８００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００～５００ヌクレオチドである。同様に、移動スピードに影響を与える他の因子、例えば、温度、粘性、イオン濃度、その他は、上に引用されている範囲内の移動スピードを得るように選択することができる。
２－１－１．イオン電流の測定
第１電極（作用電極）２０６の電位をＶ１、第２電極（対電極）２０８の電位をＶ２、第３電極（参照電極１）２１０の電位をＶ３とする。まず、第１バイアス回路２２０によって、第１電極（作用電極）２０６に電圧Ｖ１、第２電極（対電極）２０８に電圧Ｖ２を印加し（Ｖ１＜Ｖ２）Ｖ２－Ｖ１は、たとえば、７０ｍＶ～２００ｍＶの範囲内、さらに好ましくは、８０ｍＶ～１５０ｍＶの範囲内、電圧測定回路２２８によって測定される第１電極（作用電極）２０６と第４電極（参照電極２）２１２との電位差は、イオン電流が安定して測定できるような値となるように制御する。また、イオン電流のみを測定する場合には、第４電極と第１電極の間の電圧測定回路を開放状態にすることもできる。さらに、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が負の電荷を持つ場合、第３電極（参照電極１）２１０の電圧Ｖ３が、Ｖ１≦Ｖ３、かつＶ３＜Ｖ２となるように電位を制御する。
上記のようなバイアスを印加すると、シスチャンバ２０２に入れられた試料溶液中の試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）は、第３電極（参照電極１）２１０のナノポア１０２近傍に引き寄せられて集められる。試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）は、貫通孔１１３を通過する際に、１本鎖の絡まりを減じ、さらにナノポア１０２を通過し、トランスチャンバ２０４の第２電極（対電極）２０８側に引き寄せられる。このとき、第１電極（作用電極）２０６と第２電極（対電極）２０８との間の電流を電流計で測定すると、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）がナノポア１０２内に存在しない場合は、試料溶液として用いた溶液によるイオン電流のみが測定されることとなる。一方、図１２Ａに示すように、ナノポア１０２に試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が存在する場合はその断面積によりナノポア１０２内を通過できるイオンが制限されるため、流れるイオン電流は減少する。この変化量を試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）による時系列的な封鎖電流として計測して塩基の検出等の分析を行うことができる。
また、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をナノポア１０２近傍に集める段階と、ナノポア１０２に通過させる段階を分離することもできる。試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をナノポア１０２近傍に集める段階では、第１電極（作用電極）２０６と第３電極（参照電極１）２１０とにＶ１＜Ｖ３となるように電位を制御する。このとき第２電極（対電極）２０８の電位Ｖ２はどのような電位でもよく、例えば、Ｖ３≧Ｖ２となるようにしてもよい。このようなバイアスを印加することで、試料溶液中の試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が第３電極（参照電極１）２１０（すなわち、ナノポア１０２の近傍）に集められる。
次に、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をナノポア１０２に通過させる段階では、第３電極（参照電極１）２１０の電位Ｖ３と第２電極（対電極）２０８の電位Ｖ２を、Ｖ３＜Ｖ２となるように制御する。このとき第１電極（作用電極）２０６の電位Ｖ１は、Ｖ３と同じ電位にしてもよい。このように試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をナノポア１０２の近傍に集め、その後にナノポア１０２を通過させるようにすることで、多くの試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を短時間で通過させることができる。この手法では、封鎖電流の検出開始のタイミングを制御できるので、試料がナノポア１０２を通過している時間のみ、塩基の検出をさせることができ、効率的なデータ収集が可能となる。
