KR20020029138A - 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디의 제조방법 - Google Patents

서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디의 제조방법 Download PDF

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김중수
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복성해
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Abstract

본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주 유래 재조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디(ginsenoside Rd)의 제조방법에 관한 것으로 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 내열성 베타-포도당해리효소(β-glucosidase)를 암호화하는 유전자가 도입되어진 벡터에 의해 형질 전환된 재조합 균주로부터 베타-포도당해리효소를 제조하고 하기 식(Ⅲ)에 나타낸 바와 같이 진세노사이드 알디원(Rd1), 알디투(Rd2) 및 알시(Rc)를 기질로 한 상기 재조합 내열성 베타-포도당해리효소 반응을 통해 진세노사이드 알디를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 제조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디의 제조방법{Recombinant enzyme from Thermus caldophilus GK24 strain and process for preparation of ginsenoside Rd using the same}
본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주로부터 유래한 재조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디(ginsenoside Rd)의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24로부터 유래된 베타-포도당해리효소(β-glucosidase)를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질 전환된 대장균으로부터 얻은 재조합 내열성 베타-포도당해리효소를 이용한 진세노사이드 알디의 제조방법에 관한 것이다.
진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리터페노이드를 기본구조로 하는 프로토파낙사다이올과 프로토파낙사트라이올의 어글리콘에 글루코스, 람노스, 아라비노스, 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서 결합된 당들의 종류와 수 그리고 결합위치에 따라 약리 작용이 각각 다른 것으로 알려져 있다. 이들 유도체들 중 RD(20(S)-프로토파낙사다이올-3-O-베타-디-글루코피라노실(1→2)-베타-디-글루코피라노사이드)는 프로토파낙사다이올에 속하는 트리글루코 진세노사이드로서 하기와 같은 구조식으로 표기되며 동맥경화 억제작용, 부신피질 호르몬 분비 촉진작용, 소뇌성장 회복작용 및 코스코스테롤 분비 촉진작용 등을 갖는 생리활성 물질이다. 또한, 알디의 메타볼라이트들(mono, digluco-ginsenosides: Rg3, F2, Rh2, Compound-K)을 제조하기 위한 중간물질로서 중요하다. 그러나 상기와 같은 중요한 역할을 하는 알디(Rd)가 인삼에 미량으로만 존재하기 때문에 알디의 대량생산방법이 연구될 필요가 있다.
기존에 진세노사이드 알디(ginsenoside Rd)의 제조방법으로는 효소를 사용한 방법들이 연구되어 있으며, 알디의 제조시 사용되어진 효소로는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 또는 페니실리움(Penicillium)속에서 분리한 락타제(lactase)와 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에서 분리한 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)가 있다. 그러나 알디(Rd)로의 전환에 있어서 기질의 양에 비해 효소가 상당히 많이 쓰이며 반응시간과 수율 또한 비효율적인 문제점이 있다.
베타-포도당해리효소(EC 3.2.1.21,β-gucosidase, β-D-glucoside glucohy- drolase)는 식물, 곰팡이, 동물 및 세균 등에 존재하는 효소로서, 하기 식(Ⅰ)에 나타낸 바와 같이 아릴기, 알킬기 또는 당기와 포도당 사이의 베타-글루코시드(β-glucoside) 결합의 가수분해를 촉매한다.
Gβ1-3G-(G)n→ → → GGβ1-4G-(G)n→ → → G
Gβ1-5G-(G)n→ → → GGβ1-6G-(G)n→ → → G ... (Ⅰ)
효소활성은 하기 식(Ⅱ)에 나타낸 바와 같이 주로 니트로페닐 글루코시드(nitrophenyl glucoside)를 기질로 사용하여 효소반응 후, 방출된 올소-니트로페놀(ο-nitrophenol) 또는 파라-니트로페놀(ρ-nitrophenol)의 방출을 420nm에서 측정한다.
