WO2011108471A1 - ウィルス阻害剤 - Google Patents

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WO2011108471A1
WO2011108471A1 PCT/JP2011/054384 JP2011054384W WO2011108471A1 WO 2011108471 A1 WO2011108471 A1 WO 2011108471A1 JP 2011054384 W JP2011054384 W JP 2011054384W WO 2011108471 A1 WO2011108471 A1 WO 2011108471A1
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WO
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group
virus
glycoside
compound
virus inhibitor
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PCT/JP2011/054384
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泰市 碓氷
慎 尾形
龍珠 朴
忠昭 宮崎
Original Assignee
国立大学法人静岡大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses

Definitions

  • the present invention relates to a virus inhibitor.
  • Influenza is one of the pathogens for which no effective treatment or infection prevention method has been found, because it is extremely infectious, repeats antigenic mutations, and new species that differ from the previous antigenicity appear. It is known that effective defensive measures by are difficult to establish. Recently, there are concerns about the emergence of new human influenza viruses originating from avian influenza virus, and development of influenza preventive / therapeutic drugs is expected.
  • influenza virus type A isolated from avian species preferentially binds to a sugar chain having N-acetylneuraminic acid ⁇ 2,3 galactose (NeuAc ( ⁇ 2,3) Gal) at its terminal, Has been reported to exhibit high binding affinity for the terminal NeuAc ( ⁇ 2,6) Gal structure.
  • sialic acid-containing sugar chain (sialog sugar chain) compounds are expected as infection inhibitors that inhibit binding to virus receptors.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-310610 describes that a polymer obtained by binding sialyl lactose to a polystyrene derivative has a strong bond with influenza virus.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2003-73397 discloses ⁇ -polyglutamic acid as a skeleton as a compound having infection-inhibiting activity against a wide range of influenza virus isolates, and p-aminophenyl group as a linker in its side chain.
  • a sialyl-N-acetyllactosamine-containing artificial sugar chain polypeptide having a molecular weight of 2000 to 1,000,000 in which N-acetyllactosamine is introduced and sialic acid is added to the non-reducing end of oligosaccharide acid is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-31156 discloses a sialyl-N-acetyllactosamine-containing artificial sugar chain polypeptide sial as a virus adsorbent that has high adsorption inhibitory activity and infection inhibitory activity and is inexpensively produced.
  • a sialyl-N-acetyllactosamine-containing artificial polypeptide having a modified sugar chain part and a sialyl-N-acetyllactosamine-containing artificial sugar chain polypeptide having ⁇ -polyglutamic acid as a skeleton and a modified linker are disclosed.
  • These N-acetyllactosamine-containing artificial sugar chain polypeptides are described as having a molecular weight of 2 to 5 million.
  • WO 2009/001805 pamphlet discloses an N-linked sialo-sugar chain-containing polymer in which a sialic sugar chain is bonded to ⁇ -polyglutamic acid using a compound having an amino group and a carboxyl group at the terminal as a linker. .
  • This N-linked sialo-sugar chain-containing polymer is described as having a high synthesis yield and being able to be synthesized by a practical method, and having improved influenza virus infection inhibitory activity.
  • any of the compounds disclosed in these documents is not sufficient as a virus adsorption binding ability and is easy to synthesize in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-31156 and International Publication No. 2009/001805 pamphlet.
  • Each of the disclosed artificial sugar chain polypeptides is a polymer type and may be difficult to handle due to its large molecular weight.
  • an object of the present invention is to provide a low molecular weight virus inhibitor having high virus inhibitory ability.
  • virus inhibitor comprising, as an active ingredient, a polyvalent sialo sugar chain or asialo sugar chain glycoside represented by the following general formula (I).
  • W 1 and W 2 each represent a hydroxyl group or an N-acetylneuraminic acid residue
  • X represents a hydroxyl group or an acetylamino group
  • Y represents the following general formula (Y-1) or ( Y-2) represents a divalent linking group
  • m represents an integer of 0 or 1
  • n represents an integer of 2 to 4
  • Z represents a single bond or a tetravalent to divalent linking group.
  • W 1 and W 2 are not both N-acetylneuraminic acid residues.
  • L 1 represents a divalent linking group consisting of at least one selected from the group consisting of a hydrocarbon group, a hydrocarbon group containing an amide bond, and an ether group.
  • L 2 represents a divalent linking group consisting of at least one selected from the group consisting of an oxyalkylene group, an amide group and an alkylene group.
  • the virus inhibitor according to [1], wherein the hydrocarbon group in L 1 is a hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms.
  • the L 1 is an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, a cycloalkyl-substituted alkyl group, or a combination of two or more of them with an amide bond [1] or [2 ]
  • [4] The virus inhibitor according to any one of [1] to [3], wherein Z is any one of the following (Z-1) to (Z-3). In the following formula (Z-3), p represents an integer of 1 to 20.
  • [5] The virus inhibitor according to any one of [1] to [4], wherein each of W 1 and W 2 is an asialo sugar chain glycoside in which a hydroxyl group is represented.
  • [6] The virus inhibitor according to any one of [1] to [5], wherein the virus inhibitor is an influenza virus inhibitor.
  • a method for treating or preventing a viral disease comprising administering to a patient the virus inhibitor according to any one of [1] to [5].
  • [9] The method for treating or preventing a viral disease according to [8], wherein the viral disease is an influenza virus disease.
  • the virus inhibitor of the present invention is a virus inhibitor containing a polyvalent sialo-sugar chain or asialo-glycan glycoside represented by the following general formula (I) as an active ingredient.
  • W 1 and W 2 each represent a hydroxyl group or an N-acetylneuraminic acid residue
  • X represents a hydroxyl group or an acetylamino group
  • Y represents the following general formula (Y-1) or ( Y-2) represents a divalent linking group
  • m represents 0 or 1
  • n represents an integer of 2 to 4
  • Z represents a single bond or a tetravalent to divalent linking group.
  • W 1 and W 2 are not both N-acetylneuraminic acid residues.
  • L 1 represents a divalent linking group consisting of at least one selected from the group consisting of a hydrocarbon group, a hydrocarbon group containing an amide bond, and an ether group. It represents, L 2 represents a divalent linking group comprising at least one selected from the group consisting of oxyalkylene group, an amide group and an alkylene group.
  • the virus inhibitor of the present invention a plurality of sugar chains having sugar units are linked by a non-sugar chain. It is a low molecular weight and multivalent glycoside and can have high virus adsorption ability.
  • the multivalent glycoside according to the present invention has a high virus adsorption ability not only for sialoglycan glycosides but also for asialoglycosides. Therefore, according to the present invention, a low molecular weight virus inhibitor having high virus adsorption ability can be provided. The present invention will be described below.
  • process is not limited to an independent process, and even if it cannot be clearly distinguished from other processes, the term “process” is used as long as the intended effect of this process is achieved. included.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • W 1 and W 2 are located in the terminal sugar chain part of the glycoside according to the present invention and represent a hydroxyl group or an N-acetylneuraminic acid residue, both of which are N-acetyl. It does not become a neuraminic acid residue.
  • W 1 or W 2 when it has an N-acetylneuraminic acid residue as W 1 or W 2 , it becomes a sialo sugar chain part, and the compound of formula (I) constitutes a sialo sugar chain glycoside.
  • W 2 is an ⁇ 2,6 type is a hydroxyl group in W 1 is N- acetylneuraminic acid residue, it is a virus inhibitor for inhibiting infection to human infective influenza virus
  • W 1 is If the ⁇ 2,3 type in which W 2 is a hydroxyl group and N-acetylneuraminic acid residue is used, it can be used as a virus inhibitor for inhibiting infection against an avian infectious influenza virus.
  • the hydroxyl group, carboxyl group, and amide group may be chemically modified with a halogen group, an alkyl group, an acyl group, or the like, the same or different.
  • both W 1 and W 2 are a hydroxyl group, it becomes an asialo sugar chain part, and the compound of the formula (I) constitutes an asialo sugar chain glycoside.
  • the sugar chain portion is advantageously an asialo sugar chain with one step less from the viewpoint of ease of synthesis.
  • the compound having the formula (Y-1) as a linking group represents a so-called N-linked polyvalent glycoside.
  • the N type as a linking group is advantageous in terms of ease of synthesis and yield.
  • L 1 represents a divalent linking group consisting of at least one selected from the group consisting of a hydrocarbon group, a hydrocarbon group containing an amide bond, and an ether group.
  • the hydrocarbon group in the linking group of L 1 is preferably one having 1 to 30 carbon atoms from the viewpoint of synthesis solubility and virus capture, and may be either a saturated hydrocarbon group or an unsaturated hydrocarbon group.
