JP5360497B2 - 新規なn結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマーおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
(式(II)中、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Y1及びY2は水酸基又はN−アセチルノイラミン酸残基、Lは炭化水素を意味し、mは0又は1もしくは2の整数を示す。ただし、Y1とY2は同一でない。)
糖の還元末端の1位をアミノ化し、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてアミド結合させてN結合型の糖プライマーを合成する工程。
必要に応じて工程1で得られた糖プライマーに糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させ、非還元末端に目的とするアシアロ糖鎖部を合成してN結合型アシアロ糖鎖を合成する工程。
工程2で合成したN結合型アシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合してアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程。
工程3で合成したアシアロ糖鎖含有ポリマーを、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを単離取得する工程。
糖の還元末端の1位をアミノ化し、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてアミド結合させてN結合型の糖プライマーを合成する工程。
工程1で得られた糖プライマーに糖転移酵素を用いて必要に応じて糖鎖を伸長させた後、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化反応を行って前記糖プライマーの非還元末端に目的とするシアロ糖鎖部を合成してN結合型シアロ糖鎖を合成する工程。
カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び/又は添加剤を用いてγ−ポリグルタミン酸を活性化し、工程2で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合する工程。
本発明のN結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマー(N結合型人工シアロ糖鎖含有ポリペプチドと称することもある)は、以下の構造式(I)で示されるものである。
(式(II)中、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Y1及びY2は水酸基又はN−アセチルノイラミン酸残基、Lは炭化水素を意味し、mは0又は1もしくは2の整数を示す。ただし、Y1とY2は同一でない。)
(工程1)糖プライマーの合成
工程2は、工程1で合成した糖プライマー(N結合型糖プライマー)と糖供与体(糖ヌクレオチド:ウリジン5’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン5’−ジリン酸N−アセチルグルコサミンなど)を含有する反応系に合目的的な糖転移酵素(β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β1,3−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなど)を添加してN結合型糖プライマーの非還元末端側に糖鎖を伸長させ、N結合型糖プライマーの非還元末端側にアシアロ糖鎖部を合成する工程である。
工程3は、工程2で合成したN結合型アシアロ糖鎖を、その還元末端にあるリンカーのアミノ基を介してγ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合する工程である。
工程4は、工程3で合成したN結合型アシアロ糖鎖含有ポリマーを、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化し、目的とするN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを単離取得する工程である。シアル酸転移酵素を用いてN結合型アシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化する工程は、公知の方法(特許文献1及び2、非特許文献1及び2)により実施することができる。合成されたN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。
(工程1)糖プライマーの合成
工程2は、糖プライマーと糖供与体(糖ヌクレオチド:ウリジン5’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン5’−ジリン酸N−アセチルグルコサミン、シチジン5’−モノリン酸N−アセチルノイラミン酸など)を含有する反応系に合目的的な糖転移酵素(β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β1,3−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α2,6−シアリルトランスフェラーゼなど)を添加して、目的とするシアロ糖鎖部を合成する工程である。
工程3は、工程2で合成したN結合型シアロ糖鎖を、その還元末端にあるリンカーのアミノ基を介してγ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合する工程である。
工程4は、工程3で合成したN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程である。合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。