이러한 당해리효소는 생물계에 넓게 분포하고 있기 때문에 그들의 구조적 특성과 촉매적 특성들은 매우 유사하다. 즉, 거의 모든 효소들은 55-64 kDa의 분자량과, pH 5-6 정도의 산성을 갖으며, 기질로서 베타-글루코시드가 절대적으로 요구되는 등의 공통적인 특성을 나타낸다. 여러 가지 다른 종류의 생물체로부터 분리 정제된 베타-포도당해리효소들은 글루코스(glycone)나 어글리콘(nitrophenol, umbelliferone)에 대한 넓은 범위의 기질특이성에 대한 현저한 유사성을 보인다.
이 효소에 대한 부분적으로 또는 완전하게 밝혀진 아미노산서열 결과를 토대로 작용기작 및 활성부위에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데 특히, Clarke et al.(1993)은 대부분 곰팡이나 박테리아의 베타-포도당해리효소에 대한 연구로부터 얻은 특정 변이 실험, 화학적 변이(modification), 반응속도, 친화성 라벨링(affi- nity labeling) 및 아미노산서열의 유사성 등에 대한 실험결과로서 산성의 아미노산이 산성 촉매로서 작용하며 촉매과정 동안 음이온/뉴클레오파일(nucleophile)를 안정화시킨다고 밝혔다. 또한 이 효소는 그것의 기질을 가수분해시키기 위해서 이중적인 교환기작을 사용한다. 즉, 효소의 활성 부위에 있는 두 개의 산성잔기(Asp, Glu)는 기질의 글루코시드 결합을 공격하여 가수분해에 관여하며, 결과적으로 글루타민산(Glu) 주위의 잔기들에 의해 공유 결합적으로 연결된 안정한 효소-기질 중간체가 형성된다.
포유동물의 베타-포도당해리효소 중에서, 스핑고실 포도당체와 포도당 세라마이드를 기질로 사용하며 리소좀(lysosome)에 존재하는 사람의 산성 베타-포도당해리효소 또는 포도당 세레브로시다제에 대한 연구가 가장 많이 진행되었다. 사람의 경우, 이 효소활성의 부재에 의한 기질의 축적으로 야기되는 Gaucher 질환의 치료적인 측면에서 약학적으로, 생명 공학적으로 재조합 효소의 생산을 위한 일환으로 관심의 대상이 되고 있다. 포유동물의 세포질에 존재하는 베타-포도당해리효소는 위에서 설명한 바와 같이 간, 신장, 뇌 및 소장 등에서 글루코시드(glucoside) 결합을 가수분해하는 작용 이외에도, 당잔기를 기질분자로부터 수용체로 전달하여 새로운 글루코시드 결합을 형성하는 탄수화물 전이반응에도 관여한다. 식물체에서는 1837년 Liebig과 Wohler에 의해 알모드 베타-포도당해리효소의 작용이 보고된 이래 꾸준히 연구되어 왔으며, 여러 가지 중요한 대사과정과 생장 관련 반응에 관여한다고 알려졌다.
본 발명자는 비교적 많은 량이 존재하는 진세노사이드 알비원(ginsenoside Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc)에서 기본구조인 트리터페노이드의 20번 탄소와 결합한 글루코스의 6번 위치에 결합된 당들만이 상이하다는 점과 그 당들만을 선택적으로 가수분해하면 진세노사이드 알디(ginsenoside Rd)를 제조할 수 있다는 점을 착안하여 하기 식(Ⅲ)에 나타낸 바와 같이 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldoph- ilusGK24) 균주로부터 유래한 내열성 베타-포도당해리효소(β-glucosidase)와 진세노사이드 알비원, 알비투 및 알시와 반응시켜 95%이상의 전환수율로서 알디를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 베타-포도당해리효소를 암호화하는 유전자와 상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 유전자 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주와 상기 재조합 균주를 배양하여 재조합 베타-포도당해리효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효소를 이용한 진세노사이드 알디(ginsenoside Rd)의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 서머스 칼도필러스 지케이24(Thermus caldophilusGK24) 균주로부터 베타-포도당해리효소(β-glucosidase) 유전자를 확인하고, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 얻은 유전자를 대장균에 형질 전환시킨 후 상기 재조합 플라스미드를 분리하여 베타-포도당해리효소 유전자의 염기서열을 결정한 다음 재조합 발현벡터를 제작하고, 상기 발현벡터로 형질 전환된 균주를 제조한 후 이 균주를 배양하여 베타-포도당해리효소를 생산하고 분리·정제하여 상기 효소와 기질인 진세노사이드 알비원(ginsenoside Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc)의 반응을 통한 대사산물 알디(Rd)를 대량 생산함으로 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
도 1은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 재조합 내열성 베타-포도당 해리효소와 진세노사이드 알시에 대한 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 PCR 증폭하여 얻은 서머스 칼도필러스 지케이24 유래한 재조합 내열성 베타-포도당해리효소 유전자를 pKK223-3 벡터에 도입하여 제조한 재조합 벡터pKKbglA의 벡터모식도이다.
