WO2017183716A1 - 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法 - Google Patents

生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017183716A1
WO2017183716A1 PCT/JP2017/016041 JP2017016041W WO2017183716A1 WO 2017183716 A1 WO2017183716 A1 WO 2017183716A1 JP 2017016041 W JP2017016041 W JP 2017016041W WO 2017183716 A1 WO2017183716 A1 WO 2017183716A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hole
sample
molecule
biological material
ionic current
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/016041
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真楠 筒井
一道 横田
正輝 谷口
川合　知二
美奈 大河内
祐圭 田中
馬場　嘉信
範匡 加地
隆雄 安井
宮原　裕二
諭吉 堀口
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
国立大学法人東京工業大学
国立大学法人名古屋大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学, 国立大学法人東京工業大学, 国立大学法人名古屋大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to JP2018513228A priority Critical patent/JP6638913B2/ja
Priority to US16/095,340 priority patent/US10877021B2/en
Priority to CN201780024754.2A priority patent/CN110192096B/zh
Publication of WO2017183716A1 publication Critical patent/WO2017183716A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects
    • G01N15/12—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects by observing changes in resistance or impedance across apertures when traversed by individual particles, e.g. by using the Coulter principle
    • G01N15/13—Details pertaining to apertures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a biological material detection device (hereinafter sometimes simply referred to as “device”), a biological material detection detection device (hereinafter sometimes simply referred to as “detection device”), an ionic current.
  • the measurement method hereinafter, simply referred to as “measurement method”
  • the biological material identification method hereinafter, simply referred to as “identification method”.
  • Devices that form through-holes (nanopores) on a substrate and measure ion current when a sample passes through the through-holes are attracting attention as devices that can be widely applied to sensing bacteria, viruses, DNA, proteins, etc. .
  • FIG. 1 shows a conventional technique for detecting the size and number of samples, and detects changes in ion current that occur when a sample passes through a micropore formed on a substrate such as silicon.
  • the volume of the sample can be identified (see Non-Patent Document 1).
  • the ion current according to the shape of the sample can be measured by making the thickness of the through hole thinner than the sample (see Patent Document 1).
  • the size and shape of the sample can be estimated from changes in ion current.
  • the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 have a problem that it is difficult to identify a sample when the sizes and shapes of the samples are similar.
  • the present invention is an invention made in order to solve the above-mentioned conventional problems. (1) By forming a molecule that interacts with the sample in the through hole through which the sample passes, the sample passes through the through hole while interacting with the molecule. (2) Therefore, the sample that interacts with the molecule When the sample passes through the through-hole, the time for the sample to pass through the through-hole increases and the waveform of the ion current to be measured changes. (3) As a result, the sample can be identified from the waveform of the measured ion current. The headline was newly found and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a device, a detection apparatus, a measurement method, and an identification method in which molecules that interact with a sample are formed in a through hole.
  • the present invention relates to the following device, detection apparatus, measurement method, and identification method.
  • substrate A through-hole through which a test biological substance formed on the substrate passes, a molecule that is formed in the through-hole and interacts with the test biological substance that passes through,
  • a first chamber member that forms a first chamber filled with an electrolyte with at least a surface including a through hole on one surface side of the substrate;
  • a second chamber member forming a second chamber filled with an electrolyte solution with at least the surface including the through hole on the other surface side of the substrate;
  • a biomaterial detection device comprising: a test biomaterial identified by a waveform of an ionic current when the test biomaterial passes through the through-hole.
  • the biological substance detection device according to (1) or (2), wherein the interacting molecule is a peptide, a sugar chain, or a nucleic acid.
  • the interacting molecule is a flagella recognition peptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • the biological substance detection device according to any one of (1) to (3), wherein the interacting molecule is one kind of influenza recognition peptide selected from SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • the biological material detection device according to any one of (1) to (3), wherein the interacting molecule includes an influenza recognition sugar chain (6′-sialyactose).
  • the biological material detection device according to any one of (1) to (3), wherein a metal layer is laminated on the through-hole, and the interacting molecules are formed on the metal layer.
  • the biological material detection device A first electrode formed in the first chamber; A second electrode formed in the second chamber; and An ammeter for measuring an ion current when the sample passes through the through-hole, including, Detection device for biological material detection.
  • An ion current measurement method for measuring an ion current when a test biological substance passes through a through-hole formed in a substrate, A molecule that interacts with the test biological substance is formed in the through-hole, and the test biological substance passes through the through-hole while interacting with the molecule. Characterized by identifying substances, Ion current measurement method.
  • FIG. 1 is a diagram showing a conventional technique for detecting the size and number of samples.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the device 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a view for explaining a method of forming a metal layer in the through hole 3.
  • FIG. 4 is a view for explaining a method of forming a metal layer in the through hole 3.
  • FIG. 5 is a diagram showing another embodiment of the device 1.
  • FIG. 6 is a schematic view showing an example of the detection apparatus of the present invention.
  • FIG. 7 is a drawing-substituting photograph and an SEM image near the through hole 3.
  • FIG. 8 is a graph in which the waveforms of ion currents measured in Example 3 and Comparative Example 2 are superimposed.
  • FIG. 9A is a graph in which the waveform of the ionic current measured in Example 4 is superimposed
  • FIG. 9B is a graph in which the waveform of the ionic current measured in Comparative Example 3 is superimposed.
  • 10A is a graph in which the waveform of the ionic current measured in Example 6 is superimposed
  • FIG. 10B is a graph in which the waveform of the ionic current measured in Comparative Example 5 is superimposed.
  • 11A is a sequence number 3
  • FIG. 11B is a sequence number 4
  • FIG. 11C is a graph obtained by superimposing the waveform of the ion current measured in Example 8 when the molecule of the sequence number 5 is used. It is a graph.
  • FIG. 11D is a graph in which the waveform of the ion current measured in Comparative Example 7 is superimposed.
  • FIG. 12 is a graph in which waveforms of ion currents measured in Example 10 and Comparative Example 8 are superimposed.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the device 1 of the present invention.
  • the device 1 of the present invention includes a substrate 2, a through-hole 3 formed on the substrate 2 through which a sample passes, and a molecule formed in the through-hole 3 and interacting with the sample (hereinafter, simply referred to as “molecule”). 4 is included at least.
  • the device 1 shown in FIG. 2 can also be incorporated as a detection device of a detection apparatus using a known through hole.
  • the substrate 2 is not particularly limited as long as it is an insulating material generally used in the field of semiconductor manufacturing technology. For example, Si, Ge, Se, Te, GaAs, GaP, GaN, InSb, InP, SiN, and the like can be given.
  • the substrate 2 is made of a material such as SiN, SiO 2 , HfO 2 or the like, and is made of a thin film called a solid membrane, or a material such as graphene, graphene oxide, molybdenum dioxide (MoS 2 ), or boron nitride (BN). You may form in the sheet form called a two-dimensional material.
  • the substrate 2 on which the through hole 3 is formed is preferably thin.
  • 5 ⁇ m or less is preferable, 500 nm or less is more preferable, 100 nm or less is more preferable, and 50 nm or less is particularly preferable.
  • graphene can be made very thin when a solid membrane or a two-dimensional material is used as the substrate 2, for example, the substrate 2 having a thickness of 1 nm or less can be produced. However, if the substrate 2 is very thin, it may be difficult to handle without being damaged.
  • the substrate 2 may have a laminated structure in which a solid membrane or a two-dimensional material is laminated on a support plate made of the above insulating material.
  • a solid membrane or a two-dimensional material may be laminated on a support plate in which a hole larger than the through hole 3 is formed, and the through hole 3 may be formed in the solid membrane or the two-dimensional material.
  • the through hole 3 is formed so as to penetrate the substrate 2.
  • the sample include biological substances such as bacteria, cells, viruses, DNA, RNA, proteins, and pollen, but there are no particular limitations as long as they interact with the molecule 4.
  • non-biological substances such as sulfur oxide (SOx), nitrogen oxide (NOx), volatile organic compound (VOC), oxide mineral (silicon, aluminum, titanium, iron, etc.) can be used.
  • the molecule 4 is not particularly limited as long as it interacts with the sample.
  • “interaction” means that the molecule 4 recognizes the sample to be measured or has an influence on the sample to be measured, whereby a weak binding force acts between the molecule 4 and the sample to be measured, and the through hole 3 Compared to the case where the molecule 4 is not formed in the above, it means a molecule in which the time for the sample to be measured to pass through the through-hole 3 is increased. Examples of the interaction include an ion-ion interaction, a hydrogen bond, and an electrical interaction. Therefore, molecules that are firmly bound to the sample to be measured and are not separated are not included in the molecules 4 of the present invention.
  • Examples of the molecule 4 include peptides, nucleic acids, sugar chains, and organic molecules.
  • the molecule 4 may be a peptide, a nucleic acid sequence, a surface molecule, etc. specific to the sample to be measured, and a peptide or nucleic acid sequence that weakly binds to the specific peptide, nucleic acid, surface molecule, etc., or a sugar chain may be determined.
  • Examples of the weakly binding sequence include, in the case of a peptide, a partial sequence of an antibody sequence that recognizes a specific peptide of a sample to be measured, a sequence that interacts with a surface layer molecule of the sample to be measured, and the like.
