JP5130598B2 - ウイルスレセプター糖鎖認識特異性の判別方法 - Google Patents
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Description
従来、インフルエンザウイルスが結合可能なレセプター糖鎖含有化合物としては、種々報告されているものの(特許文献2〜4)、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法に好適なレセプター糖鎖含有化合物に関しては報告がない。さらに、測定時の安全性を考慮すると、不活化したウイルスサンプルが使用可能であることが必須である。しかし、不活化したウイルスサンプルを、望ましくは濃縮などの処理をしなくて用いた場合でも、そのようなサンプルと結合可能なレセプター糖鎖含有化合物がどのようなものかに関しては、まったく不明である。
レセプター糖鎖含有化合物の一例としてシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を合成する方法として特許文献2に開示された方法が挙げられる。この方法では、βガラクトシダーゼの糖転移反応を利用してp−ニトロフェニルN−アセチル−β−ラクトサミニドを合成し、p−ニトロフェニル基をp−アミノフェニル基へと還元する。その後、ポリグルタミン酸と縮合させ、ラット由来のシアリルトランスフェラーゼを用いてオリゴ糖部分をシアリル化することにより目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得していた。
レセプター糖鎖含有化合物を担体に固定化する方法としては、適当なリンカーを用いる方法が一般的である(特許文献5及び6)。しかし、リンカーを用いる方法は、簡便な方法とは言えず、かつ化学反応であって、好ましくない副反応が生じるため、好ましい方法とは言えない。さらに、レセプター糖鎖含有ポリマーとしてシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を使用する場合を例に挙げれば、シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸の担体への結合法に関しては、まったく報告されていない。
現在まで、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性の判別、ウイルス変異による感染宿主の変化を予想可能とする試薬あるいはキットは報告されていないし、市販もされていない。
(II)
(式(I)中、Zは水酸基又は式(II)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(II)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Rは炭化水素を示す。)
(IV)
(式(III)中Zは水酸基又は式(IV)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(IV)中Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Rは炭化水素を示す。)
(VI)
(式(V)中、Zは水酸基又は式(VI)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(VI)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、R’はフェニレンを除く炭化水素を示す。)
(式(V)中、Zは水酸基又は式(VI)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(VI)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、R’はフェニレンを除く炭化水素を示す。)
(VIII)
(式(VII)中、Zは水酸基又は式(VIII)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(VIII)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、R’はフェニレンを除く炭化水素を示す。)
(工程1)
糖転移酵素を用いて目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
(工程2)
工程1で合成したシアロ糖鎖とポリグルタミン酸とを化学的に結合させる工程
(工程3)
工程2で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程
〔17〕担体が複数のウエルを有し、1つの担体に異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーが複数固定されたものである、上記〔16〕記載のキット。
〔20〕前記インフルエンザウイルスが、不活化されたインフルエンザウイルスである〔6〕記載の判別方法。
〔21〕グルタミン酸単位重合度が10〜10,000である〔7〕〜〔10〕いずれかに記載のシアロ糖鎖含有ポリマー。
〔22〕グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が10〜80%である〔7〕〜〔10〕に記載のシアロ糖鎖含有ポリマー。
〔23〕ポリグルタミン酸が、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸である〔11〕記載の製造法。
〔24〕グルタミン酸単位重合度が10〜10,000である〔11〕記載の製造法。
〔25〕グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が10〜80%である〔11〕記載の製造法。
〔26〕前記シアロ糖鎖含有ポリマーの前記シアロ糖鎖が、シアリルラクト系I型糖鎖(SAα2−6(3)Galβ1−3GlcNAcβ1−)、シアリルラクト系II型糖鎖(SAα2−6(3)Galβ1−4GlcNAcβ1−)、シアリルガングリオ系糖鎖(SAα2−6(3)Galβ1−3GalNAcβ1−)およびシアリルラクトース糖鎖(SAα2−6(3)Gal1−4Glc)からなる群から選択される少なくとも一つの糖鎖である〔13〕記載の担体。
〔27〕前記ポリグルタミン酸が、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸である〔13〕又は〔14〕記載の担体。
〔28〕担体が複数のウエルを有するプレートである〔13〕又は〔14〕記載の担体。
〔29〕さらに、前記ウイルスに対する抗ウイルス抗体を含む〔16〕記載のキット。
〔30〕〔13〕ないし〔29〕のいずれかに記載の担体の製造方法であって、前記担体に、シアロ糖鎖含有ポリマーを含む液を接触させ、この状態で紫外線を前記担体に照射し、その後、前記液を除去することにより、前記担体表面に前記シアロ糖鎖含有ポリマーを固定する担体の製造方法。
本発明の判別方法で使用可能なシアロ糖鎖含有ポリマーとしては、公知のシアロ糖鎖含有ポリマー以外にも、以下の新規のシアロ糖鎖含有ポリマーも使用可能である。この新規のシアロ糖鎖含有ポリマーは、公知のポリマーより極めて安価に調製することができ、しかも天然のムチンと類似の構造を有するため、本発明の判別方法に好適である。
(II)
(式(I)中、Zは水酸基又は式(II)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(II)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Rは炭化水素を示す。)
(IV)
(式(III)中、Zは水酸基又は式(IV)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(IV)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、Rは炭化水素を示す。)
(VI)
(式(V)中、Zは水酸基又は式(VI)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(VI)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、R’はフェニレンを除く炭化水素を示す。)
(VIII)
(式(VII)中、Zは水酸基又は式(VIII)で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、nは10以上の整数を示す。式(VIII)中、Acはアセチル基、Xは水酸基又はアセチルアミノ基、R’はフェニレンを除く炭化水素を示す。)
・Poly(Neu5Acα2−3LacNAcβ−5−aminopentyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−6LacNAcβ−5−aminopentyl/ α−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−3LacNAcβ−5−aminopentyl/ α−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−6LacNAcβ−p−aminophenyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−3LacNAcβ−p−aminophenyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−6Lacβ−5−aminopentyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−3Lacβ−5−aminopentyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−6Lacβ−5−aminopentyl/ α−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−3Lacβ−5−aminopentyl/ α−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−6Lacβ−p−aminophenyl/ γ−PGA)
