KR101079293B1

KR101079293B1 - 고온성 베타-글리코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드의제조방법

Info

Publication number: KR101079293B1
Application number: KR1020090026193A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 노경환
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2011-11-04
Also published as: KR20100107865A

Abstract

본 발명은 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 이용하여 희귀 진세노사이드인 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 와이(Y) 및 엠씨(Mc)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고온성 설포로버스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 베타-글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이를 형질전환된 미생물 및 이들을 이용하여 베타-글리코시다제를 대량으로 얻는 제조방법, 그리고 상기 베타-글리코시다제를 이용하여 희귀 진세노사이드인 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨를 제조하는 방법에 관한 것이다.

고온성, 베타-글리코시다아제, 설포로버스 애시도칼다리우스, 진세노사이드,컴파운드 케이, 컴파운드 와이, 컴파운드 엠씨

Description

고온성 베타-글리코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드의 제조방법 {Method of rare ginsenosides production using thermostable beta-glycosidase}

본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 이용한 희귀 진세노사이드(rare ginsenoside)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 추출물과 초고온성 설포로버스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 것으로 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내는 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용하여 높은 온도에서 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc의 글루코오스(glucose)만을 선택적으로 가수분해 하고, 최종적으로 인삼에 존재하지 않는 희귀 진세노사이드인 컴파운드 케이(Compound K), 컴파운드 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc)의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

인삼에는 존재하지 않는 진세노사이드 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨는 각각 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2 그리고 진세노사이드 Rc에서 생산된다.

진세노사이드 Rb1은 어글리콘 프로토파낙사디올의 기본 골격구조에 네 개의 글루코오스가 있고, 그 부분을 선택적으로 가수분해 하면 컴파운드 케이(하기 화학 식 1 참조)가 만들어질 수 있다. 또한, 컴파운드 와이(하기 화학식 2 참조)와 컴파운드 엠씨(하기 화학식 3 참조)는 진세노사이드 Rb2의 아라비노피라노시드(arabinopyranoside)와, 진세노사이드 Rc의 아라비노퓨라노시드 (arabinofuranoside)가 각각 분해되지 못하고 3번 탄소의 글루코오스가 가수분해 되면서 생산될 수 있다.

진세노사이드 컴파운드 케이(K)는 면역 증강, 종양의 혈관신생 억제, 암세포 침윤 억제 및 암세포 증식 억제 등 여러 가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있어 건강식품 산업 분야에 있어서 점점 대량공급이 요구되고 있는 실정이며 따라서 안정적이고 효율적으로 생산할 필요성이 커지고 있다.

이러한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조에 대한 종래 기술로는, 다이올계 사포닌을 효소인 베타-갈락토시다아제(한국공개특허 제2003-94757호), 페니실리움속 미생물에서 분리한 셀룰라아제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다아제(한국등록특허 제377546호), 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 펙티나제(한국등록특허 제418604호) 등을 처리함으로써 컴파운드 케이를 제조하는 방법이 공지되어 있다.

그러나, 상기와 같이 진세노사이드 컴파운드 케이는 온도 10 ~ 50℃ 범위의 중온성 효소를 이용하여 생산되고 있지만, 이 효소는 낮은 반응 온도에서 작용하기 때문에 미생물에 오염되기 쉽고 생산 수율도 50% 이하로 낮은 문제점이 있다.

한편, 진세노사이드 컴파운드 와이(Y)와 엠씨(Mc)는 염증질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 그 생산 방법이나 물질의 활성이 보고된 바 없고, 또한 자연계에서의 수득률이 상당히 낮아 이를 이용한 연구 실적이 미비하다.