도 3은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 재조합 내열성 베타-포도당 해리효소의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자 염기서열이다.
도 4는 포도당 전이효소들간의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 재조합 내열성 베타-포도당해리효소의 전기영동 결과이다.
본 발명은 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 분리한 재조합 베타-포도당해리효소의 분자량을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 결정하고, 상기 효소와 진세노사이드 알비원(ginsenosid Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc)의 최적 반응온도, 최적 pH , 효소 활성 및 효소의 기질특이성을 측정하는 단계; 상기 효소 유전자의 염기서열을 자동화 염기서열결정기를 사용하여 결정하고 플라스미드 벡터에 결합시킨 후 상기 재조합 벡터(pKKbglA)로 대장균을 형질전환시켜 재조합 대장균(MV1184/ pKKbglA)을 제조하는 단계; 상기 재조합 대장균을 엠피실린 50 μg/mL가 첨가된 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 3시간 배양한 후 유전자의 발현을 유도하고 상기 배양한 균체를 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하여 효소액을 제조한 다음 정제하여 재조합 베타-포도당해리효소(β-glucosidase)를 제조하는 단계; 상기 재조합 베타-포도당해리효소를 진세노사이드 알비원(ginsenoside Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc)를 기질로 하여 pH 6-7의 인산화칼륨 완충용액에서 70∼80℃로 온도를 유지하면서 20시간 반응시켜 메타볼라이트인 알디(Rd)를 대량생산하는 단계로 구성되어 있다.
상기 단계에서 유전자 조작등과 관련된 실험방법은 문헌(Sambrook, J. et al.:Molecular Cloning.A laboratory Manual. 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York., 1989; Ausubel, F. et al.:Short Protocols in Molecular Biology. 3rd. John & Wiley Sons, Inc., 1995)에 기술된 공지방법을 따랐다.
호열성 미생물인 서머스 칼도필러스 지케이24 균주(Kwon S. T. et al.: Mole. Cells, 7, 264∼271(1997); Park, J. et al.: Eur. J. Biochem., 214, 135∼140(1993); Taguchi, H. et al.: J. Biochem., 93, 7∼13(1983))를 배양한 후 코스미드 라이브러리(cosmid library)로부터 베타-포도당해리효소(β-glucosidase) 유전자를 확인한 후 이것을 프로브로하여 베타-포도당해리효소를 포함하는 코스미드를 선택하였다.
상기 단계에서 본 발명 재조합 내열성 베타-포도당해리효소를 기질에 첨가하여 반응시 pH 5∼7로 조절하였으며 바람직한 최적 반응 pH는 5.5∼6.5였다. 또한상기 효소 반응시 온도는 50∼90℃로 조절하였으며 바람직한 최적 반응 온도는 60∼80℃로 유지하였다.
본 발명 재조합 베타-포도당해리효소 및 상기 효소를 이용하여 생산한 메타볼라이트들은 의약품 및 건강보조제로 사용할 수 있다. 또한 본 발명 베타-포도당해리효소는 기질로서 인삼의 다이올계 사포닌 중 알비원, 알비투, 알시 뿐만 아니라 펄프, 섬유와 같은 베타-결합을 하는 셀룰로오스 계열의 탄수화물 및 베타-결합 글라이칸의 가공 처리등에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 베타-포도당해리효소의 특성조사
서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 효소의 특성을 조사하기 위하여 분자량 분석, 최적반응 온도, 최적 pH 및 기질특이성을 조사하였다.
분자량분석은 공지 방법(Lammli,U.K.: Nature, 227, 680-685(1970))에 따라 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE, SDS-Polyacrylamide Gel Electro- phoresis)을 이용하여 분석하였으며, 분자량 크기 마커(Pharmacia LKB)를 표준 단백질로 사용하였다.
