KR102316324B1 - 인플루엔자 검출용 센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 액체 또는 기체 내 인플루엔자 존재의 무표지 검출 또는 그의 정량화를 위한 센서에 관한 것이다. 본 발명의 센서는 기존 센서가 달성하지 못한 탁월한 안정성과 민감성을 구비하여 고해상도의 안정된 민감한 휴대용 장치의 제공을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 액체 또는 기체 내 인플루엔자 존재의 검출 또는 그의 정량화를 위한 센서에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 멤브레인으로 둘러싸인 RNA 바이러스이며, 음성가닥 RNA의 분절된 세그먼트로 구성되고, 조류(avians)와 인간의 주요 감염원이다(Lamb et al., Annu Rev Biochem 52:467-506 (1983)).
인플루엔자는 계절마다 수 천에서 수 만명이 사망하는 유행성 독감을 일으키며, 전 세계적 유행 시에는 백 만명 가량의 사망을 일으키기도 한다. 20세기에는 새로운 인플루엔자로 인한 독감의 세계적 유행이 세 번 있었으며, 수천 만명에 이르는 사람들이 사망하였다. 이런 변종은 다른 동물에게서 인간으로 감염이 일어날 때, 인간을 숙주로 삼는 종이 다른 동물을 숙주로 삼는 종에게서 유전자를 받았을 때에 흔히 발생한다.
인플루엔자는 RNA 바이러스인 오르토믹소 바이러스과(Orthomyxoviridae)에 포함되는 5개의 속(屬, genus) 중 세 개로 구별되어, 인플루엔자 A, B 및 C로 표시된다.
인플루엔자 A, B, C형 각각의 전체적 구조는 동일하다. 비리온(virion)은 직경 80~120nm의 크기이며, 중앙의 핵을 둘러싸고 있는 바이러스성 외피는 크게 두 종류로 구별할 수 있는 당단백질이고, 핵은 바이러스성 RNA(viral RNA)와 이를 보호하고 활성화하는데 필요한 바이러스성 단백질(viral protein)을 포함한다.
바이러스로서는 흔치 않게, 인플루엔자의 게놈은 핵산의 단편이 아니다. 이 게놈은 7개나 8개로 분절된 음성가닥(negative sense) RNA이며, 각 RNA는 한 개나 두 개의 유전자를 가지고 있다. 이 RNA에는 헤마글루티닌(hemagglutinin;HA), 뉴라미니다제(neuraminidase;NA), 뉴클레오프로테인(neucleoprotein;NP), M1, M2, NS1, NS2(NEP), PA, PB1, PB1-F2, PB2 까지 11개의 단백질 정보가 암호화되어 있다.
헤마글루티닌과 뉴라미니다제는 비리온 외부에 위치한 거대한 당단백질이다. 렉틴(lectin)인 헤마글루티닌은 바이러스가 세포에 침입하는 것을 도와주며, 뉴라미니다제는 성숙한 비리온에 결합하는 당(糖)을 조각내어 비리온들이 세포로부터 방출되는 일을 보조한다. 항바이러스제는 이런 당단백질의 활동을 방해한다. 또한, 이 당단백질들은 중요한 항원으로도 작용하며, 특히 헤마글루티닌은 숙주 세포에 바이러스가 진입하는데 결정적인 역할을 한다.
인플루엔자가 숙주 세포에 침투하기 위해서는 숙주 세포막에 존재하는 시알산에 인플루엔자의 헤마글루티닌이 결합하여야 한다(제 1단계). 헤마글루티닌이 프로테아제로 잘게 쪼개지면, 세포는 바이러스를 엔도좀(endosome)으로 흡수한다. 엔도좀의 산성 환경은 두 가지 변화를 일으키는데, 헤마글루티닌의 일부가 비리온의 외피를 세포의 공포(vacuole)막과 결합시키는 것이다. 다른 하나는 M2 이온채널이 외피를 통해 양자가 이동하여 비리온의 핵을 산성화할 수 있도록 만드는 것이다. 핵이 산성화되어 분해되면 바이러스성 RNA와 단백질이 나온다. 결국 세포질로 바이러스성 RNA, 보조 단백질, RNA 의존성 RNA 중합효소가 방출된다(제 2단계).
방출된 핵의 단백질과 RNA는 감염된 세포의 핵 내부로 이동되어 결합체를 형성한다. 그리고 핵 내부에서 RNA 의존성 RNA 중합효소가 상보성 양성가닥 RNA를 전사하기 시작한다(제 3a, 3b 단계). vRNA는 세포질로 이동되어 번역되거나(제 4단계), 핵에 계속 남는다. 새로 합성된 바이러스성 단백질(뉴라미니다제와 헤마글루티닌)은 골지체를 통해 세포 표면에 분비되어 형성되거나(제 5b단계) 핵으로 보내져 vRNA와 결합해 새로운 바이러스 유전자를 만든다. 미리 유입된 바이러스성 단백질은 숙주 세포에서 여러 가지 일을 수행한다. 예컨대 원래의 mRNA를 분해해 그 산물인 뉴클레오타이드를 vRNA의 합성에 사용하거나, 감염 세포 본래의 mRNA 번역을 저해하기도 한다.