なお、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をできる限り速くナノポア１０２へ到達させるため、第１電極（作用電極）２０６の電位Ｖ１と第３電極（参照電極１）２１０の電位Ｖ３の電位差は大きい方が好ましいといえる。一方、イオン電流を計測する段階において、第３電極（参照電極１）の電位Ｖ３と第２電極（対電極）２０８の電位Ｖ２との電位差は、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）がナノポア１０２を通過して電気信号を出力する速度に影響するので、第１電流測定回路２２４のサンプリング速度に応じた適切な値とすることが好ましい。なお、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が正の電荷を持つ場合は、負の電荷を持つ場合とは電位の大小関係を反転させる。例えば、各電位はＶ１≧Ｖ３＞Ｖ２となるようにする。
２－１－２．トンネル電流の測定
試料であるＤＮＡ、ＲＮＡが導電性を有する場合、その特性を利用してナノポア１０２が設けられた第３電極（参照電極１）２１０でトンネル電流を測定することができる。
第１電極（作用電極）２０６の電位Ｖ１、第２電極（対電極）２０８の電位Ｖ２をＶ１＜Ｖ２となるように制御し、電圧測定回路２２８によって測定される第１電極（作用電極）２０６と第４電極（参照電極２）２１２との電位差は、第３電極（参照電極１）２１０において、トンネル電流が流れるような化学ポテンシャルを試料溶液に加えることで、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）から第３電極（参照電極１）にトンネル電流が流れるようにする。
ナノポア１０２内に試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が存在しないときに比べ、ナノポア１０２に試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が存在するとき（通過するとき）の方が、試料に加わる化学ポテンシャルにより第３電極にトンネル電流が流れやすい場合には、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の塩基に対応したトンネル電流を第２電流測定回路２２６で測定することができる。この場合、第３電極（参照電極１）２１０は、第４電極（参照電極２）２１２との間でトンネル電流が流れる化学ポテンシャルに制御するための電位となるように制御される。
トンネル電流はトンネル距離に対して指数関数的に減衰するので、ナノポアを通過する塩基構造、一本鎖形状、及び配向に非常に敏感になる。この特性を用いて、図１２Ｂに模式的に示すように、ナノポア１０２を形成する第２金属部材１１６の曲率半径を小さく形成すれば、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）がナノポア１０２を通過する際に、第２金属部材１１６に最近接する塩基から流れるトンネル電流が支配的になり、隣接する塩基からのトンネル電流の影響を受けにくくなるので、時系列的なトンネル電流を解析することにより、塩基配列を正確に読み出すことができる。
２－２．第６の実施形態
ＤＮＡは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の４種類の塩基を含み、Ａ－Ｔ（水素結合が２個所）、Ｇ－Ｃ（水素結合が３個所）で形成される塩基対によって二重らせん構造が作られている。また、もう一種類の核酸であるＲＮＡ（リボ核酸）のペントースはリボースであり、塩基はＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含む。これらの塩基成分と結合した際に発光特性あるいは吸収特性が変化する基を含む分子を、ナノポア１０２を形成する第２金属部材１１６の表面に化学吸着させることで、発光分析又は吸光分析から塩基の配列を解読することができる。
図１３は、発光分析に用いることのできる塩基配列解析装置２００ｂの一例を示す。塩基配列解析装置２００ｂは、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４との間に、第３の実施形態で示すナノポア構造体１００ｃが設けられている。トランスチャンバ２０４側には、励起光源２３０と検出器２３２が設けられ、ビームスプリッタ２３４によりナノポア１０２部分への光照射と、励起光による発光を観察できるように構成されている。検出器２３２としては分光器が用いられ、励起光で発光した光を分光して検出する。なお、図１３には示されないが、光路上には集光レンズ等の光学部材が設けられていてもよい。