  • alkyl group an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, and a cycloalkyl-substituted alkyl group.
  • the alkyl group, alkenyl group, or alkynyl group is preferably a straight chain or branched chain group having 1 to 20 carbon atoms.
  • alkyl group examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-octyl group, n-decyl group, n-dodecyl group, n -Straight chain alkyl group such as tetradecyl group; branched chain alkyl group such as isopropyl group, isobutyl group, t-butyl group, 2-ethylhexyl group and the like.
  • hydrocarbon group having an amide bond examples include those in which two or more of these hydrocarbon groups are linked by an amide bond.
  • alkenyl group examples include a vinyl group, a propenyl group, and an allyl group.
  • alkynyl group include ethynyl group, propynyl group, butynyl group and the like.
  • cycloalkyl group examples include those having 3 to 10 carbon atoms, particularly those having 3 to 8 carbon atoms, such as a cyclopropyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • Examples of the aryl group include those having 6 to 14 carbon atoms, such as a phenyl group, a tolyl group, and a naphthyl group.
  • Examples of the aralkyl group include aralkyl groups having 7 to 14 carbon atoms, such as benzyl group and phenethyl group.
  • cycloalkyl-substituted alkyl group examples include C3-C8 cycloalkyl-substituted C1-C10 alkyl groups such as cyclopropylmethyl group, cyclopentylmethyl group, cyclohexylmethyl group, cyclopropylethyl group, cyclopentylethyl group, cyclohexylethyl group, and cyclopropylpropyl group. , Cyclopentylpropyl group, cyclohexylpropyl group and the like.
  • the hydrocarbon may have a substituent, and examples of such a substituent include a hydroxyl group, an azide group, a cyano group, an alkoxy group, a cycloalkyloxy group, an aryloxy group, and an esterified group. And a good carboxyl group.
  • L 2 represents at least one selected from the group consisting of an oxyalkylene group, an amide group, and an alkylene group.
  • the oxyalkylene group include oxyalkylene groups having 2 or 3 carbon atoms.
  • the alkylene group include an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkylene group having about 3 to 6 carbon atoms is preferable from the viewpoint of solubility.
  • m represents 0 or 1 from the viewpoint of synthesis. Further, n represents an integer of 2 to 4 from the viewpoint of virus capture.
  • Z represents a single bond or a tetravalent to divalent linking group, and is selected according to the number of n. That is, when Z represents a single bond, n is 2, and the sialo-glycan or asialo-glycan glycoside is a divalent glycoside. On the other hand, when Z represents a trivalent or higher linking group, n is 3 or more, and the sialo-sugar chain or asialo-glycan glycoside is branched to form a branched polyvalent glycoside.
  • Z is not particularly limited as long as it is a polyvalent linking group that generates a single bond or branched glycoside corresponding to the valence of the polyvalent glycoside, and the end of the divalent linking group represented by Y
  • Specific examples of the linking group represented by Z include the following linking groups (Z-1) to (Z-3), and the linking group (Z-1) is preferable from the viewpoint of solubility.
  • p in the linking group (Z-3) represents an integer of 1 to 20, and is preferably 4, 10, or 16 from the viewpoint of synthesis.
  • polyvalent sialo-glycan or asialo-glycan glycosides examples include the following. Among these, a polyvalent asialo sugar chain glycoside is preferable from the viewpoint of virus capture.
  • the polyvalent sialic sugar chain or asialo sugar chain glycoside according to the present invention can be produced by applying a known method.
  • the production method is not particularly limited, and a polyvalent asialoglycan glycoside can be obtained by an asialoglycan synthesizing step and a condensation step of an asialoglycan and a polyvalent linker compound.
  • a polyvalent sialo-glycan glycoside can be obtained.
  • a method for synthesizing an O-linked glycoside including a step of synthesizing a sugar donor and a step of transferring the sugar donor to a sugar acceptor using a glycosyltransferase;
  • a method for synthesizing an N-linked glycoside including a step of binding an amino sugar to an organic acid having a carboxyl group can also be used.
  • influenza virus is a suitable virus, and specific examples include highly pathogenic type A avian influenza virus, human type A influenza virus and human type B influenza virus. Therefore, the virus inhibitor containing the sialosugar or asialoglycan glycoside is preferably used as an influenza therapeutic agent.
  • the virus that can be inhibited or adsorbed by the chelating function of sialosaccharide or asialoglycan glycoside used as an active ingredient is not limited to influenza virus, but can be applied to various viruses other than influenza virus.
  • viruses include paramyxovirus group, parainfluenza virus group, rotavirus, adenovirus, coronavirus, polyomavirus and the like.
  • the virus inhibitor of the present invention is used as a pharmaceutical preparation, it is not particularly limited to its dosage form, but is directly applied to nasal cavity and pharynx such as nasal solutions and gels, aerosols such as oral sprays, etc.
  • Nasal preparations or transdermal absorption preparations such as ointments, emulsions and creams are exemplified as preferred dosage forms, which can be prepared by conventional methods.
  • it when setting it as a pharmaceutical formulation, it can contain the said virus inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier as a base component.
  • the base component for producing the dosage form includes higher alcohols such as octyldodecanol; isopropyl myristate, adipine Fatty acid esters such as diisopropyl acid and isopropyl palmitate; suspending agents such as polysorbate 80 and polyoxyethylene hydrogenated castor oil; polymer compounds such as carboxyvinyl polymer, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone and sodium hyaluronate; glycerin, propylene Polyhydric alcohols such as glycol and 1,3-butylene glycol; pH regulators such as diisopropanolamine, sodium hydroxide, potassium dihydrogen phosphate and sodium hydrogen phosphate; sodium hydrogen phosphate, sodium chloride ,
  • each component in the pharmaceutical preparation is not particularly limited.
  • polymer compound 0-10% by mass polyhydric alcohol 0-30% by mass, pH regulator 0-10% by mass, stabilizer 0-10% by mass, and preservative 0-5% by mass. it can.
  • base components in the production of ointments, emulsions and creams include hydrocarbons such as white petrolatum, liquid paraffin, paraffin, microcrystalline wax, squalane and plastibase; higher alcohols such as cetanol, stearyl alcohol and behenyl alcohol Higher fatty acids such as isostearic acid and oleic acid; fatty acid esters such as medium chain fatty acid triglycerides, isopropyl myristate, diisopropyl adipate and isopropyl palmitate; surfactants such as polysorbate 80 and polyoxyethylene hydrogenated castor oil; carboxyvinyl polymer , Hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone and sodium hyaluronate, etc .; glycerin, propylene glycol, 1,3-butylene glycerin Polyhydric alcohols such as alcohol; pH regulators such as diisopropanolamine, sodium hydroxide, potassium dihydride
  • the active ingredient of the present invention can be produced by mixing a multivalent glycoside and a medium such as water.
  • a medium such as water.
  • the blending ratio of each component in the pharmaceutical preparation for example, water (medium) 0 to 80% by mass, hydrocarbons 0 to 90% by mass, higher alcohols 0 to 25% by mass, higher fatty acids 0 to 25% by mass, Fatty acid ester 0 to 20% by mass, surfactant 0.01 to 10% by mass, polymer compound 0 to 10% by mass, polyhydric alcohol 0 to 30% by mass, pH regulator 0 to 10% by mass, stabilizer 0 To 10% by weight and preservative 0 to 5% by weight.
  • the virus inhibitor of the present invention can be immobilized on a suitable carrier for preventing the spread of viruses and preventing infection, and the obtained virus adsorption carrier is also included in the present invention.
  • the virus inhibitor is used by filling it into a filter or mask, for example, the virus inhibitor of the present invention can be carried on a sheet.
  • the sheet used examples include nonwoven fabrics or woven fabrics made of synthetic fibers or natural fibers, and examples of materials include polyester, polyamide, polyacryl, polypropylene, rayon, cotton, wood pulp, and the like.
  • melt blown nonwoven fabric is preferable as a filter for a mask, an air purifier, and an air conditioner because the fiber diameter can be reduced and the pore size can be reduced.
  • the method for supporting the polyvalent glycoside, which is an active ingredient, on the sheet is arbitrary, but for example, a method of supporting it using an adhesive can be employed.
  • the present invention also includes a method for treating or preventing a viral disease comprising administering the viral inhibitor to a patient. Since the virus inhibitor has a high virus adsorption ability, it captures the virus by contact with the virus, and can inhibit the occurrence of symptoms caused by the action of the virus on the living body.
