CN114380724A - 用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途。所述化合物如下式（I）所示。本发明还提供了以所述化合物为关键组分的纳米脂质颗粒在核酸递送方面的用途，包含递送载体的组分、制备方法和使用方法。
Figure 851828DEST_PATH_IMAGE001
（I）。

Description

用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途
技术领域
本发明涉及脂质递送载体领域，是一类阳离子脂质化合物，与其他脂质成分结合后能够形成可载药的纳米脂质颗粒，从而在体外和体内实现细胞外向细胞内递送核酸。具体的说，本发明涉及用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途。
背景技术
核酸药物通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断或修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。其研发生产工艺相对简单，具有研发周期短、临床开发成功率高、改良可塑性更好等优势。核酸疫苗在近几年作为预防COVID-19的主力军之一，也已经证明了它在市场的巨大潜力。
但是裸mRNA在体内循环时间短、易被降解，且难以进入靶细胞或者靶组织。因此提高mRNA药物的体内递送效率，是提高该类产品有效性的关键方向之一。
目前，应用最广的核酸药物的递送载体是脂质纳米颗粒，它具有提高基因药物疗效以及靶向递送作用等特点，可以保护核酸在体内不被迅速降解，延长循环时间，增强靶向递送。它由2~4个脂质组分组成，包括阳离子脂质化合物、0~2种辅助脂质和0~1种PEG脂质构成。其中阳离子脂质化合物在核酸包载和释放中起关键作用，因此研发新型、高效、低毒的阳离子脂质化合物至关重要。
发明内容
本发明提供了一类含硫的阳离子脂质化合物，包括其药物可接受的盐和其立体异构体或互变异构体。其主要用途是与其他脂质组分以特定比例联合使用，以形成用于递送预防或治疗剂（如治疗性核酸）的脂质纳米颗粒。
本发明的另一目的是提供该类脂质化合物的合成方法，使用原料易得、采用条件温和的反应路线、产品产率高、仪器设备要求低且操作简单。
在一些实例中，治疗性核酸包括质粒DNA、信使RNA、反义寡核苷酸(ASON)、微小RNA(miRNA)、干扰RNA(micRNA)、dicer底物RNA、互补DNA(cDNA)。
同时本发明还提供了此类阳离子脂质化合物与其他脂质组分联合使用时的制剂配比以及使用方法，以及在细胞和动物模型中的应用。
在本发明的实施方案中，采用的是具有如下式(I)结构的阳离子脂质化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(I)
或其药物可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
L1为-C(=O)S-或-C(=O)O-；
G1和 G2各自独立地为C3-C10亚烷基；
R1为C2-C12烷基；
R2为H或C2-C12烷基；
R3为C2-C12烷基；
R4为H或C2-C12烷基；
R5为H、C1-C6烷基、R7-OH、R7-OC(=O)CH3、R7-NHC(=O)-CH3、R7-OCH3或R7-NR8；
R6为H或C1-C6烷基；或者R5、R6和它们所附接的氮连接成环；
R7为C2-C18亚烷基；
R8为C2-C8的直链或支链烷基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，G1和G2为C4-C8亚烷基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R7为C2-C8亚烷基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R1和R3各自独立地为 C4-C8烷基；R2和R4为H或C4-C8烷基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R2和R4有且仅有一个为H。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R5为R7-OH，R7为C2-C8亚烷基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R6为H。
根据本发明一些具体实施方案，其中，R5为R7-N(CH2CH3)CH2CH3，R6为H。
根据本发明一些具体实施方案，其中，其中，所述式(I)结构中的-C(R1)R2或-C(R3)R4结构各自独立地符合如下特征：
Figure 576504DEST_PATH_IMAGE002
。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物具有以下表中所示的结构之一：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 696907DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 880239DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 337765DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 620979DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 522070DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 851420DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
。
本发明还提供了包含一种或多种本发明的阳离子脂质化合物与预防性或治疗性核酸的脂质体制剂，其中，所述脂质体制剂用于预防或者治疗某种疾病。
该脂质体制剂包含选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的一种或多种组分。本发明所用到的治疗物为治疗性核酸，包含质粒DNA、信使RNA、反义寡核苷酸(ASON)、微小RNA (miRNA)、干扰RNA(micRNA)、dicer底物RNA、互补DNA(cDNA)。优选为质粒DNA、信使RNA和反义寡核苷酸。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为20：1至1：1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为10：1至4：1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，该脂质体制剂的直径为50 nm至300 nm。
根据本发明一些具体实施方案，其中，该脂质体制剂的直径为50 nm至150 nm，或150 nm至200 nm。
根据本发明一些具体实施方案，其中，还包含一种或多种其他脂质组分，包括但不限于中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所包含的类固醇为胆固醇。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述胆固醇用量为0，或者胆固醇与阳离子脂质化合物的摩尔比为（0.5-1）：1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述胆固醇与阳离子脂质化合物的摩尔比为1：（1-2）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，聚合物缀合的脂质中的聚合物为聚乙二醇（PEG）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述聚乙二醇化脂质的摩尔比为100:1至20:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述聚乙二醇化脂质的摩尔比为50:1至25:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述聚乙二醇化脂质的摩尔比为35:1至28:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述聚乙二醇化脂质为PEG-DAG、PEG-PE、PEG-SDAG、PEG-cer、PEG-DMG或ALC-0159。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述脂质体制剂包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM中的一种或多种中性脂质。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述中性脂质为DSPC或DOPE。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述中性脂质的摩尔比为2:1至8:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述中性脂质的摩尔比为3:1至6:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质化合物与所述中性脂质的摩尔比为4:1至5:1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述脂质体制剂包括核酸。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸选自反义RNA和/或信使RNA。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸为信使RNA。
本发明还提供了本发明所述的阳离子脂质化合物或所述的脂质体制剂在制备用于在对象中诱导蛋白质表达的药物中的用途。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象为哺乳动物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象是非人灵长类动物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述对象是人。
综上所述，本发明提供了用于递送核酸的阳离子脂质化合物和脂质体制剂及用途。本发明的技术方案具有如下优点：
本发明的阳离子脂质化合物具有硫酯键，硫酯键的引入使得该化合物更易降解，提高了该脂质化合物的体内清除速度，使得由该化合物构成的载体毒性更低、体内残留更少。且所述氨基脂质化合物的制备方法具有使用原料易得、反应条件温和、产品产率高、仪器设备要求低且操作简单的优点。
附图说明
图1为实施例1的核磁图谱。
图2为实施例17的荧光检测结果。
图3为实施例18的红细胞压积测定结果。
图4为实施例19的小鼠血清中和抗体滴度测试结果。
图5为实施例20的IFNγ+/TNFα+ CD8 + T细胞含量占比图。
图6为实施例20的肿瘤移植后小鼠肿瘤体积变化图。
图7为实施例21的感染后小鼠体重变化图。
图8为实施例21的感染后小鼠右肺病毒载量图。
图9为实施例21的感染后小鼠存活率。
图10为实施例22的免疫后小鼠的中和抗体滴度。
图11为实施例22的细胞免疫水平图。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
实施例1 化合物1的合成
Figure 394528DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure 266669DEST_PATH_IMAGE018
步骤1：
