JP2002514186A - ウイルス性細胞接着阻害剤としての複合糖質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトインフルエンザウイルスの宿主細胞への接着が次の一般式で表される新規化合物によって阻害される。 （式中、Ｒ¹はアシル基またはチオアシル基であり、Ｒ²はＨ、ヒドロキシル基，Ｚ−アルキル基、置換されたＺ−アルキル基、Ｚ−アリール基、置換されたＺ−アリール基であり、ここでＺはＯ、ＳまたはＮＨであり、Ｒ³はアシル基またはチオアシル基であり、Ｒ⁴はＨまたはアシル基であり、ＸはＯ、Ｓまたは直鎖状Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル基であり、ＹはＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂または糖であり、Ｗは２官能性スペーサーであり、Ｐは次の物質の一つからなる多価担体である：ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、Ｎ−置換されたポリアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−置換されたメタクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、ポリ無水物、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシカルボン酸、ポリアミノ酸、多糖類、タンパク質、デキストラン、キトサン、グルカン、リポソーム、マイクロパーティクル）。この新規化合物は、鶏卵中で育成することによって、適応化されていない真正のヒトＡ型（Ｈ１およびＨ３）およびＢ型ウイルスと結合する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス性細胞接着阻害剤としての複合糖質明細書 本発明はＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの新規多価誘導体 、および該化合物の製造に関する。本発明はさらに、この化合物を非適応化(nic ht-adaptierter)ヒトインフルエンザウイルスのウイルス性細胞接着阻害剤とし て使用することに関する。 ウイルス感染の重要な第１段階は宿主細胞表面へのウイルスの接着である。Ａ 型、およびＢ型インフルエンザウイルスの場合に、このことはウイルス血球凝集 素（ＨＡ）と宿主細胞の細胞表面の糖タンパク質、およびグリコリピドの末端シ アリルオリゴ糖との結合を介して生じる。インフルエンザ感染を阻害するための 可能な戦略は細胞接着阻害剤を使用することであるが、この阻害剤はウイルス血 球凝集素と結合し、その宿主細胞との反応を阻害するものでなければならない。 一連のインフルエンザウイルス接着阻害剤が、すでに文献で公知となっている。 特に多価化合物の開発により、何れも一定のインフルエンザ種の接着を試験管テ ストにおいて有効に阻害するいくつかの阻害剤が見いだされた（表２参照）。 これらの公知の阻害剤の欠点は、その作用領域の狭いことであり、これらの化 合物はただ一つの種に対してだけ高い活性を示し、従って実際の予防、および治 療用途にあまり適していない。 その他の欠点は、これらの公知の阻害剤の活性が何れも胚子性鶏卵で育成され た適応化インフルエンザ種に対してだけしか示されなかったということである。 鶏卵上でのヒトインフルエンザウイルスの育成が血球凝集素の受容体結合場所の 領域内でアミノ酸突然変異をもたらすことは公知である(Robertson，1993)。こ のようにして見いだされた阻害剤は、この突然変異ウイルスの変化した血球凝集 素に高い親和性を有しているが、その野生型血球凝集素に対する活性は多くの場 合に小さい（表１のポリマー性シアロシド(Sialoside)BGN-PAA参照）。 本発明の課題は、ヒトインフルエンザウイルスの新規なウイルス性細胞接着阻 害剤を見いだすことである。この阻害剤はインフルエンザ野生型種に対して広い 作用領域を有し、かつできるだけ高い阻害活性を有するものでなければならない 。 