이에 본 발명자는 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 와 이(Y) 및 엠씨(Mc)를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 초고온성 미생물인 설포로버스 애시도칼다리우스 균주에서 고온성 베타-글리코시다아제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 생산한 다음, 순수 분리된 진세노사이드 Rb1의 글루코오스를 분해하여 진세노사이드 Rd를 거쳐 컴파운드 케이를 제조함과 동시에 진세노사이드 Rb2 및 Rc의 3번 탄소에 붙은 글루코오스 두 분자를 선택적으로 가수분해하여 컴파운드 와이와 엠씨를 제조함으로써 단시간에 고수율로 제조되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 함유한 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 컴파운드 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc) 제조용 조성물 및 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 함유한 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 컴파운드 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc) 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 고온성 베타-글리코시다아제는 설포로버스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 고온성 베타-글리코시다아제는 최적 활성 온도가 70 내지 100℃인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 함유한 진세노사이드 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨 제조용 조성물 및 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨의 제조방법에 따르면, 초고온성 설포로버스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 고온성 베타-글리코시다아제가 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내어 반응 속도가 빨라지며, 글루코오스를 제외한 나머지 당에 대해 낮은 기질 특이성으로 인하여 인삼 추출물에 존재하는 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 각각 다른 물질로 전환시킴으로써 컴파운드 케이, 와이, 그리고 엠씨를 빠르고 선택적으로 생산하여 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 함유한 희귀 진세노사이드(rare ginsenoside) 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 희귀 진세노사이드는 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 컴파운드 와이(Compound Y), 컴파운드 엠씨(Compound Mc) 또는 이들 의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

통상적으로, 베타-글리코시다아제는 동·식물 및 미생물 등에 다양하게 존재하며 글루코시드나 소당류의 글리코시드 결합을 가수분해 하여 당과 어글리콘을 생성하는 효소로, 아릴, 아미노, 알킬기와 붙어있는 글루코시드나 시아노제닉 글루코시드, 그리고 올리고당 혹은 이당류를 가수분해하는 역할을 한다. 또한, 상기 효소는 물질대사의 조절에 있어 탄수화물의 생성이나 파쇄 등의 기본적인 역할을 수행한다(Park. et al., (2007) J. Microbiol. Biotechnol. 17, 454-460). 이러한 베타-글리코시다아제의 최적 활성온도는 30 ~ 50℃ 이다.

그러나, 본 발명의 희귀 진세노사이드 제조용 조성물은 이보다 높은 온도에서 최적의 효소 활성을 나타내는 고온성 베타-글리코시다아제를 함유하며, 이때 고온성 베타-글리코시다아제 최적 활성온도는 70 ~ 100℃인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제는 초고온성 미생물인 설포로버스(Sulfolobus)속에 속하는 미생물, 바람직하게는 설포로버스 애시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 것으로 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 중온성 베타-글리코시다아제와 본 발명의 설포로버스 계열의 균주에서 유래한 베타-글리코시다제의 차이점은 아미노산의 조성에서 차이가 난다. 중온성의 베타-글리코시다아제는 시스테인(Cys)의 함량이 낮고 또한 아르기닌/라이신(Arg/Lys)의 비율이 낮다. 이것은 일반적으로 고온성 효소가 열에 안정함을 설명할 수 있는 대표적인 요인이다(Themostable β-galactosidase from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus purification and properties. Eur. J. Biochem. 187, 321-328 (1990)).

상기 설포로버스 애시도칼다리우스는 원시세균(Archaea)계; 크레나케오타(Crenarchaeota)문; 써모프로테이(Thermoprotei)강; 설포로발레스(Sulfolobales)목; 설포로바세(Sulfolobaceae)과; 설포로버스(Sulfolobus)속에 속하는 균주로, 상기 설포로발레스 목의 미생물은 화산의 온천수에서 자라고 pH 2 ~ 3 및 75 ~ 80℃에서 최적의 생장을 나타낸다. 특히, 설포로버스 애시도칼다리우스 균주는 70℃ 및 pH 3에서 최적의 생장을 나타내는 것으로 알려져 있다(Zillig, W., et al., (1980) Arch. Microbiol . 125, 259~69).

상기 설포로버스 애시도칼다리우스 균주로부터 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제를 수득하는 방법은 1) 균주로부터 직접 분리정제하거나, 2) 균주로부터 베타-글리코시다아제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현벡터에서 발현시키고 이를 정제하여 수득할 수 있다. 상기와 같이 미생물로부터 효소를 얻는 과정은 당업계의 통상적인 방법에 의한다(Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).