向2-己基癸酸（1-1，2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，95 mg）和6-溴己醇（1.68 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.45 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-2（2.00 g，58％收率）。
步骤2：
向化合物1-2（2 .00g）的乙醇（20 mL）溶液中加入4-氨基丁烷-1-醇（0.47 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-3（1.83 g，90％收率）。
步骤3：
向化合物1-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.23 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（4.06 g，95％收率）。
步骤4：
向化合物1-1a（4.06g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.14 g）在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（2.80g，70％收率）。
步骤5：
向化合物1-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（4.26 g）和1,6-二溴己烷（2.72 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发,得到化合物1-1c（2.23 g，50％收率）。
步骤6：
向化合物1-3（1.80 g）的乙醇（18 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 1.09g）,化合物1-1c（2.10 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1（2.30 g，70％收率），核磁图谱见图1。
实施例2 化合物2的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 587929DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
步骤1：
向2-己基癸酸（1-1，2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，95 mg）和6-溴己醇（1.68 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.45 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-2（2.01 g，56％收率）。
步骤2：
向化合物1-2（2 .01g）的乙醇（20 mL）溶液中加入4-氨基己烷-1-醇（0.54 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物2-3（1.91 g，89％收率）。
步骤3：
向化合物1-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.23 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（4.07 g，96％收率）。
步骤4：
向化合物1-1a（4.06g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.14 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（2.80g，70％收率）。
步骤5：
向化合物1-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（4.26 g）和1,6-二溴己烷（2.72 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50 mL）稀释，用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1c（2.24 g，51％收率）。
步骤6：
向化合物2-1（1.91 g）的乙醇（18 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 1.09 g）和化合物1-1c（2.06 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物2-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物2（2.40 g，70％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.07 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.56 (q, J =5.8 Hz, 2H), 3.00 – 2.73 (m, 2H), 2.67 – 2.48 (m, 2H), 2.37 (dt, J = 12.3,6.1 Hz, 6H), 2.29 (p, J = 7.7 Hz, 1H), 1.71 – 1.45 (m, 19H), 1.45 – 1.21 (m,48H), 0.97 – 0.83 (m, 12H)。
实施例3化合物3的合成
Figure 420887DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
Figure 485795DEST_PATH_IMAGE024
步骤1：
向化合物3-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，84mg）和7-溴庚醇（2.05 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.29 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-2（2.06 g，59％收率）。
步骤2：
向化合物3-2（2 .06g）的乙醇（20 mL）溶液中加入4-氨基丁烷-1-醇（0.50 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-3（1.92 g，91％收率）。
步骤3：
向化合物3-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.50 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物3-1a直接用于下一步（4.11 g，94％收率）。
步骤4：
向化合物3-1a（4.11 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.38 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-1b（2.85 g，71％收率）。
步骤5：
向化合物3-1b（2.85 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA,3.01 g）和1,7-二溴庚烷（3.31 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-1c（2.46 g，51％收率）。
步骤6：
向化合物3-3（1.92 g）的乙醇（18 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 1.18 g）和化合物3-1c（2.13 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物2-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3（2.45 g，72％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.07 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.61 – 3.54(m, 2H), 2.95 – 2.80 (m, 2H), 2.58 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 2.49 – 2.44 (m, 2H),2.36 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 2.29 (p, J = 7.7 Hz, 1H), 1.66 (ddd, J = 14.0, 7.6,6.4 Hz, 2H), 1.63 – 1.55 (m, 10H), 1.55 – 1.44 (m, 8H), 1.44 – 1.36 (m, 9H),1.36 – 1.24 (m, 35H), 0.93 – 0.85 (m, 12H)。
实施例4 化合物4的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE025
Figure 212442DEST_PATH_IMAGE026
Figure DEST_PATH_IMAGE027
步骤1：
向化合物4-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，141mg）和6-溴己醇（2.52 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，2.16 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-2（2.26 g，56％收率）。
步骤2：
向化合物4-2（2 .26g）的乙醇（20 mL）溶液中加入2-氨基乙烷-1-醇（0.45 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-3（1.90 g，93％收率）。
步骤3：
向化合物4-1a（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.00 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物4-1b直接用于下一步（4.05 g，93％收率）。
步骤4：
向化合物4-1b（4.05 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.21 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1c（2.81 g，72％收率）。
步骤5：
向化合物4-1c（2.81 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA,2.41 g）和1,6-二溴己烷（2.51 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1d（2.17 g，51％收率）。
步骤6：
向化合物4-3（1.20 g）的乙醇（12 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.98 g）和化合物4-1d（2.13 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物4-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4（2.44 g，71％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.64 (dt, J =6.5, 5.7 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 2.63 –2.54 (m, 3H), 2.47 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.31 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 1.68 – 1.45(m, 14H), 1.45 – 1.22 (m, 42H), 0.97 – 0.81 (m, 9H)。