  • the weakly binding sequence is a nucleic acid
  • a part of the sequence that hybridizes to the specific nucleic acid of the sample to be measured can be mentioned.
  • the sequences of peptides and nucleic acids may be synthesized by a known peptide synthesizer or nucleic acid synthesizer. Alternatively, a peptide / nucleic acid contract synthesis service may be used.
  • bonds weakly is a sugar chain, what is necessary is just to select the sugar chain which interacts with a peptide specific for a measurement object sample, or a surface molecule.
  • the sample to be measured is a non-biological substance, for example, the surface charge or the like is examined, and an organic molecule having a charge that interacts with the charge may be selected.
  • numerator 4 illustrated above is an example when the sample to measure previously is decided, it interacts with the said nucleic acid by forming the nucleic acid, peptide, sugar chain, etc. which were designed arbitrarily in a through-hole.
  • the sample to be screened can also be screened. For example, suppose a case of screening bacteria, viruses, etc. that may bind to proteins and sugar chains on the surface of human cells. In that case, first, an arbitrary protein or sugar chain is selected from the human cell surface, and a peptide or sugar chain is designed based on the protein or sugar chain.
  • a device in which the designed peptide or sugar chain is formed in the through-hole and a device in which the peptide is not formed are produced, and samples having different ion current waveforms when the sample is passed may be selected.
  • a molecule that interacts with a sample may be a molecule that is known in advance to interact with a specific sample, or a sample that does not have an obvious interaction (may interact).
  • the molecule 4 formed in the through-hole 3 may be any designed nucleic acid, peptide, sugar chain, organic molecule, or the like.
  • the molecule 4 is not particularly limited as long as it can be formed in the through hole 3.
  • a metal layer is formed on the through hole 3 by vapor deposition of a metal such as gold, platinum, aluminum, copper, iron, cobalt, silver, tin, indium, zinc, gallium, chromium, titanium, and the like. What is necessary is just to form the molecule
  • the molecule 4 is a peptide
  • the sequence may be designed so that one end of the peptide contains a thiol group, and the thiol group and the metal layer may be adsorbed.
  • a thiol group is introduced into the nucleic acid by a known method and adsorbed on the metal layer.
  • a part of the sugar chain may be substituted with a teal group by a known method.
  • 3 and 4 are diagrams for explaining a method of forming a metal layer in the through hole 3.
  • a metal layer 21 is first laminated on the substrate 2 by sputtering or the like, and then an insulating layer 22 is laminated on the metal layer 21 by sputtering or the like.
  • the insulating layer 22 include SiO 2 , SiNx, SiON, Al 2 O 3 , Y 2 O 3, Ta 2 O 5, and HfO 2, but there is no particular limitation as long as it is an insulating material.
  • a portion where the through hole 3 is formed may be drawn by an electron beam drawing method, and the through hole 3 may be formed by reactive ion etching or the like.
  • the metal layer 21 can be exposed in the through hole 3 by the above method.
  • the through hole 3 is formed in the substrate 2.
  • the through-hole 3 may be formed by reactive ion etching or the like by performing drawing by an electron beam drawing method as described above.
  • the electron beam resist 23 is applied to the substrate 2 and the periphery of the through hole 3 is covered with the electron beam resist 23 by an electron beam drawing method.
  • the electron beam resist 23 may be either a negative type or a positive type.
  • the metal layer 21 is laminated on the through hole 3 and the electron beam resist 23 by sputtering or the like. (4) By lifting off the electron beam resist 23, the metal layer 21 on the electron beam resist is also removed, and the metal layer 21 can be formed in the through hole 3.
  • the thiol group of the molecule 4 is adsorbed to the metal layer 21.
  • the molecule 4 may be bonded to the substrate 2 by introducing an amino group or a carboxyl group into the molecule 4 by a silane coupling reaction.
  • the through-hole 3 portion of the substrate 2 may be covered with polyurethane, and the molecule 4 having the modified polydopamine as a scaffold may be bound to the polyurethane surface.
  • FIG. 5 is a diagram showing another embodiment of the device 1.
  • the device 1 shown in FIG. 5 includes a first chamber member 51 capable of forming a first chamber 5 filled with an electrolyte solution with a surface including at least the through hole 3 on one surface side of the substrate 2, and the other surface side of the substrate 2. And at least a second chamber member 61 capable of forming a second chamber 6 filled with an electrolyte with a surface including at least the through hole 3.
  • the first chamber member 51 and the second chamber member 61 are preferably formed of an electrically and chemically inactive material.
  • an electrically and chemically inactive material for example, glass, sapphire, ceramic, resin, rubber, elastomer, SiO 2 , SiN, Al 2 O 3 and the like.
  • the first chamber member 51 and the second chamber member 61 may be prepared separately and bonded to the substrate 2 so as to be liquid-tight.
  • a substantially rectangular parallelepiped box member having one open surface may be formed, the substrate 2 may be inserted and fixed in the center of the box, and then the open surface may be liquid-tightly sealed.
  • first chamber member 51 and the second chamber member 61 do not mean separate members, but mean a part of a box member separated from the substrate 2 as a boundary.
  • first chamber member 51 and the second chamber member 61 are formed with holes for filling and discharging the electrolyte solution and the sample solution, and inserting electrodes and / or leads as necessary. May be.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of the detection apparatus 1-1 of the present invention.
  • the detection device 1-1 includes a first electrode 52 formed at a position in contact with the electrolytic solution in the first chamber 5, and a second electrode formed at a position in contact with the electrolytic solution in the second chamber 6. 62.
  • At least an ammeter 7 for measuring an ion current when the samples 31a and 31b pass through the through hole 3 is included.
  • the detection device 1-1 displays an analysis unit 8 that analyzes the ion current measured by the ammeter 7 and a display for displaying the measured ion current value and / or the result analyzed by the analysis unit 8 as necessary.
  • Section 9 a program memory 10 in which a program for causing the analysis section 8 and the display section 9 to function in advance, and a control section 11 for reading and executing the program stored in the program memory 10 may be included.
  • the program may be stored in the program memory 10 in advance, or may be recorded in a recording medium and stored in the program memory 10 using an installation unit.
  • the first electrode 52 and the second electrode 62 can be formed of a known conductive metal such as aluminum, copper, platinum, gold, silver, or titanium.
  • the 1st electrode 52 and the 2nd electrode 62 are formed so that the through-hole 3 may be pinched
  • the second electrode 62 may be formed on the surface of the substrate 2, the inner surface of the second chamber member 61, or the second chamber. What is necessary is just to arrange
  • the first electrode 52 is formed on the inner surface of the first chamber member 51
  • the second electrode 62 is formed on the inner surface of the second chamber member 61.
  • the electrode 62 may be inserted from a hole formed in the first chamber member 51 and the second chamber member 61.
  • the first electrode 52 is connected to a power source 54 and a ground 55 via a lead 53.
  • the second electrode 62 is connected to the ammeter 7 and the ground 64 via a lead 63.
  • the power source 54 is connected to the first electrode 52 side
  • the ammeter 7 is connected to the second electrode 62 side.
  • the power source 54 and the ammeter 7 may be provided on the same electrode side. Good.
  • the power supply 54 is not particularly limited as long as a direct current can be passed through the first electrode 52 and the second electrode 62.
  • the ammeter 7 is not particularly limited as long as it can measure the ion current generated with time when the first electrode 52 and the second electrode 62 are energized.
  • a noise removal circuit, a voltage stabilization circuit, or the like may be provided as necessary.
  • the ion current flowing through the through hole 3 is blocked by the sample, and the ion current is reduced.
  • the amount of decrease in ion current is proportional to the volume of the sample in the through hole 3.
  • the sample volume is the same, the sample that interacts with the molecule 4 and the sample that does not interact with the molecule 4 have clearly different times for passing through the through-hole 3. Therefore, the type of the sample can be identified by analyzing the change time of the ionic current (the time until the sample enters and exits the through hole 3) and the waveform.
  • the samples 31a and 31b differ in the waveform of the ion current to be measured because the volume change in the through hole 3 when passing through the through hole 3 is different.
  • the speed at which the sample passes through the through hole 3 is fast, it is difficult to accurately measure the difference in the shape of the sample.
  • the time for the sample to pass through the through-hole 3 can be increased by the interaction with the molecule 4, so that the measurement of the difference in the shape of the same type of sample can also be expected.
  • the analysis unit 8 analyzes the value (waveform) of the ionic current measured by the ammeter 7.
  • the waveform passage time, shape, etc.
  • analysis may be performed based on a plurality of measurement results.
  • the display unit 9 only needs to be able to display the value (waveform) of the measured ion current and the result analyzed by the analysis unit 8, and a known display device such as a liquid crystal display, a plasma display, or an organic EL display may be used.
  • the measurement method can be performed by the following procedure.
  • the first chamber 5 and the second chamber 6 are filled with an electrolytic solution.
  • the electrolyte is not particularly limited as long as the first electrode 52 and the second electrode 62 can be energized, and a TE buffer, PBS buffer, HEPES buffer, KCl aqueous solution, or the like may be used.
  • a liquid junction is formed between the first chamber 5 and the second chamber 6 through the through hole 3.
  • the first electrode 52 and the second electrode 62 are energized by the power supply 54.
  • the value of the ion current generated by this energization is measured with the ammeter 7 over time.
  • Samples such as bacteria have surface electrification. Therefore, when the first electrode 52 and the second electrode 62 are energized, in addition to normal diffusion, the sample added to the first chamber 5 passes through the through-hole 3 formed in the substrate 2 by electrophoresis and enters the second chamber 6. However, if necessary, pressure may be applied to the solution in which the sample is dispersed with a pump or the like so that the sample passes through the through-hole 3 by a water flow.