・Poly(Neu5Acα2−3Lacβ−p−aminophenyl/ γ−PGA)
(PGA:ポリグルタミン酸、Neu5Ac:シアル酸、LacNAc:N−アセチル−ラクトサミン、Lac:ラクトース)
シアロ糖鎖含有ポリマーを低コストで大量に調製するためには、用いる酵素が未精製品であることが望ましい。ただし、そのような粗酵素を合成反応に使用するためには、反応基質としてポリグルタミン酸に結合したオリゴ糖を用いることは好ましくない。したがって、シアロ糖鎖(シアリルオリゴ糖)を合成した後、最終段階でシアロ糖鎖とポリグルタミン酸とを縮合させることが望ましい。また、微生物由来の酵素は、動物由来酵素と比較して大腸菌等を宿主として大量に生産することが容易であるが、微生物由来の糖転移酵素を用いる場合は糖ペプチドや糖タンパク質を糖受容体とすることができないことが多い。このため、この点でもシアリルオリゴ糖を合成した後に、ポリグルタミン酸との縮合を行うことが望ましい。
(工程1)
糖転移酵素を用いて非還元末端にシアル酸を含む目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
(工程2)
工程1で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合させる工程
(工程3)
工程2で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程
工程1は、糖受容体(たとえは、糖−パラニトロフェノール、5−アミノアルキル化糖等)と糖供与体(各種糖ヌクレオチド)を含有する反応系に合目的な糖転移酵素を添加して、目的とするシアロ糖鎖を合成する工程である。
工程2は、工程1で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合させる工程である。
工程3は、工程2で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程である。
工程2で合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。
シアロ糖鎖含有ポリマーを固定化するための担体としては、特に制限されず、例えば、プレート、微粒子等が使用可能である。前記プレートとしては、例えば、ウエルを有するプレート(例えば、マイクロタイタープレート)、薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレート等があげられる。前記微粒子としては、例えば、ビーズ、チップ等があげられる。前記担体の材質は、特に制限されず、各種の紙、合成樹脂、金属、セラミックス、ガラス等が使用できる。その中でも特に、紫外線照射により、シアロ糖鎖含有ポリマーを担体に固定できる、ウエルを有するプレート(たとえば、Corning−Costar,Labcoat2503,Cambridge,MA)などが望ましい。
(2−3型)
ポリ[パラ−アミノフェニル(N−アセチルノイラミニル−(2−3)−N−アセチル−β−ラクトサミニド)−L−グルタミン−co−グルタミン酸][Poly(Neu5Acα2−3Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/Gln−co−Glu)]
(2−6型)
ポリ[パラ−アミノフェニル(N−アセチルノイラミニル−(2−6)−N−アセチル−β−ラクトサミニド)−L−グルタミン−co−グルタミン酸][Poly(Neu5Acα2−6Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/Gln−co−Glu)]
本発明の判別方法において、前記結合度合いの測定は、ELISA法、免役クロマトグラフィー法、免役凝集法など免疫学的測定法を応用して行うことが可能である。例えば、より高感度に測定するためには、サンドイッチ型の免疫学的測定法による測定を好適な例として挙げることができる。サンドイッチ型の免疫学的測定法では、前記ウイルスに対する抗ウイルス1次抗体と、前記抗ウイルス1次抗体に対する標識2次抗体もしくは標識プロテインAとを用いればよい。しかし、サンドイッチ型の免疫学的測定法に限定されるものではなく、前記担体として、ビーズ等の微粒子担体を使用することで、凝集の程度により前記結合度合いを測定することも可能である。さらに、免疫学的測定法以外の方法によるウイルス特異的成分の検出法(例えば、ウイルススパイクタンパク質であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの検出、それらが持つ生物活性の検出など)も利用可能であることも明らかである。
(1)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」((株)講談社、昭和54年5月1日発行)
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)((株)医学書院、1982年12月15日発行)
(3)臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」(臨床病理刊行会、1983年発行)
(4)「バイオテクノロジー事典」((株)シーエムシー、1986年10月9日発行)
(Immunochemical techniques (Part A))
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」
(Immunochemical techniques (Part B))
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」
(Immunochemical techniques (Part C))
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」
(Immunochemical techniques (Part D: Selected Immunoassay))
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」
(Immunochemical techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))
[(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行]
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例によって、なんら制限されない。
<HPLC>
サンプルはすべて0.45μlのフィルターで濾過した後、分析した。分析条件は下記に示したものを用いた。
カラム :Mightysil Si60(φ4.6×250mm)
カラム温度 :40℃
流速 :1.0ml/min
検出波長 :210nm
溶媒 :90% CH3CN
あるいは、
カラム :YMC Pro C18RS(φ6.0×150mm)
カラム温度 :40℃
流速 :1.0ml/min
検出波長 :300nm
溶媒 :20% MeOH−50mM TEAA
分析機器 :JEOL EX−270 NMR spectrometer,
JEOL lamda 500FT NMR spectrometer
Bruker AV−500 NMR spectrometer
外部標準 :TPS[sodium3−(trimethylsilyl)−propionate]
溶媒 :D2O
温度 :25℃あるいは60℃
サンプル管 :φ3または5mm
pNP:p−nitrophenol
Lac:Lactose(Galβ1−4Glc)
LacNAc:N−acetyllactosamine(Galβ1−4GlcNAc)
Neu5Ac:N−acetylneuraminic acid
CMP−NeuAc:CMP−N−acetylneuraminic acid
γ−PGA:γ−polyglutamic acids
BOP:Benzotriazol−1−yloxytris−(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
HOBt:1−Hydroxybenzotriazole hydrate
PBS:10 mM Phosphate buffered saline(pH7.4)
TPS:Sodium 3−(trimethylsilyl)−propionate
DP:Degree of polymerization(γ−ポリグルタミン酸重合度)
DS:Degree of substitution(DPを100%とした場合の糖残基置換度%)
IPTG:Isopropyl−beta−D−thiogalactopyranoside
EDTA:Ethylenediaminetetracetic acid
dATP:2’−deoxyadenosine 5´−triphosphate
dGTP:2’−deoxyguanosine 5´−triphosphate
dCTP:2’−deoxycytidine 5´−triphosphate
dTTP:2’−deoxythymidine 5´−triphosphate
Pd−C:Palladium on carbon