  • influenza caused by influenza viruses such as highly pathogenic Avian influenza virus, human influenza A virus and human influenza B virus; paramyxovirus group, parainfluenza virus group, rota
  • influenza viruses such as highly pathogenic Avian influenza virus, human influenza A virus and human influenza B virus; paramyxovirus group, parainfluenza virus group, rota
  • viral diseases caused by viruses such as viruses, adenoviruses, coronaviruses, and polyoma viruses.
  • a method for treating or preventing influenza virus diseases is preferable.
  • treatment means that symptoms specific to a viral disease are reduced or severeness is suppressed before and after administration of the composition according to the present invention. Means that significant administration of symptoms peculiar to viral diseases is suppressed after administration of the composition according to the present invention.
  • treatment and “prevention” may be used without distinction.
  • the dose of the virus inhibitor can be appropriately selected depending on the symptoms, age, dosage form, etc.
  • as an injection for example, as an active ingredient, 0.1 mg to 100 mg at a time, preferably 10 mg to 80 mg once a day. It may be administered once or several times. If necessary, an amount outside the range may be used.
  • Gal D-Galactose
  • GalT Galactosyltransferase
  • Glc D-Glucose
  • GlcNAc N-Acetylglucosamine
  • GlcNAc 2 N, N'-diacetylchitobiose (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) (GlcNAc) 3 : N, N ', N''-triacetylchitotriose (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) (GlcNAc) 4 : N, N ', N'',N'''-tetraacetylchitotetraose (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) GlcNAc ⁇ -pNP : p-Nitrophenyl ⁇ -N-acetylglucosaminide GlcNAc-Pr-G
  • N-Acetylglucosaminyltransferase HBTU: O- (Benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N',-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • HEPES 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • Hp Heptane-1,7-diyl
  • HPLC High performance liquid chromatography
  • Hx Hexane-1,6-diyl
  • IC 50 Half maximal (50%) inhibitory concentration
  • ITC Isothermal titration calorimeter
  • Lac Lactose (Gal ⁇ 1,4Glc) LacNAc: N-Acetyllactosamine (Galbe ⁇ 1,4GlcNAc) LacNAc-Bt-LacNAc: Butan1,4-diyl- ⁇ -N-acetyllactosaminide LacNAc-Hx-LacNAc: Hexan-1,6-diyl- ⁇ -N-acetyllactosaminide MeOH: Methanol MOPS: 3-Morpholinopropanesulfonic acid
  • Na-Ac buffer Sodium acetate buffer NAHase: ⁇ -N-Acetyl-D-hexosaminnidase
  • Na-Pi buffer Sodium phosphate buffer
  • Neu5Ac N-Acetylneuraminic acid
  • Neu5Ac ⁇ 2,6LacNAc-Bt-LacNAc ⁇ 2,6Neu5Ac 1,4-dioxybutyl-bis- ⁇ - (Neu5Ac ⁇ 2,6-N-acetyllactosaminide)
  • Neu5Ac ⁇ 2,6LacNAc-Hx-LacNAc ⁇ 2,6Neu5Ac 1,6-dioxyhexyl-bis- ⁇ - (Neu5Ac ⁇ 2,6-N-acetyllactosaminide)
  • NMR Nuclear magnetic resonance
  • PBS Phosphate-buffered saline, 10 mM, pH 7.4
  • pNP p-Nitrophenyl Pr: Propane-1,3-diyl
  • Pt Pentane-1,5-diyl
  • Aminopentanecarboxyamido RU Resonance unit SiaT: Sialyltransferase
  • SNA Sambusus nigra agglutinin (elderberry)
  • SPR Surface plasmon resonance SSA: Sambucus sieboldiana agglutinin (Japanese elderberry)
  • TFA Trifluoroacetic acid
  • TLC Thin layer chromatography T.
  • Trichoderma reesei Trichoderma reesei Tris-HCl: Bis (2-hydroxylethy) iminotris- (hydroxymethyl) methane-hydrochloric acid UDP: Uridine 5'-diphosphate WGA: Wheat germ agglutinin (Tritium vulgare)
  • the divalent glycoside according to the present invention uses (GlcNAc) 4 as a donor and accepts alkanediol using a glycosyltransferase reaction of chitinolytic enzyme in a crude enzyme preparation derived from A. orientalis.
  • GlcNAc divalent glycosides were synthesized, and then the obtained GlcNAc divalent glycoside was derived from bovine milk.
  • bovine milk was synthesized by introducing galactose into both GlcNAc residues according to the methods described in WO2007 / 026669 and JP-A-2008-31156.
  • the sialoglycoside divalent glycoside is obtained by using a sialyl group by using ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase or the like according to the method described in WO2007 / 026669. Was synthesized.
  • the tetravalent glycoside according to the present invention can be simply described by using the transglycosylation reaction of chitinolytic enzyme in the crude enzyme preparation derived from A. orientalis, using (GlcNAc) 4 as a donor, and trifluoroaceta GlucNAc single-terminal glycoside is obtained by linking these with the amide terminal alcohol linker as a receptor, and then the aglycone amino group of the obtained GlcNAc single-terminal glycoside and a polyvalent chelate having a polyvalent carboxyl group The carboxyl group of the molecule was synthesized by condensing with a condensing agent for peptide synthesis such as HBTU.
  • a condensing agent for peptide synthesis such as HBTU.
  • the sialoglycoside tetravalent glycoside is obtained by using a sialyl group using ⁇ 2,6- (N) -sialyltransferase or the like according to the method described in WO2007 / 026669. Was synthesized.
  • Crude enzyme preparation derived from A. orientalis Dry powder of 80% ammonium sulfate fraction of culture supernatant of actinomycete Amycolatopsis orientalis (IFO 12806).
  • Bovine milk-derived ⁇ 1,4-galactosyltransferase manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.
  • Bovine small intestine-derived alkaline phosphatase, grade I ROCHE Trichoderma reesei cellulase (XL-522): Nagase Chemtech Co., Ltd.
  • the compound 11 was synthesized as follows. Add 100 ml of pyridine to 50 ml of 2- (2-Aminoethoxy) ethanol with ice cooling and stirring, add 100 ml of anhydrous TFA, and synthesize 2- (2-trifluoroacetamidoethoxy) ethanol, a linker compound, by a conventional method. did. LacNAc (25.0 mg, 65 mmol) and 2- (2-Trifluoroasetamidoethoxy) ethanol (16.41 ml, 82 mmol) were dissolved in 48.6 ml of 100 mM Na-Ac buf. (PH 4.0), and then T.
  • EGTA (3.8 mg, 0.08 mmol) is dissolved in 240 ⁇ l DMSO and 180 ⁇ l triethylamine, DIEA (154.5 ⁇ l, 0.88 mmol) and HBTU (269.5 mg, 0.71 mmol) as a condensing agent are added and stirred for 10 minutes. did. 2- (2-Aminoethoxy) ethyl ⁇ -LacNAc (188 mg, 0.4 mmol) was dissolved in DMSO (1000 ⁇ l), added to the previous reaction solution, and reacted at room temperature with stirring.
  • the reaction was complete after hours.
  • the reaction solution was subjected to Biogel P-2 Extra fine column chromatography ( ⁇ 35 ⁇ 600 mm) equilibrated with DW. After eluting at 1.5 ml / min with DW and collecting 15 ml in each test tube, each fraction was analyzed for absorbance at 210 nm and analyzed with TLC Silica gel 60 (same conditions), and F-1 (Fr. No. 45 to 63) were collected and concentrated.
  • the F-1 fraction was subjected to ODS column chromatography ( ⁇ 20 ⁇ 500 mm) equilibrated with 15% MeOH. Elution was carried out with the same solvent at a flow rate of 2.0 ml / min, and each test tube was 26 ml. Each fraction was analyzed for absorbance at 210 nm and analyzed by TLC Silica gel 60 (same conditions), RP-18F (developing solvent: 15% MeOH, color reagent: orcinol sulfate), and F-2 (Fr. No. 33- 37) was collected and concentrated. The F-2 fraction was concentrated and freeze-dried, and the structure was analyzed by 1 H-NMR, 13 C-NMR and MALDI-TOF-MS.
  • LacNAc tetravalent glycoside compound 11
  • the yield of LacNAc tetravalent glycoside was 143.1 mg (0.0654 mmol), and the yield per receptor was 81.7%.
  • reaction was stopped.
  • the reaction solution was concentrated and subjected to ODS column chromatography ( ⁇ 20 ⁇ 500 mm) equilibrated with DW. After eluting 1100 ml with the same solvent at a flow rate of 2.7 ml / min, the solvent was switched to 20% MeOH for elution.
  • an extended sugar chain LacNAc tetravalent glycoside (compound 12) was obtained as F-1.