이렇게 새로운 비리온을 구성하는 음성가닥 vRNA, RNA 의존성 RNA 중합효소, 바이러스성 단백질이 생성된다. 세포 표면에 형성된 헤마글루티닌과 뉴라미다아제를 사이로 형성된 구획으로 vRNA와 바이러스성 단백질이 이동한다(제 6단계). 새로운 비리온은 세포의 인지질층과 형성된 외피의 당단백질을 가진 상태에서 구형으로 방출된다(제 7단계). 비리온은 헤마글루티닌으로 숙주 세포에 부착되는 성질이 있는데, 뉴라미니다제가 이 결합을 끊어 방출을 돕는다. 바이러스 방출이 끝나면 숙주 세포는 터져 죽게 된다.
인플루엔자 바이러스의 초기 등록은 독감 질병 보호를 위한 가장 효과적인 방법 중 하나이다. 이 공공 장소에서 고감도 바이러스 검출을 제공하는 것이 중요하다. 센서는 휴대용이고, 자동이며, 긴 수명, 높은 감도 및 재생 가능성을 갖는 무표지 검출일 것이 요구된다. 표준 센서는 트랜스듀서와 수용체 층으로 이루어져 있다.
오늘날 바이러스 센서는 전기, 기계, 광학 등 여러 종류의 트랜스듀서를 사용한다. 이미 특정 수용체 항체, 당 사슬, 앱타머, 글리칸 및 단백질을 타겟으로 하는 다양한 바이오 센서가 사용되고 있다. 수용체는 바이러스 또는 표면 단백질의 RNA 및 DNA를 대상으로 한다.
한편 마이크로 캔틸레버가 단백질, DNA, 세포 등의 무표지 검출(label-free detection)을 가능하게 함으로써 바이오 센서로서 각광을 받기 시작했다.
최근에 마이크로 캔틸레버를 이용하여 PSA, CRP, 미오글로빈 등 질병 표지 단백질(marker protein)을 검출한 바 있으며, 또한 화학 물질을 하위 나노그램(sub-nanogram) 레벨의 양까지 무표지로 검출함으로써 마이크로 캔틸레버는 민감한 센서로서 더욱 주목을 받고 있다(US 2015/0065364 A1). 또한 마이크로 캔틸레버를 이용한 양자역학적 현상에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 현장에서 즉시 사용할 수 있는, 고해상도의 안정된 민감한 휴대용 장치를 위한 인플루엔자 바이러스의 무표지 검출 센서를 제공하고자 연구 노력하였다. 그 결과 액체 또는 기체 내에 존재하는 나노그램 내지 하위 나노그램 수준의 인플루엔자까지 정확하게 검출해 낼 수 있는, 기존 센서가 달성하지 못한 탁월한 안정성과 민감성을 구비한 인플루엔자 검출용 센서를 제조 해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 상기 고해상도, 안정성, 민감성의 인플루엔자 바이러스의 무표지 검출 센서를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인플루엔자 검출용 센서를 이용하여 액체 또는 기체 내에서 인플루엔자를 검출 및 정량화하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 관점은 한쪽 말단만이 고정되어 있는 센서 프로브; 및 상기 센서 프로브에 연결된 검출기를 포함하는 인플루엔자 검출용 센서에 있어서, 상기 센서 프로브의 표면에는 시알릴글라이코폴리머(sialylglycopolymer)가 공유결합에 의하여 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 센서는 액체 또는 기체 내에서 인플루엔자의 존재를 검출하거나 정량화하는데 사용될 수 있다.
시알릴글라이코폴리머
본 발명 인플루엔자 검출용 센서에 있어서, 센서 프로브의 고도의 안정성 및 민감성을 확보하기 위해서는 시알릴글라이코폴리머의 사용이 수반되어야 한다.
센서 프로브의 감도는 표적 분자의 특이적 결합으로 인해 센서 층에 발생하는 표면 응력의 값에 의존한다. 표면 응력은 복합체 형성의 상호 작용에 의해 발생하며, 센서의 응답을 높이기 위해, 수용체 분자는 매트릭스 층에 포함될 수 있다.
이 경우, 표면 응력은 수용체 분자와 타겟 분자와의 결합뿐만 아니라, 수용체 분자와 매트릭스 분자간의 상호 작용, 복합체의 안정성 등 다른 요소들의 영향을 받는다.
인플루엔자 바이러스가 시알산 모이어티에 특이적으로 결합한다는 사실은 잘 알려져 있었지만, 본 발명자들은 시알산 모노머 내지 시알릴 올리고사카라이드 자체를 직접 프로브 표면에 결합시키는 방식을 사용해서는 센서 자체의 고도의 민감성을 확보할 수 없음을 발견하였다.
또한, 다량의 시알릴 모이어티를 센서 표면에 도입하기 위하여, 시알릴기를 포함하는 올리고당, 수화겔 소재 및 센서 프로브 표면을 하나의 용액에서 동시에 반응시키어, 시알릴 올리고당이 수화겔 내부에 잠재적으로 무작위로 포함된 가교된 수화겔 형태의 다공성 매트릭스를 통하여 시알릴 모이어티를 고밀도로 프로브 표면위에 부착시키려는 시도가 있었다.
그러나, 이 경우 바이러스 탐지에 필요한 정확한 양과 비율로 시알릴 모이어티의 밀도를 조절하는 것이 불가능하고, 특히 센서 프로브의 안정도 측면에서 불리하여 dynamic 캔틸레버로 응용할 수 있을 정도의 안정도를 확보하는 것은 불가능하다.
