JPH10310610A - シアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なシアリルラクトース結合ポリスチレン
誘導体及びその用途。 【解決手段】 一般式〔Ｉ〕で表されるシアリルラクト
ース結合ポリスチレン誘導体。このポリスチレン誘導体
を有効成分とするインフルエンザウィルス付着防止剤。
シアリルラクトースに比べて約1000倍の赤血球凝集阻害
効果を有し、インフルエンザウィルスの細胞への付着を
阻止し、インフルエンザ感染の予防に有用である。 【化１】 式中Ｒは、シアリルラクトース残基を示し、またｎは１
以上の整数を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なシアリルラ
クトース結合ポリスチレン誘導体、及びこの誘導体を有
効成分とするインフルエンザウイルス付着阻止剤に関す
る。本発明のインフルエンザウイルス付着阻止剤は、細
胞へのインフルエンザウイルスの付着を著しく阻止する
ことができるので、その作用によってインフルエンザウ
イルスによる感染を予防することができる。

【０００２】

【従来の技術】シアリルラクトースは、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸が乳糖のガラクトース残基に結合したシアル
酸含有糖質で、乳及び乳製品中に微量に含まれている。
そして、乳中に存在するシアリルラクトースの比率は、
生物種や泌乳期により大きく異なることが知られてい
る。例えば、牛乳中のシアリルラクトースの比率は、0.
03〜0.06mg/ml であるが、人乳中のシアリルラクトース
の比率は、0.25〜0.90mg/ml である。また、初乳におい
ては、これよりさらに高いシアリルラクトースの比率と
なっている。

【０００３】近年、このシアリルラクトースの生理効果
が注目され、例えば、胃炎の原因菌といわれているカン
ピロバクター・ピロリ(Campylobacter pylori) の粘膜
への付着阻害(Infect. Immun., vol.56, pp.2896-2906,
1988)、新生児の脳膜炎や敗血症の原因菌であるＳ−型
の大腸菌の付着阻害(Acta Paediatr., vol.82, pp.6-1
1, 1993) 等が確認されている。

【０００４】一方、毎年、冬になると流行して多くの人
が感染するインフルエンザウイルスは、未だ有効な治療
法や感染予防法が見出されていない病原体の一つであ
る。現在、インフルエンザウイルスによる感染を予防す
る方法として、ワクチンを使用する方法が一般的であ
る。そして、このワクチンの抗原部位は、インフルエン
ザウイルス表面に位置するスパイク糖タンパク質である
へマグルチニンやシアリダーゼであるが、これら糖タン
パク質はしばしば変異するので、流行しているインフル
エンザウイルスに最適なワクチンの開発が間に合わない
という問題がある。

【０００５】このインフルエンザウイルスによる感染の
メカニズムは、インフルエンザウイルス表面のへマグル
チニンが標的細胞表面のシアル酸含有複合糖質を認識し
て結合することによると考えられている。したがって、
インフルエンザウイルスに結合するシアル酸含有複合糖
質は、体内においてインフルエンザウイルスに対する感
染防御物質として機能し得ることが予想される。実際、
いくつかのインフルエンザウイルス株については、種々
のシアル酸含有複合糖質を使用し、赤血球凝集阻止活性
を指標としたインフルエンザウイルスの付着阻止実験が
行われている。しかし、これら種々のシアル酸含有複合
糖質は、インフルエンザウイルスの付着阻止効果が低か
ったり、その合成経路が極めて複雑で実用的でないとい
う理由から、未だシアル酸含有複合糖質を有効成分とす
るインフルエンザウイルスの付着阻止剤は開発されるに
至っていない。