DMF:Dimethylformamide
Et3N:Triethyamine
pNPCF:para−Nitrophenyl choroformate
DMAP:N,N−dimethyl−4−aminopyridin
DMSO:Dimethyl sulfoxide
AP:Alkanine Phosphatase
β1,4−GalTの調製は、野口らの方法(特開2002−335988)に記載されている発現プラスミドpTGF−Aを用いて行った。pGTF−Aを保持する大腸菌JM109菌を、100μg/mlのアンピシリンを含有する2×YT培地50mlに植菌し、30℃で振とう培養した。菌体濃度が4×108個/mlに達した時点で、培養液に最終濃度0.1mMになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で16時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離(9,000×g,20分)により菌体を回収し、5mlの緩衝液(10mMトリス塩酸(pH8.0)、1mM EDTA)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離(20,000×g、10分)により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるβ1,4−GalT活性は特開2005−335988号公報に記載されている方法で測定した。
α2,3−SiaTの調製は、野口らの方法(特開2002−335988)に記載されている発現プラスミドpMal−siaTを用いて行った。pMal−siaTを保持する大腸菌JM109菌を、100μg/mlのアンピシリンを含有する2×YT培地50mlに植菌し、30℃で振とう培養した。菌体濃度が4×108個/mlに達した時点で、培養液に最終濃度0.1mMになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で16時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離(9,000×g,20分)により菌体を回収し、5mlの緩衝液(100mMトリス塩酸(pH8.0)、10mM MgCl2)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離(20,000×g、10分)により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるα2,3−SiaT活性は特開2005−335988号公報に記載されている方法で測定した。
フォトバクテリウム・ダムセラ subsp.damsela(NBRC No.15633又はATCC 33539)からの染色体DNAは次の手順により調製した。まず、該菌の凍結乾燥菌体を100μLの50mM トリス塩酸緩衝液(pH 8.0),20mM EDTAに懸濁したのちに10μLの10%SDS溶液を添加して室温で5分静置により溶菌させる。そして、この溶菌液からフェノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を20μLのTEバッファー(10mM トリス塩酸緩衝液(pH 8.0),1mM EDTA)に溶解することにより、該菌から染色体DNAを調製した。
プライマー(B):5’−AGGTCGCCACATTTACGATG−3’
プライマー(D):5’−TAAGTCGACTTAAGCCCAGAACAGAACATC−3’
100mMのTris−HCl(pH8.0),20mMのMgCl2,20mMのGlcNAc−pNP(p−nitrophenyl−GlcNAc),30mMのUDP−Gal,5.0%(v/v)Acetonitrile,0.1U/mlのβ1,4−GalTを含む溶液75mlを37℃で6時間インキュベーションした。この反応液に20mMのMnCl2,30mMのCMP−NeuAc,1U/mlのアルカリホスファターゼ(タカラバイオ社),0.22U/mlのα2,3−SiaTを添加して100mlにした。反応液は37℃で20時間インキュベーションした後、5分間煮沸し、遠心分離(8,000rpm, 20分)して上清を回収した。
1H−NMR(D2O):δ8.26(2H,d,J=9.3Hz),7.20(2H,d,J=9.3Hz),5.35(1H,d,J=8.4Hz),4.61(1H,d,J=7.9Hz),4.16−3.59(19H,m),2.78(1H,dd,J=4.6,12.5Hz),2.04(3H,s),2.02(3H,s),1.82(1H,t,J=12.2Hz)
100mMのTris−HCl(pH8.0),20mMのMgCl2,20mMのGlcNAc−pNP,30mMのUDP−Gal,5.0%(v/v)Acetonitrile,0.1U/mlのβ1,4−GalTを含む溶液75mlを37℃で6時間インキュベーションした。この反応液に20mMのMnCl2,30mMのCMP−NeuAc,1U/mlのアルカリホスファターゼ(タカラバイオ社),0.22U/mlのα2,6−SiaTを添加して100mlにした。反応液は37℃で20時間インキュベーションした後、5分間煮沸し、遠心分離(8,000rpm,20分)して上清を回収した。
1H−NMR(D2O):δ8.26(2H,d,J=9.3Hz),7.21(2H,d,J=9.3Hz),5.39(1H,d,J=8.5Hz),4.50(1H,d,J=7.9Hz),4.10(1H,dd,J=8.5,10.5Hz),4.04−3.56(18H,m),2.70(1H,dd,J=4.6,12.4Hz),2.06(3H,s),2.04(3H,s),1.75(1H,t,J=12.2Hz)
3’−SLN−pNP(503mg,0.6mmol)を蒸留水(30mL)に溶解し、10%Pd−C(50mg)、ギ酸アンモニウム(378mg,6.0mmol)を加え室温で攪拌した。2時間後にHPLC分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放系とし、室温で21時間攪拌した。Pd−Cをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水(3ml)−トリエチルアミン(1ml×1,0.5ml×2)で3回共沸して3’−SLN−pAP−Et3N塩とした後、DMF(3mL)で3回共沸脱水し、残渣をDMFの2.4mL溶液(0.25M)に調製した。
1H−NMR(D2O):δ6.97(2H,d,J=8.9Hz),6.88(2H,d,J=8.9Hz),5.04(1H,d,J=8.5Hz),4.60(1H,d,J=7.9Hz),4.14(1H,dd,J=3.1,9.9Hz),4.04−3.58(18H,m),2.78(1H,dd,J=4.6,12.5Hz),2.05(3H,s),2.05(3H,s),1.82(1H,t,J=12.2Hz)
6’−SLN−pNP(502mg,0.6mmol)を蒸留水(30mL)に溶解し、10%Pd−C(50mg)、ギ酸アンモニウム(378mg,6.0mmol)を加え室温で攪拌した。2.5時間後にHPLC分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放系とし、室温で21時間攪拌した。Pd−Cをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水(3ml)−トリエチルアミン(1ml×1,0.5ml×2)で3回共沸して6’−SLN−pAP−Et3N塩とした後、DMF(3mL)で3回共沸脱水し、残渣をDMFの2.4mL溶液(0.25M)に調製した。
1H−NMR(D2O):δ6.97(2H,d,J=8.8Hz),6.86(2H,d,J=8.8Hz),5.07(1H,d,J=8.5Hz),4.48(1H,d,J=7.9Hz),4.03−3.54(19H,m),2.69(1H,dd,J=4.6,12.4Hz),2.07(3H,s),2.04(3H,s),1.74(1H,t,J=12.2Hz)
αPGA(13mg,0.1mmol as glu unit),Et3N(17μl,0.12mmol)をDMF(1.0ml)に溶解し、0℃でDMAP(1.2mg,0.01mmol),pNPCF(24mg,0.12mmol)を加え、同温で1h攪拌した。3’−SLN−pAP(0.25M,0.4ml,0.1mmol)のDMF溶液およびHOBt(31mg,0.2mmol),Et3N(14μl,0.1mmol)をそれぞれ加え、室温で24時間攪拌した。反応液に水(200μl)を加えた後、1N−NaOH(1.6ml)を加えて、室温で1時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離(15,000rpm,5min)で除いた。
糖残基置換度(%)=(A×100)/(C−(3A/4)−4B)
1H−NMR(D2O,60℃):δ7.26(brs),6.93(brs),5.00(brs),4.57(brs),4.12(d,J=9.6Hz),4.07−3.50(m),2.78(d,J=8.2Hz),2.41(brs),2.29−1.92(m),1.81(t,J=12.0Hz)
αPGA(13mg,0.1mmol as glu unit),Et3N(17μl, 0.12mmol)をDMF(1.0ml)に溶解し、0℃でDMAP(1.2mg,0.01mmol),pNPCF(24mg,0.12mmol)を加え、同温で1時間攪拌した。6’−SLN−pAP(0.25M,0.4ml,0.1mmol)のDMF溶液およびHOBt(31mg,0.2mmol),Et3N(14μl,0.1mmol)をそれぞれ加え、室温で19時間攪拌した。反応液に水(200μl)を加えた後、1N−NaOH(1.6ml)を加えて、室温で1h攪拌した。生じた沈殿を遠心分離(15,000rpm,5min)で除いた。