  • the sample identification method should just identify a sample from the result measured by the measuring method of ion current.
  • the sample size can be determined by the degree of decrease in the measured value of the ionic current.
  • a pattern of the through-hole 3 was drawn by an electron beam drawing method at substantially the center of the silicon nitride film covering the silicon hole of about 150 ⁇ m square.
  • development was performed by dipping in a developing solution, and a cylindrical through hole 3 having a diameter of about 2 ⁇ m was formed in the silicon nitride film by reactive ion etching using an RIE apparatus.
  • an electron beam resist (ZEP520A manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) was coated on silicon nitride using a spin coater (MS-B100 manufactured by Mikasa Co.). After baking on a hot plate at 180 ° C., the resist around the through hole 3 was removed by an electron beam drawing apparatus method. Next, gold was vapor-deposited in the through hole 3 using SVC-700LRF manufactured by Sanyu Electronics Co., Ltd.
  • FIG. 7 is an SEM image near the through hole 3. It was confirmed that gold was deposited around the through hole 3 from which the electron beam resist had been removed. Although it is difficult to understand from the photograph, it was confirmed that gold was also deposited on the inner surface of the through hole 3.
  • a peptide interacting with E. coli was formed in the through-hole 3 by the following procedure.
  • a peptide that interacts with sugar chains on the surface of E. coli was designed.
  • the amino acid sequence of the designed peptide is shown below.
  • GRHIFWRRGGGGC SEQ ID NO: 1
  • a peptide having the designed amino acid sequence was synthesized by a conventional method, and dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to 1 mM to prepare a peptide solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the peptide solution prepared in (2) above was dropped into the through-hole 3 of the device 1 and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the peptide solution was rinsed several times with PBS.
  • the device 1 was produced by the above procedure.
  • a polymer block made of polydimethylsiloxane (PDMS) provided with electrodes, an electrolytic solution, and a hole for introducing a sample on the upper and lower sides of the substrate 2 of the device 1 manufactured in Example 1 is liquid-tight.
  • the first chamber 5 and the second chamber 6 were prepared by pasting. The volumes of the first chamber 5 and the second chamber 6 were each about 10 ⁇ l. Silver silver chloride electrodes were used for the first electrode 52 and the second electrode 62, and were inserted into the first chamber 5 and the second chamber 6 through holes provided in the polymer block.
  • a battery-driven bias power source (Axis Net) was used as the power source 54 and connected to the first electrode 52 through a lead.
  • the ammeter 7 obtains data using a current amplifier and a digitizer (NI 5922, National Instruments) having a high time resolution of 1 MHz, and the obtained data is stored in a RAID drive HDD (HDD-8263, National Instruments Co.). Stored.
  • Example 1 A detection apparatus was produced in the same procedure as in Example 2 except that gold deposition and peptide bonding were not performed on the device produced in Example 1.
  • the culture solution was sedimented by centrifugation, and the centrifugal sediment was washed with 2.5% LB medium (LB Broth miller, SIGMA-ALDRICH, Co. LLC.), And then sedimented again by centrifugation.
  • the centrifugal sediment was diluted with phosphate buffered saline (PBS) to 5 ⁇ 10 7 cells / mL to prepare an E. coli suspension.
  • PBS buffer phosphate buffered saline
  • Example 3 Using Escherichia coli as a sample, the ion current was measured using the detection apparatus 1-1 prepared in Example 2.
  • FIG. 8 is a graph in which the waveform of the ion current of one sample measured in Example 3 and Comparative Example 2 is superimposed.
  • Ip ion current value
  • Comparative Example 2 the size of E. coli was determined in the measurement of Example 3 and Comparative Example 2. This means that it was possible to measure accurately.
  • the sample enters the through hole 3 the ion current value decreases, and when the sample exits the through hole 3, the time (td) until the ion current value returns to the steady state is compared in Example 3. It was clearly longer than Example 2.
  • Example 4 The ionic currents of Escherichia coli and Bacillus subtilis were measured in the same procedure as in Example 3 except that the diameter of the through hole 3 was about 3 ⁇ m.
  • FIG. 9A is a graph of the results measured in Example 4.
  • FIG. 9B is a graph of the results measured in Comparative Example 3.
  • FIG. 9 (B) when a detection device that does not form a molecule in the through-hole 3 is used, the waveform of the ionic current measured for Escherichia coli and Bacillus subtilis is almost the same. could not.
  • FIG. 9 (A) when a detection device in which molecules are formed in the through-hole 3 is used, the waveforms of ionic currents measured for Escherichia coli and Bacillus subtilis are clearly different due to the interaction with the molecules. It was. From the above results, it has been clarified that by forming molecules that interact with the sample in the through-hole 3, the sample can be identified even if the samples are approximately the same size.
  • Example 5 A device 1 was prepared in the same procedure as in Example 1, except that the diameter of the through-hole 3 was about 300 nm and a peptide designed to interact with flagella of E. coli was used as the molecule 4, and then Example 2 The detection apparatus 1-1 was produced in the same procedure as described above. The amino acid sequence of the designed peptide is shown below. FLLRVPHLGGGC (SEQ ID NO: 2)
  • Escherichia coli with flagella Esscherichia coli, BW25113 (National BioResource Project, KEIO collection)
  • Escherichia coli, BW25113 National BioResource Project, KEIO collection
  • the main protein constituting flagella A sample was prepared in the same manner as in [Measurement and identification of ionic current] except that Escherichia coli, ⁇ fliC (National BioResource Project, KEIO collection), in which flagella was eliminated by deleting FliC, was used.
  • the ion current was measured.
  • the size of E. coli was almost the same except for the presence or absence of flagella.
  • FIG. 10A is a graph in which the waveform of the ionic current of each one sample measured in Example 6 is superimposed.
  • Ip ion current value
  • FIG. 10B is a graph in which the waveform of the ion current of one sample measured in Comparative Example 5 is superimposed.
  • the waveforms were almost the same, and E. coli with flagella and E. coli without flagella could not be distinguished.
  • Example 7 A device 1 and a detection apparatus 1-1 were produced in the same procedure as in Example 5 except that the following three types of peptides designed to recognize influenza virus were used instead of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • ASHRVGSTTYIAGGGC SEQ ID NO: 3
  • ASHRVGSTYIGGGC SEQ ID NO: 4
  • RVGSTYGGGC SEQ ID NO: 5
  • Example 8 (with molecules) and Comparative Examples 6 and 7 (without molecules)>
  • influenza A virus Influenza A virus (H1N1), A / PR / 8/34 (American Type Culture Collection, VR-95) was used as a sample.
  • influenza B virus Influenza B virus, B / Lee / 40 (American Type Culture Collection, VR-1535)]
  • the ion current was measured according to the procedure.
  • the virus was cultured by a conventional method of incubating eggs in a hatched chicken. That is, 10-11 day eggs cultured while rotating at 37 ° C. and a humidity of 60% or higher in a funnel were examined, and then the influenza virus was inoculated into the chorioallantoic membrane and further cultured for 3 days.
  • the egg shell membrane was broken from the air chamber and aspirated to collect the chorioallantoic fluid.
  • FIG. 11A shows the sequence of SEQ ID NO: 3
  • FIG. 11B shows the sequence of ID No. 4
  • FIG. 11C shows the sequence of the ion current of one sample when the molecule of SEQ ID NO: 5 is used. It is a graph.
  • FIGS. 11A to 11C in Example 8 in which a peptide designed to recognize influenza virus was bound to the through-hole, it was possible to distinguish between influenza A and B viruses. It was. It was also confirmed that the waveform of the measured ionic current was significantly different due to the difference in peptide sequence. On the other hand, in Comparative Example 6 in which the peptide was not bound, the influenza virus was adsorbed around the through-hole, and the ionic current could not be measured.
  • FIG. 11D is a graph in which the waveform of the ion current of one sample is overlaid in Comparative Example 7. As shown in FIG. 11 (D), influenza virus could not be identified simply by forming a through hole. From the above results, it was possible not only to identify the influenza virus but also to measure the influenza virus by binding interacting molecules to the through-hole.
  • Example 9 [Identification of influenza virus, molecule: sugar chain] ⁇ Example 9> The following sugar chain (6′-sialyl lactose; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) that recognizes influenza virus was used instead of the peptide of SEQ ID NO: 2 and was bound to the through-hole by the following binding method. The device 1 and the detection apparatus 1-1 were produced according to the procedure.
  • Example 10 (with molecules) and Comparative Example 8 (without molecules)>
  • ion currents were measured in the same procedure as in Example 6 using the detection devices prepared in Example 9 and Comparative Example 4 and using the harmless influenza virus as a sample.
  • the harmless influenza virus was adjusted according to the procedure described below.
  • ⁇ Detoxification virus preparation method As a stock solution of the sample solution, a solution containing influenza A virus H1N1 (HA value 256) detoxified with 0.05% paraformaldehyde solution was prepared.
  • FIG. 12 is a graph in which the waveform of the ion current of each sample measured in Example 10 and Comparative Example 8 is superimposed.
  • Ip ion current value
  • the present invention can take the following embodiments of a sample detection device, a sample detection apparatus, an ion current detection method, and a sample identification method. Moreover, you may combine suitably with embodiment illustrated above.
  • the interacting molecule is a peptide or a nucleic acid, The sample detection device according to (1) above.
  • a metal layer is laminated on the through hole, and the interacting molecules are formed on the metal layer. The sample detection device according to (1) or (2) above.
  • a first chamber member forming a first chamber filled with an electrolyte solution with at least a surface including a through hole on one surface side of the substrate;
  • a second chamber member forming a second chamber filled with an electrolyte with at least a surface including a through hole on the other surface side of the substrate;
  • the interacting molecule is a peptide or a nucleic acid.
  • the device 1 of the present invention By using the device 1 of the present invention, it is possible to identify even samples of almost the same size. Therefore, since it can be used as a measurement unit of an inspection apparatus for an instrument that measures ion current, it is useful for developing a detection apparatus.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