  • the yield of the extended sugar chain LacNAc tetravalent glycoside was 90.5 mg (0.025 mmol), and the yield per receptor was 82.6%.
  • EGTA (25.3 mg, 0.067 mmol) was dissolved in DMSO (210 ⁇ l) and triethylamine (140 ⁇ l), DIEA (115.9 ⁇ l, 0.67 mmol) and HBTU (252.7 mg, 0.53 mmol) as a condensing agent were added and stirred for 15 minutes.
  • the spacer-extended LacNAc tetravalent glycoside had a yield of 144.1 mg / kg (0.0546 mmol) and a yield per receptor of 81.5%.
  • Example 1 ⁇ Evaluation of influenza virus infection inhibition by polyvalent glycosides> (1) O-Linked Multivalent Glycosides Influenza viruses of Compound 7, Compound 9, Compound 11, Compound 14, Compound 12, and Compound 16 that are the above-mentioned O-linked polyvalent sialoglyco- or asialo-glycan glycosides As an evaluation for adsorption, a plaque assay for human influenza virus [A / Kadoma / 2/2006 (H3N2)] (100 PFU / well) was performed by a conventional method using MDCK cells in a confluent state.
  • H3N2 Kadoma / 2/2006
  • FIG. 1 A to G are as follows. A: Compound 7, B: Compound 9, C: Compound 11, D: Compound 14, E: Compound 12, F: Compound 16, G: Tamiflu.
  • any of the evaluated compounds that is, O-linked polyvalent glycosides
  • Compound 11 of the tetrameric asialoglycan glycoside and Compound 14 of the sialoglycan glycoside showed a stronger inhibition rate than Tamiflu at any concentration.
  • N-Linked Multivalent Glycoside The N-linked polyvalent sialosaccharide chain or asialoglycan glycoside compound N-1 and compound N-2 were evaluated for adsorption to influenza virus. Evaluation was performed by plaque assay for human influenza virus [A / Kadoma / 2/2006 (H3N2)] (100 PFU / well) in the same manner as (1) except that the compound type was changed. Tamiflu was used as a positive control. The results are shown in FIG. In FIG. 2, H, I, and G are as follows. H: Compound N-1, I: Compound N-2, G: Tamiflu.
  • any of the evaluated compounds that is, N-linked polyvalent glycosides, can inhibit influenza virus infection in the same manner as O-linked compounds.
  • an influenza virus [A / Narita / 1 /, which is a strain different from the influenza virus [A / Kadoma / 2/2006 (H3N2)] used in the above evaluation. 2009 (H1N1)] was evaluated, Compound 11 as an O-linked asialoglycan glycoside, Compound 17 as an O-linked sialoglycan glycoside, N-linked asialoglycan glycoside It was found that the compound N-1 and the N-linked sialoglycan glycoside compound N-2 showed an infection inhibition rate of 50% or more.
  • Compound 11 Compound N-1 and Compound N-2 showed an infection inhibition rate of 80% or more at a compound concentration of 100 ⁇ g / ml, and among them, Compound N-1 and Compound N-2 were 10 ⁇ g / ml. It was found that an infection inhibition rate of 70% or more was exhibited even at a compound concentration of ml.

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Abstract

　下記一般式で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤（上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ－アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、一般式（Ｙ－１）又は（Ｙ－２）で表される２価の連結基を表し、ｍは０又は１の整数を表し、ｎは２～４の整数を表し、Ｚは単結合又は二価～四価の連結基を表す。ただし、Ｗ１とＷ２が共にＮ－アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ－１）及び（Ｙ－２）中、Ｌ１は炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。

Description

ウィルス阻害剤
　本発明は、ウィルス阻害剤に関する。
　インフルエンザは、有効な治療法や感染防御方が見出されていない病原体のひとつであり、極めて感染力が強く、抗原変異を繰り返し、それまでの抗原性とは異なる新種が出現するため、ワクチンなどによる効果的な防御対策が立てにくいことで知られている。最近では、トリインフルエンザウィルスを起源とした新たなヒトインフルエンザウィルスの発生が危惧されており、インフルエンザ予防・治療薬の開発が期待されている。
　インフルエンザウィルスの宿主への感染は、ウィルス表面タンパク質であるヘマグルチニン（血赤球凝集素：ＨＡ）が細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによって起こると考えられている。例えば、トリ類から単離したインフルエンザウィルスＡ型は、末端にＮ－アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトース（ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ）を有する糖鎖に優先的に結合し、このウィルスと非常に類似したヒトインフルエンザウィルスは、末端のＮｅｕＡｃ（α２，６）Ｇａｌ構造に高い結合親和性を示すことが報告されている。
　特に、シアル酸含有糖鎖（シアロ糖鎖）化合物が、ウィルス受容体への結合を阻害する感染阻害剤として期待されている。例えば、特開平１０－３１０６１０号公報には、ポリスチレン誘導体にシアリルラクトースを結合させた高分子体が、インフルエンザウィルスと強い結合を有することが記載されている。また、特開２００３－７３３９７号公報には、広範囲なインフルエンザウィルス分離株に対して感染阻害活性を有する化合物として、α－ポリグルタミン酸を骨格とし、その側鎖に、ｐ－アミノフェニル基をリンカーとしてＮ－アセチルラクトサミンを導入し、さらにオリゴ糖酸の非還元末端にシアル酸を付与した分子量２０００～１００万のシアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドを開示している。
　また、特開２００８－３１１５６号公報には、高い吸着阻害活性及び感染阻害活性を有し、かつ安価に製造されるウィルス吸着剤として、シアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドのシアル糖鎖部を改変したシアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン含有人工ポリペプチドや、γポリグルタミン酸を骨格とし、リンカーを変更したシアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドを開示している。これらのＮ－アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドは分子量２００～５００万と記載されている。
　国際公開第２００９／００１８０５号パンフレットには、γ－ポリグルタミン酸に、末端にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてシアロ糖鎖を結合させたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーが開示されている。このＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーは、合成収率も高く実用的な方法で合成でき、インフルエンザウィルスの感染阻害活性も向上されたものと記載されている。
　しかしながら、これらの文献に開示されているいずれの化合物も、ウィルス吸着結合能としては充分でなく、また合成が容易であるとする特開２００８－３１１５６号公報及び国際公開第２００９／００１８０５号パンフレットにそれぞれ開示された人工糖鎖ポリペプチドは、いずれもポリマー型であり、分子量が大きいため取扱いが困難な場合がある。
　従って、本発明の目的は、高いウィルス阻害能を有する低分子量のウィルス阻害剤を提供することにある。
　本発明の各態様によれば、以下のウィルス阻害剤、ウィルス吸着担体及びインフルエンザの治療又は予防方法が提供される。
　［１］　下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ－アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ－１）又は（Ｙ－２）で表される二価の連結基を表し、ｍは０又は１の整数を表し、ｎは２～４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価～二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ－アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ－１）及び（Ｙ－２）中、Ｌ１は炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。
［２］　前記Ｌ１中の炭化水素基が炭素数１～３０の炭化水素基である［１］記載のウィルス阻害剤。
［３］　前記Ｌ１が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基又はこれらを２つ以上アミド結合で連結させたものである［１］又は［２］に記載のウィルス阻害剤。
［４］　前記Ｚは、下記（Ｚ－１）～（Ｚ－３）のいずれか１つである［１］～［３］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。下記式（Ｚ－３）中、ｐは１～２０の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 