实施例5 化合物5的合成
Figure 717986DEST_PATH_IMAGE028
Figure DEST_PATH_IMAGE029
Figure 553086DEST_PATH_IMAGE030
步骤1：
向化合物4-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，142mg）和7-溴庚醇（2.72 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，2.16 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物5-1（2.35 g，56％收率）。
步骤2：
向化合物5-1（2 .35 g）的乙醇（20 mL）溶液中加入2-氨基乙烷-1-醇（0.45 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物5-2（1.99 g，91％收率）。
步骤3：
向化合物4-1a（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.00 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物4-1b直接用于下一步（4.05 g，93％收率）。
步骤4：
向化合物4-1b（4.05 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.21 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1c（2.81 g，71％收率）。
步骤5：
向化合物4-1c（2.81 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA,2.41 g）和1,7-二溴庚烷（2.65 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物5-1c（2.23 g，51％收率）。
步骤6：
向化合物5-2（1.00 g）的乙醇（10 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.78 g）和化合物4-1d（1.59 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物4-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3（2.47 g，73％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.64 (dt, J =6.5, 5.7 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 2.62 –2.54 (m, 3H), 2.47 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.31 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 1.65 – 1.45(m, 14H), 1.44 – 1.21 (m, 46H), 0.93 – 0.84 (m, 9H)。
实施例6化合物6的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure 703576DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE033
步骤1：
向化合物4-1a（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，86mg）和6-溴己醇（1.53 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.33 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-1（1.82 g，56％收率）。
步骤2：
向化合物6-1（1.82 g）的乙醇（20 mL）溶液中加入2-氨基乙烷-1-醇（0.27 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-2（1.57 g，90％收率）。
步骤3：
向化合物4-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（3.32 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物4-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物6-1a直接用于下一步（4.0 g，95％收率）。
步骤4：
向化合物6-1a（4.0g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.73 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-1b（3.0g，75％收率）。
步骤5：
向化合物6-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（6.16 g）和1,6-二溴己烷（3.81 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-1c（3.00 g，59％收率）。
步骤6：
向化合物6-2（1.57 g）的乙醇（10 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.95 g）和化合物6-1c（1.42 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物4-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6（1.62 g，74％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.07 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.64 (dt, J =6.5, 5.7 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 2.57(t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.53 – 2.44 (m, 6H), 2.28 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 1.71 –1.45 (m, 14H), 1.45 – 1.24 (m, 43H), 0.93 – 0.85 (m, 9H)。
实施例7 化合物7的合成
Figure 550309DEST_PATH_IMAGE034
Figure DEST_PATH_IMAGE035
Figure 964104DEST_PATH_IMAGE036
步骤1：
向化合物4-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，141mg）和6-溴己醇（2.52 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，2.16 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-2（2.26 g，56％收率）。
步骤2：
向化合物4-2（2 .26g）的乙醇（20 mL）溶液中加入N,N-二甲基乙二胺（0.65 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-3a（2.08 g，90％收率）。
步骤3：
向化合物4-1a（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.00 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物4-1b直接用于下一步（4.05 g，94％收率）。
步骤4：
向化合物4-1b（4.05 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.21 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1c（2.81 g，71％收率）。
步骤5：
向化合物4-1c（2.81 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA,2.41 g）和1,6-二溴己烷（2.51 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1d（2.17 g，52％收率）。
步骤6：
向化合物4-3a（1.40 g）的乙醇（10 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 1.05g）和化合物4-1d（1.42 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物4-3a完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物7（2.07 g，71％收率）。1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.87 (t, J =6.7 Hz, 2H), 2.63 – 2.53 (m, 5H), 2.45 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.35 (s, 6H),2.31 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 1.71 – 1.46 (m, 14H), 1.44 – 1.19 (m, 42H), 1.02 –0.77 (m, 9H)。
实施例8 化合物8的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE037
Figure 20922DEST_PATH_IMAGE038
步骤1：
向化合物1-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中加入二氯亚砜（1.16 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（2.03 g，96％收率）。
步骤2：
向化合物1-1a（2.03g）的10% wt NaOH溶液（10 mL）溶液和甲苯（100 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（0.57 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（200 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（1.40g，72％收率）。
步骤3：
向化合物1-1b（1.40 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（2.13 g）和1,6-二溴己烷（1.36 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（25 mL）稀释，用EA（15 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（50 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发,得到化合物1-1c（1.17 g，51％收率）。