이렇게 수득된 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)는 pH 5.5 및 85℃에서 최적 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제를 함유한 희귀 진세노사이드 제조용 조성물은 인삼의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물(예, 인삼 추출물 등)과 완충용액, 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액 중에서 반응시킬 때, 고온 70 내지 100℃에서 반응속도를 빠르게 조절하여 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이, 와이 및 엠씨가 고수율로 생성되는 작용효과를 나타낸다.

본 발명은 또한 고온성 베타-글리코시다아제를 기질로서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 또는 이들 중에서 하나 이상 선택되어 혼합된 혼합물과 반응용매 중에서 반응시켜 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 희귀 진세노사이드는 진세노사이드 컴파운드 케이(K), 진세노사이드 컴파운드 와이(Y), 진세노사이드 컴파운드 엠씨(Mc) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 고온성 베타-글리코시다아제는 초고온성 미생물인 설포로버스(Sulfolobus)속에 속하는 미생물, 바람직하게는 설포로버스 애시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 것으로 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 가) 설포로버스 애시도칼다리우스 균주의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머를 가지고 PCR을 실시하여 고온성 베타-글리코시다아제 유전자(서열번호 3)를 포함하는 DNA 절편을 증폭한 다음; 나) 증폭된 고온성 베타-글리코시다아제 유전자를 포함하는 DNA 절편에 제한효소 EcoRI 및 PstI를 처리한 후 발현벡터인 pTrc 99a(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pTrc 99a(+)/베타-글리코시다아제를 제작하고; 다) 이 를 통상적 형질전환방법으로 대장균 ER2566 균주에 형질전환하고; 라) 형질전환 된 대장균을 배양한 다음 과발현을 유도하여 고온성 베타-글리코시다아제를 생산하고; 및 마) 발현된 베타-글리코시다아제 효소를 분리하여 정제한다.

상기에서 베타-글리코시다아제 효소는 상기 베타-글리코시다아제 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하고, 베타-글리코시다아제 효소의 발현을 유도하며, 발현된 효소 단백질을 분리 및 정제하는 과정으로 베타-글리코시다아제를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 마) 과정에서 발현된 고온성 베타-글리코시다아제 효소 단백질을 분리하는 과정은, (a) 상기 미생물을 파쇄하고; (b) 상기 세포 파쇄물은 원심분리하여 상등액을 얻고; (c) 다시 고온에서 열처리하여 원심분리하고; 및 (d) 이로부터 얻은 상등액을 여과하는; 과정으로 효소액을 분리함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 과정에서는 세포 상등액을 75 내지 90℃ 온도 범위에서 10분 내외로 열처리하는 것이 바람직하며, 상기 (d) 과정에서는 0.45 ㎛ 내외의 여과지 등을 사용하여 여과시키는 것이 바람직하다.

또한, 상기 베타-글리코시다아제는 기질로서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 다이올계 사포닌인 사용하며, 진세노사이드 컴파운드 케이, 와이 및 엠씨 제조시 각각 또는 이들 중에서 하나 이상 선택되어 혼합된 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 혼합물은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 얻은 인삼사포닌 혼합물 또는 추출물인 것이 좋다.

이때 반응용매는 구연산나트륨 완충액, 시트레이트-인산 완충액, 맥킬바인(McIlvaine) 완충액과 같은 완충용액, 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액이 될 수 있으며, 반응용매 중의 고온성 베타-글리코시다아제 효소 및 기질간의 반응은 pH 4.5 내지 7.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 6.3, 보다 바람직하게는 pH 5.5에서 수행하고, 온도 70 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 97℃, 보다 바람직하게는 효소의 온도 안정성을 고려하여 85℃에서 진행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 제조방법에 따르면, 고온에서 안정한 한 가지 효소를 이용하여 순수한 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 또는 이들의 혼합물을 사용했을 때 각각 희귀 진세노사이드인 진세노사이드 컴파운드 케이, 와이, 엠씨 또는 이들의 혼합물을 제조할 수 있고, 또한 상기 희귀 진세노사이드들은 단시간 내에 다량으로 전환되어 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 고온성 베타-글리코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드의 제조

(1) 고온성 베타-글리코시다아제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 고온성 베타-글리코시다아제를 제조하기 위하여, 먼저 설포로버스 애시도칼다리우스 균주로부터 유래한 베타-글리코시다아제 유전자를 분리하였다.