本発明のN結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマーは、その合成のし易さに加え、従来のO結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの数倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を有することから、インフルエンザウイルス感染、インフルエンザウイルスの流行を防止する各種の手段に適用できる。例えば、マスクや空気清浄機、エアコンなどのフィルターにおけるウイルス吸着剤などの用途があげられる。さらには、ヒト感染型とトリ感染型のインフルエンザウイルスのレセプター認識の特異性の違い(レセプターのシアロ糖鎖のシアル酸結合様式の違い)から、α2,3型結合シアロ糖鎖含有ポリマーとα2,6型結合型糖鎖含有ポリマーを基材に用いて、インフルエンザウイルスのレセプター認識特異性の解析が可能であることから、新型インフルエンザウイルスのサーベーランスにも適用できる。
(1)HPLC
サンプルはすべて0.45μmのフィルター濾過した後、分析した。分析条件は下記に示したものを用いた。
カラム :Mightysil Si60(φ4.6×250mm)
カラム温度 :40℃
流速 :1.0ml/min
検出波長 :210nm
溶媒 :90%CH3CN
あるいは、
カラム :YMC Pro C18RS(φ6.0×150mm)
カラム温度 :30℃
流速 :1.0ml/min
検出波長 :210nm
溶媒 :20%CH3CN−20mM KH2PO4
分析機器 :JEOL EX−270 NMR spectrometer,
JEOL lamda 500FT NMR spectrometer
Bruker AV−500 NMR spectrometer
外部標準 :TPS[sodium3−(trimethylsilyl)−propionate]
溶媒 :D2O
温度 :25℃あるいは60℃
サンプル管 :φ3または5mm
3−1.β1,4−ガラクトース転移酵素(β1,4−GalT)の調製
WO2007/026669の記載に従って調製した。
文献(Protein Expr. Purif.,35,54−61(2004))の記載に従って調製した。
(3−3−1)ラットシアル酸転移酵素
α2,3−シアリルトランスフェラーゼ(Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda)、α2,6−シアリルトランスフェラーゼ(Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda)は、Calbiochem社より購入した。
(3−3−2)α2,3−Sialyltransferase(α2,3−SiaT)の調製
WO2007/026669の記載の実施例に従って調製した。
(3−3−3)α2,6−Sialyltransferase (α2,6−SiaT)の調製
WO2007/026669の記載の実施例に従って調製した。
Lactose Monohydrate、5−amino−1−pentanolは、和光純薬(株)より、γ−PGAは、明治製菓(株)より、糖ヌクレオチド(UDP−GlcNAc,UDP−Gal,CMP−NeuAc)はヤマサ醤油(株)より、LacNAcは焼津水産(株)より購入した。Trifluoroacetic Anhydride、MnCl2・4H2Oは、和光純薬(株)より購入した。α−PGA、BOP、HOBt、およびBSAは、Sigma−Aldrich社より購入した。
pNP:p−nitrophenol
pAP:p−aminophenol
Lac:Lactose(Gal(β1−4)Glc)
Gal:Galactose
LacNAc:N−acetyllactosamine(Gal(β1−4)GlcNAc)
NeuAc:N−acetylneuraminic acid
GlcNAc:N−acetylglucosamine
α−PGA:α−polyglutamic acids
γ−PGA:γ−polyglutamic acids
DMSO:Dimethyl sulfoxide
DMF:Dimethyl formamide
DIEA:N,N−Diisopropylethylamine
UDP−GlcNAc・2Na:Uridine 5‘−diphospho N−acetylglucosamine,disodium salt
UDP−Gal・2Na:Uridine 5‘−diphospho −α−D.−galactose disodium salt
HBTU:o−(Benzotriazol−1−yl)−tetramethyluronium hexafuorophosphate
HOSu:N−hydroxysuccinimide
EDC:1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
BOP:Benzotriazol−1−yloxytris−(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
HOBt:1−Hydroxybenzotriazole hydrate
PBS:10mM Phosphate buffered saline(pH7.4)
TPS:Sodium 3−(trimethylsilyl)−propionateCMP NeuAc:Cytidine−monophosphate N−acetylneuraminic acid
まず、工程1について、末端にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物(6−Trifluoroacetamidohexanoic acid)を合成する工程(1−A)、1−アミノ糖を合成する工程(1−B)、工程1−Aで合成したリンカー化合物と工程1−Bで合成した1−アミノ糖とを縮合させN結合型糖プライマーを合成する工程(1−C)に分けて説明する。
Methyl 6−aminohexanoate hydrochloride(10g,55mmol)にピリジン(70ml)を加えて溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルオロ酢酸(25ml,180mmol)を滴下しながら添加し反応を開始した。反応開始から5分おきに薄層クロマトグラフィ(TLC:展開溶媒 クロロホルム:アセトン=9:1)で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。2時間後、TLCで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加えて反応を停止させ、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液280mlを加えて反応液を中和した。反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を3回程度繰り返した。続いて、反応液をH2Oで溶解後、分液ロートに移し、等量のクロロホルムとH2Oで分配し、クロロホルム層を回収することで多量に存在する炭酸水素ナトリウムを除去した。次に、このクロロホルム層を濃縮し、クロロホルム:アセトン=9:1で平衡化(10ml/min)したシリカゲルカラムクロマトグラフィ(3.5×50cm)に供した。約20mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はTLC(展開溶媒 クロロホルム:アセトン=9:1)で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー25〜56(500〜1120ml)に見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるMethyl 6−trifluoroacetamidohexanoateを収量12.4g、収率93%で得た。