步骤4：
向化合物1-1c（1.17 g）的乙醇（10 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.69g）和化合物4-1d（1.42 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-1c完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物8（1.07 g，49％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 3.61 – 3.54 (m, 2H), 2.95 – 2.80 (m,4H), 2.73 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.58 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 2.49 – 2.44 (m, 2H),2.36 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 1.61 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.59 – 1.53 (m, 13H),1.52 – 1.45 (m, 4H), 1.45 – 1.40 (m, 4H), 1.40 – 1.30 (m, 20H), 1.30 – 1.23(m, 23H), 0.94 – 0.85 (m, 12H)。
实施例9化合物9的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE039
Figure 178365DEST_PATH_IMAGE040
步骤1：
向化合物1-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.23 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（4.06 g，95％收率）。
步骤2：
向化合物1-1a（4.06g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.14 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（2.80g，70％收率）。
步骤3：
向化合物1-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（4.26 g）和1,6-二溴己烷（2.72 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发,得到化合物1-1c（2.23 g，50％收率）。
步骤4：
向化合物1-1c（1.0 g）的乙醇（20 mL）溶液中加入5-羟基戊胺（0.26 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物9-1（0.8 g，76％收率）。
步骤5：
向化合物9-1（0.8 g）的乙醇（10 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.45 g）和化合物1-1c（0.84 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物9-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物9（1.0 g，70％收率）。1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 3.56 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 2.95 – 2.80 (m, 2H),2.63 – 2.54 (m, 2H), 2.37 (dt, J = 12.4, 6.1 Hz, 3H), 1.63 – 1.46 (m, 10H),1.46 – 1.31 (m, 12H), 1.31 – 1.23 (m, 13H), 0.92 – 0.86 (m, 6H)。
实施例10 化合物10的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE041
Figure 879605DEST_PATH_IMAGE042
步骤1：
向化合物3-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.50 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物3-1a直接用于下一步（4.11 g，95％收率）。
步骤2：
向化合物3-1a（4.11 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.38 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-1b（2.85 g，70％收率）。
步骤3：
向化合物3-1b（2.85 g）的THF溶液（28 mL）溶液中二异丙基乙胺（DIPEA, 3.01 g）和1,7-二溴庚烷（3.31 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物3-1c（2.46 g，50％收率）。
步骤4：
向化合物3-1c（2.00 g）的乙醇（20 mL）溶液中加入4-羟丁胺（0.26 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物3-1c完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物10（2.6 g，66％收率）。1H NMR (500 MHz,Chloroform-d) δ 3.62 – 3.50 (m, 2H), 2.96 – 2.80 (m, 4H), 2.73 (t, J = 5.8Hz, 1H), 2.58 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 2.50 – 2.44 (m, 2H), 2.36 (t, J = 6.1 Hz,4H), 1.64 – 1.45 (m, 20H), 1.44 – 1.23 (m, 44H), 0.96 – 0.82 (m, 12H)。
实施例11 化合物11的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE043
Figure 713569DEST_PATH_IMAGE044
Figure DEST_PATH_IMAGE045
步骤1：
向化合物4-1（2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，142mg）和7-溴庚醇（2.72 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，2.16 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％ EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物5-1（2.35 g，58％收率）。
步骤2：
向化合物5-1（2.00g）的乙醇（20 mL）溶液中加入2-羟基乙胺（0.37 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物5-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物11-1（1.30 g，71％收率）。
步骤3：
向化合物4-1a（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.00 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物4-1b直接用于下一步（4.05 g，95％收率）。
步骤4：
向化合物4-1b（4.05 g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.21 g）在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物3-1a完全消失。将反应混合物用EA（30 mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物4-1c（2.81 g，70％收率）。
步骤5：
向化合物4-1c（2.81 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA,2.41 g）和1,7-二溴庚烷（2.65 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物5-1a（2.23 g，50％收率）。
步骤6：
向化合物11-1（1.0 g）的乙醇（15 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.78 g）和化合物5-1a（1.58 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物11-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物11（1.50 g，68％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 3.61 – 3.54 (m, 2H), 2.95 – 2.80 (m,4H), 2.73 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.58 (m, 2H), 2.50 – 2.44 (m, 2H), 2.36 (t, J= 6.1 Hz, 4H), 1.64 – 1.43 (m, 20H), 1.45 – 1.23 (m, 45H), 0.94 – 0.85 (m,12H)。
实施例12 化合物12的合成
Figure 739906DEST_PATH_IMAGE046
Figure DEST_PATH_IMAGE047
Figure 950307DEST_PATH_IMAGE048
步骤1：
向2-己基癸酸（1-1，2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，95 mg）和6-溴己醇（1.68 g）中。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.45 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-2（2.00g，58％收率）。
步骤2：
向化合物1-2（1.50g）的乙醇（20 mL）溶液中加入3-甲氧基丙胺（0.35 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物12-1（1.20 g，78％收率）。
步骤3：
向化合物1-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.23 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（4.06 g，95％收率）。
步骤4：
向化合物1-1a（4.06g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.14 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（2.80g，70％收率）。
步骤5：