또한 이 효소의 최적 반응 온도조사는 베타-포도당해리효소(β-glucosidase)의 일반적인 활성온도인 65∼85℃에서 24시간 효소반응 시킨 후 효소활성을 측정하여 결정하였다. 효소의 최적 pH의 결정은 각기 다른 pH의 완충용액하(pH 4∼5 아세트산 나트륨, pH 6∼8 인산화 칼륨)에서 70℃로 24시간 효소반응을 시켰다. 즉, 진세노사이드 Rb120mg을 기질로 하여 베타-포도당해리효소(β-glucosidase) 0.13∼ 0.93mg과 20mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.0)하에서 70℃로 24시간 효소반응 시켰다. 상기 반응액을 함유한 용기를 얼음에 집어넣어 반응을 중지시키고 용기 안에 메탄올을 첨가하고 원심분리하여 상층액을 분석하였다.
기질 특이성의 측정은 진세노사이들 알비원(ginsenoside Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc) 각각과 혼합물을 20mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.0)에서 정제된 베타-포도당해리효소를 사용하여 70℃에서 24시간 반응시킴으로써 수행하였다. 반응을 중지시키기 위하여 반응 혼합물을 10분간 끊이고 메탄올을 첨가하여 원심분리한 후 분석하였다. 기질의 가수분해 및 당전이반응의 당산물은 다이오넥스사의 HAPAEC-PAD (Dionex high performance anion-exchange chromatography with pulsed ampero metric detector)와 카보팩 피에이-1 컬럼(Dionex CarboPac PA-1, 0.4×25 cm)을 사용하여 유속 1ml/min으로 하고 140 mM(또는 100 mM) 수산화 나트륨 및 0∼300 mM (또는 100∼150 mM) 아세트산 나트륨 농도 기울기로부터 분석하였다.
실험 결과, 재조합 베타-포도당해리효소의 분자량은 49 kDa 이였으며, 효소 반응의 최적 온도는 70∼80℃였다. 상기 효소의 최적 pH는 도 1에 나타낸 바와 같이 6.0 이였으며 기질특이성은 베타결합을 하는 기질에 있어서 글루코실(1→2)글라코사이드(glycosyl(1→2)glycoside) 결합과 글루코실-옥시-알킬(glycosyl-oxy-alkyl)결합을 제외한 모든 베타결합을 해리하는 기질에 대한 특이성을 보였다. 본 발명 효소는 같은 온도, 같은 효소량 하에서 모든 기질이 같은 활성을 나타내진 않았다. 일예로, 진세노사이드 알비원(ginsebosid Rb1), 알비투(Rb2)와 달리 5탄당(α-L-arabinofuranosyl)을 갖는 알시(Rc)에서 반응을 다른 두 경우의 반응온도와 같은 70℃에서 하게 되면 수율이 30% 밖에 되지 않아 77∼85℃로 온도를 올려주어야 했으며, 효소량도 1.5배 정도로 증가시켜야 했다.
상기의 내용에 있어서 본 발명에서의 서머스 칼도필러스 균주 유래 베타-포도당해리효소는 신규한 효소이다.
실시예 2: 재조합 베타-포도당효소의 제조
제1공정: 베타-포도당해리효소 유전자의 발현벡터 제작
본 공정에서는 베타-포도당해리효소(β-glucosidase) 유전자의 코딩영역 (OFR, open reading frame)에 해당되는 DNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하여 회수하고, 단백질 발현용 플라스미드 벡터인 pKK223-3(Pharmacia)에 결합하여 발현용 숙주 대장균에 형질전화 시킴으로써 베타-포도당해리효소 발현 재조합체를 제조하였다. 즉, 베타-포도당해리효소 N-말단 유전자를 기초로 하여 새로이 제한효소EcoRI 절단부위와 전사개시 코돈 ATG를 포함하는 하기와 같은 PCR 프라이머를 사용하였다.
5'-GGAATTCAATGACCGAGAACGCCGAAAAGTTT-3'
또한, C-말단을 포함하는 하기와 같은 PCR 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 1.3 kb에 해당하는 유전자를 증폭·분리하여 유전자의 염기서열을 결정하고 베타-포도당해리효소 유전자의 존재를 완전히 확인하였다.