今や、シアロシドの多価結合体(konjugate)であるＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａ ｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、６ＳＬ Ｎ）が新規で活性のあるウイルス性細胞接着阻害剤であることが見いだされた。 本発明の対象は一般式 （式中、Ｒ¹はアシル基、またはチオアシル基、好ましくはアセチル基、チオア シル基、プロピオニル基、またはチオプロピオニル基であり、Ｒ²はＨ、ヒドロ キシル基、Ｚ−アルキル基、置換されたＺ−アルキル基、Ｚ−アリール基、置換 されたＺ−アリール基（ここでＺはＯ、ＳまたはＮＨである）であり、Ｒ³はア シル基、またはチオアシル基であり、Ｒ⁴はＨまたはアシル基であり、ＸはＯ、 Ｓまたは直鎖状炭素数１ないし４のアルキル基であり、ＹはＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂ または糖基であり、Ｗは２官能性スペーサであり、Ｐは次の物質、すなわちポ リアクリレート、ポリアクリルアミド、Ｎ−置換されたポリアクリルアミド、メ タクリルアミド、Ｎ−置換されたメタクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリカー ボネート、ポリエステル、ポリアミド、ポリ無水物、ポリイミノカーボネート、 ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリホスファザン、ポリヒドロキシカ ルボン酸、ポリアミノ酸、多糖類、タンパク質、デキストラン、キトサン、グル カン、リポソーム、マイクロパーティクルの一つからなる多価担体である） で表される化合物である。 Ｐは例えばＣ（ＣＨ₂ＮＨ−Ａ_n−）₄（ここでＡは中性または陰性直鎖状アミ ノ酸である）のような低分子多価担体であってもよい。 驚くべきことに、本発明の化合物は公知のすべてのＡ型、およびＢ型ヒトイン フルエンザ種の細胞接着を非常に有効に阻害することを示す。特にこの阻害剤は 血球凝集素の受容体結合場所の構成が変化していない真正のインフルエンザウイ ルスに対して活性がある。血球凝集素の受容体結合場所の変化していない構造を 確証するために、専らＭＤＣＫ−細胞(Madin-Derbyイヌ腎臓細胞)で育成した臨 床単離体からのインフルエンザウイルスが使用された。ＭＤＣＫ上で育成された ウイルスのウイルス性ＲＮＡ−配列の臨床単離体からのウイルスのＲＮＡ−配列 とのＰＣＲにより行われた比較が示したように、ＭＤＣＫ上での育成されたウイ ルスは血球凝集素の受容体結合場所の領域内において突然変異を示さない(Rober tson，1993)。 表１は、新規化合物６ＳＬＮ−ＰＡＡ、および複合糖類ＢＧＮ−ＰＡＡ（これ はすでに以前に鶏卵上で育成されたＨ３Ｎ２Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／１／８７型種 に対して開発された）によるウイルス精細胞接着阻害の比較を示している。化合 物６ＳＬＮ−ＰＡＡはすべての真正のインフルエンザ種の優れた阻害剤であるが 、ＢＧＮ−ＰＡＡは狭い作用領域を有しており、かつ多くの種に対して極めて少 ない活性しか有していない。 本発明の化合物に利点は特に公知のすべてのＡ型、およびＢ型ヒトインフルエ ンザウイルスのウイルス性細胞接着阻害剤としてのその領域にあり、またそれか ら開かれるべき、この化合物をインフルエンザ感染に対し予防、かつ治療目的に 使用するという可能性にある。そのほかの利点は、さらにマーカーを担持してい る本発明の化合物の誘導体が容易に得られることである。ここで適しているマー カーは例えばビオチン、染料、蛍光染料または放射性マーカーである。この誘導 体はウイルス性細胞接着剤を見いだすための従来入手できなかった新規なスクリ ーニングシステムの成分として使用することができる。 