그리하여, 본 발명자들은 높은 민감성, 정확성 및 안정성을 구비한 바이러스 검출기 개발을 위한 방법으로서, 시알릴 올리고사카라이드(sialyl oligosaccharide)를 인플루엔자 수용체(결합 모이어티)로 포함하는 시알릴 글라이코폴리머(sialylglycopolymer)의 사용을 제안한다.
본 발명에 있어서 인플루엔자 바이러스는 상기 시알릴 글라이코폴리머 내 시알릴 올리고사카라이드의 시알릴기를 특이적으로 인식하여 결합하게 된다.
본 발명의 센서 프로브의 표면에는 단수 또는 복수개의 독립된 시알릴글라이코폴리머 분자들이 부착될 수 있는데, 이들 시알릴글라이코폴리머 분자들간에는 가교가 되어 있지 않는 것을 특징으로 한다.
여기에서 상기 시알릴글라이코폴리머 분자 각각은, 센서 프로브의 표면에 부착되기에 앞서, 시알릴올리고사카라이드를 고분자 중합체에 공유적으로 연결시키어 미리 제조해 놓은 독립된 하나의 고분자이기 때문에, 인플루엔자 바이러스 입자에 특이적인 비율과 양으로 올리고사카라이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 시알릴글라이코폴리머 분자 각각은 센서 프로브 표면 부착에 독립적인 분자들로 미리 제조해 놓은 것이므로, 분자량, 용해도, 매트릭스 유연성, 안정성, 당질 리간드 간 거리 등과 관련하여 미리 결정된 정확한 특성을 보유하는 것이 가능하여, 센서 자체의 고도의 민감성 및 정확성뿐만 아니라 탁월한 안정성까지 확보할 수 있게 한다.
일 구현예에서 본 발명의 시알릴글라이코폴리머 분자는 시알릴(α2-3)갈락토스 모이어티 또는 시알릴(α2-6)갈락토스 모이어티를 갖는 시알릴올리고사카라이드를 포함하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
시알릴(α2-3)갈락토스 말단 또는 시알릴(α2-6)갈락토스 말단을 갖는 시알릴 올리고사카라이드는 서로 다른 분자 모양을 가지고 있고, 이로 인하여 상호간 구별된다. 인간 및 조류 인플루엔자 바이러스는 이러한 차이점을 잘 구별해 낸다.
일반적으로 인정되는 바에 따르면, 인간의 바이러스는 우선적으로 Sia(α2-6) Gal-말단을 구비한 수용체에 우선적으로 결합하고, 조류 바이러스 Sia(α2-3)Gal-말단을 구비한 수용체에 결합한다(Yoshihiro, Caister Academic Press, United Kingdom, 2006, 372p). 세 번째 당(saccharide)은 또한 인플루엔자 바이러스의 다른 서브 타입 수용체의 친화도에 영향을 미칠 수 있다(Gambaryan AS et al., Virology, 2005, 334, 2, pages 276-283). 그러나 다른 호스트에서 바이러스의 모든 종은 다양한 정도의 시알릴글리칸 수용체의 다른 유형을 결합할 수 있고, 그래서 본 발명의 센서 프로브에 포함되는 인플루엔자 수용체 분자로서의 시알릴 올리고사카라이드의 서열을 특정의 것만으로 한정하여 기재하는 것은 본 발명의 정당한 권리범위를 부당하게 제한하는 것이다.
따라서, 본 발명의 센서 프로브에 포함되는 인플루엔자 수용체 분자로서의 시알릴 올리고사카라이드는 시알릴기를 포함하는 것이기만 하면 제한없이 사용될 수 있는 것이며, 예컨대 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ (3'SL), Neu5Acα2-6Galβ1-4Glcβ (6'SL), Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6'SLN), Neu5Gcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6'(Neu5Gc)LN), Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc (3'SLN), Neu5Gcα2-3Galβ1-4GlcNAc (3'(Neu5Gc)LN), Neu5Acα2-3Galβ1-4-(6-Su)GlcNAc (Su-3'SLN), Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAc (SiaLec), Neu5Acα2-3Galβ1-3-(6-Su)GlcNAc (Su-SiaLec), (Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)GlcNAc (SiaLex), (Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)(6-Su)GlcNAc (Su-SiaLex), Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc 및 Neu5Acα2-6Galβ1-4-(6-Su)GlcNAc (Su-6'SLN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있지만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 종전 문헌(Gambaryan AS et al. Virology. 1997, 9, 232(2), pages 345-350)에 표면 당 단백질의 구성이 명확하지 않게 기술된 바와 같이, 우리는 다른 바이러스 종 및 호스트에 대하여, 서로 다른 선호도를 찾을 수 있다. 이는 또한 하나의 폴리머 매트릭스에 다른 수용체 조합에 의해 여러 종류의 바이러스에 대한 보편적인 수용체를 개발하는 기회를 제시한다. 생물학적 활성 탄수화물 리간드를 위한 매개체로서 고분자 매트릭스를 사용하는 것은 그들의 비반응성 및 탁월한 안정성으로 인하여 유용하다. 올리고당 안정성이 수용체의 전체적인 안정성에 영향을 주지는 않는것으로 여겨진다(Rune Slimestada et al, Journal of Chromatography A, 1118, Issue 2, 2006, Pages 281-284, R.S. Shallenberger et al, Food Chemistry, 12, 3, 1983, Pages 159-165).
한편, 본 발명의 센서 프로브에 사용되는 시알릴글라이코폴리머는 시알릴올리고사카라이드를 아크릴계 고분자 중합체에 공유적으로 연결시키어 제조한 고분자일 수 있다.