糖残基置換度(%)=(A×100)/(C−(3A/4)−4B)
1H−NMR(D2O,60℃):δ7.28(brs),6.97(brs),5.06(brs),4.47(d,J=7.7Hz),4.00−3.55(m),2.71(dd,J=4.2,12,2Hz),2.41(brs),2.29−1.90(m),1.71(t,J=12.0Hz)
100mM Tris−HCl(pH8.0),20mM MgCl2,20mM GlcNAc−pNP,30mM UDP−Gal,5.0%(v/v) Acetonitrile,0.1U/ml β1,4−GalTを含む溶液75mlを37℃で6時間インキュベーションした後、5分間煮沸し、遠心分離(8,000rpm,20分)して上清を回収した。これをODSカラム(60mL,50mM炭酸水素トリエチルアミンで平衡化)に吸着させ、5−10%MeOH−50mM炭酸水素トリエチルアミンで目的物を溶出した。LN−pNP溶出フラクションを回収し、濃縮後、水で5回共沸し、炭酸水素トリエチルアミンを除去した。これを真空乾燥し(50℃、3h)、LN−pNPを307mg得た。
1H−NMR(D2O):δ8.25(2H,d,J=9.3Hz),7.20(2H,d,J=9.3Hz),5.36(1H,d,J=8.4Hz),4.53(1H,d,J=7.8Hz),4.12−3.57(12H,m),2.03(3H,s)
LacNAc−pNP(550mg,1.09mmol)を水−メタノール(10:1,44ml)に溶解し、10%パラジウム炭素触媒(55mg)、ギ酸アンモニウム(550mg,8.7mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌した。反応懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をODSカラム(80mL)に吸着し、5%メタノールで目的物を溶出した。溶媒を留去し、LN−pAPを513mg(99%)得た。
1H−NMR(D2O):δ6.94(2H,d,J=8.8Hz),6.81(2H,d,J=8.8Hz),5.02(1H,d,J=8.5Hz),4.51(1H,d,J=7.8Hz),4.02−3.54(12H,m),2.05(3H,s)
γPGA(6.5mg,0.043mmol as glu unit)を100mMのNa2CO3/NaHCO3バッファ,pH10.0(0.5ml)に溶解し、LN−pAP(60.0mg,0.126mmol)の100mM Na2CO3/NaHCO3バッファ溶液(0.4ml)およびHOBt(6.5mg,0.042mmol),BOP試薬(50.7mg,0.115mmol)のDMSO溶液(1.4ml)をそれぞれ加え、室温で24時間攪拌し反応させた。得られた反応液に2.3mlのPBS(10mM リン酸バッファ(pH7.5)および120mM NaCl,2.7mM KCl)を加えて、氷上で2時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離(15,000rpm,5min)で除いた。上清4.6mlにPBS1.5mlを添加して沈殿が生じないのを確認した後、エバポレーター濃縮(バス温40℃)で0.8mlとし、ゲル濾過(Sephadex G−50F,8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水10mlで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、1000mlの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収してエバポレーター濃縮で(バス温40℃)で0.8mlとし、凍結乾燥(棚温20℃、一晩)して19.0mgのLN−γPGAを得た。得られたLN−γPGAについて、1H−NMR分析を行い、下記式に基づき、糖残基置換度を求めた結果、50%と算出された(図14参照)。
糖残基置換度(%)=(A×100)/(B−(3A/4))
1H−NMR(D2O,60℃):δ7.30(brs),6.97(brs),5.05(brs),4.50−3.64(m),2.84(br),2.43−1.92(m)
50mM カコジル酸バッファ(pH6.0),2.5m MnCl2,8mg LacNAc−γPGA,30mM CMP−NeuAc,0.1%(w/v)BSA,20U/ml AP,0.02U/ml α2,3−SiaT(Rat,Recombinant,Spodoptera frugiperda,CALBICHEM社)を含む溶液1.05mlを37℃で44時間インキュベーションした後、3分間煮沸し、遠心分離(15,000rpm,5分)して上清を回収した。上清をゲル濾過(Sephadex G−50F,8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水8mlで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、1000mlの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム(Dowex AG 50W−8X,3ml)にかけた。吸着後30mlの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した(45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で(バス温40℃)で0.8mlとし、凍結乾燥(棚温20℃、一晩)して9.0mgの3’−SLN−γPGAを得た。得られた3’−SLN−γPGAについて、1H−NMR分析を行い、下記式に基づき、シアリル化率を求めた結果、99%と算出された(図15参照)。
シアリル化率(%)=(B×100)/(A/4))
1H−NMR(D2O,60℃):δ7.35(brs),7.03(brs),5.12(brs),4.58(d,J=7.6Hz),4.13−3.54(m),2.77(d,J=12,0Hz),2.53−1.91(m),1.80(t,J=12.1Hz)
50mM カコジル酸バッファ(pH6.0),2.5m MnCl2,8mg LacNAc−γPGA,30mM CMP−NeuAc,0.1%(w/v)BSA,20U/ml AP,0.02U/ml α2,6−SiaT(Rat,Recombinant,Spodoptera frugiperda,CALBICHEM社)を含む溶液1.05mlを37℃で44時間インキュベーションした後、3分間煮沸し、遠心分離(15,000rpm,5分)して上清を回収した。上清をゲル濾過(Sephadex G−50F,8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水8mlで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、1000mlの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム(Dowex AG 50W−8X,3ml)にかけた。吸着後30mlの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した(45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で(バス温40℃)で0.8mlとし、凍結乾燥(棚温20℃、一晩)して7.4mgの6’−SLN−γPGAを得た。得られた6’−SLN−γPGAについて1H−NMR分析を行い、下記式に基づき、シアリル化率を求めた結果、99%と算出された(図16参照)。
シアリル化率(%)=(B×100)/(A/4))
1H−NMR(D2O,60℃):δ7.36(brs),7.05(brs),5.14(brs),4.49−4.39(m),4.16(brs),4.01−3.55(m),2.71(d,J=9.9Hz),2.59−1.81(m),1.71(t,J=12.1Hz)
(1)酵素
Trichoderma reesei由来セルラーゼ(cellulase XL−522)は、ナガセケムテックスより購入した。α2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼ(Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda)、α2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼ(Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda)は、CALBIOCHEM社より購入した。アルカリフォスファターゼは、Boehringer Mannheim社より購入した。
Lactose Monohydrate、5−amino−1−pentanolは、和光純薬(株)より購入した。γ−PGA、CMP−Neu5Ac、LacNAcは市販品を必要より精製して使用した。
Trifluoroacetic Anhydride、MnCl2・4H2Oは、和光純薬(株)より購入した。BOP、HOBt、およびBSAは、Sigma−Aldrich社より購入した。
<Lacβ−pNP加水分解活性>
T. reesei由来セルラーゼの酵素活性測定法はLacβ−pNPからのpNPの遊離量を定量して行った。10mM Lacβ−pNP(25μl)と50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0(70μl)とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を100μlとし、40℃で20分間反応を行った。経時的に反応液から10μlとり、予め96穴マイクロプレートに分注しておいた1.0M炭酸ナトリウム溶液(190μl)と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い405nmにおける吸光度を測定し、遊離したpNPを定量した。酵素活性1Uは、1分間に1μmolのpNPを遊離させる酵素量と定義した。