【０００６】なお、シアル酸含有複合糖質であるシアリ
ルラクトースは、Ａ型インフルエンザウイルスのレセプ
ターとして知られており、インフルエンザウイルス感染
予防剤として期待されている(Nature, vol.333, pp.426
-431, 1998) 。しかし、シアリルラクトースのインフル
エンザウイルスに対する付着阻止効果は、単位容積当た
りシアリルラクトース 0.1％以上と極めて高い投与によ
り発揮されるのみである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、インフ
ルエンザウイルス等のウイルス感染予防及び治療効果を
有する物質を求めて鋭意研究を進めていたところ、従来
よりインフルエンザウイルスのレセプターとして知られ
ているシアリルラクトースを高分子化した新規物質のシ
アリルラクトース結合ポリスチレン誘導体が、インフル
エンザウイルスと強い結合活性を有することを見出し、
本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、新
規なシアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体を提供
することを課題とする。また、本発明は、この誘導体を
有効成分とする新規なインフルエンザウイルス付着阻止
剤を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規なシアリ
ルラクトース結合ポリスチレン誘導体に関する。本発明
の新規なシアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体
は、次の一般式〔Ｉ〕で表される物質である。本発明で
は、一般式〔Ｉ〕でｎ＝１のシアリルラクトース結合ス
チレン誘導体も便宜上シアリルラクトース結合ポリスチ
レン誘導体という。

【０００９】

【化２】 （但し、Ｒはシアリルラクトース残基を示し、また、ｎ
は１以上の整数を示す。）

【００１０】また、本発明は、このシアリルラクトース
結合ポリスチレン誘導体を有効成分とする新規なインフ
ルエンザウイルス付着防止剤に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のシアリルラクトース結合
スチレン（ｐ−ビニルベンズアミド−β−Ｎ−シアリル
ラクトース）は以下のようにして調製することができ
る。すなわち、シアリルラクトースを水に溶解した後、
シアリルラクトースに対して10〜200 倍モルの炭酸水素
ナトリウムや炭酸水素アンモニウム等を加え、反応温度
20〜40℃でシアリルラクトースの還元性水酸基をアミノ
化する。次に、このアミノ化シアリルラクトースを水と
アルコールの混合溶媒に溶解し、予めテトラヒドロフラ
ンに溶解しておいたビニルベンゾイルクロリドと反応さ
せることにより、シアリルラクトース結合スチレン（ｐ
−ビニルベンズアミド−β−Ｎ‐シアリルラクトース）
を得ることができる。

【００１２】また、本発明のシアリルラクトース結合ポ
リスチレン誘導体は、上記のシアリルラクトース結合ス
チレンを公知の重合方法で重合させることにより得るこ
とができる。なお、重合に使用することができる溶媒
は、シアリルラクトース結合スチレンコモノマーを溶解
することができるものならば特に制限はない。共重合体
を調製する場合、コモノマーとしてスチレンと共重合性
を有するものであれば良く、例えば、アクリルアミド、
アクリロニトリル、アクリル酸メチル、メタクリル酸メ
チル等を使用することができる。また、重合開始剤とし
ては、アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウ
ム等のラジカル重合触媒を使用すれば良い。

【００１３】本発明で原料として使用するシアリルラク
トースの調製方法としては、乳から樹脂を用いて分離す
る方法(Biochem. Biophys Acta, vol.130, pp.1-11, 19
66)や擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用い
て分離する方法 (特開平7- 79800号公報、特開平8-2524
03号公報) 等が知られており、これらの方法で調製され
たシアリルラクトースを使用すれば良い。なお、シアリ
ルラクトースには、シアル酸とラクトースが２→６結合
したもの及び２→３結合したものがあるが、いずれのシ
アリルラクトースを使用しても良いし、また混合物を使
用しても構わない。

【００１４】また、本発明のシアリルラクトース結合ポ
リスチレン誘導体を有効成分とするインフルエンザウイ
ルス付着防止剤に関する。本発明のシアリルラクトース
結合ポリスチレン誘導体は、高分子シアリルラクトース
を含有しており、、顕著なインフルエンザウイルス付着
阻止効果を有する。したがって、このシアリルラクトー
ス結合ポリスチレン誘導体は、インフルエンザウイルス
の細胞への吸着を阻止する目的で、インフルエンザウイ
ルス付着阻止剤の有効成分として使用される。