상기 아크릴계 고분자란 아크릴산, 아크릴아미드, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 시아노 아크릴레이트, 아크릴로니트릴, CH2=CHCOOR의 유도체 등 다양한 아크릴계 단량체를 중합시키어 제조한 중합체 또는 공중합체를 의미하며, 아크릴 단위체 1개 또는 그 이상의 다른 단위체와의 공중합체일 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 아크릴계 고분자는 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트 또는 폴리아크릴아미드와 폴리아크릴레이트의 공중합체일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 시알릴글라이코폴리머는 공유결합에 의하여 센서 프로브 표면에 안정적으로 부착되는데, 예컨대 이황화 결합(disulfide bonds), 디아민 결합(diamine bonds), 황화-아민 결합(sulfide-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 등에 의하여 연결되는 것일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
센서
프로브
센서 프로브는 구조의 변형이 측정될 수 있도록 탐지 수단과 연결된, 서브 마이크로미터 또는 마이크로미터 크기의 유연한 구조를 가지는 것으로 해석되어야 한다. 이러한 변형은 센서 프로브의 임의의 움직임을 모두 포괄하는 모든 종류의 변형을 포함한다. 센서 프로브 구조의 변형이란 굽힘, 비틀림, 진동과 같은 모든 종류의 정적 및 동적 변형을 포함하는 개념이다.
센서 프로브에 부착된 멤브레인 트랜스듀서는 액체 처리 시스템, 가스처리 시스템, 또는 실제 처리가 일어나는 임의의 모든 시스템에서 측정 챔버에 부착될 수 있도록 하는 구성으로 센서 프로브에 부착되도록 설계되고 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 센서 프로브는 단층 또는 다층 구조로 이루어진 것일 수 있다.
예컨대 본 발명의 센서 프로브는 지지층; 기능기를 갖는 티올, 실란 또는 실란트란 링커; 및 상기 링커의 기능기를 통하여 지지층에 공유적으로 연결된 시알릴글라이코폴리머층을 포함하는 것일 수 있다.
여기서, 상기 지지층의 모양과 크기는 조건과 측정 작업에 따라 다를 수 있으며, 지지층은 하나 또는 여러 지점 또는 측면에 의해 한쪽 말단이 고정될 수 있다. 지지층의 재료는 실리콘, 폴리머, 산화 알루미늄, 유리 등 각종 다양한 재료로 구성된 것일 수 있다.
상기 링커는 기능기를 통하여 지지층과 시알릴글라이코폴리머층을 안정적으로 연결하기 위하여 제공되는 것이다.
링커의 기능기는 알케닐, 알키닐과 같은 반응성 탄화수소기; 할로알킬, 플루오로알킬과 같은 할로탄화수소기; 하이드록시, 카보닐, 알데하이드, 할로포밀, 에스테르, 카복실레이트, 카복실, 알콕시, 페록시, 에테르, 아세탈, 케탈과 같은 산소 함유 반응성기; 아민, 아미드, 이민, 이미드, 아자이드, 아조, 시아네이트, 니트레이트. 니트릴, 니트라이트, 니트로, 니트로소와 같은 질소 함유 반응성기; 티올, 설파이드, 디설파이드, 설폭사이드, 설폰, 설포네이트, 티오시아네이트, 티온, 티알과 같은 황 함유 반응성기; 포스핀, 포스페이트, 포스포노와 같은 인 함유 반응성기; 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트와 같은 붕소함유작용기로부터 선택되는 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 링커는 아민 그룹을 기능기로서 포함하는 실란/실란트란 링커일 수 있는데, 이 경우 시알릴글라이코폴리머는 링커에 존재하는 아민(amine) 그룹에 안정적으로 쉽게 고정될 수 있다. 시알산의 카르복시기 또한 아미드 결합 형성을 통하여 표면에 존재하는 아민 그룹과 반응할 수 있다.
지지층이 석영, 실리콘 또는 유리 재료로 구성된 경우에는, (3- 아미노 프로필)트리에톡시 실란, 3-아미노 프로필 트리 메톡시 실란 또는 3-(1-아미노 프로필)-실란트란과 같은 실란/실란트란 링커를 사용할 수 있으며, 시알릴글라이코폴리머층은 링커의 아미노기를 통하여 센서 프로브의 표면에 결합되는 것일 수 있다.
지지층이 금 또는 은의 재료로 구성된 경우에는 링커로서 4-아미노 티오 페놀과 같은 티올 링커를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 시알릴글라이코폴리머층은 전술한 바와 같이 시알릴 올리고당을 폴리머 분자 및 센서 프로브 표면을 동시에 포함하는 하나의 용액 중에서 반응시키어 가교결합을 통해 무작위로 도입된 것이 아니고, 각각의 분자가 정확한 비율과 양으로 시알릴 모이어티를 포함하도록 미리 제조된 시알릴글라이코폴리머 분자를 표면에 도입하여 제조된 것이므로, 폴리머 분자간에 가교된 겔의 형태가 아닌 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 센서 프로브는 부가층을 추가로 포함할 수도 있다. 부가층은 은, 금, 백금, 팔라듐, 알루미늄, 크롬, 티타늄, 구리, 루테늄, 로듐, 또는 이러한 금속들 또는 다른 금속들과의 조합 또는 합금과 같은 금속층일 수 있다.