ナノポア１０２の裏面側（トランスチャンバ２０４側）から励起光を当てると発光する基は、第２金属部材１１６ａ、１１６ｂの表面にのみ化学吸着するため、ナノポア１０２のみで発光の変化が観察できる。これにより、各塩基に対応する発光特性、又は吸収特性が変化する基を含む分子を、ナノポア１０２の部分に化学吸着させ、裏面から励起光を照射して、発光特性あるいは吸収特性を観察すると、ＤＮＡの１本鎖が、ナノポア１０２を通過する際に、一つずつ塩基を判別でき、ＤＮＡの塩基配列を読み出すことができる。この場合において、自己組織化単分子膜１２６は、シスチャンバ２０２側のみに設けておくことにより、精密に塩基の配列を解読することができる。
自己組織化単分子膜１２６は、ＤＮＡ及びＲＮＡに含まれる特定の塩基を標識する蛍光体分子がインターカレートされていてもよい。例えば、ＤＮＡに含まれる４種類の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）のそれぞれに異なる蛍光体を対応させるように、自己組織化単分子膜１２６のそれぞれに異なる蛍光体分子がインターカレートされるようにすることができる。このようなインターカレート蛍光体分子を有する自己組織化単分子膜１２６を設けることで、ナノポア１０２を用いて試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の塩基配列を時系列的な光学シグナルとして解読する際に蛍光分析を行うことができる。
蛍光体分子を含む自己組織化単分子膜１２６を形成する際には、絶縁膜１０６の貫通孔１１３側のナノポア狭窄部下面と狭窄部表面にのみ自己組織化単分子膜１２６が形成されていることが好ましい。これにより、シスチャンバ側のナノポア部にのみ、蛍光体分子を含む自己組織化単分子膜１２６が形成される。
蛍光体としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、シアニン系色素などを用いることができる。ＤＮＡのモノマー配列を決定するには、モノマーが蛍光標識で標識されるようにする。
蛍光分析を行う際には、励起光はトランスチャンバ２０４側から照射することが好ましいが、シスチャンバ２０２側から照射しても構わない。蛍光色素はナノポア１０２のみに存在するように自己組織化単分子膜を作製すると、ＤＮＡの塩基との組み合わせで変化する蛍光を、ＳＮ比よく検出することができる。蛍光の検出は、励起光を照射する光学系とハーフミラーなどを利用して、入射側から受光することが好ましい。ナノポア１０２は金（Ａｕ）を含み、金（Ａｕ）表面は表面プラズモン増強により、励起光強度が増幅する。これにより、励起光のフォトンは、効率良く蛍光色素を励起することができる。励起光を検出する際に、色素近傍に金属が存在すると消光する場合がある。自己組織化単分子膜１２６により、色素とナノポア部の距離を適度に制御すると、この消光を抑制することができる。
自己組織化単分子膜１２６は、０．３ｎｍ～５ｎｍの長さを有するため、その長さの分だけナノポア１０２の有効な孔径が小さくなる。また、自己組織化単分子膜１２６とＤＮＡ塩基の親和力により、ナノポア１０２の表面が金属のみの場合と比較すると、第２金属部材１１６と蛍光色素間のクエンチを防ぐことができ好ましい。
本発明の一実施形態に係る塩基配列の解析方法は、ナノポア１０２を通してポリマーを移動させるステップであって、（ａ）ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポア１０２と接続する絶縁膜１０６の貫通孔１１３及びナノポア１０２が、一列で移動するようにモノマーを制約するステップと、（ｂ）ポリマーがナノポア１０２を通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時系列的変化を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、（ｄ）光学的シグナルの時系列的変化からモノマーの配列を決定するステップと、によって実行することができる。
ここでは、光学的シグナルとして蛍光シグナルを用いる。遷移区間において生成された蛍光シグナルが、ナノポア１０２から出現した蛍光標識の１個又は複数の自由に回転可能な双極子の存在によるものであり、これにより、例えば、直接的励起後に、又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介した励起により、蛍光標識が、蛍光シグナルを生成できるようになると考えられる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ等、一本鎖ポリヌクレオチドであるが、特に、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがナノポア１０２を通って移動するときに、ナノポアを一度に１個ずつ退出するにつれて蛍光標識によって生成されたシグナルを記録することにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。