向化合物1-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（4.26 g）和1,6-二溴己烷（2.72 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1c（2.23 g，50％收率）。
步骤6：
向化合物12-1（1.0 g）的乙醇（15 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.87 g）和化合物1-1c（1.20 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物12-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物12（1.2 g，65％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.07 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.42 (td, J =6.6, 1.4 Hz, 2H), 3.18 (s, 3H), 2.95 – 2.80 (m, 2H), 2.63 – 2.52 (m, 3H),2.37 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.29 (m, 1H), 1.79 – 1.22 (m, 66H), 0.94 – 0.85 (m,12H)。
实施例13化合物13的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE049
Figure 381420DEST_PATH_IMAGE050
步骤1：
向2-己基癸酸（1-1，2.00 g）的DCM（20 mL）溶液中依次加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，95 mg）和6-溴己醇（1.68 g）。混合物在25℃搅拌5分钟后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)（EDCl，1.45 g），反应混合物25℃搅拌12小时，然后TLC显示起始醇完全消失。将反应混合物用DCM（30 mL）稀释，并用饱和NaHCO3（100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-2（2.00 g，58％收率）。
步骤2：
向化合物1-2（2 .00g）的乙醇（20 mL）溶液中加入4-乙酰氧基丁胺（0.69 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物13-1（1.80 g，80％收率）。
步骤3：
向化合物13-1（1.50 g）的乙醇（15 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.87g）和化合物1-1d（1.60 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物13（2.0 g，76％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.11 – 4.04 (dt, J = 8.0, 6.4 Hz, 4H),2.38 – 2.34 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.32 – 2.26 (m, 1H), 2.03 (s, 2H), 1.79 –1.21 (m, 68H), 0.92 – 0.87 (m, 12H)。
实施例14 化合物14的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE051
Figure 386285DEST_PATH_IMAGE052
步骤1：
向化合物1-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（2.23 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合物1-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物1-1a直接用于下一步（4.06 g，95％收率）。
步骤2：
向化合物1-1a（4.06g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.14 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1b（2.80g，70％收率）。
步骤3：
向化合物1-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（4.26 g）和1,6-二溴己烷（2.72 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物1-1c（2.23 g，50％收率）。
步骤4：
向化合物1-1c（2 .00g）的乙醇（20 mL）溶液中加入3-甲氧基丙胺（0.45 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-1c完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物14-1（1.80 g，88％收率）。
步骤5：
向化合物14-1（1.50 g）的乙醇（18 mL）溶液中加入二异丙基乙胺（DIPEA, 0.87g）和化合物1-1c（1.62 g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-3完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物14（2.10 g，78％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 3.42 (td, J = 6.6, 1.4 Hz, 2H), 3.18 (s,3H), 2.95 – 2.81 (m, 4H), 2.63 – 2.52 (m, 4H), 2.37 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 1.78– 1.64 (m, J = 6.5 Hz, 2H), 1.63 – 1.23 (m, 64H), 0.92 – 0.85 (m, 12H)。
实施例15化合物15的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE053
Figure 27482DEST_PATH_IMAGE054
步骤1：
向化合物4-1（4.00 g）的DCM（40 mL）溶液中加入二氯亚砜（3.32 g）。将混合物在40℃搅拌6小时。然后TLC显示起始化合4-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，得到粗产物6-1a直接用于下一步（4.0 g，90％收率）。
步骤2：
向化合物6-1a（4.0g）的10% wt NaOH溶液（20 mL）溶液和甲苯（200 mL）的混合溶液中加入硫代乙酰胺（1.73 g），在25℃搅拌48小时。然后TLC显示起始化合物1-1a完全消失。将反应混合物用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-1b（3.0g，76％收率）。
步骤3：
向化合物6-1b（2.80 g）的THF溶液（28 mL）溶液中加入碳酸钾（6.16 g）和1,6-二溴己烷（3.81 g）。将混合物在25℃搅拌12小时。然后TLC显示化合物1-1b完全消失。将反应混合物用水（50mL）稀释，用EA（30mL）萃取两次，合并有机层并用饱和盐水（100 mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物6-1c（3.00 g，57％收率）。
步骤4：
向化合物6-1c（2.50g）的乙醇（20 mL）溶液中加入N,N-二甲基-1,2-乙二胺（0.47g）。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物1-2完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物15-1（2.30 g，90％收率）。
步骤5：
向化合物15-1（2.00 g）的乙醇（20 mL）溶液中分别加入N,N-二甲基-1,2-乙二胺（1.44 g）和化合物1-1d(2.84 g)。将混合物在90℃搅拌12小时。然后TLC显示起始化合物15-1完全消失。将反应混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含0-1％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到化合物15（2.6 g，63％收率）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 2.92 – 2.85 (dt, J = 12.1, 6.5 Hz,4H), 2.61 – 2.56 (m, 5H), 2.53 – 2.48 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.47 – 2.43 (t, J= 6.1 Hz, 4H), 2.38 – 2.34 (s, 6H), 1.64 – 1.57 (m, 7H), 1.57 – 1.51 (m, 4H),1.50 – 1.45 (m, 4H), 1.44 – 1.25 (m, 43H), 0.92 – 0.87 (m, 9H)。
实施例16纳米脂质颗粒制备以及性状表征
配制水相：将mRNA按照 0.13 μg/μL的终浓度稀释于柠檬酸缓冲液；
将各脂质组分（本文所示阳离子脂质，DSPC，胆固醇，PEG脂质）按照总浓度10 mg/mL溶于乙醇，比例随阳离子脂质不同而有所不同。其中编号1-3、8-10、12-14和16所用的PEG脂质为ALC-0159；编号4-7、11、15和17-19用的PEG脂质为PEG2000-DMG。
将3 mL mRNA缓冲液和1 mL脂质溶液分别装入两个5 mL注射器，安装于微流控注射泵上，将芯片连接到注射器，设定注射泵流速，点击注射泵的开始按键，将料液注入芯片。观察芯片出口的产品颜色，弃去前5滴乳白色液滴（约为100 μL）后，后端样品收集到EP管中。将收集到的产品放入透析袋中，隔10 mM PBS（pH 7.4）透析6小时（截留分子量：100KDa），随后保存于4℃。
按照Ribogreen试剂盒说明，测试计算产品的包封率；于马尔文公司的Zetasizernano仪器上使用标准检测方法进行粒径与PDI检测、Zeta电位分析。
本实施例所制备得到的负载mRNA的LNP的粒径、PDI和包封率的检测结果如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE055
Figure 526727DEST_PATH_IMAGE056
Figure DEST_PATH_IMAGE057
实施例17 利用纳米脂质颗粒组合物递送荧光素酶mRNA在体内表达效果测定
在6-8周龄的雌性SD大鼠通过肌肉注射含30ug mRNA的LUC-mRNA-脂质纳米颗粒（LUC-mRNA对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:1），制备方法同实施例16。在特定时间点小鼠尾静脉注射D-Luciferin Potassium Salt 200ug，使用PerkinElmer小动物成像系统进行检测。Fluc通常用于哺乳动物细胞培养物中以测量基因表达和细胞活力。其在底物荧光素存在下发射出生物性光。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果如图2和表2，1-15#化合物组成的纳米脂质颗粒组合物递送mRNA至肝脏的水平优于16#（ALC-0315）。