부가층은 증착, 침전, 레이저 어블레이션, 전자빔 증착, 전기 도금, 쉐도우 마스킹, 또는 금속층을 제공하기 위한 임의의 다른 적합한 기술에 의해 제공될 수 있다. 부가층은 수백 나노미터 내지 수 나노미터 사이의 두께를 가질 수 있다.
부가층은 센서 프로브의 외부 표면에 제공될 수도 있다. 외부 표면은 센서 프로브 멤브레인에 존재하거나, 혹은 일부 또는 상부 프로브의 바닥 표면일 수 있다.
부가층은 프로브 내 매립 층으로서 제공될 수도 있다. 부가층을 매립층으로서 제공함으로써 가능한 바이 모프 효과를 피하거나 최소화할 수 있다. 원칙적으로, 입사되는 광의 적어도 일부를 반사 측정하거나 또는 압전 저항 특성을 갖고 있는 재료로 구성된 프로브의 부가층은 매립 층으로서 제공 및 구성될 수도 있다.
기준
프로브
본 발명의 인플루엔자 검출용 센서는 전술한 센서 프로브에 더하여, 기준 신호를 획득하는데 사용되는 기준 프로브를 추가로 포함할 수도 있다. 센서가 사용 상황에 따라 적어도 2 개의 멤브레인 프로브를 포함하는 경우, 프로브 중 적어도 하나는 기준 신호를 획득하는데 사용되는 기준 프로브일 수 있다. 기준 신호는 예를 들어 유속의 변동, 농도의 변동, 액체의 광학 특성의 변화, 비특이적 결합으로 인한 열 드리프트 또는 과도 현상에서 발생되는 인공 센서 신호와 같은 소음을 필터링하는데 이용될 수 있기 때문에, 검출 신호를 얻는 동시에 기준 신호를 얻는 것이다.
본 발명의 인플루엔자 검출용 센서는 2-3, 2-5, 5-10, 10-20, 20-50 같이 혹은 그 이상의 심지어 100개에서 수천 개 이상의 멤브레인 프로브를 포함할 수 있다. 배열된 프로브들은 기계적 및 화학적 특성의 관점에서 유사할 수 있고, 유사한 멤브레인 그룹이 제공될 수 있고, 또는 배열된 프로브 모두가 서로 상이한 기계적 및/또는 화학적 특성을 가질 수도 있다.
유사한 프로브들을 제공하는 것은 유사한 특성을 가진 상이한 프로브들로부터 유래한 신호들을 비교 분석하는 것에 의하여, 프로브 변형의 더욱 정확한 측정을 가능하게 하는 장점이 있다.
서로 상이한 특성을 가진 멤브레인 프로브들을 제공하는 것은 다기능 센서 디바이서를 제공하는 장점이 있다.
검출기
프로브 변형을 측정하는 일반적인 방법은 검출 타겟이 센서 프로브에 결합함에 따라 발생하는 상기 센서 프로브에 처짐(deflection)의 변화를 검출수단을 사용하여 측정하는 것이다.
여기서 검출기는 프로브 상에 광빔을 조사(shining)하고 포토 다이오드 등의 감광성 검출수단에 의해 광원과 프로브로부터 반사된 광을 감지기를 통하여 모니터링하여 광학적으로 기록하는 역할을 수행한다. 검출기는 이와 같이 발광기 및 광 감지기를 포함할 수 있다.
프로브 변형을 측정하는 다른 방법은 검출 타겟이 센서 프로브에 결합함에 따라 발생하는 상기 센서 프로브의 공진주파수의 변화를 검출 수단을 사용하여 측정하는 것이다.
여기서 프로브의 변형은 압전 또는 압전 저항을 판독함으로써 검출 될 수도 있다. 이 경우 프로브의 재료는 압전 또는 압저항 속성이 추가된 부가층을 포함할 수도 있다.
지금까지 본 발명의 인플루엔자 검출용 센서의 구성 요소적 특징을 기술하였다.
상술한 본 발명의 센서는 일 구현예로서 마이크로 캔틸레버(cantilever)일 수 있다. 캔틸레버와 여타의 멤브레인 표면 응력 센서는 높은 특이성을 갖는 민감한 시스템을 확립한다. 그들은 비특이적 중량 분석적 시그널의 문제를 나타내지 아니하고, 크기가 작으며 생산에 용이하다. 종전에 캔틸레버를 비롯한 다른 종류의 표면 응력 멤브레인 트랜스듀서들이 소개된 바 있다(Shengbo Sang et. Biosensors and Bioelectronics 51 (2014) 124-135).
캔틸레버 센서에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 올리고사카라이드 서열에 결합하는 경우 시알릴글라이코폴리머층 내 측면 응력의 변화가 발생하게 되고, 이는 멤브레인 구조의 변화를 리드한다. 그 신호의 검출이 위에서 언급된 모든 것(광, 전기 등)을 판독하여 수행될 수 있다.
본 발명의 캔틸레버는 검출하고자 하는 분자가 흡착될 때, 분자 상호작용에 의한 응력에 의하여 발생하는 캔틸레버의 처짐의 변화를 측정하는 정적(static) 캔틸레버이거나, 또는 공진주파수의 이동을 측정하여 무표지 검출을 수행하는 동적(dynamic) 캔틸레버일 수도 있다.
정적(static) 마이크로 캔틸레버보다, 동적(dynamic) 마이크로 캔틸레버를 이용하는 것이 타겟 물질의 검출에 있어서 더욱 민감한 무표지 검출이 가능하다는 것이 제시되었다.