［５］　前記Ｗ１及びＷ２がいずれも水酸基を表すアシアロ糖鎖配糖体である［１］～［４］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。
［６］　　前記ウィルス阻害剤がインフルエンザウィルス阻害剤である［１］～［５］のいずれかに記載のウィルス阻害剤。
［７］　［１］～［６］のいずれかに記載のウィルス阻害剤を担体上に固定化させたウィルス吸着担体。
［８］　［１］～［５］のいずれかに記載のウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法。
［９］　前記ウィルス疾患がインフルエンザウィルス疾患である［８］に記載のウィルス疾患の治療又は予防方法。
本発明の実施例にかかるＯ結合型多価配糖体化合物のウィルス感染阻害評価の結果を示すグラフである。 本発明の実施例にかかるＮ結合型多価配糖体化合物のウィルス感染阻害評価の結果を示すグラフである。
　本発明のウィルス阻害剤は、下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ－アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ－１）又は（Ｙ－２）で表される二価の連結基を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは２～４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価～二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ－アセチルノイラミン酸残基になることはない。式（Ｙ－１）又は（Ｙ－２）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。
　本発明のウィルス阻害剤にかかる上記一般式（Ｉ）で表される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は、糖単位を有する複数の糖鎖部が非糖鎖部で連結された低分子且つ多価の配糖体であり、高いウィルス吸着能を有することができる。特に、本発明にかかる多価配糖体は、シアロ糖鎖配糖体だけでなく、アシアロ配糖体であっても、高いウィルス吸着能を備えている。
　従って本発明によれば、高いウィルス吸着能を有する低分子量のウィルス阻害剤を提供することができる。
　以下、本発明について説明する。
　なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２は、本発明にかかる配糖体の末端の糖鎖部に位置しており、水酸基又はＮ－アセチルノイラミン酸残基を表すが、共にＮ－アセチルノイラミン酸残基となることはない。ここで、Ｗ１又はＷ２としてＮ－アセチルノイラミン酸残基を有する場合、シアロ糖鎖部となって、式（Ｉ）の化合物はシアロ糖鎖配糖体を構成する。具体的に、Ｗ１がＮ－アセチルノイラミン酸残基でＷ２が水酸基であるα２，６型とすれば、ヒト感染型のインフルエンザウィルスに対する感染阻害のためのウィルス阻害剤となり、Ｗ１が水酸基でＷ２がＮ－アセチルノイラミン酸残基であるα２，３型とすれば、トリ感染型のインフルエンザウィルスに対する感染阻害のためのウィルス阻害剤とすることができる。なお、Ｎ－アセチルノイラミン酸残基は、その水酸基、カルボキシル基およびアミド基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基、アシル基等で化学的に修飾されていてもかまわない。
　一方、Ｗ１及びＷ２が共に水酸基の場合、アシアロ糖鎖部となって、式（Ｉ）の化合物はアシアロ糖鎖配糖体を構成する。
　糖鎖部としては、合成し易さの点で一工程少ないアシアロ糖鎖であることが有利である。
　前記化合物が、式（Ｉ）におけるＹで示される二価の連結基のうち、上記式（Ｙ－１）を連結基として有する場合は、所謂、Ｎ結合型多価配糖体を示す。連結基としてのＮ型は、合成し易さ及び収率の点で有利である。式（Ｙ－１）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。Ｌ１の連結基における炭化水素基としては、炭素数１～３０のものが合成上の溶解度およびウィルス捕捉の観点から好ましく、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基が挙げられる。アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基としては、好ましくは、炭素数１～２０の直鎖又は分岐鎖のものが挙げられる。
　アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基等の直鎖アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、２－エチルヘキシル基等の分岐鎖アルキル基が挙げられる。アミド結合を有する炭化水素基としては、これらの炭化水素基が２つ以上をアミド結合で連結したものを挙げることができる。
　アルケニル基の具体例としてはビニル基、プロペニル基、アリル基等が挙げられる。アルキニル基の具体例としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、炭素数３～１０のものが挙げられ、特に炭素数３～８のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。
　アリール基としては炭素数６～１４のもの、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、炭素数７～１４のアラルキル基、具体的にはベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基としてはＣ３－Ｃ８シクロアルキル置換Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、例えばシクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルエチル基、シクロペンチルエチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。
　また、当該炭化水素は置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基、アルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、エステル化されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。
　前記化合物が、式（Ｉ）におけるＹで示される二価の連結基のうち、上記式（Ｙ－２）を連結基として有する場合は、所謂、Ｏ結合型多価配糖体を示す。式（Ｙ－２）中、Ｌ２は、オキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１つを表す。
　オキシアルキレン基としては、炭素数２又は３のオキシアルキレン基を挙げることができる。アルキレン基としては、炭素数１～６のアルキレン基を挙げることができ、溶解度の観点から炭素数３～６程度のアルキレン基であることが好ましい。
　式（Ｉ）中、ｍは、合成上の観点から０又は１を表すものである。
　また、ｎは、ウィルス捕捉の観点から２～４の整数を表すものである。
　式（Ｉ）中、Ｚは、単結合又は４価～２価の連結基を表し、上記ｎの数に応じて選択される。即ち、Ｚが単結合を表す場合、ｎは２となって、当該シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は二価の配糖体となる。一方、Ｚが３価以上の連結基を表す場合、ｎは３以上となって、当該シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は分岐して、分岐型多価配糖体となる。
　Ｚとしては、多価配糖体の価数に相当する単結合又は分岐型配糖体を生成する多価の連結基であれば特に制限はなく、Ｙで示される二価の連結基の末端との反応性に応じて、当業者であれば適宜選択可能である。
　Ｚとして表される連結基の具体例としては、以下の連結基（Ｚ－１）～（Ｚ－３）を挙げることができ、溶解度の観点から連結基（Ｚ－１）であることが好ましい。なお、連結基（Ｚ－３）におけるｐは、１～２０の整数を表し、合成上の観点から４、１０又は１６であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 
　このような多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体としては、例えば、以下のものをあげることができる。なかでも、多価アシアロ糖鎖配糖体であることがウィルス捕捉の観点から好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 
　本発明にかかる多価シアル糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体は、公知の方法を適用して製造することができる。製造方法については特に制限はなく、アシアロ糖鎖の合成工程及びアシアロ糖鎖と多価リンカー化合物との縮合工程により、多価アシアロ糖鎖配糖体を得ることができ、多価糖鎖配糖体のシアル化工程を更に加えることにより、多価シアロ糖鎖配糖体を得ることができる。
　また、例えば、糖供与体を合成する工程及び、糖転移酵素を用いて糖供与体を糖受容体へ転移させる工程を含むＯ結合型配糖体の合成方法；縮合剤を用いて、多価カルボキシル基を有する有機酸にアミノ糖を結合させる工程を含むＮ結合型配糖体の合成方法なども利用することができる。これらの方法については、J. Biochem., 2008, Vol.143, 22、Carbohydr. Res., 2008, Vol.343, p434、特開２００８－３１１５６号公報、ＷＯ２００７／０２６６６９号、ＷＯ２００９／００１８０５号などに記載されている。
　対象となるウィルスとしては、インフルエンザウィルスが好適なウィルスであり、具体的には、高病原性Ａ型トリインフルエンザウィルス、ヒトＡ型インフルエンザウィルスおよびヒトＢ型インフルエンザウィルス等が挙げられる。従って、前記シアロ糖又はアシアロ糖鎖配糖体を含むウィルス阻害剤は、インフルエンザ治療剤として好適に用いられる。
　また、有効成分として用いるシアロ糖又はアシアロ糖鎖配糖体のキレート機能により阻害又は吸着され得るウィルスは、インフルエンザウィルスに限らず、インフルエンザウィルス以外の様々なウィルスにも適用可能である。そのようなウィルスとしては、例えば、パラミクソウィルス群、パラインフルエンザウィルス群、ロタウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ポリオーマウィルス等が例示される。
　本発明のウィルス阻害剤を医薬製剤として利用する場合、特にその剤型に制限されるものではないが、点鼻用の液剤及びゲル剤、口腔スプレーなどのエアロゾルなどの鼻腔や咽頭に直接適用する点鼻適用製剤、あるいは軟膏剤、乳剤及びクリーム剤などの経皮吸収用製剤が好ましい剤型として例示され、それらは常法により調製することができる。また、医薬製剤とする場合には、前記ウィルス阻害剤と、基剤成分として医薬として許容可能な担体とを含むものとすることができる。
　たとえば、点鼻適用製剤としては、液剤、ゲル剤、懸濁剤、エアゾール剤等の剤形として用いることが好ましい。上記剤形を製造するための基剤成分について説明すると、液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤を製造する場合の基剤成分としては、オクチルドデカノール等の高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の懸濁化剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール及び１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
　液剤、ゲル剤、懸濁剤及びエアゾール剤などの医薬製剤を製造する場合、本発明の有効成分である多価アシアロ糖鎖又はシアロ糖鎖配糖体及び水等の媒体を混合して製造することができる。前記医薬製剤における各成分の配合割合に特に制限はなく、たとえば、水（媒体）５０～９９質量％、高級アルコール０～２５質量％、脂肪酸エステル０～２０質量％、懸濁化剤０～５質量％、高分子化合物０～１０質量％、多価アルコール０～３０質量％、ｐＨ調節剤０～１０質量％、安定化剤０～１０質量％及び防腐剤０～５質量％とすることができる。
　軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合の基剤成分の例としては、白色ワセリン、流動パラフィン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン及びプラスチベース等の炭化水素；セタノール、ステアリルアルコール及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；イソステアリン酸及びオレイン酸等の高級脂肪酸；中鎖脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル及びパルミチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヒアルロン酸ナトリウム等の高分子化合物；グリセリン、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール；ジイソプロパノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム及びエデト酸ナトリウム等の安定化剤；メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウム等の防腐剤等が挙げられる。
　軟膏剤、乳剤及びクリーム剤を製造する場合、本発明の有効成分である多価配糖体及び水等の媒体を混合して製造することができる。前記医薬製剤における各成分の配合割合に特に制限はなく、たとえば水（媒体）０～８０質量％、炭化水素０～９０質量％、高級アルコール０～２５質量％、高級脂肪酸０～２５質量％、脂肪酸エステル０～２０質量％、界面活性剤０．０１～１０質量％、高分子化合物０～１０質量％、多価アルコール０～３０重量％、ｐＨ調節剤０～１０質量％、安定化剤０～１０質量％及び防腐剤０～５質量％である。
　また、本発明のウィルス阻害剤をウィルスの拡散防止や感染予防のために、適当な担体に固定化することもでき、得られたウィルス吸着担体も本発明に包含される。本ウィルス阻害剤をフィルターやマスクへ充填して利用する場合、たとえば、本発明のウィルス阻害剤をシートに担持させることにより実施することができる。
　用いられるシートの例としては、合成繊維または天然繊維からなる不織布または織布を挙げることができ、材質としては、例えば、ポリエステル、ポリアミド、ポリアクリル、ポリプロピレン、レーヨン、木綿、木材パルプ等が挙げられる。特にメルトブローン不織布は、繊維径を細くでき、ポアサイズを小さくできることから、マスクや空気清浄機用並びにエアコン用フィルターとして好ましい。また、シートに有効成分である多価配糖体を担持させる方法は任意であるが、たとえば接着剤を用いて担持させる方法を採用することができる。
　本発明は、前記ウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法も包含する。
　前記ウィルス阻害剤は、高いウィルス吸着能を有しているので、ウィルスと接触してウィルスを捕捉し、生体に対してウィルスが作用することによって生じる症状の発生を阻害することができる。
　前記ウィルス疾患としては、前述と同様であり、高病原性Ａ型トリインフルエンザウィルス、ヒトＡ型インフルエンザウィルス及びヒトＢ型インフルエンザウィルス等のインフルエンザウィルスによるインフルエンザ；パラミクソウィルス群、パラインフルエンザウィルス群、ロタウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ポリオーマウィルス等のウィルスによるウィルス疾患等を挙げることができる。特に、インフルエンザウィルス疾患の治療又は予防方法であることが好ましい。
　本発明において「治療」とは、本発明にかかる組成物の投与前後においてウィルス疾患に特有の症状が軽減又は、重篤化が抑制されることを意味し、また、本発明において「予防」とは、本発明にかかる組成物の投与後においてウィルス疾患に特有の症状の顕著な発生が抑制されることを意味する。ただし、本発明においては、用語「治療」と「予防」とを明確に区別することなく使用してもよい。
　ウィルス阻害剤の投与量は、症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、例えば注射剤として、例えば有効成分として１回０．１ｍｇ～１００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ～８０ｍｇの量で１日１回又は数回投与してもよい。なお、必要により当該範囲外の量を用いてもよい。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
　なお、使用材料の略語は以下のとおりである。
A.orientalis：Amycolatopsis orientalis
APase：Alkaline phosphatase
BSA：Bovine serum albumin
Bt：Butane-1,4-diyl
CMP：Cytidine monophosphate
DEG：Diethylene glycol
DIEA：N-Ethyldiisopripylamine
DMSO：Dimethyl sulfoxide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide HCl
EGTA：Ethylene glycol tetraacetic acid
ESI-MS：Electrospray ionization mass spectrometry
EtOH：Ethanol
FAB-mass：Fast atom bombardment mass spectrometry
Gal：D-Galactose
GalT：Galactosyltransferase
Glc：D-Glucose
GlcNAc：N-Acetylglucosamine
(GlcNAc)2：N, N’-diacetylchitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc)
(GlcNAc)3：N, N',N''-triacetylchitotriose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc)
(GlcNAc)4：N,N',N'',N'''-tetraacetylchitotetraose
(GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc)
GlcNAcβ-pNP：p-Nitrophenyl β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Pr-GlcNAc：Propan1,3-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Bt-GlcNAc：Butan1,4-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Pt-GlcNAc：Pentan-1,5-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAcβ-Hx：6-Hydroxyhexyl β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Hx-GlcNAc：Hexan-1,6-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GlcNAc-Hp-GlcNAc：Heptan-1,7-diyl-β-N-acetylglucosaminide
GnT：N-Acetylglucosaminyltransferase
HBTU：O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HEPES：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid
Hp：Heptane-1,7-diyl
HPLC：High performance liquid chromatography
Hx：Hexane-1,6-diyl
IC50：Half maximal (50%) inhibitory concentration
ITC：Isothermal titration calorimeter
Lac：Lactose (Galβ1,4Glc)
LacNAc：N-Acetyllactosamine (Galbeβ1,4GlcNAc)
LacNAc-Bt-LacNAc：Butan1,4-diyl-β-N-acetyllactosaminide
LacNAc-Hx-LacNAc：Hexan-1,6-diyl-β-N-acetyllactosaminide
MeOH：Methanol
MOPS：3-Morpholinopropanesulfonic acid
Na-Ac buffer：Sodium acetate buffer
NAHase：β-N-Acetyl-D-hexosaminnidase
Na-Pi buffer：Sodium phosphate buffer
Neu5Ac：N-Acetylneuraminic acid
Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Ac：
　　　1,4-dioxybutyl-bis-β-(Neu5Acα2,6-N-acetyllactosaminide)
Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Ac：
　　　1,6-dioxyhexyl-bis-β-(Neu5Acα2,6-N-acetyllactosaminide)
NMR：Nuclear magnetic resonance
PBS：Phosphate-buffered saline, 10 mM, pH 7.4
pNP：p-Nitrophenyl
Pr：Propane-1,3-diyl
Pt：Pentane-1,5-diyl
PTC：Aminopentanecarboxyamido
RU：Resonance unit
SiaT：Sialyltransferase
SNA：Sambusus nigra agglutinin (elderberry)
SPR：Surface plasmon resonance
SSA：Sambucus sieboldiana agglutinin (Japanese elderberry)
TFA：Trifluoroacetic acid
TLC：Thin layer chromatography
T. reesei：Trichoderma reesei
Tris-HCl：Bis(2-hydroxylethy)iminotris-(hydroxymethyl)methane-hydrochloric acid
UDP：Uridine 5’-diphosphate
WGA：Wheat germ agglutinin (Tritium vulgare)
　また、各種測定には、以下の機器又は条件をそれぞれ適用した。
・HPLC
　　送液装置　　　　　：JASCO PU-2080 Plus Intelligent HPLC Pump
　　オートサンプラー　：JASCO AS-2055 Plus Intelligent Sampler 
　　検出器　　　　　　：JASCO MD-2010 Plus Multiwavelength Detector
　　データ処理　　　　：JASCO-BORWIN/HSS-2000
　分析条件
　　　カラム　　　　　　：Asahipak NH2P-50 4-E (φ4.6 × 250 mm)
　　　溶媒　　　　　　　：80% CH3CN
　　　カラム温度 　：40 ℃
　　　検出　　　　　　　：UV 210 nm
　　　流速　　　　　　　：1.0 ml/min
　　又は、
　　　カラム　　　　　　：Imtakt Unison UK-Amino (φ4.6 × 250 mm)
　　　溶媒　　　　　　　：75% CH3CN
　　　カラム温度 　：40 ℃
　　　検出　　　　　　　：UV 210 nm
　　　流速　　　　　　　：0.8 ml/min
　　又は、
　　　カラム　　　　　　：Imtakt Unison US-C18 (φ4.6 × 250 mm)
　　　溶媒　　　　　　　：15% MeOH containing 0.05% TFA
　　　カラム温度 　：40℃
　　　検出　　　　　　　：UV 210 nm 260 nm
　　　流速　　　　　　　：1.0 mL/min
・NMR
　　1H-NMR
　　　分析機器　 ：JEOL JNM-LA 500FT NMR spectrometer
　　　外部標準　 ：sodium 3-(trimethylsilyl)-propionate (TPS)
　　　温度　 ： 25℃
　　　溶媒　　　　： D2O
　　　サンプル管　： φ3 mm
　　又は、
　　１H-NMR、13C-NMR
　　　分析機器　 ：　JEOL EX-270 NMR
　　　外部標準 　：　sodium 3-(trimethylsilyl)-propionate (TPS)
　　　温度　 ： 25℃
　　　溶媒　　　　： D2O
　　　サンプル管　： φ5 mm
・ESI-MS
　　サンプル溶液 (0.1 mg/ml) を調整し、以下の機器を用いて測定した。
　　　分析機器　　　　　　： JEOL JMS-T100LC Accu TOF mass spectrometer
　　　オリフィス電圧掃引　： 80 V
　　　計算機　　　　　　　： レセルピン
　　　イオン化モード 　　： ESIζ
　　　溶媒　　　　　　　 ： D.W.