【００１５】本発明のシアリルラクトース結合ポリスチ
レン誘導体は水溶性の粉末であり、取り扱い易く、投与
法に特に制限はなく、軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠
剤、丸剤、類粒剤、懸濁剤等の経口剤、注射剤等の非経
口剤として投与することができる。なお、一日当たりの
成人の投与量は、経口投与で約10〜100mg 、非経口投与
の場合は、静脈内投与で約１〜10mg、筋肉内投与で約５
〜30mg、皮下及び皮内投与で約３〜15mgが好ましく、一
日一回又は数回に分けて投与すれば良い。

【００１６】次に、参考例、実施例及び試験例を示し、
本発明をさらに詳しく説明する。

【参考例１】チーズを製造する際に排出されるホエー15
L を限外濾過（Cefilt 10kDa 、 NGフィルテック製、1.4
m²）して蛋白質を取り除いた残渣から、さらにシーデイ
ングにより乳糖を結晶で取り除いた乳糖結晶母液をエバ
ポレーターを用い30％まで濃縮して擬似移動床（ＳＭ
Ｂ）への供給液として用いた。溶離液は脱イオン水を用
いている。ＳＭＢは、カラムの直径 25mm 長さ 460mmの
８塔型で、各々カチオン交換樹脂UBK510L 三菱化学製）
の対イオンをNa型として充填した。ＳＭＢの運転条件
は、ＳＭＢ処理液供給量 3.4mL/min、ＳＭＢ溶離液供給
量 5.8mL/min、ラフィネート抜き出し量 4.2mL/min、エ
キストラクト抜き出し量 5.0mL/min、カラム温度10℃、
ステップ時間7.40とした。

【００１７】以上の条件で、先の乳糖結晶母液濃縮物 3
1Lを処理したところ、エキストラクトに乳糖等を含む非
酸性糖画分 38Lを、また、ラフィネートにシアリルラク
トースを含む濃縮画分 460mLをそれぞれ得た。次に、こ
のラフィネートをロータリーエバポレーターで濃縮し、
直径40cm×70cmのアニオン交換樹脂（Dow 1,酢酸型）に
通して吸着させた。十分量の水を流して中性糖を溶出し
た後、上記吸着シアリルラクトースを０〜0.06M の酢酸
ナトリウムを用いてグラジェント溶出した。この溶出条
件によりシアリルラクトースは完全に分離することが可
能となった。得られた溶出画分をさらに濃縮し、電気透
析（トクヤマ製）、モデル TS-24型、膜面積：カチオン
膜、アニオン膜共に960dm²）で脱塩した。このようにし
て得たシアリルラクトースを減圧濃縮後、凍結乾燥して
白色粉末 4.80gを得た。このようにして調製したシアリ
ルラクトースの純度は、高速液体クロマトグラフィーで
97％以上であった。また、このときのシアリルラクトー
スはシアリルα２−６ラクトース(1a)とシアリルα２−
３ラクトース(1b)の比が１：6.5 であった。

【００１８】

【実施例１】100mlのナス型フラスコに、参考例１で調
製したシアリルラクトース(1a),(1b) 0.2g (0.32ミリモ
ル）をとり、水10mlを加えて溶解させ、撹拌しながら炭
酸水素アンモニウムを過飽和となるまで加えた。この反
応溶液は37℃で約３日間スターラーで撹拌した。反応の
進行状態は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で追跡し
た（展開溶媒として、酢酸エチル：酢酸：メタノール：
水＝４：３：３：１（容量比）の混合溶媒を使用した。
シアリルラクトースのRf値は 0.4、β−シアリルラクト
シルアミンのRf値は0.18）。反応を始めてから３日後に
はシアリルラクトースのスポットか殆どなくなった。過
剰の炭酸水素アンモニウムを除去するために、水 150ml
を加えて希釈した後、減圧エパポレーターで濃縮する操
作をアンモニア臭がなくなるまで３回繰り返した。粉末
として得られたβ−シアリルラクトシルアミンを精製す
ることなく、次の反応に用いた。