表１ ポリマーサリソイドＢＧＮ−ＰＡＡ、および６ＳＬＮ−ＰＡＡによるインフルエ ンザウイルスのウイルス性細胞接着の阻害：実施例８およびGambaryanおよびMat rosovich，１９９２に記載されているようなフェチュインへのウイルス結合の阻 害により測定 ＢＧＮはＮｅｕ５Ａｃα２−ＯＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₄ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ− ６ＳＬＮはＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＨＣＯ ＣＨ₂ＮＨ− 以下の実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１ Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ₂ の製造 （Likhosherstov等による変法、１９８６；およびManger等１９９２） 室温で６’−シアリルラクトサミンＮＨ₄ ⁺塩１３．８ｍｇ（２０μＭ、ヒト尿 から単離）を重炭酸アンモニウム飽和溶液１ｍｌに溶解し、１７０時間かき混ぜ 、培養中にこの溶液に飽和するまでさらに固体重炭酸アンモニウムを添加した。 この反応溶液を水２ｍｌで希釈し、冷凍し、親媒化した。残渣（得られる生成物 の重量が使用した糖の量よりも大きいときは、残渣を更に水２ｍｌに溶解し、冷 凍した）１３．７ｍｇが得られ、これを１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ０．６ｍｌに溶解 した。０℃でかき混ぜながら、酢酸エチル０．３４ｍｌ中に無水クロル酢酸３４ ｍｇ（２００μＭ）を添加した。１時間後にこの溶液を酢酸で中和し、真空中で 濃縮した。得られた残渣を最小量の水に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カ ラム（１ｘ５０ｃｍ）でクロマトグラフィー処理した。糖含有フラクションを濃 縮し、残渣を炭酸アンモニウム飽和溶液１ｍｌに溶解した。４８時間後に水２ｍ ｌで希釈し、冷凍し、親媒化した。残渣を１％酢酸２ｍｌに溶解し、１５時間後 にカラムによりＤｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４（Ｈ⁺型）３ｍｌを添加した。カ ラムを水３０ｍｌで洗浄し、次いで１Ｍ水酸化アンモニウム溶液で溶離した。水 酸化アンモニウム溶離液を濃縮した後に６’−シアリルラクトース Ｎ−グリシ ル誘導体９．８ｍｇ（６７％）を得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（Ｄ₂Ｏ、δ、ｐｐｍ）：５．１６（ｄ、１Ｈ、Ｊ₂ ９Ｈｚ、Ｈ−１ Ｇａｌ）、４．４７（ｄ、１Ｈ、Ｊ₂８Ｈｚ、Ｈ−１ Ｇｌｃ ＮＡｃ）、４．００〜３．５５（Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ）、３． ４６（ｓ、２Ｈ、ＣｏＣＨ₂ ＮＨ₂）、２．６９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_3ax１２Ｈｚ 、Ｊ₄ ４．５Ｈｚ、Ｈ−３ｅｑ Ｎｅｕ５Ａｃ）、２．０４（ｓ、６Ｈ、２Ｃ Ｈ₃ＣＯ）、１．７２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ₄ １２．５Ｈｚ、Ｈ−３ａｘ Ｎｅｕ５ Ａｃ）。 反応経過は薄層クロマトグラフィーによって追跡した（ケイ酸ゲル６０、メル ク製）： 溶離液１：２−プロパノール／アセトン／水 ４：３：２ ６’ＳＬＮ Ｒ_f=０．６１ ６’ＳＬＮ−ＮＨ₂ ０．４９ニンヒドリン⁺ ６’ＳＬＮ−ＮＨＣＯＣＨ₂Ｃｌ ０．６６ ６’ＳＬＮ−ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ₂ ０．０９ニンヒドリン⁺ 溶離液２：メタノール／アセトン／水 １：１：１ ６’ＳＬＮ−ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ₂ ０．７３ニンヒドリン⁺ 実施例２ Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ ＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＯ−ｐ−Ｃ₆Ｈ₄ＮＯ₂の製造 室温で、実施例１からのＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ １−ＮＨＣＯＣＨ₂ＮＨ₂７．