サンプルが貫通孔を通過する時間を長くなるようにした生体物質検出用デバイスを提供することを課題とする。基板、該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔、該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、該基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、該基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、を具備し、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形（通過時間、形状等）により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイスにより、課題が解決できる。

Description

生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法
　本発明は、生体物質検出用デバイス（以下、単に「デバイス」と記載することがある。）、生体物質検出用検出装置（以下、単に「検出装置」と記載することがある。）、イオン電流の測定方法（以下、単に「測定方法」と記載することがある。）、及び、生体物質の識別方法（以下、単に「識別方法」と記載することがある。）に関する。特に、生体物質等のサンプルが通過する貫通孔にサンプルと相互作用する分子を形成することで、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなり、サンプルの識別ができるデバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法に関する。
　基板に貫通孔（ナノポア）を形成し、該貫通孔をサンプルが通過する際のイオン電流を測定するデバイスは、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質等のセンシングに幅広く応用可能なデバイスとして注目されている。
　図１は、サンプルの大きさや個数等の検出方法の従来技術を示しており、シリコン等の基板上に形成した細孔（マイクロポア）をサンプルが通過する際に生じるイオン電流の変化を検出することで、サンプルの体積を識別できる（非特許文献１参照）。また、貫通孔の厚さをサンプルより薄くすることで、サンプルの形状に応じたイオン電流を測定できることも知られている（特許文献１参照）。
国際公開第２０１３／１３７２０９号公報
Ｗａｓｅｅｍ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ　ｏｎ　ａ　Ｃｈｉｐ，　Ｖｏｌ．１２，　ｐｐ．２３４５－２３５２　（２０１２）
　上記特許文献１及び非特許文献１に記載されている検出方法（デバイス）では、イオン電流の変化からサンプルのサイズや形状を推定できる。しかしながら、特許文献１及び非特許文献１に記載されている方法では、サンプルのサイズや形状が類似している場合は、サンプルの識別をすることが困難であるという問題がある。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、
（１）サンプルが通過する貫通孔に、サンプルと相互作用する分子を形成しておくことで、サンプルが分子と相互作用しながら貫通孔を通過する、（２）そのため、分子と相互作用するサンプルが貫通孔を通過した場合、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなり、測定するイオン電流の波形が変化する、（３）その結果、測定したイオン電流の波形からサンプルの識別ができること、を新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、サンプルと相互作用する分子を貫通孔に形成したデバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法を提供することである。
　本発明は、以下に示す、デバイス、検出装置、測定方法、及び、識別方法に関する。
（１）基板、
　該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
　該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
　該基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
　該基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
を具備し、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
（２）前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、上記（１）に記載の生体物質検出用デバイス。
（３）前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、上記（１）又は（２）に記載の生体物質検出用デバイス。
（４）前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、上記（１）～（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（５）前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、上記（１）～（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（６）前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’－ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、上記（１）～（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（７）前記貫通孔に金属層が積層され、前記相互作用する分子が金属層上に形成されている、上記（１）～（３）の何れか一つに記載の生体物質検出用デバイス。
（８）上記（１）に記載の生体物質検出用デバイス、
　前記第１チャンバーに形成された第１電極、
　前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
　前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
を含む、
生体物質検出用検出装置。
（９）基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
　前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子が形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
イオン電流の測定方法。
（１０）前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、上記（９）に記載のイオン電流の測定方法。
（１１）前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、上記（９）又は（１０）に記載のイオン電流の測定方法。
（１２）前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、上記（９）～（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１３）前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、上記（９）～（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１４）前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’－ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、上記（９）～（１１）の何れか一つに記載のイオン電流の測定方法。
（１５）上記（９）～（１４）に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、被検生体物質を識別する生体物質の識別方法。
　本発明のデバイスを用いると、分子と相互作用するサンプルが貫通孔を通過した場合、サンプルが貫通孔を通過する時間が長くなる。そのため、測定したイオン電流の波形を解析することで、大きさが類似しているサンプルを識別することができる。
図１は、サンプルの大きさや個数等の検出方法の従来技術を示す図である。 図２は、本発明のデバイス１の概略を示す図である。 図３は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。 図４は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。 図５は、デバイス１の他の実施形態を示す図である。 図６は、本発明の検出装置の一例を示す概略図である。 図７は、図面代用写真で、貫通孔３付近のＳＥＭ画像である。 図８は、実施例３及び比較例２で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図９（Ａ）は、実施例４で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフ、図９（Ｂ）は、比較例３で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１０（Ａ）は、実施例６で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフ、図１０（Ｂ）は、比較例５で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１１（Ａ）は配列番号３、図１１（Ｂ）は配列番号４、図１１（Ｃ）は配列番号５の分子を用いた際の実施例８で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ｄ）は、比較例７で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。 図１２は、実施例１０及び比較例８で測定したイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。
　以下に、デバイス、検出装置、測定方法、及び識別方法について詳しく説明する。
　図２は、本発明のデバイス１の概略を示す図である。本発明のデバイス１は、基板２、基板２に形成されサンプルが通過する貫通孔３、貫通孔３に形成されサンプルと相互作用する分子（以下、単に「分子」と記載することがある。）４を少なくとも含んでいる。図２に示すデバイス１は、公知の貫通孔を用いた検出装置の検出用デバイスとして組込むこともできる。
　基板２は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている絶縁性の材料であれば特に制限は無い。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、ＳｉＮ等が挙げられる。また、基板２は、ＳｉＮ、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2等の材料を用い、固体メンブレンと呼ばれる薄膜状、または、グラフェン、酸化グラフェン、二酸化モリブデン（ＭｏＳ2）、窒化ホウ素（ＢＮ）等の材料を用い、２次元材料と呼ばれるシート状に形成してもよい。サンプルの検出感度は、貫通孔３の体積が小さいほど高くなることから、貫通孔３を形成する基板２は薄い方が好ましい。例えば、５μｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましい。なお、例えば、グラフェンは１ｎｍ以下の膜厚の基板２の作製が可能である等、基板２として固体メンブレンまたは２次元材料を用いた場合は、膜厚を非常に薄くできる。しかしながら、基板２の膜厚が非常に薄いと、破損せずに取り扱うことが困難な場合がある。そのため、基板２は、上記の絶縁性の材料で形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層した積層構造としてもよい。積層構造にする場合は、貫通孔３より大きな孔を形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層し、固体メンブレンまたは２次元材料に貫通孔３を形成すればよい。
　貫通孔３は、基板２を貫通するように形成されている。イオン電流を検出する際には、貫通孔３の体積が少ないほど感度が高くなる。したがって、上記基板２を薄くするとともに、貫通孔３の大きさは、測定対象サンプルよりは大きいが、大き過ぎないように適宜調整すればよい。サンプルとしては、細菌、細胞、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、花粉等の生体物質が挙げられるが、分子４と相互作用するものであれば特に制限はない。例えば、硫黄酸化物（ＳＯｘ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、酸化鉱物（ケイ素、アルミニウム、チタン、鉄等）等の非生体物質が挙げられる。
　分子４は、サンプルと相互作用するものであれば特に制限はない。なお、本発明において「相互作用」とは、分子４が測定対象サンプルを認識あるいは測定対象サンプルと影響を及ぼしあうことで、分子４と測定対象サンプルの間に弱い結合力が働き、貫通孔３に分子４を形成していない場合と比較して、測定対象サンプルが貫通孔３を通過する時間が長くなるような分子を意味する。相互作用としては、イオン間相互作用、水素結合、電気的相互作用等が挙げられる。したがって、測定対象サンプルと強固に結合し分離しない分子は、本発明の分子４には含まれない。
　分子４としては、ペプチド、核酸、糖鎖、有機分子等が挙げられる。分子４は、測定対象サンプルに特異的なペプチド、核酸配列、表面分子等を調べ、当該特異的なペプチド、核酸、表面分子等と弱く結合するペプチド又は核酸配列、或いは糖鎖等を決めればよい。弱く結合する配列としては、例えば、ペプチドの場合、測定対象サンプルの特異的なペプチドを認識する抗体配列の一部の配列や測定対象サンプルの表層分子と相互作用する配列などが挙げられる。また、弱く結合する配列が核酸の場合、測定対象サンプルの特異的な核酸にハイブリダイズする配列の一部が挙げられる。ペプチド及び核酸とも、配列が決まれば、公知のペプチド合成装置、核酸合成装置で合成すればよい。又は、ペプチド・核酸の受託合成サービスを利用してもよい。また、弱く結合する分子が糖鎖の場合、測定対象サンプルに特異的なペプチドや表面分子と相互作用する糖鎖を選択すればよい。測定対象サンプルが非生体物質の場合は、例えば表面電荷等を調べ、当該電荷に相互作用する電荷を持つ有機分子を選択すればよい。