　　　温度　　　　　　　　： RT
・MALDI-TOF-MS
　　　分析機器　　　　　　： Autoflex (BRUKER DALTONICS)
　　　測定モード　　　　　： positive reflection mode
　　　マトリックス　　　　： 2,5-dihydroxybenzoic acid 10 mg/ml (H2O/EtOH=70/30)
　　　ターゲット　　 　　： MTP 384 target ground steel T F
　　　スタンダード　　　　： peptide calibration standard
［多価配糖体の合成］
　本発明にかかる二価配糖体は、簡単に言えば、A. orientalis由来粗酵素標品中のキチン分解酵素の糖転移反応を用いて、(GlcNAc)4を供与体とし、アルカンジオールを受容体として、J. Biochem., 2008, Vol.143, pp.21-30に記載された方法に従い、GlcNAc二価配糖体を合成し、次いで、得られたGlcNAc二価配糖体にウシミルク由来のβ1,4-galactosyltransferaseを用いて、ＷＯ２００７／０２６６６９及び特開２００８－３１１５６号に記載された方法に従って、両末端GlcNAc残基にガラクトースを導入することによって合成した。シアロ糖鎖二価配糖体は、得られたアシアロ糖鎖二価配糖体に、WO２００７／０２６６６９号に記載された方法に従って、α２，６－（Ｎ）－シアリルトランスフェラーゼ等を用いてシアリル基を導入することによって合成した。
　また本発明にかかる四価配糖体は、簡単に言えば、A. orientalis由来粗酵素標品中のキチン分解酵素の糖転移反応を用いて、(GlcNAc)4を供与体とし、トリフルオロアセタミド末端アルコールリンカーを受容体として、これらを連結してGlucNAc片末端配糖体を得て、次いで、得られたGlcNAc片末端配糖体のアグリコンアミノ基と、多価カルボキシル基を有する多価キレート分子のカルボキシル基とを、ＨＢＴＵのようなペプチド合成用縮合剤により縮合させて合成した。シアロ糖鎖四価配糖体は、得られたアシアロ糖鎖四価配糖体に、ＷＯ２００７／０２６６６９号に記載された方法に従って、α２，６－（Ｎ）－シアリルトランスフェラーゼ等を用いてシアリル基を導入することによって合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 
　なお、以下の合成において使用された材料は、以下のとおりである。
　A. orientalis由来粗酵素標品：放線菌Amycolatopsis orientalis (IFO 12806)培養液上清の80％硫安沈殿の画分の乾燥粉末。
　ウシミルク由来β1,4-galactosyltransferase；シグマアルドリッチジャパン（株）社製。
　ウシ小腸由来alkaline phosphatase,gradeＩ：ROCHE社製
　Trichoderma reesei由来cellulase (XL-522) ：ナガセケムテック社製
　ヒト由来組換え体昆虫細胞発現β1,3-(N)-Acethylglucosaminyltransferaseは本学農学部応用生物化学科生物工学研究室より供与。α2,6-sialyltransferase (Photobacterium damsela) はヤマサ醤油（株）より供与。α2,6-sialyltransferase (Rat, Recombinant, Bombyx mori) は本学農学部応用生物化学科生物工学研究室より供与して頂いたカイコの体液をそのまま粗酵素標品として用いた。BMC. Biotechnol., 2009, Vol.9, pp.1-13
　α2,3-sialyltransferase (Rat, Recombinant, Spodoptera fungiperda)：CALBIOCHEM社製
　(GlcNAc)4：焼津水産化学工業（株）製キトオリゴ糖から精製。
　LacNAc：焼津水産化学工業（株）製ラクトサミン溶液を活性炭－セライトカラムクロマトグラム処理により精製。
　UDP-Gal、UDP-GlcNAc、CMP-Neu5Ac：ヤマサ醤油（株）製
　なお、各種酵素は、ＷＯ２００７／０２６６６９、ＷＯ２００９／００１８０５に記載の方法に従って、精製し、活性を測定したものを使用した。
　各化合物の合成は、以下のとおりである。
＜化合物６の合成＞
　(GlcNAc)4 (830 mg、1.0 mmol) 及び 1,4-butanediol (45 μｌ、0.5 mmol) を50 mM Na-Pi buf. (pH 6.7) 8.96 mlに溶解後、A. orientalis由来粗酵素標品（0.5 U/mlを1.0 ml添加し、40℃で振とう反応を行い、常法に従って、GlcNAc-Bt-GlcNAc（化合物２）を得た。GlcNAc-Bt-GlcNAcは収量40.9 mg (0.0823 mmol) で供与体当たりの収率は8.24 %であった。
　得られたGlcNAc-Bt-GlcNAc (29.8 mg、0.060 mmol) 及びUDP-Gal (109.8 mg、0.18 mmol)を、50 mM Tris-HCl buf. (pH 8.0) 12.0 ml、200 mM MnCl2・H2O 1.0 ml、10 mg/ml BSA 1.0 mlに溶解後、182 U/μｌ APase を2.2μｌ及びβ1,4-GalT 500 mUを 添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10μｌを経時的に採取し、190μｌのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Galが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した40時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液をD.W.で平衡化したODSクロマトグラフィー (φ 20×300 mm) に供した。流速2.7 ml/min、D.W. (250 ml) で洗浄後、D.W. (500 ml) - 25% MeOH (500 ml) のメタノール直線濃度勾配法で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取した。各フラクションにつき、GlcNAcのN-アセチル基に由来する210 nm及び、ウリジンに由来する260 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.16～22) を得た。F-1を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び ESI-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-1がLacNAc-Bt-LacNAc（化合物６）であることを確認した。LacNAc-Bt-LacNAcの収量は42.1 mg (0.051 mmol)、受容体当たりの収率は85.5%であった。
　LacNAc-Bt-LacNAc；HRESIMS：m/z 843.32240 [M＋Na]＋(calcd for C32H56N2Na1O22, 843.32224)；1H-NMR(D2O, 500 MHz)：δ 4.54 (d, 2H, J1,28.0 Hz, H-1), 4.49 (d, 2H, J1’2’ 8.0 Hz, H-1'), 4.00 (dd, 2H, J5,6a2.5 Hz, J6a,6b 12.5 Hz, H-6b), 3.94 (2H, H-4’), 3.91 (m, 2H, H-αb), 3.84 (dd, 2H, J5,6a 5.0 Hz, J6a6b 12.5Hz, H-6a), 3.80-3.73 (8H, H-5’, H-6’, H-4), 3.72 (t, 2H, J1,2 6.0 Hz, J2,3 6.0 Hz, H-2), 3.70 (t, 2H, H-3), 3.66 (dd, 2H, J2’,3’ 10 Hz, J3’,4’3.5 Hz, H-3’), 3.61-3.59 (4H, H-5, H-αa), 3.55 (dd, 2H, J1’,2’ 10 Hz, J2’,3’ 8.0 Hz, H-2’), 2.04 (s, 6H, CH 3 CONH-), 1.59 (q, 4H, H-β)；13C-NMR(D2O, 500 MHz)：δ177.2 (CH3 CONH-), 105.7 (C-1’), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3’), 75.3 (C-3), 73.8 (C-2’), 72.7 (C-α), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 63.0 (C-6), 57.9 (C-2), 27.9 (C-β), 25.0 (CH3CONH-) 
＜化合物７の合成＞
　供与体を(GlcNAc)4(830 mg、1.0 mmol) とし、受容体を1,6-hexanediol (59 mg、0.5 mmol) とし、A. orientalis由来粗酵素標品 0.5 U/mlを用いた以外は、上記化合物２の合成と同様にして合成反応を行い、GlcNAc-Hx-GlcNAcを得た。GlcNAc-Hx-GlcNAc（化合物４）の収量は44.3 mg (0.0844 mmol)、供与体当たりの収率は8.44%であった。
　得られたGlcNAc-Hx-GlcNAc (62.9 mg、0.120 mmol) 及びUDP-Gal (219.6 mg、0.36 mmol)を50 mM Tris-HCl buf. (pH 8.0) 34.0 ml、200 mM MnCl2・H2O 2.0 ml、10 mg/ml BSA 2.0 mlに溶解後、182 U/μｌ APase を4.4μｌ及びβ1,4-GalT 1000 mUを 添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10μｌを経時的に採取し、190μｌのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Galが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した28時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液を、D.W及び100％メタノールで洗浄したSep-Pak C18カラムクロマトグラフィー (35 cc) に供した。D.W、5％メタノール、10％メタノール、15％メタノール、20％メタノールそれぞれ175 mlにより溶出させた。それぞれの画分をTLC Silica gel 60 (展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1、呈色試薬：オルシノール硫酸)による分析を行った。TLCにより目的物があると確認された10％メタノール、15％メタノールの画分を濃縮し、さらにCHCl3/CH3OH/H2O (5/5/1) で平衡化したシリカゲルカラムクロマトグラフィー (φ20×300 mm) に供し、同溶媒にて流速10 ml/minで溶出した。各試験管に15 mlずつ分取してTLC Silica gel 60（同条件）で分析した。F-1(Fr.No.16～40)、F-2(Fr.No.41～98)を回収・濃縮・凍結乾燥し、1H-NMRにより構造解析を行った。その結果、F-2として、LacNAc-Hx-LacNAc（化合物７）を得た。LacNAc-Hx-LacNAcの収量は76.3 mg (0.090 mmol)、受容体当たりの収率は74.9%であった。