３ｍｇ（１０μＭ）のＤＭＳＯ０．２ｍｌ中の溶液 にＤＭＦ０．６ｍｌ中のビス(４−ニトリフェニル)−アジペート３９ｍｇ(１０ ０μＭ)を添加した。３時間後に反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カ ラム（１．８ｘ３０ｃｍ、溶離液アセトニトリル／水１：１）により、クロマト グラフィー処理した。糖含有フラクションを濃縮し、水に溶解し、冷凍し、親媒 化した。グリコシド７．４ｍｇ（７６％）を得た。実施例３ テトラキス（Ｎ−第３ブチルオキシカルボニルグリシルアミドメチル）メタン の製造 テトラキス（アミノメチル）メタン（Fleisher等、1971）テトラヒドロクロラ イド１ｇ（３．６ｍモル）、ＢｏｃＧｌｙＯＮｐｈ８．５２ｇ（２８．８ｍモル ）およびＮＥｔ₃（２．５ｍｌ、１８ｍ＋モル）のＤＭＦ２ｍｌ中の混合物を室 温で１２０時間かき混ぜた。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル１００ｍｌ中に懸 濁させ、２％Ｈ₂ＳＯ₄、水、飽和ＮａＨＣＯ₃溶液および水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄ で乾燥した。この溶液を濃縮し、残渣をトリフルオルエタノールに溶解し、Ｃ ＨＣｌ₃／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（９：３：１）の混合物、およびＥｔ₂Ｏを添 加した。結晶生成物２．１ｇ（７８％）を得た。 ＤＣ：Ｒ_f＝０．５、ＣＨＣｌ₃／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９：３： ２：０．２中（ニンヒドリン⁺、ＨＣｌガスによる板の５分間処理）¹Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル、Ｄ₆−ＤＭＳＯ中（δ、ｐｐｍ）：７．９７（ｂｒ ｔ、１Ｈ、ＣＣＨ₂ＮＨ）、７．３７（ｔ、１Ｈ、ＮＨ^Gly）、３．４９（ｄ、２ Ｈ、Ｊ_NH ６Ｈｚ、 ＣＨ₂ ^Gly）、２．７６（ｂｒｄ、２Ｈ、ＣＣＨ₂）１．３ ７（ｓ、９Ｈ、ＯＣＭｅ₃）、質量スペクトル７８３（ＭＮａ）。実施例４ テトラキス（Ｎ−第３ブチルオキシカルボニルトリグリシルアミノメチル）メ タンの製造 実施例３からのテトラキス（Ｎ−第３ブチルオキシカルボニルグリシルアミド メチル）−メタン０．７６ｇ（１ｍモル）のＣＦ₃ＣＯＯＨ ８ｍｌ中の溶液を 室温で２時間かき混ぜた。この反応混合物をトルエン１６ｍｌで処理し、濃縮し た。残渣を水３ｍｌに溶解し、濃ＨＣｌ ０．３５ｍｌ（１２モル）を添加し、 この溶液を濃縮し、残渣を真空中で乾燥した。生成したテトラアミンをＤＭＦ１ ８ｍｌに懸濁させ、ＢｏｃＧｌｙＧｌｙＯＮｓｕ１．４５ｇ（４．４ｍモル）、 およびＥｔ₃Ｎ ０．６ｍｌを添加した。この反応溶液を室温で２４時間かき混 ぜ、真空中（０．５〜１Ｔｏｒｒ）で濃縮し、得られた残渣をケイ酸ゲルカラム でクロマトグラフィー処理し（ケイ酸ケル６０、メルク製）、３０：１：１〜１ ５：１：１のＭｅ₂ＣＯ／ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏで溶離して、純粋な生成物０．９４ｇ （７７％）を得た。ＤＣ：Ｒ_f＝０．７９、Ｍｅ₂ＣＯ／ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ １５ ：１：１中（ニンヒドリン⁺、ＨＣｌガスによる板の５分間処理） ¹Ｈ ＮＭＲ−スペクトル、Ｄ₆−ＤＭＳＯ中（δ、ｐｐｍ）：８．５３（ｔ、 １Ｈ、ＮＨ^Gly3）、７．９８（ｔ、１Ｈ、ＣＣＨ₂ＮＨ）、７．８１（ｔ、１Ｈ 、ＮＨ^Gly2）、６．９８（ｔ、１Ｈ、ＮＨ^Gly1）、３．８５（ｄ、２Ｈ、ＪＮＨ ５５Ｈｚ、ＣＨ₂ ^Gly2）、３．７３（ｄ、２Ｈ、Ｊ_NH５．５Ｈｚ、ＣＨ₂ ^Gly3）、 ３．５９（ｄ、２Ｈ、Ｊ_NH６Ｈｚ、ＣＨ₂ ^Gly1）、２．６９（ｂｒ．ｄ、２Ｈ、 Ｊ_NH6．５Ｈｚ、ＣＣＨ₂）、１．３８（ｓ、９Ｈ、ＯＣＭｅ₃）；質量スペ クトル：１２３９（ＭＮａ）。