第２金属部材１１６は、金（Ａｕ）などで構成されるため、表面プラズモン共鳴により励起頻度を高めることができる。特にナノポア１０２部は、一本鎖ＤＮＡの周囲を第２金属部材１１６が取り囲んでいることから、励起頻度が極めて高くなる。また、ナノポア１０２を形成する第２金属部材１１６の曲率半径は１ｎｍ～２０ｎｍであるため励起頻度を高める空間分解能を小さくすることができ、ＤＮＡがナノポア１０２を通過するときにナノポア１０２部で励起頻度が高くなることによる時系列的光学シグナルから、ナノポア１０２部を通過する一本鎖ＤＮＡの塩基配列を分離しやすい。
ナノポア１０２には、絶縁膜１０６の貫通孔１１２が接続している。異方性エッチングが可能な反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching：ＲＩＥ）を用いると、貫通孔１１２の孔径は、第１金属部材１１０及び下地金属膜１０８の孔径と等しくなる。したがって、貫通孔１１２の孔径の幅は５０ｎｍ以下、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以下の大きさを有する。絶縁膜１０６の貫通孔１１２を、ＤＮＡが始めに存在するシスチャンバとして、ナノポア１０２を通過させ、逆側のトランスチャンバに輸送する際、絶縁膜１０６の貫通孔１１２の幅が狭いため、絡まったＤＮＡをほどき、１本鎖のＤＮＡとしてナノポア１０２に導く、マイクロ流路として有効である。シスチャンバを上部とする際には、図１Ａ及び図１Ｂ、又は図３Ａ及び図３Ｂに示す構造を、上下を逆にして、絶縁膜１０６の貫通孔１１２を上側、ナノポア１０２を下側にして上部のシスチャンバから、トランスチャンバにＤＮＡを通過させることが好ましい。
２－３．第７の実施形態
図１３に示す塩基配列解析装置において、励起光源２３０としてレーザ光源を用い、検出器２３２としてラマン散乱光を検出する分光検出器を用いることができる。この場合、ナノポア構造体１００ｃに設けられる自己組織化単分子膜１２６には、塩基と相互作用してラマンシフトが変化するものを担持させておく。
本発明の一実施形態に係る塩基配列の解析方法は、ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、（ａ）ポリマーの異なる種類のモノマーが、第二電極材料によるナノポア部の表面プラズモン増強により鑑別可能なラマンスペクトルを生成することにより標識され、ナノポアと接続する絶縁膜１０６の貫通孔１１３及びナノポア１０２が、一列で移動するようにモノマーを制約する、ステップと、（ｂ）ポリマーがナノポアを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルとしてラマンスペクトルの時系列変化を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからのラマンスペクトルを分離するステップと、（ｄ）ラマンスペクトルの時系列変化からモノマーの配列を決定するステップとによって実行することができる。
ナノポア１０２の狭窄部は、金（Ａｕ）などの金属で構成されているため、ナノポア部を一本鎖ＤＮＡが通過する際に、表面プラズモン共鳴ラマン散乱光強度を桁違いに高めることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡに含まれる特定の塩基は、それぞれの構造の違いに起因したラマンスペクトルを有する。特にナノポア１０２の部分は、一本鎖ＤＮＡの周囲を第２金属部材１１６が取り囲んでいることから、表面プラズモン増強の効果が極めて高くなる。また、ナノポア１０２の曲率半径は１ｎｍ～２０ｎｍであるため励起頻度を高める空間分解能を小さくすることができ、ＤＮＡナノポア１０２を通過するときにナノポア１０２の部分でラマン散乱光強度が高くなることにより時系列的光学シグナルを分光評価することが容易になり、ナノポア１０２を通過する一本鎖ＤＮＡの塩基配列を高分解能で評価することができる。
２－４．第８の実施形態
シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４とを区分するナノポア構造体として、第４の実施形態に示すようにナノポアが設けられた電極を複数個配列させたナノポア構造体１００ｄを用いることができる。以下、図１１に示す塩基配列解析装置２００ａと相違する部分を中心に説明する。
図１４に示す塩基配列解析装置２００ｃは、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４との間に複数のナノポア付き電極１２０が設けられたナノポア構造体１００ｄが設けられている。複数のナノポア付き電極１２０は、それぞれが電気的に分離されており、図示されない個別配線によって選択回路２３６に接続されている。選択回路２３６は、第２バイアス回路２２２及び第３バイアス回路２４０と接続されている。選択回路２３６と第２バイアス回路２２２との間には、第３電極（参照電極１）２１０を用いて電流を測定する第２電流測定回路２２６が設けられていてもよい。