糖類をメタノール(MeOH)溶液に溶解させ、アンモニアガスを飽和させるか、または炭酸水素アンモニウムを溶解させ、1−アミノ糖を調製した。糖類としては、ラクトース、N−アセチルラクトサミン(LacNAc)、またはN−アセチルグルコサミンを用いた。
(1−B−1)β−Lactosylamineの化学合成
耐圧ガラス容器にラクトース(5.0g,0.014mol)を入れ、95%MeOH
containing 0.5%CH3COOH(117ml)で溶解した。続いて、反応液を氷冷後、アンモニアガスを用いて反応液をアンモニア飽和させた。アンモニア飽和後、耐圧ガラス容器の蓋をきつく閉め、攪拌しながら40℃で反応を行った。反応開始から48時間後、エタノール(110ml)を加えて反応を停止した。次に、反応液をガラスフィルターでろ過後、エタノール(500ml)とジエチルエーテル(500ml)で順次洗浄し、白色粉末としてβ−Lactosylamineを収量4.5g,収率95%で得た。
耐圧ガラス容器にLacNAc(1.0g,2.6mmol)とammoniumbicarbonate(0.21g,2.6mmol)を入れ、MeOH(8ml)で溶解した。続いて、反応液を氷冷後、アンモニアガスを用いて反応液をアンモニア飽和させた。アンモニア飽和後、耐圧ガラス容器の蓋をきつく閉め、攪拌しながら40℃で反応を行った。反応開始から120時間後、エタノール(8ml)を加えて反応を停止した。次に、反応液をガラスフィルターでろ過後、エタノール(50ml)とジエチルエーテル(50ml)で順次洗浄し、白色粉末としてβ−N−Acetyllactosaminylamineを収量0.71g,収率71%で得た。
N−Acetylglucosamine(5.0g、22.6mmol)と炭酸水素アンモニウム(40g)を蒸留水(50ml)に溶解し、40℃で撹拌した。反応の進行をTLC(展開溶媒AcOEt:MeOH:AcOH:H2O=4:3:3:2、アニスアルデヒドにて呈色、Rf:S.M.=0.65、Prod.=0.48)で確認した。原料の消失をTLCで確認後、反応溶液を冷却して過剰量の炭酸水素アンモニウムを析出させ、これをろ過することで除去した。ろ液を約10mlまで減圧下濃縮し、冷却後再び析出する炭酸水素アンモニウムをろ過により除去した。ろ液に蒸留水を加え、減圧下濃縮する操作を3回繰り返すことで、残存する炭酸水素アンモニウムを除去し、アメ状物質を得た。これを少量の蒸留水に溶解し凍結乾燥することでβ−N−Acetylglucoaminylamine白色粉末7.4gを得た。
(1−C−1) N−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−lactosylamineの化学合成
6−Trifluoroacetamidohexanoic acid(334mg,1.47mmol)を有機溶媒(DMSO:2.6ml)に溶解した後、塩基(DIEA:1.3ml,7.35mmol)と縮合剤(HBTU:557mg,1.47mmol)を加え、5分間撹拌した。その後、あらかじめ別の容器でDMSO(5.3ml)に溶解したβ−Lactosylamine(500mg,1.47mmol)を加え、攪拌しながら室温で反応を行った。反応の経時変化はオルシノール硫酸発色法を用いてTLC(クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で分析した。反応開始から5時間
後反応を終了し、クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5で平衡化(10ml/min)したシリカゲルカラムクロマトグラフィ(3.5×60cm)に供した。約30ml/tubeずつ分取後、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で、オルシノール硫酸発色を用い、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー68〜135(2,040〜4,050ml)を濃縮後、凍結乾燥し、N結合型糖プライマーとして、N−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−lactosylamineを収量685mg,収率82%で得た。
6−Trifluoroacetamidohexanoic acid(41mg,0.18mmol)をDMSO(330μl)に溶解した後、DIEA(160μl,0.9mmol)とHBTU(68mg,0.18mmol)を加え、5分間撹拌した。その後、あらかじめ別の容器でDMSO(660μl)に溶解したβ−N−Acetyllactosaminylamine(70mg,0.18mmol)を加え、攪拌しながら室温で反応を行った。反応の経時変化はオルシノール硫酸発色法を用いてTLC(クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で分析した。反応開始から5時間後反応を終了し、クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5で平衡化(10ml/min)したシリカゲルカラムクロマトグラフィ(3.5×60cm)に供した。約30ml/tubeずつ分取後、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で、オルシノール硫酸発色を用い、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー65〜90(1950〜2700ml)を濃縮後、凍結乾燥し、N結合型糖プライマーとしてN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamineを収量81mg,収率75%で得た。