구체적으로, 이미 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 특정되어 있는 설포로버스 애시도칼다리우스 균주를 선발하고, 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, 이 균주의 베타-글리코시다아제 유전자의 염기서열[서열목록 참조; 진뱅크 수탁번호 YP_256448.1(Genebank Accession No. YP_256448.1)]을 기초로 하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향의 두 개의 프라이머를 각각 제작하였다.

서열번호 1 : 5'-GAATTCATGTTATCATTCCCAAAGGGTTTC-3'

서열번호 2 : 5'-CTGCAGTTAATGTCTCAAAGGTTTTATTGGTGG-3'

그 다음 상기 게놈 DNA 및 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 베타-글리코시다아제의 해당 유전자(서열번호 3)의 염기서열을 증폭하였다. 상기 과정으로 증폭된 베타-글리코시아다제 유전자 절편을 제한효소 EcoRI 및 PstI를 사용하여 플라스미드 벡터 pTrc 99a(+)(Amersham Biosciences, Sweden)에 삽입하는 과정으로 본 발명의 재조합 발현 벡터 pTrc 99a(+)/베타-글리코시다아제를 제작하였다.

또한 상기와 같이 제작한 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER2566 균주에 형질전환 하고, 상기 형질전환된 대장균은 20% 글리세 린(glycerine) 용액을 첨가하여 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

( 2) 고온성 베타-글리코시다아제의 발현

본 발명에서는 베타-글리코시다아제를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 E. coli ER2566 pTrc 99a(+)/베타-글리코시다아제 균주를 LB 배지 3 ㎖가 들어있는 시험관(test tube)에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 배양된 종균을 다시 LB 배지 500 ㎖가 들어있는 2 ℓ의 삼각 플라스크에 첨가하여 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하되, 이때 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 조정하였다. 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 된 이후, 여기에 0.1 mM IPTG(isopropyl-beta-thiogalactoside)를 첨가하여 베타-글리코시다아제의 대량 발현을 유도하였으며, 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하였다.

또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 정제하기 위하여, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 100 mM 구연산나트륨 완충용액(Sodium citrate buffer, pH 5.5)을 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 85℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리 하였으며, 이때 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 희귀 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있는 효소 액으로 분리하였다.

(3) 고온성 베타-글리코시다아제와 희귀 진세노사이드에 대한 활성 조사

본 발명에서는 상기 실시예 1-(2)에서 분리한 고온성 베타-글리코시다아제가 인삼에 주로 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc에 미치는 영향을 다음과 같이 확인하였다.

가. 고온성 베타-글리코시다아제의 효소 활성 측정

본 발명에 따른 고온성 베타 글리코시다아제의 활성은 4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(pNP-Glu)를 기질로 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 1.0 mM 4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드, 50 mM 구연산나트륨 완충용액(pH 5.5) 및 본 발명의 고온성 베타-글리코시아다제 효소를 희석하여 총 부피 1 ㎖이 되게 섞은 후 온도 85℃에서 15분 동안 반응을 진행시켰다. 그런 다음 2 M 탄산나트륨을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

이때 사용된 4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드의 양과 효소 반응으로 인하여 생성된 4-니트로페놀 양은 420 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 산정하였고, 효소 단위(Unit)는 1 마이크로몰(μmole)의 4-니트로페놀을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

또한, 효소 단백질의 양은 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 기준으로 한 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 산정하였다.