　なお、上記に例示した分子４は、予め測定したいサンプルが決まっている場合の例であるが、任意に設計した核酸、ペプチド、糖鎖等を貫通孔に形成することで、当該核酸に相互作用するサンプルをスクリーニングすることもできる。例えば、ヒト細胞表面のタンパク質や糖鎖に結合する可能性がある細菌、ウイルス等をスクリーニングする場合を想定する。その場合、先ず、ヒト細胞表面から任意のタンパク質や糖鎖を選択し、当該タンパク質や糖鎖に基づいて、ペプチドや糖鎖を設計する。そして、設計したペプチドや糖鎖を貫通孔に形成したデバイスと、形成していないデバイスを作製し、サンプルを流した際にイオン電流の波形が異なるサンプルを選択すればよい。つまり、「サンプルと相互作用する分子」とは、特定のサンプルと相互作用することが予め明らかであるものでもよいし、相互作用するサンプルが明らかでない（相互作用する可能性がある）ものでもよい。上記のとおり、貫通孔３に形成する分子４は、任意に設計した核酸、ペプチド、糖鎖、有機分子等であればよい。
　分子４は、貫通孔３に形成できれば、特に制限はない。例えば、貫通孔３に、金、プラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム、クロム、チタン等の金属を蒸着することで金属層を形成し、分子４を含む水溶液に基板２を浸漬することで金属層に分子４を形成すればよい。分子４がペプチドの場合は、ペプチドの一方の末端がチオール基を含むように配列を設計し、チオール基と金属層を吸着すればよい。また、分子４が核酸の場合は、公知の方法により核酸にチオール基を導入し、金属層に吸着すればよい。また、分子４が糖鎖の場合は、公知の方法により、糖鎖の一部をチール基に置換すればよい。
　図３及び図４は、貫通孔３に金属層を形成する方法を説明するための図である。図３に示す例では、（１）基板２の上に、先ず、金属層２１をスパッタリング等により積層し、次いで、金属層２１の上に絶縁層２２をスパッタリング等により積層する。絶縁層２２としては、ＳｉＯ2、ＳｉＮｘ、ＳｉＯＮ、Ａｌ2Ｏ3、Ｙ2Ｏ3、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2等が挙げられるが、絶縁性の材料であれば特に制限はない。（２）そして、貫通孔３を形成する部分を電子線描画法により描画を行い、反応性イオンエッチング等により貫通孔３を形成すればよい。上記方法により、貫通孔３に金属層２１を露出させることができる。
　図４に示す例では、（１）基板２に先ず貫通孔３を形成する。貫通孔３は、上記と同様、電子線描画法により描画を行い、反応性イオンエッチング等により形成すればよい。（２）基板２に電子線レジスト２３を塗布し、電子線描画法により貫通孔３の周囲を電子線レジスト２３でカバーする。電子線レジスト２３は、ネガ型でもポジ型のどちらでも良い。（３）スパッタリング等により金属層２１を貫通孔３及び電子線レジスト２３上に積層する。（４）電子線レジスト２３をリフトオフすることで、電子線レジスト上の金属層２１も除去し、貫通孔３に金属層２１を形成できる。
　なお、図３及び図４に示す例は、分子４のチオール基を金属層２１に吸着しているが、貫通孔３に分子４を形成できれば金属層２１を設けなくてもよい。例えば、基板２の材料としてＳｉＯ２を用いた場合、分子４にシランカップリング反応によりアミノ基またはカルボキシル基を導入することにより、分子４を基板２に結合させてもよい。また、基板２の貫通孔３部分をポリウレタンで被覆し、修飾したポリドーパミンを足場として有する分子４をポリウレタン表面に結合させてもよい。
　図５は、デバイス１の他の実施形態を示す図である。図５に示すデバイス１は、基板２の一方の面側の少なくとも貫通孔３を含む面とで電解液を充填する第１チャンバー５を形成できる第１チャンバー部材５１、基板２の他方の面側の少なくとも貫通孔３を含む面とで電解液を充填する第２チャンバー６を形成できる第２チャンバー部材６１、を少なくとも含んでいる。
　第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は、電気的および化学的に不活性な材料で形成することが好ましく、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ2、ＳｉＮ、Ａｌ2Ｏ3などが挙げられる。
　第１チャンバー５及び第２チャンバー６は、貫通孔３を挟むように形成され、第１チャンバー５に投入したサンプルが、貫通孔３を通り第２チャンバー６に移動できるように形成されていれば特に制限はない。例えば、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１を別々に作成し、基板２に液密となるように接着すればよい。又は、１つの面が解放状態の略直方体の箱部材を形成し、箱の中央に基板２を挿入・固定し、その後、解放状態の面を液密に封止してもよい。その場合、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は別々の部材を意味するのではなく、基板２を境に分けた箱部材の一部を意味する。なお、図示はしていないが、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１には、電解液及びサンプル液を充填・排出、電極及び／又はリードを挿入するための孔を必要に応じて形成してもよい。
　図６は、本発明の検出装置１－１の一例を示す概略図である。検出装置１－１は、デバイス１に加え、第１チャンバー５内の電解液と接する箇所に形成された第１電極５２、第２チャンバー６内の電解液と接する個所に形成された第２電極６２、サンプル３１ａ、３１ｂが貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定するための電流計７を少なくとも含んでいる。
　また、検出装置１－１は、必要に応じて、電流計７で測定したイオン電流を解析する解析部８、測定したイオン電流値及び／または解析部８が解析した結果を表示するための表示部９、予め解析部８や表示部９を機能させるためのプログラムを格納したプログラムメモリ１０、プログラムメモリ１０に格納されているこのプログラムを読み出し実行するための制御部１１を含んでいてもよい。プログラムは、予めプログラムメモリ１０に記憶しておいても良いし、記録媒体に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ１０に格納されるようにしてもよい。
　第１電極５２及び第２電極６２は、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の導電性金属で形成することができる。第１電極５２及び第２電極６２は、貫通孔３を挟むように形成し、直流電流を印加することで電解液中のイオンを輸送する。したがって、第１電極５２は、第１チャンバー５内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第１チャンバー部材５１の内面、又は第１チャンバー５内の空間にリード５３を介して配置すればよい。第２電極６２も第１電極５１と同様に、第２チャンバー６内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第２チャンバー部材６１の内面、又は第２チャンバー６内の空間にリード６３を介して配置すればよい。なお、図５に示す例では、第１電極５２は第１チャンバー部材５１の内面に、第２電極６２は第２チャンバー部材６１の内面にそれぞれ形成されているが、第１電極５２及び第２電極６２は、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１に形成した孔から挿入してもよい。
　第１電極５２は、リード５３を介して電源５４、アース５５に接続している。第２電極６２は、リード６３を介して電流計７、アース６４に接続している。なお、図６に示す例では、電源５４は第１電極５２側に、電流計７は第２電極６２側に接続しているが、電源５４と電流計７は、同じ電極側に設けてもよい。
　電源５４は、第１電極５２及び第２電極６２に直流電流を通電できるものであれば特に制限はない。電流計７は、第１電極５２及び第２電極６２に通電した際に、発生するイオン電流を経時的に測定できるものであれば特に制限はない。なお、図６には図示していないが、必要に応じてノイズ除去回路や電圧安定化回路等を設けてもよい。
　本発明の検出装置１－１の貫通孔３にサンプルが通過すると、貫通孔３を流れているイオン電流がサンプルにより遮断され、イオン電流が減少する。このイオン電流の減少量が貫通孔３内のサンプルの体積に比例する。しかしながら、従来の検出装置では、サンプルの体積がほぼ同じであると、同じ種類のサンプルであるのか、違う種類であるのか、イオン電流の測定値から識別することは困難であった。本発明では、サンプルの体積が同じであっても、分子４と相互作用するサンプルと分子４と相互作用しないサンプルとでは、貫通孔３を通過する時間は明らかに異なる。したがって、イオン電流の変化時間（サンプルが貫通孔３に入り、出るまでの時間）と波形を解析することで、サンプルの種類を識別することができる。
　また、同じ種類であっても、エクソソームやＤＮＡ塩基配列のように形状が異なるサンプルがある。図６に示すようにサンプル３１ａと３１ｂでは、貫通孔３を通過する時の貫通孔３内の体積変化が異なることから、測定するイオン電流の波形が異なる。しかしながら、従来の検出装置１－１では、サンプルが貫通孔３を通過するスピードが速いため、サンプルの形状の違いを精度よく測定することは難しかった。本発明では、分子４との相互作用により、サンプルが貫通孔３を通過する時間を長くできることから、同じ種類のサンプルの形状の違いの測定も期待できる。
　解析部８は、電流計７で測定したイオン電流の値（波形）を解析する。サンプルが球形でない場合、図６に示すように同じ種類のサンプルであっても貫通孔３に入る際の向きが異なると、測定するイオン電流の波形（通過時間、形状等）が異なる場合がある。その場合、複数の測定結果に基づき解析すればよい。
　表示部９は、測定したイオン電流の値（波形）、解析部８で解析した結果を表示できればよく、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなど、公知の表示装置を用いればよい。
　次に、本発明の検出装置１－１を用いた測定方法、及び識別方法について説明する。先ず、測定方法は、以下の手順で行うことができる。
（１）第１チャンバー５及び第２チャンバー６に、電解液を充填する。電解液は、第１電極５２及び第２電極６２が通電できれば特に制限は無く、ＴＥバッファー、ＰＢＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＫＣｌ水溶液等を用いればよい。このとき、第１チャンバー５内と第２チャンバー６内との間は、貫通孔３を介して液絡が取れている。
（２）サンプルを第１チャンバー５に添加する。
（３）電源５４により、第１電極５２及び第２電極６２に通電する。この通電により発生するイオン電流の値を電流計７で経時的に測定する。なお、細菌等のサンプルは表面電化を有する。したがって、第１電極５２及び第２電極６２に通電すると、通常の拡散に加え、第１チャンバー５に添加したサンプルは電気泳動により基板２に形成した貫通孔３を通過し、第２チャンバー６に移動するが、必要に応じて、サンプルが分散している溶液にポンプ等で圧力を加え、水流によってサンプルが貫通孔３を通過するようにしてもよい。
　以上の手順により、サンプルが検出装置１－１の貫通孔３を通過する時のイオン電流を測定することができる。そして、サンプルの識別方法は、イオン電流の測定方法により測定した結果から、サンプルを識別すればよい。具体的には、イオン電流の測定値の低下の程度によりサンプルの大きさが分かる。また、サンプルの大きさが同じ場合でも、イオン電流の測定値が変化し定常状態に戻るまでの時間及び波形から、サンプルが分子４と相互作用するかどうかが分かるので、サンプルの種類を特定できる。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
〔デバイス１の作製〕
＜実施例１＞
　まず、両表面に５０ｎｍの窒化シリコン膜を持つ面方位（１００）のシリコンウエハー（Ｅ＆Ｍ　ＣＯ．，ＬＴＤ）を２９ｍｍ四方に切った。基板の一方の面に約５００μｍ四方の領域の孔が形成されているエッチング防止用のメタルマスクをかぶせ、ＲＩＥ装置（ＲＩＥ－１０ＮＲ、ＳＡＭＣＯ　ＣＯ．，Ｌｔｄ）によって、孔が形成されている５００μｍ四方の領域のみ窒化シリコン膜を除去し、シリコン表面をむき出しにした。その後、むき出しにした部分のシリコンのみを選択的に水酸化カリウム水溶液（和光純薬株式会社）によって、約３時間かけて１２５℃のホットプレート（Ｈｏｔ　ｐｌａｔｅ　ＮＩＮＯＳ　ＮＤ－１、Ａｓ　Ｏｎｅ　ＣＯ．，Ｌｔｄ）上でウェットエッチングを行った。この操作により、基板の他方の面の窒化シリコン膜に到達するまでシリコンをエッチングした。窒化シリコン膜に到達したシリコンの孔は約１５０μｍ四方であった。
　次に、上記約１５０μｍ四方のシリコンの孔を覆っている窒化シリコン膜のほぼ中央に、電子線描画法により貫通孔３のパターンの描画を行った。次いで、現像液に浸して現像を行い、ＲＩＥ装置によって反応性イオンエッチングにより、窒化シリコン膜に直径約２μｍの円筒状の貫通孔３を形成した。
　次に、電子線レジスト（日本ゼオン社製ＺＥＰ５２０Ａ）を窒化シリコン上にスピンコーター（ミカサ社製ＭＳ－Ｂ１００）を用いてコートした。ホットプレート上で、１８０℃でベーキングの後、電子線描画装置法により貫通孔３の周囲のレジストを除去した。次に、サンユー電子社製ＳＶＣ－７００ＬＲＦを用い、貫通孔３に金を蒸着した。図７は、貫通孔３付近のＳＥＭ画像である。電子線レジストが除去されていた貫通孔３の周囲に金が蒸着しているのを確認した。写真からは分かりにくいが、貫通孔３内面にも金が蒸着していることを確認した。
　次に、以下の手順により、大腸菌と相互作用するペプチドを貫通孔３に形成した。
（１）大腸菌表面の糖鎖と相互作用するペプチドを設計した。設計したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　ＧＲＨＩＦＷＲＲＧＧＧＣ（配列番号１）
（２）設計したアミノ酸配列のペプチドを定法により合成し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１ｍＭとなるように溶解し、ペプチド溶液を作製した。
（３）デバイス１の貫通孔３に、上記（２）で作製したペプチド溶液を滴下し、２時間室温で静置した。
（４）ペプチド溶液をＰＢＳで数回リンスした。以上の手順によりデバイス１を作製した。
〔検出装置１－１の作製〕
＜実施例２＞
　次に、実施例１で作製したデバイス１の基板２の上下に、電極、電解液及びサンプル投入用の孔を設けたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のポリマーブロック（ＴＯＲＡＹ社製）を液密に貼り付け、第１チャンバー５及び第２チャンバー６を作製した。第１チャンバー５及び第２チャンバー６の容量は、各々約１０μｌであった。第１電極５２及び第２電極６２には銀塩化銀電極を用い、ポリマーブロックに設けた孔から第１チャンバー５及び第２チャンバー６に挿入した。電源５４として電池駆動のバイアス電源（アクシスネット）を用い、リードを介して第１電極５２に接続した。電流計７には、電流アンプと１ＭＨｚの高時間分解能を持つデジタイザ（ＮＩ５９２２，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの取得を行い、取得したデータは、ＲＡＩＤドライブＨＤＤ（ＨＤＤ－８２６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ．）に格納した。