表2
Figure 327193DEST_PATH_IMAGE058
Figure DEST_PATH_IMAGE059
Figure 519271DEST_PATH_IMAGE060
Figure DEST_PATH_IMAGE061
Figure 647764DEST_PATH_IMAGE062
Figure DEST_PATH_IMAGE063
Figure 199968DEST_PATH_IMAGE064
实施例18 利用纳米脂质颗粒组合物递送促红细胞生成素（EPO）mRNA在小鼠内表达与效果测定
在6-8周龄的雌性Balb/c小鼠通过尾静脉注射10ug EPO-mRNA-脂质纳米颗粒（EPO-mRNA对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:2），制备方法同实施例16，并根据特定检测时间点(0、4、12、24、48小时)将动物分为5组。在特定时间点对小鼠进行眼框取血，测定红细胞压积。hEPO通常用于哺乳动物血液中蛋白质表达水平的表征基因，其表达水平与红细胞压积成正比。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果如图3所示，由结果可知，化合物1#组成的纳米脂质颗粒组合物递送mRNA的水平优于17#（MC3）。
实施例19 利用纳米脂质颗粒组合物递送单克隆抗体Palivizumab mRNA在小鼠内功能测定
在6-8周龄的雌性Balb/c小鼠通过肌肉注射10ug Palivizumab-mRNA-脂质纳米颗粒（Palivizumab-mRNA对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4），制备方法同实施例16。在特定时间点24h对小鼠进行眼框取血，测定小鼠血清中和RSV A2的中和抗体滴度。在384孔的微量滴定板上进行HEp-2细胞培养。培养皿每孔含有15 ml病毒，组织培养半最大感染剂量(TCID50)为25 ~ 1000，每孔含有15 ml连续稀释的血清，在37℃、5%CO2条件下孵育1 ~ 1.5小时。每孔中加入2.5 x105个HEp-2细胞，37℃孵育3 - 4天。用80%丙酮/20%磷酸盐缓冲盐水在4℃低温条件下固定细胞15分钟，用辣根过氧化物酶结合的抗RSV F的ELISA试剂盒检测病毒复制，并通过酶标仪在450nm时监测吸光率来定量，利用GraphPad Prism中的非线性拟合算法计算IC50值。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果如图4，采用1#化合物制备的阳离子脂质递送的Palivizumab-mRNA表达量优于18#化合物（lipid5）的表达量，因此产生了更好的抗病毒效果。
实施例20 利用纳米脂质颗粒组合物递送肿瘤抗原Kras-mRNA在小鼠内表达效果测定
在6-8周龄的雌性NOG-SCID小鼠荷瘤LU65，小鼠通过瘤内注射10ug G12C Kras-mRNA-脂质纳米颗粒（Kras-mRNA对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:5），每周注射1次，持续4周，制备方法同实施例16。在4周后对小鼠进行眼框取血，测定小鼠血清中抗Kras G12C的抗体滴度，同时检测细胞免疫水平。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果如图5、图6，采用1#、2#、3#化合物制备的阳离子脂质递送的Kras-mRNA诱导了优于ALC-0315的细胞免疫（图5），产生了更好的抑制肿瘤生长效果（图6）。
实施例21 利用纳米脂质颗粒组合物递送新型冠状病毒mRNA疫苗
采用6周K18-hACE2 KI小鼠模型，于0、14天肌肉注射给与不同纳米脂质颗粒组合物递送的mRNA新冠肺炎疫苗（对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:6）进行免疫，第28天（末次免疫后第14天）以2.5×103PFU的新冠病毒剂量滴鼻攻击动物，评价不同纳米脂质颗粒组合物递送的mRNA新冠肺炎疫苗对SARS-CoV-2病毒毒株感染的保护效果。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。检测结果攻毒后体重变化、右肺病毒载量以及存活率分别如图7、图8、图9所示，由结果可知，化合物1#组成的纳米脂质颗粒组合物递送mRNA的水平优于17#（MC3）。
实施例22 利用纳米脂质颗粒组合物递送呼吸道合胞病毒mRNA疫苗
5 - 7周龄雌性BALB/c小鼠，不同纳米脂质颗粒组合物递送的mRNA新冠肺炎疫苗进行免疫，所用的mRNA编码RSF F 融合前构型（DS-Cav1，对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:7）每隔3周免疫1次。第二次免疫后两周，抽血进行血清学检测。第二次免疫后4周处死动物，收集脾脏进行ICS检测。所用到的mRNA的基本特征为ARCA帽结构，polyA尾长度为100-120nt，假尿嘧啶完全取代。免疫后小鼠的中和抗体滴度和细胞免疫水平如图10、图11所示，由结果可知，化合物1#组成的纳米脂质颗粒组合物递送mRNA的水平优于19#（SM102）。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> 用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途
<130> GAI22CN2026
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备Luciferase疫苗
<400> 1
atggaggatg ctaagaatat caagaagggt ccagccccat tttacccgct ggaagacgga 60
acggctggcg agcagctcca caaggcaatg aaaaggtacg ccttagtgcc tggcacgatc 120
gcttttacag acgcccatat tgaggtcaat attacgtatg ctgagtattt cgagatgagt 180
gtgagacttg cagaggccat gaagcgttac gggctcaaca ctaatcatcg tatagtggtg 240
tgttcagaaa actctctgca attcttcatg ccggtcttag gagcgctctt cataggagtg 300
gcagttgcgc cagcgaatga catatataac gagcgcgagt tgctgaactc tatgaatatt 360
tcacagccaa cggtcgtttt cgtatccaaa aaaggcctac aaaagatcct caacgtacaa 420
aaaaaactgc ctatcataca aaaaattatt attatggact cgaagaccga ctatcaaggg 480
tttcaaagca tgtacacgtt cgttactagc catctccctc caggcttcaa tgaatacgac 540
ttcgtgcctg aatcattcga ccgtgacaaa accatagccc tgatcatgaa ctcatcggga 600
agcacgggct taccaaaagg tgtggcgctt ccacacagga ctgcttgtgt aagatttagt 660
catgccagag atcccatctt tggaaatcaa atcattccag acactgccat tcttagtgtc 720
gtaccgttcc atcatggttt cggaatgttc acgactttgg gctatttaat ttgtggtttc 780
cgcgttgttt tgatgtatag gttcgaagag gaactgttcc tgagatcatt acaggactat 840
aagatccaga gcgccctact cgttccgacg ctattttcct ttttcgcgaa atcgaccctc 900
attgacaaat acgatctgtc taacctacat gagattgcta gtgggggtgc gcccctaagc 960
aaagaggttg gtgaagcggt ggcgaagcga tttcatctgc ctggaatacg gcaagggtac 1020
ggtttaaccg aaaccacatc ggccatcttg ataacgccag aaggggacga caagccggga 1080
gctgtaggta aggttgttcc attcttcgaa gcgaaagtgg tggacttgga cactggaaag 1140
accttagggg ttaatcaacg tggggagctg tgcgtcagag gcccgatgat catgtctggg 1200
tacgttaaca accctgaagc aacgaatgcc ttaattgata aggacgggtg gttgcactcg 1260
ggtgacatag cctactggga cgaagacgaa cactttttca ttgtggatcg tctgaagtcc 1320
ctgattaaat ataaaggcta tcaagtggcc ccagcggagc tcgaatctat tttgctgcaa 1380
cacccgaaca tcttcgatgc gggcgttgca ggtctgccag acgatgatgc gggagagctc 1440
ccggctgcag ttgttgtcct tgagcatggg aagactatga cggaaaaaga aatcgttgat 1500
tatgtggcat cgcaagtaac caccgccaag aagctacgtg gtggggtggt cttcgtggat 1560
gaggtaccca aaggtctgac tggaaaacta gacgctcgga aaattcgcga gattctcatc 1620
aaggcgaaaa aaggtggaaa aagcaagcta tga 1653
<210> 2
<211> 579
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备EPO疫苗
<400> 2
atgggggttc ctgagagacc aactctactg ttgctactat cacttttact catcccttta 60
ggattgccag ttctgtgcgc acccccgcgc cttatttgcg attctcgcgt gctagaacgt 120
tacatactcg aggccaagga ggccgagaat gttacaatgg ggtgcgccga agggccccgc 180
ctaagcgaga acatcacggt gccggatacc aaggttaatt tttacgcatg gaaacgaatg 240
gaagtagagg aacaagcaat cgaagtctgg cagggcctgt cgttgctaag cgaagccatt 300
ctccaagccc aggcccttct cgccaacagc agtcaaccgc ctgaaacgct gcaacttcac 360
atcgacaaag ccatatctgg tctccgttcc ctgacctccc ttctgcgggt tttgggagcc 420
cagaaagagc ttatgagccc gccggatact acccctcccg cccctttgcg gacccttacg 480
gttgatacct tttgcaaact gttcagggta tatgcgaatt tcctccgagg taaacttaaa 540
ctttatacag gggaggtatg tcggagaggt gaccgctga 579
<210> 3
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备Palivizumab疫苗VL