第２バイアス回路２２２に対し第３バイアス回路２４０は異なるレベルのバイアス電圧を印加する。選択回路２３６は、複数のナノポア付き電極１２０のそれぞれと、第２バイアス回路２２２及び第３バイアス回路２４０との接続を切り替える機能を有する。選択回路２３６は、例えば、アナログスイッチなどで構成されるスイッチ回路が含まれている。また、選択回路２３６の動作を制御する制御回路２４２、第２電流測定回路２２６で測定されたデータを記憶する記憶回路２４４が設けられていてもよい。
図１５は、複数のナノポア付き電極１２０と、選択回路２３６との接続の一例を示す。図１５は、模式的にナノポア構造体１００ｄに４つのナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｄが設けられる構造を例示する。選択回路２３６は、スイッチ２３８ａ～２３８ｄを含む。スイッチ２３８ａ～２３８ｄの動作は制御回路２４２により制御される。ナノポア付き電極１２０ａはスイッチ２３８ａと接続される。スイッチ２３８ａは、第２バイアス回路２２２と第３バイアス回路２４０との接続を切り替える機能を有する。ナノポア付き電極１２０ｂ～１２０ｄは、同様にスイッチ２３８ｂ～２３８ｄと接続されている。
ここで、第２バイアス回路２２２はナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｄに電位Ｖ３を与え、第３バイアス回路２４０は電位Ｖ４を与える機能を有するものとする。第２－２．節で説明されたように、第１電極（作用電極）２０６の電位Ｖ１、第２電極（対電極）２０８の電位Ｖ２、第３電極（参照電極１）２１０の電位Ｖ３において、Ｖ１＜Ｖ３、かつＶ３＜Ｖ２となるように電位を制御されたとき、電位Ｖ４はＶ１と同じ又はＶ４より低い電位に設定される。電位Ｖ４はイオン電流を流さないようにする電位であるため、抑止電位（又は抑止電圧）と呼ぶこともできる。
そして、図１４に示す塩基配列解析装置２００ｃにおいて、図１５に示すように、ナノポア付き電極１２０ａを第２バイアス回路２２２と接続し、他のナノポア付き電極１２０ｂ～１２０ｄを第３バイアス回路２４０と接続すると、ナノポア付き電極１２０ａにイオン電流が流れ、他のナノポア付き電極１２０ｂ～１２０ｄにはイオン電流が流れないか、ほとんど無視できるレベルのイオン電流しか流れないこととなる。
２－４－１．イオン電流の測定
選択回路２３６により、ナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｄの接続先を順次切り替え、そのタイミングに応じて第２電流測定回路２２６でイオン電流を測定することで、ナノポア構造体１００ｄの中でどのナノポアに試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が通過しているのか（又は通過し始めているのか）を知ることができる。
図１６は、このような動作のタイミングチャートの一例を示す。第１電極(作用電極)２０６を電位Ｖ１、第２電極（対電極）２０８を電位Ｖ２に制御した後、ナノポア付き電極１２０ａを電位Ｖ３とし、他のナノポア付き電極１２０ｂ～１２０ｄを電位Ｖ４に制御する。一定時間を経過後、次のタイミングでは、ナノポア付き電極１２０ａを電位Ｖ４とし、ナノポア付き電極１２０ｂを電位Ｖ３に制御する。以下、このような電位の制御を順次繰り返していくことで、ナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｄに流れるイオン電流を順次測定することができる。図１６に示すように、第２電流測定回路２２６からはイオン電流が順次（シリアルに）測定される。そして、イオン電流の大小から、封鎖電流が流れているか否かを評価することができる。第２電流測定回路２２６で測定されたデータは、記憶回路２４４に記憶させることもできる。
２－４－２．ナノポアアレイの評価
図１４に示す装置において、イオン電流の流れ易さはナノポア１０２の孔径に依存する。その特性を利用して、作製されたナノポア１０２の評価を行うことができる。ナノポア１０２の孔径はナノポア構造体１００ｄの中で均一であることが望ましいが、製造ばらつきにより孔径にばらつきが含まれる場合がある。このような場合、以下に示す手法によって、予めナノポア１０２の良否を判定し、又はナノポア１０２をクラス分けすることができる。
シスチャンバ２０２及びトランスチャンバ２０４には、試料（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含まない溶液だけを充填しておく。この状態で、図１６で説明したように、ナノポア付き電極毎に順次イオン電流の測定を行う。イオン電流は第２電流測定回路２２６によって測定され、ナノポア付き電極１２０ａ～１２０ｄのアドレスに対応させて測定値を記憶回路２４４に記憶させておいてもよい。ある標準的なナノポアを基準とした場合（予め定められた基準値として）、イオン電流がその基準値より大きいとナノポア１０２の孔径が基準値より大きいことを示し、小さい場合には孔径が基準値より小さいことを意味する。このような評価は、製造ばらつきの他、ナノポア１０２に異物等が詰まっているような不良を発見することもできる。