実施例５ ６ＳＬＮ ２０モル％のポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド （６ＳＬＮ−ＰＡＡ） 実施例１からの６ＳＬＮ−Ｇｌｙ １ｍｇ（１．３７μＭ）のＤＭＳＯ １ｍ ｌ中の溶液にポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）１．３２ｍｇ（６．８４ μモル）およびＤＭＦ０．１３２ｍｌ中のＥｔ₃Ｎ ７ｍｌを添加した。この反 応混合物を４０℃で養生し（結合反応経過をＤＣにより追跡した。糖抽出物の斑 点消失）、２４時間後にエタノールアミン２３μｌを添加した。室温でさらに１ ５時間後に反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（１．５ｘ２５ｃ ｍ、溶離液アセトニトリル／水１：１）により、クロマトグラフィー処理した。 糖含有フラクションを濃縮し、水に溶解し、冷凍し、親媒化した。結合体１．６ ｍｇ（９０％）を得た。実施例６ ６ＳＬＮ ２０モル％のポリアクリル酸（Ｎａ⁺塩） ６ＳＬＮ−Ｇｌｙ １ｍｇ（１．３７μモル）のＤＭＳＯ ０．１ｍｌ中の溶 液にＤＭＳＯ １．３２ｍｇ中のポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）１． ３２ｍｇ（６．８４μモル）およびＥｔ₃Ｎ（７μｌを添加した。この反応混合 物を４０℃で養生し(結合反応経過をＤＣにより追跡した。糖抽出物の斑点消失) 、２４時間後に０．１Ｍ ＮａＯＨ２３０μｌを添加した。室温でさらに１５時 間後に１Ｍ ＨＣｌ１５μｌを添加し、この反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｌ Ｈ−２０カラム（１．５ｘ２５ｃｍ、溶離液アセトニトリル／水１：１）でクロ マトグラフィー処理した。糖含有フラクションを濃縮し、水に溶解し、冷凍し、 親媒化した。結合体１．５ｍｇ（９３％）を得た。実施例７ ｛Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＨＣＯＣＨ₂Ｎ ＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯ（ＮＨＣＨ₂ＣＯ）₃ＮＨＣＨ₂−｝₄Ｃの製造 実施例４からのテトラキス（Ｎ−第３ブチルオキシカルボニルトリグリシルア ミドメチル）メタン１．２ｍｇ（１μモル）のＣＦ₃ＣＯＯＨ ０．１ｍｌ中の 溶液を室温でかき混ぜた。１５時間後にトルエン１ｍｌを添加し、この溶液を濃 縮した。残渣を水０．５ｍｌに溶解し、濃ＨＣｌ ５μｌを添加し、この溶液を 濃縮し、残渣を真空中で乾燥した。得られたテトラアミンをＤＭＦ０．２ｍｌに 懸濁させ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＨＣＯＣ Ｈ₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₄ＣＯＯ−ｐ−Ｃ₆Ｈ４ＮＯ₂ ４．９ｍｇ（５μモル）の ＤＭＦ０．３ｍｌおよびＮＥｔ₃ ５μｌ中の溶液を添加した。この反応溶液を ２０℃で１５時間かき混ぜた。濃アンモニウム溶液１０μｌを添加し、１時間後 に反応溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（１．２ｘ５０ｃｍ）に通した（溶離 液：０．０５Ｍアンモニア溶液）。糖含有フラクションを濃縮し、水に溶解し、 冷凍し、親媒化した。結合体２．９ｍｇ（６８％）を得た。実施例８ インフルエンザウイルスの培養およびフェチュインへのウイルス性結合の阻害 の測定 非適応化ヒトインフルエンザウイルスＡ／イングランド１５７／８３Ｍ、Ａ／ ＮＩＢ／１２／８９Ｍ、Ａ／ＮＩＢ／２３／８９Ｍ、Ａ／ＮＩＢ５０／８９Ｍ( Ｈ１Ｎ１)、Ａ／ＮＩＢ／４７／８９Ｍ、Ａ／ＮＩＢ／３／９０Ｍ、Ａ／ＮＩＢ ／４４／９０Ｍ（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／イングランド／２２２／８２Ｍ、Ｂ／ＮＩＢ ／４８／９０ＭおよびＢ／ＮＩＢ／１５／８９Ｍを国立生物標準化管理所Nation al Institute for Biological Standardisation and Control(NIBSC，Potters B ar/英国）から入手した。