<400> 3
atggacatcc agatgaccca atctcctagt actcttagcg cctccgtcgg cgatcgagtt 60
acaataactt gccgggcgtc ccagtcaatt tcatcatggc tcgcttggta ccaacagaag 120
ccggggaagg cacccaagtt actaatctac gacgcttctt ctctagagtc gggcgtgcct 180
tctcgctttt ccggctccgg aagtggcacc gaattcacgc ttaccattag ctcattgcaa 240
cccgatgact tcgccacata ctattgtcaa cagtataact cgtactcctg a 291
<210> 4
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备Palivizumab疫苗VH
<400> 4
atgcaggtca ctttacggga aagcggcccg gcactagtaa agccaacgca aaccctcact 60
ctcacttgca cattttccgg atttagcctg agcacgtccg gcatgtcagt cggatggatc 120
agacaacccc cgggtaaagc actagagtgg ttagcggata tctggtggga tgacaagaaa 180
gattataatc cctctcttaa aagcaggtta acaatatcca aggatacgtc caagaatcaa 240
gtggtgctta aggtgacgaa tatggacccc gctgataccg caacttacta ttgtgctcgg 300
tccatgataa cgaattggta tttcgatgtt tggggggctg gcacaaccgt cactgtatct 360
agttga 366
<210> 5
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备Kras G12C疫苗
<400> 5
atgacggaat acaagttagt ggttgtagga gcctgcggag tgggaaaatc cgccttgaca 60
atacagctaa tccaggggtc tatgacggaa tacaaattag ttgtggtggg cgcgtgcggc 120
gtaggtaagt ctgctctaac gatacagttg attcaatga 159
<210> 6
<211> 3822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备COVID-19 Spike疫苗
<400> 6
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cctgaccacc 60
cggacccagc tgccaccagc ctacaccaac agcttcaccc ggggcgtcta ctaccccgac 120
aaggtgttcc ggagcagcgt cctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca acggcaccaa gcggttcgac 240
aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gagcaacatc 300
atccggggct ggatcttcgg caccaccctg gacagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aataacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt ccgggtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgagccagc ccttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgg gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaagatct acagcaagca caccccaatc aacctggtgc gggatctgcc ccagggcttc 660
tcagccctgg agcccctggt ggacctgccc atcggcatca acatcacccg gttccagacc 720
ctgctggccc tgcaccggag ctacctgacc ccaggcgaca gcagcagcgg gtggacagca 780
ggcgcggctg cttactacgt gggctacctg cagccccgga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggac tgcgccctgg accctctgag cgagaccaag 900
tgcaccctga agagcttcac cgtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgggtg 960
cagcccaccg agagcatcgt gcggttcccc aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag 1020
gtgttcaacg ccacccggtt cgccagcgtg tacgcctgga accggaagcg gatcagcaac 1080
tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggcgtgagcc ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccgtg gcgacgaggt gcggcagatc gcacccggcc agacaggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320
ctcgacagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtacc ggctgttccg gaagagcaac 1380
ctgaagccct tcgagcggga catcagcacc gagatctacc aagccggctc caccccttgc 1440
aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc cctctgcaga gctacggctt ccagcccacc 1500
aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgggtg gtggtgctga gcttcgagct gctgcacgcc 1560
ccagccaccg tgtgtggccc caagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggccttac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaaattcctg 1680
ccctttcagc agttcggccg ggacatcgcc gacaccaccg acgctgtgcg ggatccccag 1740
accctggaga tcctggacat caccccttgc agcttcggcg gcgtgagcgt gatcacccca 1800
ggcaccaaca ccagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860
cccgtggcca tccacgccga ccagctgaca cccacctggc gggtctacag caccggcagc 1920
aacgtgttcc agacccgggc cggttgcctg atcggcgccg agcacgtgaa caacagctac 1980
gagtgcgaca tccccatcgg cgccggcatc tgtgccagct accagaccca gaccaattca 2040
ccccggaggg caaggagcgt ggccagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100
gccgagaaca gcgtggccta cagcaacaac agcatcgcca tccccaccaa cttcaccatc 2160
agcgtgacca ccgagattct gcccgtgagc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gcgacagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttctgc 2280
acccagctga accgggccct gaccggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag acccctccca tcaaggactt cggcggcttc 2400
aacttcagcc agatcctgcc cgaccccagc aagcccagca agcggagctt catcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctagccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc 2520
ctcggcgaca tagccgcccg ggacctgatc tgcgcccaga agttcaacgg cctgaccgtg 2580
ctgcctcccc tgctgaccga cgagatgatc gcccagtaca ccagcgccct gttagccgga 2640
accatcacca gcggctggac tttcggcgct ggagccgctc tgcagatccc cttcgccatg 2700
cagatggcct accggttcaa cggcatcggc gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc 2820
accgctagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac 2880
accctggtga agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gcagcgtgct gaacgacatc 2940
ctgagccggc tggaccctcc cgaggccgag gtgcagatcg accggctgat cactggccgg 3000
ctgcagagcc tgcagaccta cgtgacccag cagctgatcc gggccgccga gattcgggcc 3060
agcgccaacc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagag caagcgggtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg agctttcccc agagcgcacc ccacggagtg 3180
gtgttcctgc acgtgaccta cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac cgccccagcc 3240
atctgccacg acggcaaggc ccactttccc cgggagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300
cactggttcg tgacccagcg gaacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360