【００１９】このβ−シアリルラクトシルアミンに水
4.0mlを加えて希釈した。次いで、炭酸ナトリウム0.2g
とメタノール５mlを加えて、５時間撹拌して溶解させ
た。氷水浴により反応温度を０℃に保ちながらｐ−ビニ
ルベンゾイルクロリド(2) 0.6mlをテトラヒドロフラン
溶液 6.0mlに溶解させたものを滴下し、反応の進行をＴ
ＬＣで追跡した（展開溶媒として、酢酸エチル：酢酸：
メタノール：水＝４：３：３：１（容量比）の混合溶媒
を使用した。β−シアリルラクトシルアミンのRf値は0.
18、ｐ−ビニルベンズアミド−β−シアリルラクトース
のRf値は0.67）。生成物を陰イオン交換カラムクロマト
グラフィー（充填剤：DEAE-ION EXCHANGERセルロファイ
ンA-500;溶出液：NaCl ステップワイズ法 0N →0.1N）
により分離精製した。脱塩装置で脱塩した後、凍結乾燥
を行いｐ−ビニルベンズアミド−β−シアリルラクトー
ス(3a),(3b) の白色粉未を単離した。

【００２０】

【化３】

【００２１】

【実施例２】シアリルラクトース結合ポリスチレンの製
造例を以下に示す。すなわち、試験管にｐ−ビニルベン
ズアミド−β−シアリルラクトース(3a),(3b) 0.15g を
とり、予め脱気しておいた 1.0mlの水に溶解させた。次
に、 6.3μl のN,N,N',N'-テトラメチレンジアミン(TME
DA) を加えた後、キャピラリーを用いて溶液中に窒素を
流し、試験管内が十分に窒素で満たされたところでセー
ラムキャップを被せた。これらの操作は、重合が始まら
ないように全て氷浴中で行った。事前に調製しておいた
過硫酸アンモニウム100mg/mlをシリンジを用いて25μL
注入し、30℃の恒温槽で重合を開始した。５時間後、試
験管を氷浴につけて反応を停止させた後、反応溶液をメ
タノール中に注いで得られたポリマーを沈澱させた。上
澄みを取り除いた後、沈澱物を少量の水に溶かし、分子
量 3,500以下の物質を透析するセルロ一スチュ一ブ（ナ
カライテスク製）を用いて３日間透析した後、凍結乾燥
して白色粉末状のｐ−ビニルベンズアミド−β−シアリ
ルラクトース重合体（シアリルラクトース結合ポリスチ
レン）(5a),(5b) を得た。なお、化合物(5a),(5b)のx,
y,z はそれぞれ 0.005, 0.034,0.96であった。得られた
重合体の収率は89重量％（133mg)であった。得られたシ
アリルラクトース結合ポリスチレンは水、ＤＭＳＯに可
溶である。

【００２２】

【化４】

【００２３】

【実施例３】シアリルラクトース結合ポリスチレンとポ
リアクリルアミドの共重合体の製造例を以下に示す。す
なわち、試験管にｐ−ビニルベンズアミド−β−シアリ
ルラクトース0.065gとアクリルアミド0.065g（モル分率
１：12.5）をとり、予め脱気しておいた 1.0mlの水に溶
解させた。次に、12.5μl のN,N,N',N'-テトラメチレン
ジアミン（ＴＭＥＤＡ) を加えた後、キャピラリーを用
いて溶液中に窒素を流し、試験管内が十分に窒素で満た
されたところでセーラムキャップを被せた。これらの操
作は、重合が始まらないように全て氷浴中で行った。事
前に調製しておいた過硫酸アンモニウム (ＡＰＳ) 100m
g/mlをシリンジを用いて25μL 注入し、30℃の恒温槽で
重合を開始した。５時間後、試験管を氷浴につけて反応
を停止させた後、反応溶液をメタノール中に注いで得ら
れたポリマーを沈澱させた。上澄みを取り除いた後、沈
殿物を少量の水に溶かし、分子量 3,500以下の物質を透
析するセルロ一スチュ一ブ（ナカライテスク製）を用い
て３日間透析した後、凍結乾燥して白色粉末状のシアリ
ルラクトース結合ポリスチレンとポリアクリルアミドの
共重合体を得た。得られた重合体の収率は85重量％（11
0mg)であった。また、1H-NMRにより算出した共重合体の
モル分率は１：16であった。