6−Aminohexanoic acid(0.538g、4.1mmol)、Triethylamine(0.86ml、6.2mmol)にMeOH(5ml)を加え懸濁した。これにEthyl trifluoroacetate(0.75ml、6.2mmol)を滴下し、室温(約22℃)で1時間撹拌した。TLC(展開溶媒AcOEt:MeOH:AcOH:H2O=4:3:3:2、ニンヒドリン呈色、Rf:S.M.=0.66、Prod.=none)にて原料の消失を確認後、反応溶液を減圧下濃縮した。残渣にDMFを加え減圧下濃縮する操作を3回繰り返し、残存する試薬等を除去した。残渣をDMF(40ml)に溶解し、氷浴にて0℃に冷却後Ethyl chlorocarbonate(0.78ml、8.2mmol)、Triethlylamine(1.14ml、8.2mmol)を添加した。0℃にて10分間撹拌後、これをGlcNAc−NH2(3.1g、8.2mmol、純度75%として算出)のDMF(40ml)懸濁液中に加え、氷浴から出して徐々に室温に戻しつつ1時間撹拌した。反応溶液を再び氷浴で冷却し、蒸留水(10ml)を加え、反応を停止した後、析出した塩酸塩をろ過により除去した。ろ液を減圧下濃縮し、蒸留水により共沸操作を行うことで、残存するDMFを除去した。残渣を蒸留水にて40mlに調製し、5%アセトニトリルにて平衡化したODSカラム(CV=200ml)に供した。流速400ml/hr、1Fr=20mlにて分取し、目的物の溶出をTLC及びHPLCにより確認し、溶出画分を回収した
。回収した溶離液を減圧下濃縮後、残渣を少量の蒸留水で溶解して凍結乾燥することで、目的物であるアミノ基が保護基で保護されたN結合型アシアロ糖鎖N−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−N−acetylglcosaminylamine(GlcNAc−6AHA−TFA)を収量0.63g、収率36%で得た。
150mM Tris−HCl buffer(pH6.8,5.7ml)に受容体基質となるN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−Lactosylamineを50mg(0.09mmol)、供与体基質としての糖ヌクレオチド(UDP−GlcNAc・2Na)を117mg(0.18mmol)、MnCl2・4H2Oを14.5mg(0.07mmol)溶解させ、防腐剤として1%(w/v)NaN2を0.09ml加えた後、3.3ml(250mU)の精製した糖転移酵素(β3GnTII)を添加して37℃で反応を行った。144時間後、供与体基質のGlcNAcの転移が100%進んだところで反応液を5分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液に別の糖ヌクレオチド(UDP−Gal・2Na)を111mg(0.18mmol)加え、別の糖転移酵素(β4GalTI) 500μl(950mU)を添加してGal転移反応を行った。156時間後、Gal転移が100%進んだところで反応液を5分間煮沸することにより反応を停止した。反応液を濃縮後、5%MeOHで平衡化(2.0ml/min)したODSカラムクロマトグラフィ(2.5×50cm)に供した。5%MeOH(760ml)で非吸着部を溶出した後、5%(500ml)−15%(500ml)のMeOH直線濃度勾配法により20ml/tubeずつ分取後、各フラクションを210nmの吸光度で測定し、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー28〜38(560ml〜760ml)を濃縮後、凍結乾燥し、非還元末端側に糖鎖を伸長させたN結合型アシアロ糖であるN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineを収量67mg、収率80%で得た。
工程1−C−1で合成したN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−lactosylamine(150mg,0.27mmol)に1.0M NaOH(1.5ml)を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から30分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化(0.5ml/min)したSephadex G−25カラムクロマトグラフィ(2.5×55cm)に供した。約3.0mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー47〜58(141ml〜174ml)に
見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるN−(ε−Aminocaproyl)−β−lactosylamineを収量123mg、収率99%で得た。
工程1−C−3で得られたN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine(160mg,0.27mmol)に1.0M NaOH(1.6ml)を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から30分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化(0.5ml/min)したSephadex G−25カラムクロマトグラフィ(2.5×55cm)に供した。約3.0mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー45〜56(135ml〜168ml)に見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるN−(ε−Aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamineを収量123mg、収率92%で得た。