上記の評価によって、１つのナノポア構造体１００ｄの中でクラス分けされたナノポア１０２は、判定基準に応じて試料の計測に使用するか否かの使い分けをすることができる。例えば、不良と判定されたナノポアは試料の計測に使用しないように抑止電位Ｖ４のままにしておくことができる。
このように、本実施形態によれば、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４とを区画するナノポア構造体１００ｄにナノポア付き電極１２０を複数個配列させることで、試料の塩基配列の解読を効率良く行うことができる。この場合において、個々のナノポア付き電極１２０の電位を個別に制御することで、シスチャンバ２０２とトランスチャンバ２０４と共通化しつつ、注目するナノポアにおける試料の解析を行うことができる。
２－５．第９の実施形態
第５乃至第７の実施形態において、第２バイアス回路２２２をパルス電源として、第３電極（参照電極１）２１０にパルス電圧を印加することで、パルス電圧を加えた際にナノポアを通過する試料に対し、１塩基ずつ通過させることができる。イオン電流、トンネル電流、発光・吸光分析、ラマンシフトを測定する際に、１塩基ずつ評価を行うことができる。このような方式により、読み取りエラーを低減し、精密に塩基配列を解読することができる。
イオン電流、トンネル電流、発光・吸光分析、ラマンシフトは、それぞれ独立に測定が可能であるため、これらを２～４種の範囲で複数組み合わせて測定を行うことにより、塩基配列の精度を高めることができる。
各種電極間の電圧測定、電圧印加、電流測定は、バッテリーで駆動が可能であるため、本ナノポア電極とバッテリーを組み合わせることにより、持ち運び可能なＤＮＡ、ＲＮＡの解析装置とすることができる。
［実施例１］
本実施例は、ナノポア構造体の作製例を示す。ナノポア構造体は、第１－５．節で説明する工程に従って作製を行った。作製条件の概略は以下の通りに行った。
（１）両面に１００ｎｍの酸化膜（ＳｉＯ２）が形成されたシリコンウェハ（厚さ３００μｍ）の裏面にポジ型フォトレジスト（OFPR-800）を塗布する。
（２）シリコンウェハ裏面に１００×１００μｍ２のキャビティ作製するためのレジストパターンをフォトリソグラフィプロセスにより作製する。
（３）ＩＣＰ－ＲＩＥ（Inductive Coupled Plasma-Reactive Ion Etching）プロセスを
用いて裏面の酸化膜をエッチングし、その後フォトレジストを除去する。パターン化された裏面側の酸化膜は、次のエッチングプロセスのためのハードマスクとして使用する。
（４）シリコンウェハ（３００μｍ）をＩＣＰ－ＲＩＥプロセスで除去して、裏面にキャビティを形成する。
（５）シリコンウェハの表面にポジ型ＥＢＬレジスト（ZEP-520A）を塗布する。
（６）ナノポア構造と電極リードを作製するためのパターニングをＥＢＬレジスト上に行う。ナノポア部分には、電子線が当たらないようにし、ナノポアが形成される領域の周囲に電子線を当ててレジストを感光する。また、電極リードと、ナノポア周囲部は接続するように電子線を当てる。ナノポア部分となる電子線を当てない領域は、正方形であっても、円形であってもよい。
（７）電子ビーム蒸着によりチタン（Ｔｉ）、白金（Ｐｔ）の順に金属膜を堆積する。
（８）リフトオフプロセスによりレジストを剥離し、ナノポアを作製する部分の酸化膜（ＳｉＯ２）表面を露出させる。
（９）ナノポアに独立して電圧を印加するための電極パッド（１００×１００μｍ２）のパターンをフォトレジストでパターニングする。
（１０）電子ビーム蒸着により電極パッドのためのチタン（Ｔｉ）、白金（Ｐｔ）積層膜を形成する。
（１１）シリコンウェハの表面にポジ型ＥＢＬレジストを塗布し、ナノポアが存在する部分をパターニングする。
（１２）表面の酸化膜（ＳｉＯ２）が露出した部分をチタン（Ｔｉ）・白金（Ｐｔ）層マスクとして用いてＩＣＰ－ＲＩＥプロセスで加工し、貫通したナノポアを形成する。
（１３）ナノポア表面で穴の開いたチタン（Ｔｉ）・白金（Ｐｔ）電極上に無電解めっきプロセスにより金メッキを行い、孔サイズを２ｎｍ以下に狭める。
（１４）ＥＢＬレジストを除去する。
以上のような作製工程において、（６）の電子ビームの描画面積を異ならせた試料の評価を行った。具体的には、電子ビームを当てず、酸化膜（ＳｉＯ２）を露出させる面積を変化させたパターンを同一基板上に作製し、ナノポアの孔径を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で評価した。