나. 고온성 베타-글리코시다아제가 인삼 추출물에 미치는 활성 조사

상기 본 발명의 고온성 베타-글리코시아다제 효소가 미삼 추출물과 반응할 때 관찰되는 영향을 조사하기 위하여, 메탄올/물 혼합물(MeOH/water mixture, 4:1 v/v) 1 ℓ 에 100 g의 건조된 미삼가루를 넣고 80℃에서 1시간 동안 추출한 후 필터링과 농축을 거쳐 1 ℓ의 2차 증류수에 녹인 미삼추출물을 제조하고(Kim SK, et al. (1988) J. Ginseng Res. 22, 155-160), 이를 효소 반응 시 기질로 사용하였다.

상기 미삼 추출물을 기질로 사용하여 24시간 동안 효소 반응시킨 결과, 도 1에서와 같이 전환된 3가지 물질을 확인하였다.

다. 고온성 베타-글리코시다아제에 의한 생성물의 질량분석

상기 (나)에서 생산된 물질에 대한 질량분석을 실시하였다. 질량분석의 이온화를 용이하게 하기 위하여 물과 아세토니트릴(acetonitrile)에 각각 0.1%가 되도록 포름산을 첨가하여 질량분석을 실시하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이 각각의 전환된 물질은 진세노사이드 컴파운드 케이(K), 와이(Y) 및 엠씨(Mc)임을 확인하였다.

상기에서 진세노사이드 컴파운드 케이는, 원래 분자량이 623이나 LC/MS 분석 시 용매로 물과 아세토니트릴을 사용하고, 0.1% 포름산을 첨가하였기 때문에 원래 분자량 623에서 포름산의 분자량(46)이 더해지고 수소 하나가 빠진 623 + 46 - 1 = 668 이라는 결과를 얻었다. 또한, 진세노사이드 컴파운드 와이의 경우도 마찬가지로 원래 분자량 755에서 포름산의 분자량이 더해지고 수소 하나가 빠진 800(755 + 46 - 1)이었다.

반면, 진세노사이드 컴파운드 엠씨는 원래 분자량(754)에서 포름산의 분자량이 더해진데 반해 수소 하나가 빠지지 아니하여 799.8의 결과가 나왔다.

라. 고온성 베타-글리코시다아제가 순수 분리된 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc에 미치는 활성 조사

상기 본 발명의 고온성 베타-글리코시아다제 효소가 순수 분리된 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc와 반응할 때 관찰되는 영향을 조사하기 위하여, 기질로 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc를 각각 1 ㎎/㎖씩 사용하였다. 또한, 상기 효소는 각각 33단위(Unit), 187단위 및 110단위가 사용되었으며, 온도 85℃에서 3시간 동안 진행시켰다. 반응이 끝나면 n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시키고, 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1은 진세노사이드 Rd를 거쳐 진세노사이드 컴파운드 케이(K)로(도 3a 참조), 진세노사이드 Rb2는 컴파운드 와이(Y)를 거쳐 미량의 컴파운드 케이(K)로(도 3b 참조), 그리고 진세노사이드 Rc는 컴파운드 엠씨(Mc)로 각각 전환되는 것을 확인하였다(도 3c 참조).

(4) 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 생산

본 발명에서는 상기 고온성 베타-글리코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기 효소의 최적 pH(pH 5.5) 및 효소활성 이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(85℃)에서 미삼 추출물(농도 10%)과 효소 126 단위를 가지고 진세노사이드 컴파운드 케이(K), 와이(Y) 및 엠씨(Mc)의 시간별 생산량을 측정하였다.

도 4는 기질로서 농도 10%의 미삼 추출물에서 본 발명의 베타-글리코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산량을 나타낸 그래프로, 각각 진세노사이드 컴파운드 케이 1.49 ㎎/㎖, 컴파운드 와이 0.63 ㎎/㎖ 및 컴파운드 엠씨 0.53 ㎎/㎖을 생산하였다.

현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 상업용 효소인 노보자임사(Novozyme Co.)의 펙티넥스 100(Pectinex 100)과, 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)의 베타-글리코시다아제가 있다.