工程2で得られたN−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine(45mg,0.05mmol)に1.0M NaOH(1.0ml)を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から30分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化(0.5ml/min)したSephadex G−25カラムクロマトグラフィ(2.5×55cm)に供した。約3.0mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー50〜61(150ml〜183ml)に見られた。これを濃縮し、目的物であるN−(ε−Aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineを収量40mg、収率99%で得た。
γ−PGA(M.W.:990000,30.0mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(3.6ml)に溶解後、予めDMSO(10.9ml)に溶解しておいた縮合剤(BOP:298mg)、および添加剤(HOBt:29.5mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に工程3−A−1で得られたN−(ε−Aminocaproyl)−β−lactosylamine(45.1mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(1.8ml)に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で24時間反応を行った。反応終了後、反応液が17.5mlになるようにPBSを添加した。その後、PD−10カラム1本あたり2.5mlの反応液をPBSで平衡化したPD−10(1.7×5.0cm,Sephadex G−25)カラムに供し、3.5mlのPBSでPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamine/γ−PGA)]を溶出した。次にこの画分を2.5Lの超純水に対して3日間透析した。その間、超純水の交換を6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度
(%)の計算は1H−NMRより、γ−PGAのβおよびγ位プロトンとN−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamineのアグリコン部のα位のプロトン2個分の積分比の和(A)とN−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamineのアグリコン部位のプロトン6個分の積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度31%のPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamine/γ−PGA)]を収量34.3mgで得た。
(計算式)
4×100
A−2(B/6)
γ−PGA(M.W.:990000,30.0mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(3.6ml)に溶解後、予めDMSO(10.9ml)に溶解しておいたBOP(298mg)、HOBt(29.5mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に工程3−A−2で得られたN−(ε−Aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine(49.3mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(1.8ml)に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で24時間反応を行った。反応終了後、反応液が17.5mlになるようにPBSを添加した。その後、PD−10カラム1本あたり2.5mlの反応液をPBSで平衡化したPD−10(1.7×5.0cm,Sephadex G−25)カラムに供し、3.5mlのPBSでPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine/γ−PGA)]を溶出した。次にこの画分を2.5Lの超純水に対して3日間透析した。その間、超純水の交換を6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度(%)の計算は1H−NMRより、γ−PGAのβおよびγ位プロトンとN−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamineのアグリコン部のα位のプロトン2個分およびN−アセチル基に由来するプロトン3個分の積分比の和(A)とN−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamineのアグリコン部位のプロトン6個分の積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度32%のPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine/γ−PGA)]を収量36.6mgで得た。
(計算式)
4×100
A−5(B/6)
γ−PGA(M.W.:990000,12.0mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(1.4ml)に溶解後、予めDMSO(4.4ml)に溶解しておいたBOP(94.7mg)、HOBt(11.8mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に工程3−A−3で得られたN−(ε−Aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine(32.6mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(0.7ml)に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で24時間反応を行った。反応終了後、反応液が7.5mlになるようにPBSを添加した。その後、PD−10カラム1本あたり2.5mlの反応液をPBSで平衡化したPD−10(1.7×5.0cm,Sephadex G−25)カラムに供し、3.5mlのPBSでPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine/γ−PGA)]を溶出した。次にこの画分を2.5Lの超純水に対して3日間透析した。その間、超純水の交換を6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度(%)の計算は1H−NMRより、γ−PGAのβおよびγ位プロトンとN−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineのアグリコン部のα位のプロトン2個分およびN−アセチル基に由来するプロトン3個分の積分比の和(A)とN−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineのアグリコン部位のプロトン6個分の積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度32%のPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine/γ−PGA)]を収量19.6mgで得た。