【００２４】

【試験例１】実施例１で得られたシアリルラクトース結
合スチレン、実施例２で得られたシアリルラクトース結
合ポリスチレン誘導体及び対照としてシアリルラクトー
スを使用し、赤血球凝集阻止活性を指標としてインフル
エンザウイルスに対する反応性を調べた。すなわち、試
料１mgをＰＢＳ 1mlに溶解させて、１mg／mlの溶液を調
製した。この試料溶液25μl をマイクロタイタープレー
ト上で、0.02％(W/V)ゼラチン−ＰＢＳ溶液25μl を加
え倍々希釈する。各ウエルに予め４倍の血球凝集阻止活
性に調製しておいたウイルス液25μl を加えた後、マイ
クロミキサーで30秒振とうし、４℃で１時間静置後、赤
血球凝集阻害を起こした最高希釈倍率を測定した。その
結果を表１に示す。

【００２５】

【表１】 ────────────────────────────────── 最少阻害濃度 (mg/ml) ────────────────────────────────── シアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体 0.001 シアリルラクトース結合スチレン 0.015 シアリルラクトース ＞1 ──────────────────────────────────

【００２６】これよると、シアリルラクトース結合スチ
レン及びシアリルラクトース結合ポリスチレン誘導体
は、それぞれ、シアリルラクトースよりも強くインフル
エンザウイルスと結合することが判った。なお、赤血球
凝集活性はニワトリ赤血球が凝集するために必要なウイ
ルスの希釈倍率で表した。すなわち、精製インフルエン
ザウイルス25μl をマイクロタイタープレート(96-bott
om wells, Falcon社製)上にて、0.01％(W/V) ゼラチン
−ＰＢＳ溶液25μl を加え、倍々希釈する。各ウエルに
0.5％(V/V) ニワトリ赤血球−ＰＢＳ溶液25μl を加
え、マイクロミキサーで30秒振とうし、４℃で１時間静
置後、凝集像を観察した。

【００２７】

【実施例４】実施例２で得られたシアリルラクトース結
合ポリスチレン誘導体 10gを精製蒸留水1Lに懸濁し、こ
れを10mlのアンプルに充填し、殺菌を行って静注用注射
剤を得た。

【００２８】

【実施例５】実施例２で得られたシアリルラクトース結
合ポリスチレン誘導体 20gを乳糖 15g、トウモロコシ澱
粉 15g、カルボキシメチルセルロースカルシウム 10g及
びステアリン酸マグネシウム1gを混合し、打錠して錠剤
1,000錠を製造した。

【００２９】

【発明の効果】シアリルラクトース結合ポリスチレン誘
導体は、インフルエンザウイルスと強く結合するので、
インフルエンザウイルスの細胞への吸着を阻止すること
ができる。従って、本発明のシアリルラクトース結合ポ
リスチレン誘導体を有効成分とするインフルエンザウイ
ルス吸着阻止剤を使用することにより、インフルエンザ
ウイルスの感染を予防することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 一清 愛知県愛知郡東郷町和合ケ丘３−13−10 (72)発明者 鈴木 康夫 静岡県静岡市瀬名１丁目８番３−102

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の一般式〔Ｉ〕で表されるシアリルラ
   クトース結合ポリスチレン。 【化１】 （但し、Ｒはシアリルラクトース残基を示し、また、ｎ
   は１以上の整数を示す。）
2. 【請求項２】 請求項１に記載のシアリルラクトース結
   合ポリスチレン誘導体を有効成分とするインフルエンザ
   ウイルス付着阻止剤。