동적(dynamic) 마이크로 캔틸레버는 특히 캔틸레버의 길이가 작아질 수록, 실험으로 측정된 공진주파수는 이론적으로 예측된 값에서 더욱 벗어나게 된다. 이 경우, 실험으로 측정된 공진주파수의 값과 이론 값이 다른 것은 실제적으로 크기(size)가 매우 작은 캔틸레버의 경우 geometry를 정확하게 공정할 수 없기 때문이다. 구체적으로, etching 공정으로 인해 캔틸레버의 두께 변화가 야기되는데 이로 인한 공진주파수의 변화가 생기게 된다. 특히, 크기가 매우 작은 캔틸레버일수록 작은 두께 변화가 공진주파수 변화에 큰 영향을 주게 된다.
따라서, 프로브 수용체 분자와 매트릭스의 안정성이 확보되지 않으면, 이 공정에서 야기되는 에러로 인해 측정된 공진주파수의 값이 이론적으로 예측된 값과 다를 수 밖에 없다.
본 발명의 인플루엔자 검출용 센서는 기존의 시알릴 올리고당 내지 시알릴 모이어티를 무작위로 포함한 가교된 수화겔 대신에 미리 정확하게 제작된 시알릴글라이코폴리머를 사용하기 때문에 고도의 안정성 및 감도를 확보할 수 있으며, 그 결과 더욱 민감한 동적(dynamic) 마이크로 캔틸레버로까지 활용이 가능한 장점이 있다.
또한, 본 발명의 안정된 센서 프로브 내에서 생성된 표면 응력은 기질 내의 바이러스의 농도에 의해 확립되는 매트릭스의 특정 바인딩의 양으로부터 의존한다. 이 기능은 다른 기질에서 바이러스의 정량적인 측정을 제공하는 발명된 센서의 기회를 제공한다.
매트릭스 내에서 생성된 표면 응력은 바이러스 입자를 가지는 올리고당 서열 착물은 세척 용액, 예컨대 카바마이드 수용액에 의해 재생될 수 있다. 발명된 센서에서 이러한 수용체 분자의 사용은 재사용을 위한 기회를 제공한다.
본 발명은 고해상도의 안정된 민감한 휴대용 장치를 위한 인플루엔자 바이러스의 무표지 검출 센서를 제공한다. 본 발명의 인플루엔자 검출 센서는 액체 또는 기체 내에 존재하는 나노그램 내지 하위 나노그램 수준의 인플루엔자까지 정확하게 검출해 내는, 기존 센서가 달성하지 못한 탁월한 안정성과 민감성을 구비한다.
도 1은 인플루엔자 탐지를 위한 센서의 개요도를 나타낸 것이다.
도 2는 시알릴글라이코폴리머의 일 예시로서 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ(3'SL-PAA)로 변성된 폴리아크릴아미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 흐름 내 실험을 제공하기 위한 셋업의 개요도를 나타낸 것이다.
도 4는 PAA-3'SL 수용체 분자를 이용한 오리 바이러스의 탐지 결과를 나타낸 것이다. 다른 농도에서 표면 응력의 시간 의존성이 관찰되었다. (흑색선: 108 바이러스/ml, 적색선: 107 바이러스/ml, 청색선: 106 바이러스/ml, 녹색선: 0 바이러스/ml.)
도 5는 바이러스 탐지를 위한 PAA-3'SL 수용체의 재생을 나타낸다. (청색선: 재생 전에 107 바이러스/ml 농도의 용액 주입. 녹색선: 10% 우레아 수용액으로 재생한 후의 107 바이러스/ml 농도의 용액 제2차 주입.)
도 6은 압전세라믹 캔틸레버의 주파수 스펙트럼을 나타낸 것이다. (1: 굴곡 모드에 대응한 공진 피크, 2: 길이 모드에 대응한 공진 피크.)
도 7은 바이러스 용액 및 요막액을 사용한 실험에 있어서, PAA-3'SL 수용체로 변성시킨 압전세라믹의 상대적 공진 주파수 이동의 시간 의존성을 나타낸 것이다.
도 2는 시알릴글라이코폴리머의 일 예시로서 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ(3'SL-PAA)로 변성된 폴리아크릴아미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 흐름 내 실험을 제공하기 위한 셋업의 개요도를 나타낸 것이다.
도 4는 PAA-3'SL 수용체 분자를 이용한 오리 바이러스의 탐지 결과를 나타낸 것이다. 다른 농도에서 표면 응력의 시간 의존성이 관찰되었다. (흑색선: 108 바이러스/ml, 적색선: 107 바이러스/ml, 청색선: 106 바이러스/ml, 녹색선: 0 바이러스/ml.)
도 5는 바이러스 탐지를 위한 PAA-3'SL 수용체의 재생을 나타낸다. (청색선: 재생 전에 107 바이러스/ml 농도의 용액 주입. 녹색선: 10% 우레아 수용액으로 재생한 후의 107 바이러스/ml 농도의 용액 제2차 주입.)
도 6은 압전세라믹 캔틸레버의 주파수 스펙트럼을 나타낸 것이다. (1: 굴곡 모드에 대응한 공진 피크, 2: 길이 모드에 대응한 공진 피크.)