T.reesei由来セルラーゼ中に夾雑するβ−D−ガラクトシダーゼ活性測定法はGalβ−pNPからのpNPの遊離量を定量して行った。10mM Galβ−pNP(25μl)と50mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0(25μl)とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を100μlとし、40℃で20分間反応を行った。経時的に反応液から10μlとり、予め96穴マイクロプレートに分注しておいた1.0M炭酸ナトリウム溶液(190μl)と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い405nmにおける吸光度を測定し、遊離したpNPを定量した。酵素活性1Uは、1分間に1μmolのpNPを遊離させる酵素量と定義した。
<T. reesei 由来セルラーゼの部分精製>
T.reesei由来セルラーゼの粗酵素溶液(1000ml,875kU)を25%飽和硫安で処理後、高速微量遠心機(KUBOTA 1720;RA−200J ローター使用、KUBOTA製)を用いて4℃で遠心分離を行い(6010g×20min)上清を回収した。これを、75%飽和硫安で処理し、同様の条件で遠心分離後、生じた沈殿を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に溶解した。分画分子量30000の限外ろ過膜(PM−30,Millipore Corp.)を用いて脱塩後、凍結乾燥を行い、7.8gの酵素粉末を得た。そのうち1.0gを10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したDEAE−Sepharose Fast Flowカラムクロマトグラフィー(φ2.6×18cm)に供した。カラムを1000mlの同緩衝液で洗浄後、600mlの500mM NaClを含む同緩衝液でステップワイズ溶出を行った。カラム吸着部を限外ろ過により脱塩、濃縮後、凍結乾燥を行い、部分精製酵素(0.7g,0.70U/mg)を得た。
部分精製酵素(50mg,Lacβ−pNP加水分解活性 35U,Galβ−pNP加水分解活性 19U)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.0(1.0ml)に溶解し、予め同溶媒で平衡化しておいたGal−amidineアフィニティーカラムクロマトグラフィー(φ1.2×1.7cm)に供した。流速10ml/hにおいて各エッペンドルフチューブに1mlずつ分取して、非吸着部を50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.0(30ml)で洗浄した。吸着部を1.0M NaClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.0(20ml)で溶出し、さらに0.5M methyl β−Galを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0(10ml)で溶出した。タンパク質の検出は280nmの吸光度を測定することで行い、Lacβ−pNPおよびGalβ−pNPの加水分解活性を測定した。それぞれの画分を分画分子量30000の限外ろ過膜(PM−30, Millipore Corp.)を用いて濃縮後、凍結乾燥を行い、非吸着部よりβ−D−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素(Lacβ−pNP加水分解活性32U,Galβ−pNP加水分解活性0.3U)を得た(Table.1)。なお、以後の反応には全てβ−D−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素を用いた。
(X)
はじめに、5−amino−1−pentanol(10g,97mmol)にピリジン(20ml)を加えて溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルオロ酢酸(25ml,180mmol)を滴下しながら添加し反応を開始させた。反応開始から5分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:アセトン=8:2)で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加えて反応を停止させ、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液200mlを加えて反応液を中和した。反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を3回程度繰り返したのち、反応液をアセトンで溶解し、多量に存在する炭酸水素ナトリウムを析出させた。これをろ過後、濃縮し、クロロホルム:アセトン=8:2で平衡化(10ml/min)したシリカゲルカラムクロマトグラフィー(φ4.5×35cm)に供した。約25mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はTLC(展開溶媒 クロロホルム:アセトン=8:2)で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である5−Trifluoroacetamido−1−pentanolを収量18g、収率94%で得た。これを1H−NMRに供した。
(5−Trifluoroacetamido−1−pentanolのNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ3.59(t, 2H, H−α), 3.33(t, 2H, H−e), 1.65−1.48(2H×2, H−b, d), 1.36(2H, H−c)
基質としてlactose(54.3g,151mmol)と5−Trifluoroacetamido−1−pentanol(30.0g,151mmol)とを50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0(151ml)に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したT. reesei由来セルラーゼ(4500U)を加えて反応を開始させた。反応を追跡するために反応液10μlを経時的に採取し、190μlの脱塩水を加えた後、100℃で10分間煮沸して反応を停止させ、0.45μmフィルターでろ過した後、ろ液をHPLCにより分析した。反応液を激しく振とう(200rpm)し、40℃で120時間反応を行った。その後、100℃、10分間の煮沸により反応を停止させた。反応液を濃縮後、クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5で平衡化(10ml/min)したSilica Gel 60N カラムクロマトグラフィー(φ4.5×50cm)に供し同溶媒で溶出し、23ml/tubeずつ分取してTLC(クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して1H−NMRにより構造解析した結果、5−Trifluoroacetamidopentyl β−lactosideを収量849mg、収率1.0%で得た。
(5−Trifluoroacetamidopentyl β−lactosideのNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.48(d, 1H, H−1), 4.45(d, 1H, H−1’), 3.34(t, 2H, H−e), 3.32(1H, H−2), 1.71−1.57(2H×2, H−b, d), 1.42(2H, H−c)
基質としてN−acetyllactosamine(20.0g,52.2mmol)と5−Trifluoroacetamido−1−pentanol(15.6g,78.4mmol)とを100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0(52.2ml)に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したT. reesei由来セルラーゼ(6200U)を加えて反応を開始させた。反応を追跡するために反応液10μlを経時的に採取し、190μlの脱塩水を加えた後、100℃で10分間煮沸して反応を停止させ、0.45μmフィルターでろ過した後、HPLCにより分析した。反応液を激しく振とう(200rpm)し、40℃で144時間反応を行った。その後、100℃、10分間の煮沸により反応を停止した。反応液を濃縮後、水で平衡化(5.0ml/min)した活性炭−セライトクロマトグラフィー(φ4.5×100cm)に供した。まず、0%(5.0L)−25%(5.0L)のエタノール直線濃度勾配法により、基質として用いたLacNAcを溶出した。60ml/tubeずつ分取後、各フラクションをN−アセチル基に由来する210nmの吸光度で測定した。LacNAcを含む画分を濃縮することで、LacNAcを回収量17.2g、回収率86%で得た。次に80%エタノール(5.0L)に切り換え吸着部を溶出した。60ml/tubeずつ分取後、各フラクションを210nmの吸光度で測定した。続いて、目的画分を含む画分を濃縮し、クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5で平衡化(10ml/min)したSilica Gel 60N カラムクロマトグラフィー(φ4.5×50cm)に供し同溶媒で溶出し、28ml/tubeずつ分取してTLC(クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して1H−NMRにより構造解析した結果、5−Trifluoroacetamidopentyl β−N−acetyllactosaminideを収量322mg、収率1.1%で得た。