5'-TCAGAGCTGGGCCCGCGC-3'
도 2에 나타낸 바와 같이 상기 증폭된 베타-포도당해리효소 유전자 DNA를 제한효소EcoRI,PstI으로 처리하고 분리, 정제한 후 동일한 효소로 처리한 단백질 발현용 플라스미드 벡터 pKK223-3(Pharmacia)에 결합시켜 재조합 내열성 베타-포도당해리효소 발현 플라스미드를 pKKbglA를 제조하였다. 상기 벡터를 발현 대장균 (E.coliMV1184)에 형질전환시켜 단백질 발현용 플라스미드 벡터 pKK223-3에 결합시킴으로써 베타-포도당해리효소 발현 재조합체(E. coli: MV1184/pKKbglA)를 제조하였다.
염기서열의 결정은 자동화 염기서열 결정기(AB1373A automatic DNA sequen cer)를 사용하였으며 도 3에 나타낸 바와 같이 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 베타-포도당해리효소 유전자의 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 결정된 아미노산과 DNA 염기서열에 의하면 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 베타-포도당해리효소는 431개의 아미노산으로 구성되어 있으며 효소 단백질 분자량은 48.7 kDa이고 1296개의 염기로 구성되어 있으며 G+C의 구성비가 70.4 %를 이루고 있다. 다른 종으로부터 분리된 베타-포도당해리효소와 아미노산 서열을 비교해본 결과 20∼51.0 %의 상동성을 보여주었다 (Kiel, J. A. K. W. et al.:Mol.Microbiol., 11(1), 203-218; Furukawa, K. et al.:J. Biol. Chem.269(2)) 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 베타-포도당해리효소는 여러 군데의 보존구역을 가지고 있음을 알 수 있었다.
상기 플라스미드 pKKbglA를 함유한 형질전환된 대장균(MV1184/pKKbglA)은 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 10월 2일 기탁번호 KCTC 0868BP로서 기탁되어 있다.
제2공정: 재조합 베타-포도당해리효소의 발현 및 정제
상기 제 1공정에서 클로닝된 포도당 해리효소의 유전자를 발현시키기 위해, 대장균 (MV1184/pKKbglA)를 50 μg/mL의 앰피실린이 첨가된 LB액체배지에 접종하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 배양 후 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고 12시간 계속 배양하여 유전자의 발현을 유도하였으며, 발현율은 총 세포 단백질의 10 %였다.
상기와 같은 방법으로 배양한 균체를 원심분리하여 회수한 다음, 20 mM 인산화칼륨 완충용액(pH 7.0; 이하 완충용액 A)에 현탁시키고 초음파 세포파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 세포 용액을 4℃에서 12,500×g로 30분간 원심분리하여 미파쇄 세포 및 불용성 세포 파쇄물을 제거한 효소액을 제조하였다. 상기 얻어진 수용성 상층 효소액만을 85℃에서 30분간 열처리하고 원심분리하여 대장균 유래 변성 단백질을 제거하였다. 상기 변성 단백질을 제거한 효소액을 12,500×g로 30분간 원심분리하여 효소액만을 수득하고 상기 효소액에 무게 대 부피비로 50% 되는 황산암모늄을 4℃에서 서서히 첨가하면서 잘 교반하였다. 상기 효소액을 12,500×g로 30분간 원심분리하여 침전물만을 모아 완충용액 A에 녹이고 동일한 완충용액에서 투석하였다. 상기 투석된 효소액을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 베타-포도당해리효소의 정제에 사용하였다. 상기 효소액을 1 M의 황산암모늄을 포함한 완충용액 A로 완충용액 교체를 마친 후 동일한 완충용액으로 평형화된 소수성 수지 컬럼(Butyl-Sepharose column)에 통과시키고 세척하였다. 상기 컬럼을 통과하여 분리된 각각의 효소 분획들 중 효소 활성이 있는 분획만을 모아 100 mM 염화나트륨을 포함한 완충용액 A로 완충용액을 교체한 후 동일 완충용액으로 평형화된 젤 여과 수지 컬럼(Sephacryl S-200 column)에 통과시켜 효소 단백질을 분획하여 도 5에 나타낸바와 같이 순수하게 정제된 베타-포도당해리효소를 수득하였다.