상기 효소로 미삼 추출물 10%와 반응시켜 보았을 때, 펙티텍스의 경우 24시간에 1.3 ㎎/㎖의 컴파운드 케이를 생산하였으며(Bo-Hye Kim et al. (2006) Biol. Pharm. Bull. 29, 2472-2487), 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)의 베타-글리코시다아제는 펙티텍스보다 약 2.5배 높게 생산한 결과가 보고되었다(Kyeong-Hwan Noh et al. (2009) Biol. Pharm. Bull. 73(2), 316-321).

그러나, 본 발명에 따른 고온성 베타-글리코시다아제를 사용하면 동일한 조건으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 1.49 ㎎/㎖ 생산할 수 있었으며, 더욱이 한 가지 효소를 사용하여 진세노사이드 컴파운드 와이와 엠씨를 생산한 것은 보고된 바 없다.

따라서 본 발명의 설포로버스 애시도칼다리우스로부터 분리한 베타-글리코시다아제가 컴파운드 케이 생산에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 미삼 추출물을 기질로 하여 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산을 관찰한 것으로, 화살표는 각각 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K), 와이(Y) 및 엠씨(Mc)를 나타낸다.

도 2는 상기 도 1에서 확인한 각 진세노사이드 컴파운드들의 질량 분석 결과로, (a)는 진세노사이드 컴파운드 케이, (b)는 진세노사이드 컴파운드 와이, 및 (c)는 진세노사이드 컴파운드 엠씨이다.

도 3은 순수 분리된 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc를 기질로 하여 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산량을 나타낸 것으로, (a)는 진세노사이드 컴파운드 케이(C-K), (b)는 진세노사이드 컴파운드 와이(C-Y), 및 (c)는 진세노사이드 컴파운드 엠씨(C-Mc)이다.

도 4는 미삼 추출물을 기질로 하여 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산량을 나타낸 것이다(C-K: 진세노사이드 컴파운드 케이; C-Y: 진세노사이드 컴파운드 와이; 및 C-Mc: 진세노사이드 컴파운드 엠씨).