(5−Trifluoroacetamidopentyl β−N−acetyllactosaminideのNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.51(d, 1H, H−1), 4.46(d, 1H, H−1’), 3.31(t, 2H, H−e), 2.02(s, 3H, −NHAc), 1.57(2H×2, H−b, d), 1.34(2H, H−c)
5−Trifluoroacetamidopentyl β−lactoside(104mg,0.19mmol)に1.0M NaOH(1.2ml)を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から30分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化(1.0ml/min)したSephadex G−25カラムクロマトグラフィー(φ2.5×48cm)に供した。約2.0mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5)でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である5−aminopentyl β−lactosideを収量82mg、収率96%で得た。これを1H−NMRに供した。
(5−aminopentyl β−lactosideのNMR)
1H−NMR(D2O, 500 MHz):δ4.49(d, 1H, H−1), 4.45(d, 1H, H−1’), 3.30(t, 1H, H−2), 2.97(t, 2H, H−e), 1.67(2H×2, H−b, d), 1.47(2H, H−c)
5−Trifluoroacetamidopentyl β−N−acetyllactosaminide(100mg,0.18mmol)に1.0M NaOH(1.2ml)を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から30分おきにTLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。1時間後、TLCで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化(1.0ml/min)したSephadex G−25カラムクロマトグラフィー(φ2.5×55cm)に供した。約2.0mlごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はN−アセチル基に由来する210nmの吸光度と、TLC(展開溶媒 クロロホルム:メタノール:水=6:4:1)でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminideを収量82mg、収率99%で得た。これを1H−NMRに供した。
(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminideのNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.52(d, 1H, H−1), 4.47(d, 1H, H−1’), 2.77(t, 2H, H−e), 2.03(s, 3H, −NHAc), 1.54(2H×2, H−b, d), 1.35(2H, H−c)
γ−PGA(M.W.:77000,16.5mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(1.3ml)に溶解後、予めDMSO(3.5ml)に溶解しておいたBOP(130mg)、HOBt(16mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に5−aminopentyl β−lactoside(140mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3pH10.0(0.9ml)に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で24時間反応を行った。反応終了後、反応液が7.5mlになるようにPBSを添加した。その後、PD−10カラム1本あたり2.5mlの反応液をPBSで平衡化したPD−10(φ1.7×5.0cm, Sephadex G−25)カラムに供し、3.5mlのPBSでPoly(5−aminopentyl β−lactoside / γ−PGA)を溶出した。次にこの画分を2.5Lの超純水に対して3日間透析した。その間、超純水の交換を6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供した。また、糖残基置換度(%)の計算は1H−NMRより、γ−PGAのβおよびγ位プロトンの積分比(A)と5−aminopentyl β−lactosideのアグリコン部位のプロトン6個分の積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した(図17)。その結果、糖残基置換度69%のPoly(5−aminopentyl β−lactoside / γ−PGA)を収量29.6mgで得た。
(Poly(5−aminopentyl β−lactoside / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 500 MHz):δ4.47(d, 1H, H−1), 4.45(d, 1H, H−1’), 4.34−4.22(1H, H−α), 3.31(t, 1H, H−2), 3.20(2H, H−e), 2.42(2H, H−γ), 2.20−1.98(2H, H−β), 1.63(2H, H−d), 1.52(2H, H−b), 1.35(2H, H−c)
γ−PGA(M.W.:77000,15.1mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(1.3ml)に溶解後、予めDMSO(3.5ml)に溶解しておいたBOP(119mg)、HOBt(15mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide(140mg)を100mM Na2CO3/NaHCO3 pH10.0(0.9ml)に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で24時間反応を行った。反応終了後、反応液が7.5mlになるようにPBSを添加した。その後、PD−10カラム1本あたり2.5mlの反応液をPBSで平衡化したPD−10(φ1.7×5.0cm, Sephadex G−25)カラムに供し、3.5mlのPBSでPoly(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide / γ−PGA)を溶出した。次にこの画分を2.5Lの超純水に対して3日間透析した。その間、超純水の交換を6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1H−NMRによる構造解析に供した。また、糖残基置換度(%)の計算は1H−NMRより、γ−PGAのβおよびγ位プロトンの積分比(A)と5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminideのアグリコン部位のプロトン6個分の積分比(B)をに示す式にあてはめ算出した(図18)。その結果、糖残基置換度61%のPoly(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide / γ−PGA)を収量17.0mgで得た。
(Poly(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.51(d, 1H, H−1), 4.47(d, 1H, H−1’), 4.30−4.21(1H, H−α), 3.18(2H, H−e), 2.40(2H, H−γ), 2.18−1.98(2H, H−β), 2.02(s, 3H, −NHAc), 1.52(2H×2, H−b, d), 1.35(2H, H−c)
受容体基質としてPoly(5−aminopentyl β−lactoside / γ−PGA)[69%, 210kDa]5.5mgをLac−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl22.5mM、BSA0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。シアリル化率は1H−NMRより、糖鎖由来のGlc(H−2)プロトンの積分比と5−aminopentyl β−lactosideのアグリコン部位のプロトン2個分の積分比の和(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンの積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率69%のPoly(Neu5Acα2−3Lac β−5−aminopentyl / γ−PGA)を収量6.7mgで得た(図19)。シアリル化率は、次の式により求めた。