ttcgtgagcg gcaactgcga cgtggtgatc ggcatcgtga acaacaccgt gtacgatccc 3420
ctgcagcccg agctggacag cttcaaggag gagctggaca agtacttcaa gaatcacacc 3480
agccccgacg tggacctggg cgacatcagc ggcatcaacg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg atcggctgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagagcct gatcgacctg 3600
caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gaccagctgc 3720
tgcagctgcc tgaagggctg ttgcagctgc ggcagctgct gcaagttcga cgaggacgac 3780
agcgagcccg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct ga 3822
<210> 7
<211> 1659
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于制备DS-Cav1疫苗
<400> 7
atggaattgt tgatcctgaa ggcgaacgcg atcaccacta ttctcaccgc agtgactttc 60
tgttttgctt cgggccaaaa cataaccgaa gagttttacc aatccacctg ctctgcagtg 120
tccaaaggtt acctctcggc actgagaaca ggatggtaca ccagcgttat aacaattgaa 180
ttaagtaata tcaaggagaa taaatgtaac ggcactgatg cgaaggtcaa actcattaaa 240
caagaactgg acaaatacaa gaatgctgtg acagagctac agctactcat gcaaagcacg 300
ccccctacga ataatcgagc tcgacgcgaa ctaccgagat tcatgaacta cacccttaat 360
aatgctaaga aaacgaacgt aacactttcc aagaaacgaa aacgacggtt tctagggttc 420
ctattgggtg tcggatcggc catagcatct ggggttgcgg tctgcaaagt tttgcatctc 480
gaaggcgagg ttaataaaat taagtcggcg ctattgtcca caaataaggc cgtggtctct 540
ctctcgaatg gcgtttctgt acttaccttc aaagtactgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcaacttc tccctatttt gaacaagcag tcatgtagta tatcgaacat cgaaaccgtc 660
attgaattcc aacagaaaaa taatcgtctg ctagaaataa cacgcgagtt tagtgtgaat 720
gctggagtaa ccacgcctgt ttccacgtac atgcttacga attcagaact gctctcattg 780
attaacgaca tgccaattac aaatgatcag aaaaaactaa tgtctaacaa tgtccaaatt 840
gtccggcagc agtcatatag tataatgtgt attatcaaag aagaagttct ggcgtatgta 900
gtgcagttgc ctttgtatgg agtgatagac accccgtgtt ggaaattgca cacgtcgcct 960
ttgtgcacaa ctaataccaa agagggatca aacatctgtc tgacacgcac ggatagaggt 1020
tggtactgtg acaacgccgg ttccgtgtca ttctttccgc aggcagagac atgcaaagta 1080
cagagcaaca gggtcttctg tgacacaatg aacagcctaa ctcttccctc ggaaatcaat 1140
ctatgcaatg ttgacatctt caatccgaag tacgactgca agatcatgac ctccaaaacg 1200
gacgtgtcat caagcgtaat aacttcgctg ggtgcaatag tgtcgtgcta tggaaaaact 1260
aaatgtacag cgtcaaacaa aaatcggggg ataattaaaa cgttcagtaa tggatgtgac 1320
tatgtatcta acaaaggcat ggacaccgtt tcggtcggca ataccctcta ctacgtgaat 1380
aagcaggaag gcaaatccct ttacgtcaaa ggggaaccaa taatcaattt ctatgatccg 1440
cttgtgttcc caagtgatga gtttgacgcc agtatcagtc aagttaatga aaagataaat 1500
caatccttgg ctttcatccg caaaagtgat gagttgctac acaatgtgaa tgcgggaaag 1560
tcaactacga atgccggtta cattccagag gctccgagag atggccaagc ttacgtacgg 1620
aaagatggcg aatgggtttt cttgtctacg ttcctatga 1659

Claims (27)

1.具有以下式(I)结构的用于递送核酸的阳离子脂质化合物：
Figure 793085DEST_PATH_IMAGE001
(I)
或其药物可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其特征在于：
L1为-C(=O)S-或-C(=O)O-；
G1和 G2各自独立地为C3-C10亚烷基；
R1为C2-C12烷基；
R2为H或C2-C12烷基；
R3为C2-C12烷基；
R4为H或C2-C12烷基；
R5为H、C1-C6烷基、R7-OH、R7-OC(=O)CH3、R7-NHC(=O)-CH3、R7-OCH3或R7-NR8；
R6为H或C1-C6烷基；或者R5、R6和它们所附接的氮连接成环；
R7为C2-C18亚烷基；
R8为C2-C8的直链或支链烷基。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，G1和G2为C4-C8亚烷基。
3.如权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R7为C2-C6亚烷基。
4.如权利要求3所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R5为R7-OH。
5.如权利要求4所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R6为H。
6.如权利要求5所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R1和R3各自独立地为 C4-C9烷基；R2和R4为H或C4-C9烷基。
7.如权利要求6所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R2和R4有且仅有一个为H。
8.如权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R5为R7-N(CH2CH3)CH2CH3，R6为H。
9.如权利要求5所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述式(I)结构中的-C(R1)R2或-C(R3)R4结构各自独立地符合如下特征：
Figure 674453DEST_PATH_IMAGE002
。
10.如权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物具有以下表中所示的结构之一：
Figure 46660DEST_PATH_IMAGE003
Figure 962663DEST_PATH_IMAGE004
Figure 745811DEST_PATH_IMAGE005
Figure 380055DEST_PATH_IMAGE006
Figure 415007DEST_PATH_IMAGE007
Figure 326462DEST_PATH_IMAGE008
Figure 421457DEST_PATH_IMAGE009
Figure 277418DEST_PATH_IMAGE010
Figure 506274DEST_PATH_IMAGE011
Figure 865711DEST_PATH_IMAGE012
Figure 397187DEST_PATH_IMAGE013
Figure 370738DEST_PATH_IMAGE014
Figure 13072DEST_PATH_IMAGE015
。
11.包含权利要求1-10任意一项所述阳离子脂质化合物与预防性或治疗性核酸的脂质体制剂，其特征在于，所述制剂用于预防或者治疗某种疾病。
12.如权利要求11所述的脂质体制剂，其特征在于，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为20：1至1：1。
13.如权利要求12所述的脂质体制剂，其特征在于，所述核酸与所述阳离子脂质化合物的摩尔比为10：1至4：1。
14.如权利要求11所述的脂质体制剂，其特征在于，该脂质体制剂的直径为50 nm至300nm。
15.如权利要求14所述的脂质体制剂，其特征在于，该脂质体制剂的直径为50 nm至150nm，或150 nm至200 nm。
16.如权利要求11所述的脂质体制剂，其特征在于，还包含一种或多种其他脂质组分，包括中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质。
17.如权利要求16所述的脂质体制剂，其特征在于，所包含的类固醇为胆固醇。
18.如权利要求17所述的脂质体制剂，其特征在于，所述胆固醇用量为0，或者胆固醇与阳离子脂质化合物的摩尔比为（0.5-1）：1。
19.如权利要求11所述的脂质体制剂，其特征在于，聚合物缀合的脂质中的聚合物为聚乙二醇（PEG）。
20.如权利要求19所述的脂质体制剂，其特征在于，所述阳离子脂质化合物与所述聚乙二醇缀合的脂质的摩尔比为100:1至20:1。
21.如权利要求19所述的脂质体制剂，其特征在于，所述聚乙二醇缀合的脂质为PEG-DAG、PEG-PE、PEG-SDAG、PEG-cer、PEG-DMG或ALC-0159。
22.如权利要求16所述的脂质体制剂，其特征在于，所述中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM中的一种或多种的组合。
23.如权利要求22所述的脂质体制剂，其特征在于，所述阳离子脂质化合物与所述中性脂质的摩尔比为2:1至8:1。
24.如权利要求11所述的脂质体制剂，其特征在于，所述核酸选自反义RNA和/或信使RNA。
25.如权利要求1-10任意一项所述的阳离子脂质化合物或权利要求11-24任意一项所述的脂质体制剂在制备用于在对象中诱导蛋白质表达的药物中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述对象为哺乳动物。
27.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述对象是非人灵长类动物或人。
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