실시예 3: 재조합 포도당해리효소에 의한 진세노사이드 알디의 대량 생산
진세노사이드 알비원(Rb1), 알비투(Rb2), 알시(Rc) 및 각각 세가지 기질을 50mg 씩 혼합한 혼합물을 기질로 하여 20 mM 인산완충용액(pH 6∼7)에서 상기 실시예 2에서 제조한 정제된 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 베타-포도당해리효소 0.5 mL(효소의 양은 0.66 mg)를 첨가하여 70∼80℃의 항온수조에서 20시간 반응시켰다. 반응이 완료되면 박층크로마토그래피(TLC)를 실시하여 기질의 소실여부를 확인하였다. 이때 박층크로마토그래피의 전개액으로는 클로로포름:메탄올:증류수가 60:40:10으로 혼합된 액을 사용하였으며, 기질의 소실여부가 확인되면비등수에서 10분간 처리한 후 원심분리하여 효소를 제거하고 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 전환되어진 진세노사이드 알디를 각각 95%이상의 수율로 얻었다. 상기 반응결과에 대한 수소, 탄소 핵자기공명 스펙트럼은 하기와 같다.
1H-NMR(d5-Py)δ:4.93(1H, d, J=7.42Hz, glu.), 5.20(1H, d, J=7.66Hz, glu.), 5.38(1H, d, J=7.56Hz, glu.)
13C-NMR(d5-Py)δ:16.0, 16.3, 16.6, 17.4, 17.8, 18.5, 22.4, 23.2, 25.8, 26.7, 26.9, 28.1, 30.9, 30.9, 35.2, 36.2, 36.9, 39.2, 39.7, 40.1, 49.5, 50.2, 51.4, 51.6, 56.4, 62.7, 62.8, 62.9, 70.3, 71.6, 71.7, 71.7, 75.2, 77.2, 78.0, 78.1, 78.3, 78.3, 78.4, 79.4, 83.3, 83.6, 89.0, 98.3, 105.1, 106.1, 126.0, 131.0
mp: 207∼208℃
알디로의 전환율을 높이기위해 pH, 반응온도, 효소량 및 반응시간에 변화를 주어 반응시킴으로서 최적의 반응조건을 확인할 수 있었다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및 이를 이용한 진세노사이드 알디(ginsenosideRd)의 제조방법은 재조합 내열성 베타-포도당해리효소를 인삼 다이올계 사포닌 중 알비원(Rb1), 알비투(Rb2) 및 알시(Rc)와 반응시켜 고수율로 진세노사이드 알디를 제조하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품, 화학 및 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래한 재조합 내열성 베타-포도당해리효소를 암호화하는 하기와 같은 유전자 서열.
  2. 제 1항 기재 재조합 효소의 하기와 같은 아미노산 서열 및 이와 기능적으로동등한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  3. 서머스 칼도필러스 지케이24 균주로부터 유래된 재조합 내열성 베타-포도당해리효소 유전자를 포함하는 재조합 유전자 벡터(pKKbglA)
  4. 제 3항 기재의 유전자 발현벡터로 형질전환된 대장균(MV1184/pKKbglA) KCTC 0868BP.
  5. 하기와 같은 생화학적 특성을 나타내는 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의 재조합 내열성 베타-포도당해리효소.
    분자량: 약 49,000 달톤
    반응온도: 50∼90℃
    최적 반응온도: 75℃ 부근
    반응 pH: pH 5.0∼7.0
    최적 반응pH: pH 6.0
  6. 베타-결합 셀룰로오스 계열의 탄수화물 또는 베타-결합 글라이칸을 기질로 함을 특징으로 하는 재조합 내열성 베타-포도당해리효소.
  7. 재조합 베타-포도당해리효소를 진세노사이드 알비원, 알비투, 알시 각각 또는 이들의 혼합물을 기질로 하여 pH 5∼7, 온도 50∼90℃로 유지하면서 반응시킴을 특징으로 하는 진세노사이드 알디 제조방법.
  8. 제 7항 기재의 진세노사이드 알디를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
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