(Poly(Neu5Acα2−3Lac β−5−aminopentyl / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.53(d, 1H, H−1), 4.47(d, 1H, H−1’), 4.35−4.19(1H, H−α), 3.30(t, 1H, H−2), 3.20(2H, H−e), 2.76(dd, 1H, H−3’’eq), 2.41(2H, H−γ), 2.20−1.98(2H, H−β), 2.03(s, 3H, −NHAc’’), 1.82(t, 1H, H−3’’ax), 1.63(2H, H−d), 1.53(2H, H−b), 1.36(2H, H−c)
受容体基質としてPoly(5−aminopentyl β−lactoside / γ−PGA)[69%, 210kDa]5.5mgをLac−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl22.5mM、BSA0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。シアリル化率は1H−NMRより、糖鎖由来のGlc(H−2)プロトンの積分比と5−aminopentyl β−lactosideのアグリコン部位のプロトン2個分の積分比の和(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンの積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率57%のPoly(Neu5Acα2−6Lac β−5−aminopentyl /γ−PGA)を収量6.8mgで得た(図20)。
(Poly(Neu5Acα2−6Lac β−5−aminopentyl / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.47(d, 1H, H−1), 4.43(d, 1H, H−1’), 4.32−4.20(1H, H−α), 3.32(t, 1H, H−2), 3.20(2H, H−e), 2.71(dd, 1H, H−3’’eq), 2.41(2H, H−γ), 2.20−1.98(2H, H−β), 2.03(s, 3H, −NHAc’’), 1.75(t, 1H, H−3’’ax), 1.63(2H, H−d), 1.52(2H, H−b), 1.35(2H, H−c)
受容体基質としてPoly(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide / γ−PGA)[61%, 210kDa]5.0mgをLacNAc−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl22.5mM、BSA0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。シアリル化率は1H−NMRより、5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminideのアグリコン部位のプロトン2個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンの積分比(B)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率96%のPoly(Neu5Acα2−3LacNAc β−5−aminopentyl / γ−PGA)を収量6.4mgで得た(図21)。
(Poly(Neu5Acα2−3LacNAc β−5−aminopentyl / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 270 MHz):δ4.53(d, 1H, H−1), 4.47(d, 1H, H−1’), 4.35−4.20(1H, H−α), 3.18(2H, H−e), 2.73(dd, 1H, H−3’’eq), 2.40(2H, H−γ), 2.20−1.98(2H, H−β), 2.03(s, 3H×2, −NHAc, −NHAc’’), 1.82(t, 1H, H−3’’ax), 1.52(2H×2, H−b, d), 1.30(2H, H−c)
受容体基質としてPoly(5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminide / γ−PGA)[61%, 210kDa]5.0mgをLacNAc−単位当たり8.0mM、供与体基質としてCMP−Neu5Ac 16.0mM、MnCl22.5mM、BSA0.1%、MOPS buffer(pH7.4)50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し10U/mlのアルカリフォスファターゼおよび40mU/mlのα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼを添加し、37℃で48時間反応を行った。シアリル化率は1H−NMRより、5−aminopentyl β−N−acetyllactosaminideのアグリコン部位のプロトン2個分の積分比(A)と、Neu5Acに特徴的な3位エクアトリアルプロトンの積分比(B)、3位アキシャルプロトンの積分比(C)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率97%のPoly(Neu5Acα2−6LacNAc β−5−aminopentyl / γ−PGA)を収量6.1mgで得た(図22)。
(Poly(Neu5Acα2−6LacNAc β−5−aminopentyl / γ−PGA)のNMR)
1H−NMR(D2O, 500 MHz):δ4.55(d, 1H, H−1), 4.45 (d, 1H, H−1’), 4.33−4.21(1H, H−α), 3.19 (2H, H−e), 2.67(dd, 1H, H−3’’eq), 2.40 (2H, H−γ), 2.18−1.98(2H, H−β), 2.06 (s, 3H, −NHAc’’), 2.03(s, 3H, −NHAc), 1.74 (t, 1H, H−3’’ax), 1.56−1.51 (2H×2, H−b, d), 1.31 (2H, H−c)
参考例の方法で調製した下記の2種類のシアル糖鎖含有ポリマー(sialyl−glycopolymer)をミクロタイタープレートに下記の方法により吸着させた。まず、96穴ミクロタイタープレート(Corning−Costar,Labcoat2503,Cambridge,MA)に、前記シアル糖鎖含有ポリマーのPBS溶液を100μlづつ加えた(倍々希釈:200μg/ml、PBSを最大濃度として倍々希釈する)。つぎに、前記プレートを、室温に1時間放置後、紫外線照射装置(VILBER LOURMAT,France)のガラス面上に前記プレートを置き、紫外線(254nm)を1分間照射した。照射後、ウエル内のシアル糖鎖含有ポリマー溶液を、前記プレートを斜めにして捨てた。そして、前記プレートに2%BSA(Sigma,Grade96%)を100μl加え、室温で1時間ブロッキング処理した。
(2−3型)
Poly(Neu5Acα2−3Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/α−PGA)
(2−6型)
Poly(Neu5Acα2−6Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/α−PGA
各種シアロ糖鎖結合ポリグルタミン酸ポリマー(2μg/ml)をPBS液で倍々希釈後、マイクロプレート(Corning−Costar; Labcoat 2503, Cambrige, MA)の各ウエルに100μlずつ加えた。つぎに、前記プレートを4℃に2時間静置後、紫外線照射装置のガラス面上に前記プレートを置き、紫外線(254nm)を10分間照射した。照射後、ウエル内のシアロ糖鎖含有ポリマー溶液を捨て、各ウエルに2%BSA(Albumin bovine Fraction V, Sigma, St. Louis, MO)もしくは0.1%ブロックエース(大日本製薬)250μlを加え、4℃に一晩ブロッキング処理した。その後、各ウエルを250μlのPBS液で5回洗浄し、エーテル処理で不活性化したインフルエンザウイルス(トリA型ウイルス:A/duck/Hong Kong/313/4/78(H5N3), 128HAU;ヒトA型ウイルス:A/Memphis/1/71(H3N2), 128 HAU)のPBS懸濁液を50μl各ウエルに加え、4℃に5時間放置した。各ウエルを0.01% Tween20含有PBS液250μlで5回洗浄後、0.1%BSAもしくは0.01%ブロックエースで1000倍に希釈した抗インフルエンザウイルスウサギ抗血清を各ウエルに50μlずつ加え、4℃に2時間静置した。各ウエルを0.01%Tween20含有PBS液250μlで5回洗浄後、0.1%BSAもしくは0.01%ブロックエースで1000倍に希釈したHRP標識プロティンAを各ウエルに50μlずつ加え、4℃に2時間静置した。各ウエルを0.01%Tween20含有PBS液250μlで5回洗浄後、100μlの基質溶液(O−phenylenediamine 4mg,0.01%H2O2含有100mMクエン酸リン酸緩衝液pH5.0)を加え、室温で15−20分間放置後、1N硫酸水溶液を各ウエルに50μl加え反応を停止した。各ウエルの発色を492nm(対照波長630nm)にて測定した。