図１７の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に、電子ビームを当てず酸化膜（ＳｉＯ２）を露出させる面積を異ならせた試料のＳＥＭ像を示す。（ａ）は正方形の形状で電子ビームを当てない面積を１００×１００ｎｍ２とした試料であり、（ｂ）は６０×６０ｎｍ２、（ｃ）は４０×４０ｎｍ２である。各試料においてナノポアのサイズは、（ａ）が４０ｎｍであり、（ｂ）が１７ｎｍ、（ｃ）が１０ｎｍとなっている。このように、電子ビームの描画パターンが小さくなると、無電解めっき後のナノポアのサイズは小さくなることが示された。本めっき条件では、金（Ａｕ）の核生成密度が高いため、粒が相互に接続した構造となっている。また平面部は金で覆われている。さらに、酸化膜（ＳｉＯ２）の露出部は、正方形であったものが、円形のナノポアとなっている。これは、ナノポアは、上部からみると円形となる方が、正方形よりもエネルギー的に安定であるため、円形になろうとする。また、基板面に対して垂直な断面は、ナノポア部では対の円形構造となっており、ドーナッツの内側の穴の部分のような構造となっている。貫通穴があると、平面部分と比較すると突起形状となるため、ナノポア部の円形断面部分は、めっきが進行しやすく、平面部分よりも盛り上がった構造となっている。しかしながら、平面部分よりも盛り上がった構造とならない場合もある。ナノポア部の円形構造は、少なくとも１８０度の範囲で同じ曲率半径を有しており、第１金属部材１１０と下地金属膜１０８の境界の初期ポア部を、その円形は貫いている。
［実施例２］
本実施例は、ナノポア構造体の耐熱性を評価した結果を示す。図１８は、２００℃と３００℃でナノポアが形成された試料を熱処理した結果をＳＥＭ像で示す。図１８において、（ａ）及び（ｄ）は試料の熱処理前の状態を示し、（ｂ）は２００℃、５分の熱処理後、（ｃ）は２００℃、２時間の熱処理後、（ｅ）は３００℃、５分の熱処理後、（ｆ）は３００℃、２時間の熱処理後の状態を示す。熱処理後の試料を観察すると、金（Ａｕ）表面は平滑となっている。一方、中心のナノポアの部分は形状に変化が無いことが分かる。このことから、ナノポアは、３００℃の熱処理にも耐えることが明らかとなった。また、酸素プラズマ処理を施しても、形状に変化が無いことが判明している。金（Ａｕ）で形成されたナノポアが、このような耐熱性を示すのは、白金（Ｐｔ）上でヘテロエピタキシャル成長していることに起因している。
ＤＮＡの２重らせん構造を１本鎖にほどく際には、６５℃程度で温める手法が用いられる。本実施例で作製されたナノポアは３００℃に耐えることから、ナノポアを含む測定セルを暖めて、１本鎖にするプロセスを行うことができることが確認された。
本発明の一実施形態に係るナノポア構造体は、生体試料分析装置に用いることができる。本発明の一実施形態に係る生体試料分析装置は、ナノポア構造体を有し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのシーケンシング（すなわち、ＤＮＡシーケンサ）として用いることができる。
［付記］
本明細書により開示された本発明の例示的な実施形態の全体又は一部に基づく塩基配列の解析方法を以下に付記する。
本発明の一実施形態に係る塩基配列の解析方法は、ナノポアを通してポリマーを移動させる方法であって、（ａ）ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポアと接続する絶縁膜の貫通孔及びナノポアが、一列で移動するようにモノマーを制約するステップと、（ｂ）ポリマーがナノポアを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時系列的変化を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、（ｄ）光学的シグナルの時系列的変化からモノマーの配列を決定するステップと、を含む。
本発明の一実施形態に係る塩基配列の解析方法は、ナノポア１０２を通してポリマーを移動させるステップであって、（ａ）ポリマーの異なる種類のモノマーが、ナノポアを形成する第２金属部材による表面プラズモン増強により鑑別可能なラマンスペクトルを生成することにより標識され、ナノポアと接続する絶縁膜の貫通孔及びナノポアが、一列で移動するようにモノマーを制約するステップと、（ｂ）ポリマーがナノポアを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルとしてラマンスペクトルの時系列変化を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからのラマンスペクトルを分離するステップと、（ｄ）ラマンスペクトルの時系列変化からモノマーの配列を決定するステップとを含む。