＜比較例１＞
　実施例１で作製したデバイスに、金蒸着とペプチドの結合を行わなかった以外は、実施例２と同様の手順で検出装置を作製した。
〔イオン電流の測定及び識別〕
　次に、作製した検出装置１－１を用いて、サンプルが貫通孔３を通過する際のイオン電流を測定した。サンプルの調整と測定方法は以下のとおりである。
（１）サンプルの調整
　サンプルには、大腸菌（ＪＭ１０９；タカラバイオ株式会社）及び枯草菌（２５９７５；ＡＴＣＣ）を用いた。枯草菌の大きさは、０．７－０．８×３．０μｍ、大腸菌の大きさは０．５×１．０～３．０μｍで、ほぼ同じ大きさである。サンプルは定法により培養した。培養液を遠心分離で沈降し、遠心沈降物を２．５％のＬＢ培地（ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ　ｍｉｌｌｅｒ，ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｃｏ．ＬＬＣ．）で洗浄した後、再度遠心分離により沈降した。遠心沈降物を５×１０７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、大腸菌懸濁液を作製した。
（２）イオン電流の測定
　実施例２及び比較例１で作製した検出装置１－１の第２チャンバー６に、電解液（ＰＢＳバッファー：和光純薬社製）を充填した。次に、上記（１）で調整したサンプルをＰＢＳバッファーによって１００倍に希釈した１０μｌの溶液を第１チャンバー５に加え、第１電極５２及び第２電極６２に５０ｍＶの電圧を印加し、イオン電流Ｉｉｏｎを測定した。
＜実施例３＞
　サンプルとして大腸菌を用い、実施例２で作製した検出装置１－１を用いてイオン電流の測定を行った。
＜比較例２＞
　実施例２で作製した検出装置１－１に代え、比較例１で作製した検出装置１－１を用いた以外は、実施例３と同様にイオン電流の測定を行った。
　図８は、実施例３及び比較例２で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図８から明らかなように、低下したイオン電流の値（Ｉｐ）は、実施例３及び比較例２とも同じであったことから、実施例３及び比較例２の測定では、大腸菌の大きさを正確に測定できたことを表している。一方、サンプルが貫通孔３に入ることでイオン電流値が低下し、サンプルが貫通孔３を出ることでイオン電流値が定常状態に戻るまでの時間（ｔｄ）は、実施例３の方が比較例２より明らかに長くなっていた。また、サンプルが貫通孔３を通過する時間が長くなったことで、図中の点線矢印で示すように、従来の測定では観察できなかった波形が見られるようになった。イオン電流値の低下は貫通孔３中のサンプル量に比例することから、本発明の測定方法により、サンプルの形状をより正確に測定したと考えられる。
＜実施例４＞
　貫通孔３の直径を約３μｍとした以外は、実施例３と同様の手順で大腸菌及び枯草菌のイオン電流の測定を行った。図９（Ａ）は、実施例４で測定した結果のグラフである。
＜比較例３＞
　貫通孔３の直径を約３μｍとした以外は、比較例２と同様の手順で大腸菌及び枯草菌のイオン電流の測定を行った。図９（Ｂ）は、比較例３で測定した結果のグラフである。
　図９（Ｂ）に示すように、貫通孔３に分子を形成していない検出装置を用いた場合、大腸菌と枯草菌を測定したイオン電流の波形はほぼ同じであり、両者を区別することはできなかった。一方、図９（Ａ）に示すように、貫通孔３に分子を形成した検出装置を用いた場合は、分子との相互作用により、大腸菌と枯草菌を測定したイオン電流の波形は明らかに異なっていた。以上の結果より、貫通孔３にサンプルと相互作用する分子を形成することで、大きさがほぼ同じサンプルであっても、サンプルを識別できることが明らかとなった。
　次に、相互作用する分子の種類、及びサンプルの種類を変えた種々の実験を行った。
［鞭毛あり大腸菌と鞭毛なし大腸菌の識別、分子：ペプチド］
＜実施例５＞
　貫通孔３の直径を約３００ｎｍとし、分子４として大腸菌の鞭毛と相互作用するように設計したペプチドを用いた以外は、実施例１と同様の手順でデバイス１を作製し、次いで、実施例２と同様の手順で検出装置１－１を作製した。設計したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　ＦＬＬＲＶＰＨＬＧＧＧＣ（配列番号２）
＜比較例４＞
　配列番号２に示すペプチドを貫通孔に形成しなかった以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス、及び検出装置を作製した。
＜実施例６（分子あり）および比較例５（分子なし）＞
　次に、実施例５及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして、鞭毛がある大腸菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ＢＷ２５１１３（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＫＥＩＯ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］、及び、鞭毛を構成する主要タンパク質であるＦｌｉＣを欠損させることで鞭毛をなくした大腸菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ΔｆｌｉＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，　ＫＥＩＯ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］を用いた以外は、上記〔イオン電流の測定及び識別〕と同様の手順で、サンプルを調製し、イオン電流の測定を行った。なお、大腸菌の大きさは、鞭毛の有無を除いて、ほぼ同じであった。
　図１０（Ａ）は、実施例６で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１０（Ａ）から明らかなように、大腸菌の鞭毛を認識するペプチドを貫通孔に結合した実施例５の検出装置でイオン電流の値（Ｉｐ）を測定した場合、鞭毛の有無により、イオン電流値の波形が明らかに異なっていた。一方、図１０（Ｂ）は、比較例５で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１０（Ｂ）から明らかなようにペプチドを貫通孔に結合していない比較例５の検出装置では、波形はほぼ同じであり、鞭毛あり大腸菌、鞭毛なし大腸菌の識別はできなかった。
［インフルエンザウイルスの識別、分子：ペプチド］
＜実施例７＞
　配列番号２に代え、インフルエンザウイルスを認識するように設計した以下の３種類のペプチドをそれぞれ用いた以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス１及び検出装置１－１を作製した。
　ＡＳＨＲＶＧＳＴＹＩＡＧＧＧＣ（配列番号３）
　ＡＳＨＲＶＧＳＴＹＩＧＧＧＣ（配列番号４）
　ＲＶＧＳＴＹＧＧＧＣ（配列番号５）
＜実施例８（分子あり）および比較例６、７（分子なし）＞
　次に、実施例７及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして、Ａ型のインフルエンザウイルス［Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓ（Ｈ１Ｎ１），Ａ／ＰＲ／８／３４（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＲ－９５）］及びＢ型のインフルエンザウイルス［Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ，Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＲ－１５３５）］を用い、以下に記載する手順でサンプルを調製した以外は、実施例６と同様の手順でイオン電流の測定を行った。
＜ウイルスの調整方法＞
　ウイルスは、ふ化鶏卵内培養法の定法にて培養した。すなわち、ふらん器にて３７℃、湿度６０％以上で転卵しながら培養した１０～１１日卵を検卵後、漿尿膜内にインフルエンザウイルスを接種し、さらに３日間培養した。気室から卵殻膜を破って吸引し漿尿液を採取した。
　図１１（Ａ）は配列番号３、図１１（Ｂ）は配列番号４、図１１（Ｃ）は配列番号５の分子を用いた際の、それぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ａ）～（Ｃ）から明らかなように、インフルエンザウイルスを認識するように設計したペプチドを貫通孔に結合した実施例８では、Ａ型、Ｂ型のインフルエンザウイルスを識別することができた。また、ペプチド配列の違いにより、測定したイオン電流の波形が大幅に異なることも確認した。一方、ペプチドを結合しなかった比較例６では、インフルエンザウイルスが貫通孔の周りに吸着し、イオン電流の測定ができなかった。なお、インフルエンザウイルスが貫通孔の周りに吸着したのは、金蒸着が原因と考えられた。そのため、貫通孔の直径を３００ｎｍとし、及び、金蒸着を行わず且つ分子を結合していない検出装置を実施例１および２に記載の手順に基づき作製し、イオン電流の測定を行った（比較例７）。図１１（Ｄ）は、比較例７でそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１１（Ｄ）に示すように、単に貫通孔を形成したのみでは、インフルエンザウイルスを識別することができなかった。以上の結果より、インフルエンザウイルスを識別できるのみならず、相互作用する分子を貫通孔に結合させることで、インフルエンザウイルスを測定できた。
［インフルエンザウイルスの識別、分子：糖鎖］
＜実施例９＞
　配列番号２のペプチドに代え、インフルエンザウイルスを認識する下記の糖鎖（６’－シアリルラクトース；東京化成社製）を、以下の結合方法により貫通孔に結合した以外は、実施例５と同様の手順で、デバイス１及び検出装置１－１を作製した。
＜結合方法＞
　オキシルアミノ基を有するウンデカンジスルフィド（Ｈ2Ｎ－Ｏ－（ＣＨ2）11－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）11－ＯＨ、Ｈ2Ｎ－Ｏ－（ＣＨ2）11－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ2）11－ＮＨ2）（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）をＰａｒｋらの文献（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００８，Ｖｏｌ．２４，６２０１－６２０７）を参考に合成を行った。得られた中間層形成材料をエタノールに溶解させ、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）形成用溶液を調製した。金の層を有する貫通孔をＳＡＭ形成用溶液に浸し、１時間置くことにより糖を固定化するためのＳＡＭを形成した。糖はｐＨ５．３の酢酸溶液中で０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で調製し、１５分間貫通孔を浸すことで糖の固定化を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
＜実施例１０（分子あり）および比較例８（分子なし）＞
　次に、実施例９及び比較例４で作製した検出装置を用い、サンプルとして無害化したインフルエンザウイルスを用い、実施例６と同様の手順でイオン電流の測定を行った。なお、無害化したインフルエンザウイルスは、以下に記載する手順で調整した。
＜無害化ウイルス調製方法＞
　検体溶液の原液として、０．０５％パラホルムアルデヒド溶液により、無害化されたＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（ＨＡ価２５６）を含む溶液を調製した。
　図１２は、実施例１０及び比較例８で測定したそれぞれ１個のサンプルのイオン電流の波形を重ね合わせたグラフである。図１２から明らかなように、インフルエンザウイルスを認識する糖鎖を貫通孔に結合した実施例９の検出装置でイオン電流の値（Ｉｐ）を測定した場合、糖鎖を結合していない比較例４の検出装置で測定したイオン電流値の波形と明らかに異なっていた。したがって、糖鎖を貫通孔に形成することで、インフルエンザウイルスを識別できることが明らかとなった。
［その他の実施形態］
　また、本発明は、以下のサンプル検出用デバイス、サンプル検出装置、イオン電流の検出方法及びサンプルの識別方法の実施形態を採ることもできる。また、上記に例示した実施形態と適宜組み合わせてもよい。
（１）基板、
　該基板に形成されたサンプルが通過する貫通孔、
　該貫通孔に形成され、通過するサンプルと相互作用する分子、
を含む、サンプル検出用デバイス。
（２）前記相互作用する分子が、ペプチド又は核酸である、
上記（１）に記載のサンプル検出用デバイス。
（３）前記貫通孔に金属層が積層され、前記相互作用する分子が金属層上に形成されている、
上記（１）又は（２）に記載のサンプル検出用デバイス。
（４）前記基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
　前記基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
を含む、上記（１）～（３）の何れか一に記載のサンプル検出用デバイス。
（５）上記（４）に記載のサンプル検出用デバイス、
　前記第１チャンバーに形成された第１電極、
　前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
　前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
を含む、
サンプル検出装置。
（６）基板に形成した貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
　前記貫通孔にはサンプルと相互作用する分子が形成され、サンプルが前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、サンプルが前記貫通孔を通過する時間を長くした、
イオン電流の測定方法。
（７）前記相互作用する分子が、ペプチド又は核酸である、
上記（６）に記載のイオン電流の測定方法。
（８）上記（６）又は（７）に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、サンプルを識別するサンプルの識別方法。
　本発明のデバイス１を用いることで、ほぼ同じ大きさサンプルであっても、識別することができる。したがって、イオン電流を測定する機器の検査装置の測定部として用いることができるので、検出装置の開発に有用である。