(1)パラ−ニトロフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニド[Galβ1−4GlcNAcβ−pNP]の調製
2.4gの乳糖および2.3gのパラ−ニトロフェニルトルN−アセチルグルコピラノシド(シグマ社)を、20%アセトニトリルを含む20mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)に溶解し(12mL)、20単位のバチルスサーキュランス由来β−ガラクトシダーゼ(大和化成社)を加え40℃で6時間反応させる。その後、反応液を95℃、10分間加熱して反応を停止させた後に遠心し、上清を回収する。上清液をトヨパールHW−40Sカラム(商品名、5×100cm、東ソー社)に供し、溶出液を分画採取し(20mL/本)、その一部を300nmの吸光度を測定してパラ−ニトロフェニル残基を定量し、さらにフェノール−硫酸法による485nmの吸光度を測定し、炭化水素を定量する。パラ−ニトロフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニド含む画分(120mL)を集めて採取し、濃縮後、メタノールを徐々に添加する。析出した沈殿を濾取し、減圧乾燥して292mgのパラ−ニトロフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニドの結晶を得る。
前記(1)で得られたパラ−ニトロフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニド100mgを20mLのメタノールに溶解し、その溶液にギ酸アンモニウム300mgおよび10%パラジウム/活性炭末20mgを加えて、40℃で反応を行う。その際、反応を高速液体クロマトグラフィーで経時的に追跡する。40分後に、パラ−ニトロフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニドのピークが消滅したことを確認後、反応液を室温に戻して反応を停止する。反応液を順次、セライト、濾紙により濾過し、濾液は濃縮後、予め12%メタノールで平衡化したクロマトレクス−ODS DM1020Tカラムクロマトグラフィーに供する。溶出液を分画採取し(30mL/本)、210nm、300nmの両吸収の一致したアミノ還元二糖誘導体と予想されるピーク画分を濃縮、凍結乾燥し、70.7mgのパラ−アミノフェニルトルN−アセチル−β−ラクトサミニドの結晶を得る。
α−ポリ−L−グルタミン酸ナトリウム(シグマ社)20mgを0.4mLのジメチルスルホキシドに溶解し、予め0.2mLのジメチルスルホキシドに溶解したヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム160mgと1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物18mgを添加し、室温下20分間攪拌する。さらに前記(2)で得られたパラ−アミノフェニル−N−アセチル−β−ラクトサミニド60mgをジメチルスルホキシド0.4mLに溶解して添加し、室温下24時間攪拌する。その反応液をセファデックスG−25カラム(商品名、2.0×26cm、アマシャムファルマシアバイオテク社)に供し、0.1M塩化ナトリウムを含む0.02Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)で溶出する(流速1.0mL/分)。溶出液を分画採取し(2.0mL/本)、その一部をフェノール−硫酸法による485nmの吸光度を測定し、炭化水素を含む画分を集めて採取する(13mL)。その溶液を、YM−3メンブランを装着した限外ろ過器(アミコン社)で濃縮し(2kg/cm2)、さらに凍結乾燥し、46mgの標品を得る。
前記(3)で得られたポリ(パラ−アミノフェニルトル−N−アセチル−β−ラクトサミニド−L−グルタミン−co−グルタミン酸)[Poly(Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/α−PGA)]10mgとシチジン5’−モノホスフォ−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム15mg、さらに250mM塩化マンガン10μLと10%牛血清アルブミン10μLおよびアルカリホスファターゼ2μLを、50mMカコジル酸バッファー(pH6.0)950μLに溶解し、30ミリ単位のα2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼ(ラットリコンビナント、Spodoptera frugiperda由来、カルビオケム社)を添加して37℃で48時間反応を行なう。この反応液をセファデックスG−25カラム(2.0x26cm、アマシャムファルマシアバイオテク社)に供し、10.9mgの最終生成物を得る。
前記(3)で得られたポリ(パラ−アミノフェニルトル−N−アセチル−β−ラクトサミニド−L−グルタミン−co−グルタミン酸)[Poly(Galβ1−4GlcNAcβ−pAP/α−PGA)]5mgとシチジン5’−モノホスフォ−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム7.5mg、さらに250mM塩化マンガン5μLと10%牛血清アルブミン5μLおよびアルカリホスファターゼ1μLを、50mMカコジル酸バッファー(pH6.0)474μLに溶解し、15ミリ単位のα2,6−(N)−シアリルトランスフェラーゼ(ラット肝由来、カルビオケム社)を添加して37℃で48時間反応を行なう。この反応液をセファデックスG−25カラム(商品名、2.0×26cm、アマシャムファルマシアバイオテク社)に供し、6.3mgの最終生成物を得る。
Claims (10)
- インフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法であって、
下記式(I)または下記式(III)で表されるγ−ポリグルタミン酸に結合させた2種類以上の異なるシアロ糖鎖含有ポリマーを、複数のウエルを有するプレートにおいて、前記ウエル毎、あるいは前記ウエルの列毎に異なる種類の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを固定し、または、異なる種類の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを2種類以上の担体のそれぞれの表面に固定して、前記シアロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウイルスサンプルを接触させ、それぞれの結合度合いを測定し、
それらの結果を比較してインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別することを特徴とする、インフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
- 前記結合度合いの測定が、前記ウイルスに対する抗ウイルス抗体を用いた免疫学的測定法による測定である請求項1記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
- 2種類以上の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを含む溶液を前記1つの担体に接触させ、または、異なる前記シアロ糖鎖含有ポリマーを含む複数の溶液を2種類以上の担体の何れかに接触させ、この状態で紫外線を照射した後、前記液を除去することにより、前記シアロ糖鎖含有ポリマーを前記担体に固定する請求項1または2に記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
- 前記インフルエンザウイルスは、エーテル処理で不活性化されている請求項1乃至3の何れか一に記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
- γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーの製造法であって、
(工程1)
糖転移酵素を用いて目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
(工程2)
工程1で合成したシアロ糖鎖とγ−ポリグルタミン酸とを化学的に結合させる工程
(工程3)
工程2で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするγ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程を含み、
前記γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーは、下記式(I)または下記式(III)で表されるγ−ポリグルタミン酸に結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーであるγ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーの製造法。
- 前記担体が複数のウエルを有し、異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーが複数固定されている請求項8記載の担体。
- 請求項1又は2記載のウイルスのレセプター糖鎖認識特異性又はその変異を判別する方法に用いるキットであって、請求項8又は9記載の担体を含むキット。
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