１００・・・ナノポア構造体、１０２・・・ナノポア、１０４・・・支持部材、１０６・・・絶縁膜、１０８・・・下地金属膜、１１０・・・第１金属部材、１１２・・・貫通孔、１１３・・・貫通孔、１１４・・・結晶粒、１１５・・・アモルファス領域、１１６・・・第２金属部材、１１８・・・結晶領域、１１９・・・アモルファス領域、１２０・・・ナノポア付き電極、１２２・・・配線、１２４・・・電極パッド、１２６・・・自己組織化単分子膜、１３０・・・シリコン基板、１３１、１３２・・・絶縁膜、１３４・・・開口部、１４０・・・フォトレジスト膜、１４２・・・フォトレジスト膜、１４３・・・レジストパターン、１４４・・・フォトレジスト膜、１４５・・・レジストパターン、２００・・・塩基配列解析装置、２０２・・・シスチャンバ、２０４・・・トランスチャンバ、２０６・・・第１電極（作用電極）、２０８・・・第２電極（対電極）、２１０・・・第３電極（参照電極１）、２１２・・・第４電極（参照電極２）、２２０・・・第１バイアス回路、２２２・・・第２バイアス回路、２２４・・・第１電流測定回路、２２６・・・第２電流測定回路、２２８・・・電圧測定回路、２３０・・・励起光源、２３２・・・検出器、２３４・・・ビームスプリッタ、２３６・・・選択回路、２３８・・・スイッチ、２４０・・・第３バイアス回路、２４２・・・制御回路、２４４・・・記憶回路

Claims (17)

  1. 薄膜状であり、貫通孔を有する第１金属部材と、
    前記貫通孔の孔径を狭窄するように設けられた第２金属部材と、を有し、
    前記第１金属部材と前記第２金属部材とによって、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアが形成されているナノポア構造体。
  2. 前記ナノポアが、５ｎｍ以下、１ｎｍ以上の孔径を有する、請求項１に記載のナノポア構造体。
  3. 前記第２金属部材が、前記第１金属部材の上面部及び前記貫通孔の側壁面の少なくとも一部を覆う、請求項１又は２に記載のナノポア構造体。
  4. 前記第２金属部材は、前記貫通孔の端部と重なる部位において球状又は円柱状の曲面を有する、請求項１に記載のナノポア構造体。
  5. 前記曲面の曲率半径は、前記第１金属部材の膜厚と同じ又は前記膜厚以下である、請求項４に記載のナノポア構造体。
  6. 前記第１金属部材は多結晶構造を含み、
    前記第２金属部材は、前記第１金属部材に含まれる少なくとも一つの結晶粒からヘテロエピタキシャル成長した結晶領域を含む、請求項１に記載のナノポア構造体。
  7. 前記第２金属部材は島状構造体を複数含み、複数の前記島状構造体が前記貫通孔を囲む、請求項６に記載のナノポア構造体。
  8. 前記第２金属部材は前記第１金属部材上で連続する膜状構造体であり、
    前記膜状構造体が前記貫通孔を囲み、
    前記膜状構造体は、前記ナノポアの部分の厚さが、前記膜状構造体の他の部分の厚さよりも厚い、請求項１に記載のナノポア構造体。
  9. 前記第１金属部材は、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）から選ばれた一種であり、
    前記第２金属部材は、金（Ａｕ）である、請求項１に記載のナノポア構造体。
  10. 前記第２金属部材の表面に自己組織化単分子膜が設けられている、請求項１に記載のナノポア構造体。
  11. 前記自己組織化単分子膜は、ＤＮＡの各塩基又はＲＮＡの各塩基に対応したインターカレート色素を含む、請求項１０に記載のナノポア構造体。
  12. 前記ナノポアを形成する前記第１金属部材及び前記第２金属部材が設けられた絶縁膜を有し、
    前記絶縁膜は、前記ナノポアと連通する第２の貫通孔を有する、請求項１に記載のナノポア構造体。
  13. 前記第２の貫通孔が２０ｎｍ以下の孔径を有する、請求項１２に記載のナノポア構造体。
  14. シスチャンバ及びトランスチャンバと、
    前記シスチャンバと前記トランスチャンバを区画するナノポア構造体と、
    前記シスチャンバに設けられた第１電極と、
    前記トランスチャンバに設けられた第２電極、及び第３電極と、
    を有し、
    前記ナノポア構造体は、
    薄膜状であり、前記シスチャンバと前記トランスチャンバとを連通させる貫通孔が少なくとも１個設けられ、
    前記貫通孔を有する第１金属部材と、
    前記貫通孔の孔径を狭窄するように設けられた第２金属部材と、を有し、
    前記第１金属部材と前記第２金属部材とによって、１０ｎｍ以下の孔径を有するナノポアが形成されている、
    塩基配列解析装置。
  15. 前記トランスチャンバ側に顕微ラマン分光装置が設けられている
    請求項１４に記載の塩基配列解析装置。
  16. 前記ナノポア構造体は、前記第１金属部材及び前記第２金属部材によって形成された第４電極を少なくとも1個有する
    請求項１４に記載の塩基配列解析装置。
  17. 前記ナノポア構造体は着脱自在に設けられている
    請求項１６に記載の塩基配列解析装置。
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