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Method of rare ginsenosides production using thermostable beta-glycosidase <130> P09-E071 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaattcatgt tatcattccc aaagggtttc 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctgcagttaa tgtctcaaag gttttattgg tgg 33 <210> 3 <211> 1476 <212> DNA <213> Sulfolobus acidocaldarius <400> 3 atgttatcat tcccaaaggg tttcaaattt ggctggtctc agtcgggatt ccagtctgaa 60 atgggaactc caggtagcga ggatccgaac agcgattggc acgtctgggt tcatgacagg 120 gagaacatag tctcacaggt tgtcagtgga gatttacccg aaaatggtcc agggtactgg 180 gggaactata agagatttca tgacgaagca gagaaaatag gactaaatgc agtgagaatt 240 aacgtagagt ggagtagaat atttcccaga ccactaccca agcctgaaat gcaaacaggg 300 actgataaag agaacagtcc tgtcattagc gtagacttaa atgagtctaa gctgagagaa 360 atggacaact acgctaatca tgaagcgtta tcacattaca ggcaaatact ggaggatcta 420 agaaacagag gatttcacat agtactgaac atgtatcatt ggactttgcc catatggttg 480 cacgacccta tcagagtgag gagaggagac tttacaggac caacaggttg gttaaactcc 540 aggacagttt atgagttcgc taggttctcg gcttacgtag cctggaaatt agatgatttg 600 gcgagtgaat atgcaacaat gaatgaacct aacgtggttt ggggagcagg ttacgctttt 660 cctagagcag gctttccacc taattacctt agcttcaggc tttcagaaat agctaaatgg 720 aatataattc aggctcatgc gagggcttat gacgccatca agagcgtatc aaaaaagagt 780 gtaggtataa tatatgcaaa cacatcatat tacccactca gaccacaaga taacgaagct 840 gtggaaatag cagagagatt gaacagatgg agtttctttg actccattat aaagggagag 900 ataactagtg agggacaaaa tgtcagagag gacttaagga acaggttaga ctggattggc 960 gtaaactatt acacgaggac tgtggtaaca aaagctgaga gtggttattt aacccttccg 1020 ggttatggag atcgttgtga aaggaactca ttgagtttag ctaacctccc taccagtgat 1080 ttcggttggg agttctttcc tgagggtcta tatgatgtac ttttgaagta ttggaatagg 1140 tatgggttac cattatacgt aatggagaac ggtatcgctg atgacgctga ctaccaaaga 1200 ccgtattact tagtatcaca tatctaccag gtgcacaggg ctttaaacga gggagtagat 1260 gtaagaggtt atcttcattg gtctttggca gataattatg agtggtcgtc aggtttttca 1320 atgaggttcg gtctacttaa ggtagattat ctaacaaaga gattgtactg gagaccttct 1380 gcattagttt acagggagat tactaggagt aacggtattc ctgaggagct ggaacatcta 1440 aacagagtac caccaataaa acctttgaga cattaa 1476 <210> 4 <211> 491 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius <400> 4 Met Leu Ser Phe Pro Lys Gly Phe Lys Phe Gly Trp Ser Gln Ser Gly 1 5 10 15 Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn Ser Asp 20 25 30 Trp His Val Trp Val His Asp Arg Glu Asn Ile Val Ser Gln Val Val 35 40 45 Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp Gly Asn Tyr Lys 50 55 60 Arg Phe His Asp Glu Ala Glu Lys Ile Gly Leu Asn Ala Val Arg Ile 65 70 75 80 Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Arg Pro Leu Pro Lys Pro Glu 85 90 95 Met Gln Thr Gly Thr Asp Lys Glu Asn Ser Pro Val Ile Ser Val Asp 100 105 110 Leu Asn Glu Ser Lys Leu Arg Glu Met Asp Asn Tyr Ala Asn His Glu 115 120 125 Ala Leu Ser His Tyr Arg Gln Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Arg Gly 130 135 140 Phe His Ile Val Leu Asn Met Tyr His Trp Thr Leu Pro Ile Trp Leu 145 150 155 160 His Asp Pro Ile Arg Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Gly Pro Thr Gly 165 170 175 Trp Leu Asn Ser Arg Thr Val Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr 180 185 190 Val Ala Trp Lys Leu Asp Asp Leu Ala Ser Glu Tyr Ala Thr Met Asn 195 200 205 Glu Pro Asn Val Val Trp Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Pro Arg Ala Gly 210 215 220 Phe Pro Pro Asn Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Ser Glu Ile Ala Lys Trp 225 230 235 240 Asn Ile Ile Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Ser Val 245 250 255 Ser Lys Lys Ser Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Thr Ser Tyr Tyr Pro 260 265 270 Leu Arg Pro Gln Asp Asn Glu Ala Val Glu Ile Ala Glu Arg Leu Asn 275 280 285 Arg Trp Ser Phe Phe Asp Ser Ile Ile Lys Gly Glu Ile Thr Ser Glu 290 295 300 Gly Gln Asn Val Arg Glu Asp Leu Arg Asn Arg Leu Asp Trp Ile Gly 305 310 315 320 Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Thr Lys Ala Glu Ser Gly Tyr 325 330 335 Leu Thr Leu Pro Gly Tyr Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ala Asn Leu Pro Thr Ser Asp Phe Gly Trp Glu Phe Phe Pro Glu 355 360 365 Gly Leu Tyr Asp Val Leu Leu Lys Tyr Trp Asn Arg Tyr Gly Leu Pro 370 375 380 Leu Tyr Val Met Glu Asn Gly Ile Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Tyr Leu Val Ser His Ile Tyr Gln Val His Arg Ala Leu Asn 405 410 415 Glu Gly Val Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn 420 425 430 Tyr Glu Trp Ser Ser Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val 435 440 445 Asp Tyr Leu Thr Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr 450 455 460 Arg Glu Ile Thr Arg Ser Asn Gly Ile Pro Glu Glu Leu Glu His Leu 465 470 475 480 Asn Arg Val Pro Pro Ile Lys Pro Leu Arg His 485 490

Claims

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설포로버스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 균주로부터 유래한 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 고온성 베타-글리코시다아제를 진세노사이드 Rb2와 반응용매 중에서 반응시켜 진세노사이드 컴파운드 와이(Compound Y)를 제조하는 방법.
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