Claims (15)

  1. 　基板、
    　該基板に形成された被検生体物質が通過する貫通孔
    　該貫通孔に形成され、通過する被検生体物質と相互作用する分子、
    　該基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
    　該基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
    を具備し、被検生体物質が貫通孔を通過する時のイオン電流の波形により被検生体物質を識別することを特徴とする生体物質検出用デバイス。
  2. 　前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、請求項１に記載の生体物質検出用デバイス。
  3. 　前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、請求項１又は２に記載の生体物質検出用デバイス。
  4. 　前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質検出用デバイス。
  5. 　前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質検出用デバイス。
  6. 　前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’－ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質検出用デバイス。
  7. 　前記貫通孔に金属層が積層され、前記相互作用する分子が金属層上に形成されている、請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質検出用デバイス。
  8. 　請求項１に記載の生体物質検出用デバイス、
    　前記第１チャンバーに形成された第１電極、
    　前記第２チャンバーに形成された第２電極、及び、
    　前記貫通孔をサンプルが通過する時のイオン電流を計測するための電流計、
    を含む、
    生体物質検出用検出装置。
  9. 　基板に形成した貫通孔を被検生体物質が通過する時のイオン電流を測定するイオン電流の測定方法であって、
    　前記貫通孔には被検生体物質と相互作用する分子が形成され、被検生体物質が前記分子と相互作用しながら前記貫通孔を通過することで、イオン電流の波形の差異により、被検生体物質を識別することを特徴とする、
    イオン電流の測定方法。
  10. 　前記被検生体物質が、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、タンパク質のいずれか一つ以上である、請求項９に記載のイオン電流の測定方法。
  11. 　前記相互作用する分子が、ペプチド、糖鎖又は核酸である、請求項９又は１０に記載のイオン電流の測定方法。
  12. 　前記相互作用する分子が、配列番号２に示す鞭毛認識ペプチドである、請求項９～１１の何れか一項に記載のイオン電流の測定方法。
  13. 　前記相互作用する分子が、配列番号３乃至５から選択される１種のインフルエンザ認識ペプチドである、請求項９～１１の何れか一項に記載のイオン電流の測定方法。
  14. 　前記相互作用する分子が、インフルエンザ認識糖鎖（６’－ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）を含む、請求項９～１１の何れか一項に記載のイオン電流の測定方法。
  15. 　請求項９～１４に記載のイオン電流の測定方法により測定したイオン電流から、被検生体物質を識別する生体物質の識別方法。
     