(計算式)
4×100
A−5(B/6)
受容体基質として工程(3−B−1)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamine/γ−PGA)][31%, 1800kDa]7.1mgをlactose−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMPシアル酸(CMP−Neu5Ac)16.0mM、MnCl2 2.5mM、牛血清アルブミン(BSA)0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう反応液を調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのラットα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−1)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamineのGlcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比(B,B’)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率100%のPoly[Neu5Acα2−3lactosylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量8.4mgで得た。
(計算式)
(B+B’)/2×100
A/1
受容体基質として工程(3−B−2)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine/γ−PGA)][32%, 1900kDa] 7.0mgをLacNAc−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl2 2.5mM、BSA 0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのラットα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−2)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamineのGlcNAcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンの積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約100%のPoly[Neu5Acα2−3−N−acetyllactosaminylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量7.9mgで得た。
(計算式)
B×100
A/1
受容体基質として工程(3−B−3)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine/γ−PGA)][32%, 2600kDa] 5.1mgをLNnT−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl2 2.5mM、BSA
0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−3)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineのGlcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比(B,B’)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約100%のPoly[Neu5Acα2−3lacto−N−neotetraosylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量5.2mgで得た。
(計算式)
(B+B’)/2×100
A/1
酵素を代え、工程4−1と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程(3−B−1)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamine/γ−PGA)][31%, 1800kDa] 7.0mgをlactose−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl2 2.5mM、BSA 0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−1)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamineのGlcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比(B,B’)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率71%のPoly[Neu5Acα2−6lactosylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量7.2mgで得た。
(計算式)
(B+B’)/2×100
A/1