도 7은 바이러스 용액 및 요막액을 사용한 실험에 있어서, PAA-3'SL 수용체로 변성시킨 압전세라믹의 상대적 공진 주파수 이동의 시간 의존성을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
캔틸레버
센서의 제조
실험에 사용된 인플루엔자 검출 센서는 도 1에 제시된 수정 멤브레인에 기초하였다. spacered 올리고사카라이드를 폴리(N-옥시숙시니미딜 아크릴레이트)에 문헌(Tuzikov et al., 2000; Pazynina et al., 2002; Mochalova et al., 2003; Shilova et al., 2005)에 기술된 바와 같이 연결하여, Neu5Acα2-3Gal β1-4Glcβ (3SL) (도 2)를 가지는 고 분자량의 폴리아크릴아미드 접합체를 제조하였다.
두 개의 직사각형 캔틸레버(500 X 100 X 1 um) Arrow™ TL1Au (NanoWorld, 스위스)를 멤브레인으로 사용하였다. 그들은 한측면에 5 nm 티타늄 / 30 nm의 금으로 코팅된 단일체 실리콘으로부터 제조하였다.
광학 판독으로 캔틸레버 처짐(deflection)을 측정하기 위하여 BioScan 셋업(Biosensor Academy, LLC.)을 사용하였다.
압전세라믹(piezoceramic) 캔틸레버(1500 X 1000 X 110 um)는 압전 다이아프램 AW4E6,5T-70E으로부터 제조하였다.
공진주파수 변화를 측정하기 위하여 FemtoScan 셋업(Advanced Technologies Center)을 사용하였다.
캔틸레버 표면 변성을 위하여 3-아미노프로필트리메톡시실란을 사용하였다. 센서 캔틸레버(비 개질 된 금 표면 상)에 비특이적 흡착을 방지하기 위하여, 바이러스 실험 전에 2 시간 동안 BSA 수용액에서 캔틸레버를 반응시켰다. BSA를 갖는 변성 캔틸레버(APTMS 통해 표면에 화학적으로 부착된)는 모든 바이러스 실험에서 참조로 사용되었다.
압전세라믹 캔틸레버의 표면 변성을 위하여 4-아미노티올페놀을 사용하였다. 센서 캔틸레버 상에 비특이적 흡착을 방지하기 위하여, 바이러스 실험 전에 2 시간 동안 BSA 수용액에서 캔틸레버를 반응시켰다.
센서 및 기준 캔틸레버는 아래에 설명 된 프로토콜에 따라 실험 전에 제조하였다.
캔틸레버 Arrow™ TL1Au(NanoWorld, 스위스)를 변성을 위해 준비하였다. 캔틸레버를 piranha 용액(H2SO4·H2O2)으로 세척하였다. piranha 용액은 H2O2의 30 % 용액에 농축 H2SO4를 첨가하는 방법에 의해 각 세정 과정 전에 준비되어야 한다. 증류수와 에탄올로 캔틸레버를 세척하고, APTMS의 10 % 에탄올 용액을 준비하였다. 1 시간 동안 APTMS의 10 % 에탄올 용액에서 반응시키었으며, 그 다음 에탄올과 밀리 Q water로 수회 세척하였다. 10-3 M PAA 3'SL 수용액을 준비하고, 실온에서 16시간 동안 PAA-3'SL의 용액에 캔틸레버 센서를 반응시켰다. 밀리 Q water로 수회 세척하고, 1 시간 동안 BSA 용액에 2개의 캔틸레버를 반응시켰다. 그 다음 2개의 캔틸레버를 물로 수회 세척하였다.
변성을 위하여 압전세라믹 캔틸레버를 압전 다이아프램 AW4E6,5T-70E으로부터 잘라내고, 증류수 및 에탄올로 세척하였다. 4-아미노티오페놀 0.001 M 수용액을 준비하고, 캔틸레버를 이 수용액 중에서 12시간 동안 반응시킨 후, 밀리-Q water로 수회 세척하였다. 10-3 M PAA-3SL 수용액을 준비하고, 실온의 PAA-3SL 수용액 중에서 압전세라믹 캔틸레버를 16시간 동안 반응시켰다. 그 다음 밀리-Q water로 수회 세척하고, 압전세라믹 캔틸레버를 BSA 용액 중에서 한 시간 동안 반응시켰다. 압전세라믹 캔틸레버를 물로 수회 세척하였다.
실험은 연속적인 흐름으로 BioScan 캔틸레버 시스템에 의해 수행되었다. 도 3에 보여지는 흐름으로 측정을 위한 세팅을 계획하였다.
10 ml 시린지의 시린지 펌프(New Era Pump Systems, Inc, USA )를 6 방향 밸브(Upchurch, USA )의 제2포트에 연결하고, 액체 전지 BioScan 캔틸레버 시스템의 액체 cell을 제3포트에 연결하고, 300 ㎕ 부피의 루프는 제1 및 제4포트에 연결하고, 샘플은 제5포트를 통해 주입하고, 제6포트는 폐기 처리용으로 사용하였다. 모든 실험에서 시린지 펌프의 속도는 1 ㎖/h로 설정하였다. 시린지는 PBS로 완전히 채워졌다. 프로브를 주입하면, 프로브는 테플론 튜브를 통해 세포로 이동하기 시작한다. 그것은 단지 7분 후에 세포에 도달하였다.
Example
1. 바이러스의 다른 농도에 대한 센서의 반응
도 4는 PBS 용액 내에 상이한 농도로 존재하는 오리(duck) 바이러스의 주입에 따른 표면 응력의 전개를 보여 준다. 표면 응력 성장의 동적 특성은 상이한 농도의 실험에서 모두 동일하였다. 0, 106, 107 및 108 바이러스/㎖ (v/㎖)의 상이한 농도 신호 중에서 의미 있는 차이가 얻어졌다. 제로 프로브로는 요막액(allantoic liquid)을 사용하였다. 요막액은 다른 단백질을 포함하지만 바이러스 솔루션에 비해 다소 적은 수용체 층 스트레스 변화를 야기하였다.
