JP6403839B2 - コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)由来エンドグリコシダーゼ - Google Patents
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Description
[1] 以下の(a)又は(b)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖(アスパラギン結合型糖鎖)を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼ:
(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるエンドグリコシダーゼ;
(b) 配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼ。
[2] 以下の(a)又は(b)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼをコードするDNA:
(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるエンドグリコシダーゼ;
(b) 配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼ。
[3] 以下の(c)又は(d)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼをコードするDNA:
(c) 配列番号1で表される塩基配列を含むDNA;
(d) 配列番号1で表される塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[4] 以下の(e)又は(f)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素:(e) 配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる酵素;
(f) 配列番号4で表されるアミノ酸配列において180番目のグルタミン以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素。
[5] 以下の(e)又は(f)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素をコードするDNA:
(e) 配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる酵素;
(f) 配列番号4で表されるアミノ酸配列において180番目のグルタミン以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素。
[6] 以下の(g)又は(h)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素をコードするDNA:
(g) 配列番号3で表される塩基配列を含むDNA;
(h) 配列番号3で表される塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、第538番目から540番目の塩基配列がCAAであり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素をコードするDNA。
[7] [2]又は[3]のDNAを含む発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを含む、[1]のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼを作製する方法。
[8] [5]又は[6]のDNAを含む発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを含む、[4]のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素を作製する方法。
[9] [1]のエンドグリコシダーゼを糖タンパク質と接触させ、糖鎖を切断し、遊離糖鎖を得ることを含む、遊離糖鎖を作製する方法。
[10] [4]の酵素をタンパク質及びオキサゾリン化糖鎖と接触させ、糖鎖をタンパク質に転移させることを含む、糖タンパク質の作製方法。
本発明は糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖(アスパラギン結合型糖鎖)の根元部分に存在するジアセチルキトビオース部分(GlcNAc-GlcNAc)を加水分解により切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(エンドグリコシダーゼ)である。N-結合型糖鎖は、タンパク質のアミノ酸配列のAsn-任意のアミノ酸-Ser/Thrで表される糖鎖結合配列のアスパラギン残基に結合する。
さらに、本発明は配列番号2に表されるアミノ酸配列の180番目のアスパラギン酸(N)をグルタミン(Q)に置換したアミノ酸配列を有し、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素を含む。
本発明の糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼであるEndo-CCは、コプリナス・シネレウスを培養し、製造することができ、コプリナス・シネレウスの培養液等の培養物から公知の方法を用いて単離することができる。また、本発明の糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼは、該酵素をコードするDNAを宿主微生物に導入し、該微生物を培養することにより組換え酵素として製造することができる。例えば、適当なベクターに本発明のDNAを連結(挿入)することにより発現ベクターを作製し、該発現ベクターを宿主微生物に導入し宿主微生物を形質転換すればよい。
本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のDNAを発現し得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌としては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・卵巣(CHO)細胞、サルCOS細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
本発明のエンドグリコシダーゼEndo-CCは、糖タンパク質のN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有する。例えば、均一な糖ペプチドや糖タンパク質に本発明のEndo-CCを作用させることにより、糖鎖が切断され、均一な遊離の糖鎖を得ることができる。
遺伝子を単離したCoprinus cinerea (Coprinopsis cinerea)はATCC (American Type Culture Collection)から購入した(ATCC No. MYA-4618)。
逆転写反応する前にRNA溶液のABS260の吸光度を測定し、RNAの濃度をあらかじめ求めておき、またRNA溶液を65℃で5分間インキュベートし、その後氷上で急冷するという操作を行った。逆転写反応は、37℃,15min;50℃,5min;98℃,5min;4℃,holdという順で温度インキュベートして行った。
50℃で15minインキュベート、反応終了後すぐに大腸菌XL1-Blueに形質転換して、大腸菌発現ベクターを得た。
5mlのMMI培地+Amp(アンピシリン)+Cm(クロラムフェニコル)培地に接種し、37℃で12時間培養した。この培養液を前培養液とした。次いで、250mlのLB培地+Amp+Cm液体培地にOD600=0.05となるように前培養液を接種し、15℃で48時間培養した。
実施例2で作製したEndo-CCを用いて基質特異性を測定した。この際、比較のためにEndo-M(東京化成工業製品)を用いた。
実施例2で作製したEndo-CCとSGP(シアリルグリコペプチド、図3上)(伏見製薬所)及び糖鎖のアクセプターであるGlcNAc、D-Glucose(グルコース)を混合し、SGPが加水分解されて生じたSG(シアリル化糖鎖:図3下)がGlcNAc、D-Glcoseに転移して、SG-GlcNAc、SG-D-Glucoseが生成するかどうかをTLC(Merck Millipore社 シリカゲル60)で確認を行った。SGP及びSGの構造を図3に示す。
展開溶媒は、プロパノール;酢酸;水=3:2:2で、オルシノール硫酸法で発色をさせた。
この結果は、本発明のEndo-CCが糖転移活性を有することを示す。
改変型Endo-CC(N180Q株)の糖転移活性を測定した。
オキサゾリン化SGは野口らの方法(Helvetica Chimica Acta, 2012)に従い行った。
SG 12.3 mgを0.5 M CDMBI 61μlに溶解し、4℃に冷却した。その後、1.5 Mリン酸カリウム緩衝液61μlを加え、4℃で2時間撹拌した。4℃、14000 rpmで15分間遠心分離した後、0.2μmのフィルターでろ過し、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーを行い、目的物の画分を回収した。
溶媒:蒸留水100%
温度:30℃
流速:1.0 ml/min
検出器:UV(214 nm)
機器:ポンプ HITACHI L-2130
カラムヒーター スガイケミー U-620
UV GLサイエンス UV702
Endo-CCの糖転移活性の確認は以下のように行った。終濃度100 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)、1 0 mMオキサゾリン化SG、4 mMのアクセプター分子(p-ニトロフェニルN-アセチルグルコサミン)、及び野生株若しくはN180Q株Endo-CC酵素液(酵素量24.5μg)を含む反応液(計200μl)を30℃で3時間インキュベートし、99℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を以下の条件で高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶媒:
A液:0.1%TFA
B液:0.1%TFAを含むアセトニトリル
A液:B液=90:10で溶出
温度:30℃
流速:1.0 ml/min
検出器:UV(300 nm)
機器:ポンプ HITACHI L-2130
カラムヒーター スガイケミー U-620
UV GLサイエンス UV702
Claims (4)
- 以下の(e)又は(f)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素:
(e) 配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる酵素;
(f) 配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素(但し、180番目のアミノ酸はグルタミン)。 - 以下の(e)又は(f)のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素をコードするDNA:
(e) 配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる酵素;
(f) 配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素(但し、180番目のアミノ酸はグルタミン)。 - 請求項2に記載のDNAを含む発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を培養することを含む、請求項1記載のコプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN-結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素を作製する方法。
- 請求項1記載の酵素を、タンパク質及びオキサゾリン化糖鎖と接触させ、糖鎖をタンパク質に転移させることを含む、糖タンパク質の作製方法。
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