酵素を代え、工程4−2と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程(3−B−2)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−N−acetyllactosaminylamine/γ−PGA)][32%, 1900kDa] 7.0mgをLacNAc−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl2 2.5mM、BSA 0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのラットα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−2)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−lactosylamineのGlcNAcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比(B,B’)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約100%のPoly[Neu5Acα2−6−N−acetyllactosaminylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量7.9mgで得た。
(計算式)
(B+B’)/2×100
A/1
酵素を代え、工程4−3と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程(3−B−3)で合成したPoly[N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamine/γ−PGA)][32%, 2600kDa] 5.1mgをLNnT−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl2 2.5mM、BSA 0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調製した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。続いて、この反応液を工程(3−B−3)と同様の方法で処理した。シアリル化率は1H−NMRより、N−(ε−aminocaproyl)−β−lacto−N−neotetraosylamineのGlcの1位のプロトン1個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比(B,B’)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約100%のPoly[Neu5Acα2−6−lacto−N−neotetraosylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA]を収量5.4mgで得た。
(計算式)
(B+B’)/2×100
A/1
(1)N−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−N−acetylglcosaminylamineの合成
実施例2の工程1として、実施例1の工程(1−C−3)記載と同じ方法で、アミノ基が保護されたリンカー化合物と1−アミノ糖とを縮合させ、N−(ε−Trifluoroacetamidocaproyl)−β−N−acetylglcosaminylamine(GlcNAc−6AHA−TFA)を調製した。
工程2では、前記工程(1)で調製したN結合型アシアロ糖鎖(GlcNAc−6AHA−THA)をシアリル化してシアロ糖鎖部を合成した後(工程2−1)、これを精製した(工程2−2)。以下、具体的に説明する。
前記工程(1)で調製したGlcNAc−6AHA−TFA 420mg(1.04mmol)、20mM塩化マグネシウム、7.5mM UDP−Gal、0.1U/ml反応液アルカリフォスファターゼを含有する100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)190mlにH. influenzae由来β1,4−ガラクトース転移酵素を0.16U/ml反応液になるように添加し、37℃にて振とうしながら反応を開始した。反応開始26時間後、沸騰湯浴中に反応液を移し、内液を80℃に達温させることでβ1,4−ガラクトース転移酵素反応を停止させた。熱処理したβ1,4−ガラクトース転移酵素反応液を十分に放冷した後、7.5mM CMP−NeuAc、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)分を更に添加し、続いて0.1U/ml反応液になるようにP. damselae由来α2,6−シアル酸転移酵素を添加し、37℃で振とうしながらシアリル化反応を開始した。反応開始17時間後、沸騰浴中に反応液を移し、内液を80℃に達温させることでα2,6−シアル酸転移酵素反応を停止させ、非還元末端側にシアロ糖鎖部を有するN結合型シアロ糖鎖(α2,6−SLN−6AHA−TFA)を合成した。
以上の手順で合成したN結合型シアロ糖鎖を以下の手順により精製した。まず、工程(2−1)の反応停止液を放冷後、遠心分離(20,000g×10min)し、さらに得られた上清を0.45μmフィルターろ過することで、残渣を完全に取り除き、上清画分を回収した。これを50mM炭酸水素アンモニウムで平衡化したODSカラム(200ml)に通液しα2,6−SLN−6AHA−TFAを吸着させた後、続いて50mM炭酸水素アンモニウムで洗浄を行うことで、核酸、糖等の親水性物質を除去した。10%メタノールを含有する炭酸水素アンモニウムで吸着剤に吸着したα2,6−SLN−6AHA−TFAを溶出した後、これをエバポレーター濃縮乾固、水共沸を行うことで含有する炭酸水素アンモニウムを除去した。上記手順で調製したα2,6−SLN−6AHA−TFA乾固物を蒸留水で50mlに溶解した後、DEAEカラム(50ml、炭酸水素型)に通液することで、α2,6−SLN−6AHA−TFAをカラムに吸着させた。このカラムを蒸留水で洗浄することで残存していたアシアロ糖鎖を取り除いた後、50mM炭酸水素アンモニウムを通液することでカラムに吸着されたα2,6−SLN−6AHA−TFAを溶出させた。
α2,6−SLN−6AHA−TFAは、アミノ酸を保護する保護基(TFA基)を持つことから、ポリグルタミン酸との縮合反応を行う前に、保護基を脱保護した。具体的には、上記操作で得られたα2,6−SLN−6AHA−TFAを減圧下濃縮することにより乾固させた後、1M NaOHで溶解、室温で1時間攪拌することでα2,6−SLN−6AHA−TFA中のTFA基を外した。