これらは臨床検体から単離され、もっぱらＭＤＣＫ細 胞内で育成された。 鶏卵中で育成したインフルエンザウイルスはD．I．Ivanovsky Institutes fur Virology，Moskouのウイルス種保存局から入手された。このウイルスは９〜１ ０日胚発育鶏卵中に培養された。ウイルス性結合を調べるために、ウイルス含有 培養地浮遊物、または腸尿管液からの存在し得る細胞破片を遠心分離により除去 し た。この溶液はさらに精製することなく、直ちに使用するか、または４℃で４週 間貯蔵した。牛フェチュイン(Fluka，CH)によるマイクロ滴定板の被覆は次のよ うにして行った。ポリスチレン性９６番ＥＩＡマイクロ滴定板(Flow，米国)の各 穴でＰＢＳ中フェチュイン溶液０．１ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用い、３７℃で ２時間培養した。この板をＰＢＳ中０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Serva，D）溶液 、そして次に蒸留水で洗浄し、直ちに使用するか、または気中乾燥し、使用する まで−２０℃で貯蔵した。 フェチュインを被覆した板にウイルスを特異的に吸い上げるために、１：５０ 〜１：２００の血球凝集素滴定値になるまでＰＢＳによりウイルス培地を希釈し た。次にこの板の各穴でこの溶液０．１ｍｌにより４℃で２時間培養した。 オランダカラシ−ペルオキシダーゼ−フェチュイン結合体（周期的活性化標準 法により製造したもの）の前記の吸い上げたウイルスとの結合の阻害は次のよう にして測定した：板をＰＢＳ中の０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄し、次に ペルオキシダーゼ−フェチュイン結合体の０．０２μモル溶液０．１ｍｌ、およ び同時に種々の濃度の試験阻害剤を添加した。４℃で１時間培養した後、板を冷 ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄した。 ペルオキシダーゼ活性は基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン０．４ｍｇ／ｍｌ ＋５０ｍモル酢酸ナトリウム緩衡剤中＋０．０２％、Ｈ₂Ｏ₂ ＰＨ５．５）各０ ．１ｍｌを添加することにより測定した。基質溶液を添加した後に、板を室温で 暗所で３０分間培養し、次いで５％Ｈ₂ＳＯ₄ ０．０５ｍｌを添加し、タイター テックマルチスキャンリーダー（Flow，フィンランド）により４９２ｎｍの吸収 を測定した。 非特異的結合を測定するために、各板のいくつかの穴にはウイルスを添加しな いで培養した。それそれ極めて少量の非特異的結合が見られた。（Ａ₄₉₂値：０ ．０５〜０．２）。 最大結合Ａｍａｘを測定するために各板について、阻害剤を添加せずにペルオ キシダーゼ−フェチュイン結合体の結合を測定した。その他の対照例として各ウ イルス種にペルオキシダーゼ−フェチュイン結合体（これは予めビブリオーコレ ラーゼからのノイラミニダーゼと反応させた）と反応させた。何れの場合にも 結合体はウイルスへの親和性を喪失し、従って結合体とウイルスとの間の相互作 用がシアリルオリゴ糖により制限されることが立証された。 結合親和力は次式によって計算した： ここでＫ_affはウイルス−阻害剤錯体の解離定数であり、Ａ_maxは阻害剤存在下 の吸収測定値であり、Ｃ_iおよびＡ_iは阻害剤の使用濃度、および対応吸収測定値 であり、Ａ_oは阻害剤飽和時の吸収測定値である。 実施例５からの新規結合体６ＳＬＮ−ＰＡＡのウイルス性接着阻害の結果を表 １、または表２に要約する。 表２ シアロシド阻害剤によるインフルエンザウイルスのウイルス性細胞接着の阻害 それぞれ最大公称阻害活性を述べている文献を総括する。活性は阻害剤のＮｅｕ ５Ａｃ基の濃度μモル（５０％阻害をもたらす値）で示してある。 使用試験システム：血球凝集素の阻害（ＨＡＩ）、赤血球へのウイルス吸着の 阻害（ＡＩ）、細胞培地中のウイルス増殖の減少（ＭＩ）、フェチュインへのウ イルス結合の減少（ＦＢＩ）。