PCT/JP2017/016041 2016-04-21 2017-04-21 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法 WO2017183716A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018513228A JP6638913B2 (ja) 2016-04-21 2017-04-21 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法
US16/095,340 US10877021B2 (en) 2016-04-21 2017-04-21 Device for biological material detection, detection apparatus for biological material detection, method for measuring ion current, and method for identifying biological material
CN201780024754.2A CN110192096B (zh) 2016-04-21 2017-04-21 生物体物质检测用设备和检测装置、离子电流的测定方法以及生物体物质的识别方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-085113 2016-04-21
JP2016085113 2016-04-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017183716A1 true WO2017183716A1 (ja) 2017-10-26

Family

ID=60116152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/016041 WO2017183716A1 (ja) 2016-04-21 2017-04-21 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10877021B2 (ja)
JP (1) JP6638913B2 (ja)
CN (1) CN110192096B (ja)
WO (1) WO2017183716A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020017608A1 (ja) * 2018-07-19 2020-01-23 国立大学法人大阪大学 ウイルス計測方法、ウイルス計測装置、ウイルス判定プログラム、ストレス判定方法、およびストレス判定装置
JPWO2021111987A1 (ja) * 2019-12-03 2021-06-10

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110282599A (zh) * 2019-05-05 2019-09-27 湖南大学 一种镶嵌功能材料微纳孔结构及其制备方法和使用方法
CN112019090B (zh) * 2019-05-30 2021-08-31 清华大学 装饰环
WO2024102081A1 (en) * 2022-11-10 2024-05-16 National University Of Singapore Nanopore sensor for biomarkers

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10310610A (ja) * 1997-05-09 1998-11-24 Snow Brand Milk Prod Co Ltd シアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体及びその用途
WO2013137209A1 (ja) * 2012-03-13 2013-09-19 株式会社 東芝 一粒子解析装置および解析方法
JP2014173936A (ja) * 2013-03-07 2014-09-22 Toshiba Corp 検体検出装置及び検出方法
JP2014210245A (ja) * 2013-04-22 2014-11-13 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポア作製方法、ナノポア作製装置、及びナノポアを用いた分析装置
JP2014531901A (ja) * 2011-09-23 2014-12-04 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド ポリマー単位を含むポリマーの解析

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171578B1 (en) * 1999-04-14 2001-01-09 Diatide, Inc. Benzodiazepine derivatives for imaging thrombi
WO2008049108A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-24 Northwestern University Surface-independent, surface-modifying, multifunctional coatings and applications thereof
CN102000658B (zh) * 2010-12-15 2013-04-03 成都西南交大科技园管理有限责任公司 一种基于聚多巴胺的生物功能化改性方法
EP2697394A4 (en) * 2011-04-12 2015-01-14 Electronic Biosciences Inc CHEMICALLY MODIFIED NANOPORA DEVICES AT A SPECIFIC SITE
EA026527B1 (ru) * 2011-09-30 2017-04-28 Селлтрион Инк. Связующая молекула, обладающая нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа а, полученная из в-клеток человека
JP2013090576A (ja) * 2011-10-24 2013-05-16 Hitachi Ltd 核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置
WO2013125225A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 Shimoide Yoshiteru Composition for preventing or treating allergic disease or major depressive disorder (depression)
US20130256139A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 International Business Machines Corporation Functionalized graphene or graphene oxide nanopore for bio-molecular sensing and dna sequencing
EP2861998B1 (en) * 2012-06-18 2020-07-22 Electronic Biosciences Inc. Cell-free assay device and methods of use
US9188578B2 (en) * 2013-06-19 2015-11-17 Globalfoundries Inc. Nanogap device with capped nanowire structures
JP6189231B2 (ja) 2014-02-26 2017-08-30 株式会社東芝 微粒子検査装置と微粒子検査システム及び微粒子検査方法
US9921181B2 (en) * 2014-06-26 2018-03-20 International Business Machines Corporation Detection of translocation events using graphene-based nanopore assemblies
US20180299424A1 (en) * 2014-11-12 2018-10-18 Bharath Takulapalli System and method for nucleotide sequencing
US9551707B2 (en) * 2015-04-30 2017-01-24 International Business Machines Corporation Gold ion beam drilled nanopores modified with thiolated DNA origamis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10310610A (ja) * 1997-05-09 1998-11-24 Snow Brand Milk Prod Co Ltd シアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体及びその用途
JP2014531901A (ja) * 2011-09-23 2014-12-04 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド ポリマー単位を含むポリマーの解析
WO2013137209A1 (ja) * 2012-03-13 2013-09-19 株式会社 東芝 一粒子解析装置および解析方法
JP2014173936A (ja) * 2013-03-07 2014-09-22 Toshiba Corp 検体検出装置及び検出方法
JP2014210245A (ja) * 2013-04-22 2014-11-13 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポア作製方法、ナノポア作製装置、及びナノポアを用いた分析装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEXTON, L.T. ET AL.: "An Adsorption-Based Model for Pulse Duration in Resistive-Pulse Protein Sensing", JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 132, no. 19, 19 May 2010 (2010-05-19), pages 6755 - 6763, XP055431975, Retrieved from the Internet <URL:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jal00693x> [retrieved on 20170612] *
WEI, R. ET AL.: "Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores", NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 7, no. 4, April 2012 (2012-04-01), pages 1 - 7, XP055283004, Retrieved from the Internet <URL:http://www.researchgate.net/publication/221692925Stochastic_Sensing-of-Proteins_with_Receptor-Modified_Solid-State_Nanopores> [retrieved on 20170612] *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020017608A1 (ja) * 2018-07-19 2020-01-23 国立大学法人大阪大学 ウイルス計測方法、ウイルス計測装置、ウイルス判定プログラム、ストレス判定方法、およびストレス判定装置
JPWO2020017608A1 (ja) * 2018-07-19 2021-08-02 国立大学法人大阪大学 ウイルス計測方法、ウイルス計測装置、ウイルス判定プログラム、ストレス判定方法、およびストレス判定装置
US20210285911A1 (en) * 2018-07-19 2021-09-16 Osaka University Virus measuring method, virus measuring device, virus determining program,stress determining method, and stress determining device
JP7194458B2 (ja) 2018-07-19 2022-12-22 国立大学法人大阪大学 ウイルス計測方法、ウイルス計測装置、およびストレス判定装置
US12013365B2 (en) 2018-07-19 2024-06-18 Osaka University Virus measuring method, virus measuring device, virus determining program,stress determining method, and stress determining device
JPWO2021111987A1 (ja) * 2019-12-03 2021-06-10
WO2021111987A1 (ja) * 2019-12-03 2021-06-10 国立研究開発法人科学技術振興機構 ナノポア構造体、ナノポア構造体を含む塩基配列解析装置
JP7237388B2 (ja) 2019-12-03 2023-03-13 国立研究開発法人科学技術振興機構 ナノポア構造体、ナノポア構造体を含む塩基配列解析装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN110192096A (zh) 2019-08-30
US10877021B2 (en) 2020-12-29
JPWO2017183716A1 (ja) 2019-03-07
CN110192096B (zh) 2022-04-19
JP6638913B2 (ja) 2020-02-05
US20190128888A1 (en) 2019-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017183716A1 (ja) 生体物質検出用デバイス、生体物質検出用検出装置、イオン電流の測定方法、及び、生体物質の識別方法
Xie et al. An electrochemical peptide cleavage-based biosensor for prostate specific antigen detection via host–guest interaction between ferrocene and β-cyclodextrin
US8513001B2 (en) Method and apparatus for target detection using electrode-bound viruses
CN102242062B (zh) 一种高分辨率的生物传感器
CN104203808B (zh) 具有纳米结构电极的生物传感器
Gao et al. Direct ultrasensitive electrical detection of prostate cancer biomarkers with CMOS-compatible n-and p-type silicon nanowire sensor arrays
US20190242885A1 (en) Digital protein sensing chip and methods for detection of low concentrations of molecules
US20190017103A1 (en) Nano-sensor array
KR102409049B1 (ko) 전계 효과 트랜지스터 센서(a field-effect transistor sensor)
CN108368466B (zh) 生物体分子测定装置
CN112020645A (zh) 基于多孔电极的生物传感器
EP1869226A2 (en) Viral nucleoprotein detection using an ion channel switch biosensor
Mahmoodi et al. Multiwell plate impedance analysis of a nanowell array sensor for label-free detection of cytokines in mouse serum
CN102788833B (zh) 一种检测低丰度低分子量蛋白谱的试剂盒
JP4497903B2 (ja) タンパク質チップおよびそれを用いたバイオセンサー
JP5311406B2 (ja) 免疫センサ
CN107192747B (zh) 一种可变电容式微纳米生物检测芯片及其加工方法
CN104726559A (zh) 一种检测生物分子的方法
JP6782968B2 (ja) 電極およびバイオセンサ
JP7398118B2 (ja) サンプル識別方法、サンプル識別用デバイス、および、サンプル識別装置
EP4124855A1 (en) Graphene biosensor for the detection of hepatitis c virus
TW202415945A (zh) 微流體感測裝置、微流體感測系統及微流體感測方法
JP2007271619A (ja) イオン物質のサイズ及び濃度を同時に検出する方法及び装置
TW202338344A (zh) 製備生物晶片的方法及所製備出的生物晶片
CN116615656A (zh) 电化学传感器

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018513228

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17786053

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17786053

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1