2,6−SLN−6AHA)のアンモニウム塩を357mg(0.48mmol)回収した。
次に、工程3−1で得られた(α2,6−SLN−6AHA)のアンモニウム塩とγ−ポリグルタミン酸とを縮合させた。具体的にはγ−PGA(4.3mg、0.033mmol as Glu)に蒸留水0.05ml、DMF 0.45mlを加え均一な溶液とし、氷浴中で0℃に冷却した。γ−PGA溶液に縮合剤としてHOSu:1.4mg、0.012mmol)、EDC(2.6mg、0.013mmol)を加え0℃で2時間撹拌した。続いて反応溶液にα2,6−SLN−6AHA(11.2mg、 0.013mmol)、Triethylamine(13.8μL、0.1mmol)を加え25℃で9時間撹拌し、Poly[Neu5Acα2,6−N−acetyllactosaminylamine β−N−(ε−aminocaproyl)/γ−PGA](α2,6−SLN−6AHA/γ−PGA)を合成した。反応液を0℃に冷却後1.0M NaOH水溶液0.5mlを添加し、0℃で30分間撹拌して反応を停止した。
1.0M AcOH水溶液を用いて上記反応液をpH7に調整し、これを透析チューブに入れ、蒸留水(1,000ml×7)にて透析を行った。透析チューブ内の溶液を回収
し、イオン交換カラム(Dowex AG 50W−8X,Na form,CV=2ml)へ通液しNa塩へと変換した。回収液を減圧下濃縮し、残渣を少量の蒸留水に溶解し、凍結乾燥することで、α2,6−SLN−6AHA/γ−PGAの白色粉末を12.2mg得た。得られたα2,6−SLN−6AHA/γ−PGAについて、1H−NMR分析を行い、下記式に基づき糖残基置換度(DS)を求めた結果、37%と算出された。
DS=A/(B−A/2−3A/4−3C×3A/4)
A=1.5ppm:6AHA(2CH2)
B=1.8〜2.5ppm:(γ−PGA(2CH2)+Ac(GlcNAc)+Ac(NeuAc)+6AHA(CH2)
C=2.7ppm:NeuAc(2−CH’)
赤血球凝集活性測定用マイクロプレートを氷上に置き、各ウエルに0.01% gelatine含有PBSを25μlずつ加えた。次に、実施例1の工程3−Bで調製された3種類の人工アシアロ糖鎖含有ポリペプチドおよび工程4で調製された6種類の人工シアロ糖鎖含有ポリマーを0.01% gelatin含有PBSに溶解させ、各々25μl
をNo.1のウエルに加え、No.2のウエルから連続2倍希釈となるように調製する。
続いて、試料を希釈した各ウエルにPBSで懸濁したインフルエンザウイルス(Human strain:A/Aichi/2/28(H3N2),感染価220HAU、Avian strain:A/Duck/HongKong/313/4/76(H5N2),感染価217HAU)(それぞれ22HAU)を25μlずつ加え、マイクロプレートミキサーで数秒間攪拌後、4℃で1時間静置した。この各ウエルに0.6%(v/v)モルモット赤血球含有PBS懸濁液を50μlずつ加え、マイクロプレートミキサーで数秒間攪拌後、4℃で2時間静置した。最後に赤血球凝集像を観察しHI活性(Hemaggulutination inhibition activity)を求めた。HI活性はインフルエンザウイルスの完全凝集阻止が認められる試料の最高希釈濃度で表した。
Claims (9)
- 糖の還元末端の1位をアミノ化した1−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するN結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記N結合型アシアロ糖鎖を、このN結合型アシアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、
前記アシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化してN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを得る工程と、を含むN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。 - 前記リンカーが、ω−アミノ酸である請求項5に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数1〜30のものである請求項5に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを2個以上アミド結合で縮合させたものである請求項5に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 糖の還元末端の1位をアミノ化した1−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するN結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記N結合型アシアロ糖鎖をシアリル化して、非還元末端側にシアロ糖鎖部が合成されたN結合型シアロ糖鎖を得る工程と、
前記N結合型シアロ糖鎖を、このN結合型シアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、を含むN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。 - 水又は緩衝液と有機溶媒とを含む混合溶媒にγ−ポリグルタミン酸を溶解させ、カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び/又は添加剤を用いて前記γ−ポリグルタミン酸を活性化した後、前記N結合型シアロ糖鎖と縮合させる請求項9に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 前記リンカーが、ω−アミノ酸である請求項9に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数1〜30のものである請求項9に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
- 前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを2個以上アミド結合で縮合させたものである請求項9に記載のN結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
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