Example
2. 재생가능성
처음에 실험은 이전과 같은 107 바이러스/㎖ 농도로 바이러스 용액을 주입하는 흐름에서 수행하였다(도 5, 청색선). 센서 및 기준 캔틸레버는 18 분 동안 1 ㎖/h의 속도의 10%의 우레아(urea) 수용액 흐름에 침지하였다. 그 다음 루프 내 프로브 교체를 위하여 우레아 용액을 주입하였다. 그 후 첫 번째 실험을 반복하였다. 두 번째 실험에 대한 표면 응력의 변화는 도 5(녹색선)에 나타내었다. 실험결과 세척에 의하여 센서의 재생 및 재사용이 가능함을 확인하였다.
실시예
3.
공진주파수
이동의 측정
압전세라믹 캔틸레버는 압전층의 높은 압전효과의 결과로서, 실리콘계 마이크로캔틸레버와 같은 비압전 마이크로캔틸레버가 결여한 종방향 익스텐션 모드와 같은 고주파수 비굴절 공진 모드를 나타내었다(도 6). 압전세라믹 캔틸레버 상에 고정된 수용체 층의 기계적 변화는 표적 분자의 결합에 따라 종방향 익스텐션 모드의 공진 피크를 드라마틱하게 이동시키었다.
바이러스 탐지 실험을 실시예 1에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 바이러스 흡착에 따른 공진주파수의 이동을 도 7에 나타내었다(녹색선).
실험결과 인플루엔자 흡착으로 인한 공진주파수의 이동이 뚜렷하게 관찰됨을 확인할 수 있었다.
Claims (19)
- 한쪽 말단이 고정되어 있는 센서 프로브; 및 상기 센서 프로브에 연결된 검출기를 포함하는 인플루엔자 검출용 센서에 있어서,
상기 센서 프로브는 다층 구조로 이루어지는 것으로,
상기 센서 프로브는 지지층; 기능기를 갖는 티올, 실란 또는 실란트란 링커; 및 상기 링커의 기능기를 통하여 지지층에 공유결합하는 시알릴글라이코폴리머층을 포함하고,
상기 시알릴글라이코폴리머 층은 복수개의 시알릴글라이코폴리머 분자가 부착되어 있으며, 시알릴글라이코폴리머 분자들간에는 가교되어 있지 않는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 상기 시알릴글라이코폴리머의 시알릴기에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 센서는 액체 또는 기체 내에서 인플루엔자의 존재를 검출하거나 정량화하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 센서.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 시알릴글라이코폴리머는 시알릴(α2-3)갈락토스 모이어티 또는 시알릴(α2-6)갈락토스 모이어티를 갖는 시알릴올리고사카라이드를 포함하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제5항에 있어서, 상기 시알릴올리고사카라이드는 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ (3'SL), Neu5Acα2-6Galβ1-4Glcβ (6'SL), Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6'SLN), Neu5Gcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6'(Neu5Gc)LN), Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc (3'SLN), Neu5Gcα2-3Galβ1-4GlcNAc (3'(Neu5Gc)LN), Neu5Acα2-3Galβ1-4-(6-Su)GlcNAc (Su-3'SLN), Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAc (SiaLec), Neu5Acα2-3Galβ1-3-(6-Su)GlcNAc (Su-SiaLec), (Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)GlcNAc (SiaLex), (Neu5Acα2-3Galβ1-4)(Fucα1-3)(6-Su)GlcNAc (Su-SiaLex), Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc 및 Neu5Acα2-6Galβ1-4-(6-Su)GlcNAc (Su-6'SLN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 시알릴글라이코폴리머 분자 각각은, 상기 센서 프로브의 표면에 부착되기 전에, 시알릴올리고사카라이드를 고분자 중합체에 공유적으로 연결시키어 미리 제조해 놓은 독립된 하나의 고분자인 것을 특징으로 하는 센서.
- 제7항에 있어서, 상기 고분자 중합체는 아크릴계 고분자 중합체인 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 센서는 기준 신호를 획득하는데 사용되는 기준 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 지지층은 실리콘 지지층이고, 상기 링커는 아미노 실란 화합물인 것을 특징으로 하는 센서.
- 제 1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 시알릴기에 결합함에 따라 상기 센서 프로브에 처짐(deflection)의 변화가 발생하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제13항에 있어서, 상기 검출기는 센서 프로브에 광을 조사하는 광원과 프로브로부터 반사된 광을 수집하는 감지기를 포함하는 것이고, 조사된 광 빔과 반사된 광 빔의 위치 변화를 비교하는 것에 의하여 처짐의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제 1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 시알릴기에 결합함에 따라 상기 센서 프로브의 공진주파수에 변화가 발생하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제15항에 있어서, 상기 검출기는 센서 프로브의 압전저항소자(piezoresistive) 또는 압전 효과를 측정하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 센서 프로브는 마이크로 캔틸레버(cantilever)인 것을 특징으로 하는 센서.
- 제17항에 있어서, 상기 센서 프로브는 정적(static) 캔틸레버 또는 동적(dynamic) 캔틸레버인 것을 특징으로 하는 센서.
- 삭제
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