比較のために最下段に実施例５の化合物６ＳＬＮ −ＰＡＡのデータを記載した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ツジコフ，アレクサンドル ロシア連邦，105037，モスクワ，イズマイ ロフスキー シュトラーセ 47―４ (72)発明者 キナレフ，アレクサンドル ロシア連邦，117871，モスクワ，ミクルコ ―マクラヤ シュトラーセ 16／10 (72)発明者 ギャンバルヤン，アレクサンドラ ロシア連邦，117133，モスクワ，ヴルギー シュトラーセ 40―71 (72)発明者 ロベルトソン，ジェームス イギリス，ヘルトフォードシャー イーエ ヌ６ ３キュージー，ポッタース バー, サウス ミムス，ブランシェ レーン 【要約の続き】 のヒトＡ型（Ｈ１およびＨ３）およびＢ型ウイルスと結 合する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の一般式で示される化合物。 （式中、Ｒ¹はアシル基またはチオアシル基であり、Ｒ²はＨ、ヒドロキシル基， Ｚ−アルキル基、置換されたＺ−アルキル基、Ｚ−アリール基、置換されたＺ− アリール基であり、ここでＺはＯ、ＳまたはＮＨであり、Ｒ³はアシル基または チオアシル基であり、Ｒ⁴はＨまたはアシル基であり、ＸはＯ、Ｓまたは直鎖状 Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル基であり、ＹはＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂または糖であり、Ｗは２ 官能性スペーサーであり、Ｐは次の物質の一つからなる多価担体である：ポリア クリレート、ポリアクリルアミド、Ｎ−置換されたポリアクリルアミド、メタク リルアミド、Ｎ−置換されたメタクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリカーボネ ート、ポリエステル、ポリアミド、ポリ無水物、ポリイミノカーボネート、ポリ オルトエステル、ポリジオキサノン、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシカルボ ン酸、ポリアミノ酸、多糖類、タンパク質、デキストラン、キトサン、グルカン 、リポソーム、マイクロパーティクル） ２．多価担体がＣ（ＣＨ₂ＮＨ−Ａｎ−）₄（ここで、Ａは中性または陰性直鎖状 アミノ酸である）である請求項１に記載の一般式で表される化合物。 ３．Ｐがビオチン、染料、蛍光染料または放射性マーカーでマークされている請 求項１または２に記載の一般式で表される化合物。 ４．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をウイルスと結合するた めに使用すること。 ５．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をインフルエンザウイル スと結合するために使用すること。 ６．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をヒトインフルエンザウ イルスと結合するために使用すること。 ７．請求項３に記載の一般式で表される化合物をウイルス性細胞接着阻害剤をス クリーニングするための試験システムの成分として使用すること。 ８．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をインフルエンザウイル スの血球凝集素と結合するために使用すること。 ９．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物を天然受容体とのウイル ス性細胞接着の阻害剤として使用すること。 １０．請求項４〜９のいずれかに記載の一般式で表される化合物をノイラミニダ ーゼ−阻害剤と組み合わせて使用すること。 １１．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をウイルス感染の予防 または治療処置のために使用すること。 １２．請求項１または２に記載の一般式で表される化合物をウイルス感染の予防 または治療処置のためにノイラミニダーゼ−阻害剤と組み合わせて使用すること 。