　LacNAc-Bt-LacNAc； FAB-mass：m/z 850 [M＋Na]+ ； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)： δ 4.53 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.47 (d, 2H, J1’2’7.7 Hz, H-1’), 4.00-3.52 (28H, H-6b, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-6’b, H-6’a, H-5’, H-4’, H-3’, H-2’, H-αb, H-αa), 2.03 (s, 6H, CH 3 CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.1 (CH3 CONH-), 105.7(C-1’), 103.8 (C-1), 81.3 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.3 (C-3’), 75.3(C-3), 73.8 (C-2’), 73.3 (C-α), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 62.9 (C-6), 57.9 (C-2), 31.4 (C-β), 27.5 (C-γ), 25.0 (CH3CONH-) 
＜化合物８の合成＞
　上記化合物８は以下のようにして合成した。
　CMP-Neu5Ac・2Na (26.3 mg, 40 μmol) 及びLacNAc-Bt-LacNAc；化合物６ (13.1 mg、16 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 1000 μl、D.W. 731 μlに溶解し、250 mM MnCl2 20 μl及び10 mg/ml BSA 20 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 3.65 μl及び22.5 U/ml α2,6-SiaT 45 μl (25 mU) を添加し、37℃で静置反応を行った。反応液10 μlを経時的に採取し、190 μlのD.W.に加え、100℃で10分間煮沸し、反応の経時変化をHPLCにより分析した。Neu5Acが両末端に転移された目的生成物のピークが定常に達した73時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液をD.W.で平衡化したODSクロマトグラフィー (φ20×300 mm) に供した。流速2.7 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取した。各フラクションにつき、GlcNAcのN-アセチル基に由来する210 nm及び、シチジンに由来する260 nmの吸光度測定、及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =5/5/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.7～9)、D.W.で平衡化したSephadex G-25 column chromatography (φ25×550 mm)に供した。約0.35 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に約3.5 mlずつ分取後、各フラックションにつき210、260 nmの吸光度測定 (Fig. 14B)、及びTLC Silica gel 60（同条件）による分析を行なった。210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-2 (Fr.No.31～50) を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び ESI-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-2として、Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Acを得た。Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Acの収量は14.3 mg (10 μmol)、受容体当たりの収率は62.7%であった。
Neu5Acα2,6LacNAc-Bt-LacNAcα2,6Neu5Ac；ESI-MS：m/z 1423.19105 [M＋Na]+ ；1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.57 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.46 (d, 2H, J1’2’7.5 Hz, H-1’), 4.01 (dd, 2H, J5,6a 4.5 Hz, J6a,6b 5.5 Hz, H-6b), 3.99 (dd, 2H, H-6’b) 3.95 (t, 2H, J3’,4’ 3.0 Hz, J4’,5’3.0 Hz, H-4’), 3.92-3.88 (6H, H-8”, H-9”b, H-αb), 3.86-3.81 (8H, H-6a, H-5’, H-5”, H-6”), 3.79-3.73 (4H, H-2, H-3), 3.71-3.67 (4H, H-3’, H-4”), 3.66-3.61 (8H, H-4, H-5, H-9”a, H-αa), 3.56-3.54 (6H, H-2’, H-6’a, H-7”), 2.69 (2H, J3”ax,3”eq12.5 Hz, J3”eq,4”4.5 Hz, H-3”eq), 2.06 (s, 6H, CH3 CONH”-), 2.05 (s, 6H, CH 3 CONH-), 1.73 (t, 2H, J3”ax,3”eq12.0 Hz, J3”ax,4” 12.5 Hz, H-3”ax), 1.61 (m, 4H, H-β)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)： δ177.8 (CH3 CONH”-), 177.2 (CH3 CONH-), 176.3 (C-1”), 106.3 (C-1’), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5’), 76.5 (C-5), 75.4 (C-6”), 75.3 (C-3’), 75.3(C-3), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 72.6 (C-α), 71.3 (C-4’), 71.3 (C-4”), 71.0 (C-7”), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 57.8 (C-2), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 27.9 (C-β), 25.1 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)
＜化合物９の合成＞
　CMP-Neu5Ac・2Na (48.4 mg、73.6 μmol) 及びLacNAc-Hx-LacNAc；化合物７ (25 mg、29.5 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 1840 μl、D.W. 1340 μlに溶解し、250 mM MnCl236.8 μl及び10 mg/ml BSA 36.8 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 6.71 μl及び22.5 U/ml α2,6-SiaT 89 μl (50 mU) を添加し、37℃で静置反応を行い、上記化合物８と同様にして、Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Acを得た。Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Acの収量は24.2 mg (16.9 μmol)、受容体当たりの収率は57.5%であった。
　Neu5Acα2,6LacNAc-Hx-LacNAcα2,6Neu5Ac；FAB-mass： m/z 1432 [M+H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)： δ 4.55 (d, 2H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.45 (d, 2H, J1’2’ 8.0 Hz, H-1’), 3.892-3.366 (40H, H-6b, H-6’b, H-4’, H-8”, H-9”b, H-αb, H-6a, H-5’, H-5”, H-6”, H-2, H-3, H-3’, H-4”, H-4, H-5, H-9”a, H-αa, H-6’a, H-7”), 2.68 (dd, 2H, J3”ax,3”eq 12.2 Hz, J3”ax,4”4.6 Hz, H-3”eq), 2.05 (s, 6H, CH 3 CONH”-), 2.03 (s, 6H, CH 3 CONH-), 1.71(t, 2H, J3”ax,3”eq 12.5 Hz, J3”ax,4” 12.5 Hz, H-3”ax), 1.56 (m, 4H, H-β), 1.30 (m, 4H, H-γ)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)： δ177.8 (CH3 CONH”-), 177.2 (CH3 CONH-), 176.3 (C-1”), 106.3 (C-1’), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.5 (C-4), 77.3(C-5’), 76.5 (C-5), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3’), 75.2 (C-6”), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 73.4 (C-α), 71.2 (C-4’), 71.2 (C-4”), 71.0 (C-7”), 66.1 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 57.7 (C-2), 54.7 (C-5”), 42.9 (C-3”), 31.4 (C-β), 27.5 (C-γ), 25.2 (CH3CONH”-), 25.1 (CH3CONH-)
＜化合物１１の合成＞
　上記化合物１１は以下のようにして合成した。
　2-(2-Aminoethoxy)ethanol 50 mlにピリジン 100 mlを氷冷、攪拌しながら加え、無水TFA 100 mlを添加して、常法により、リンカー化合物である2-(2-trifluoroacetamidoethoxy)ethanolを合成した。
　LacNAc (25.0 mg、65 mmol) 及び2-(2-Trifluoroasetamidoethoxy)ethanol (16.41 ml、82 mmol) を100 mM Na-Ac buf. (pH 4.0) 48.6 mlに溶解後、T. ressei生産部分精製cellulase2100 Uを1.0 mg添加し、37℃で振とう反応を行い、常法によって、2-(2-Trifluoroacetamidoethoxy)ethyl β-LacNAcを得た。次いで、2-(2-Trifluoroacetamidoethoxy)ethylβ-LacNAcに0.1 M NaOHを加えて溶解し、Sephadex G-25 column chromatographyを用いて常法により、脱アシル化し、アミノ基に変換して、2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAcを得た。収量85.4 mg (0.182 mmol) で受容体当たりの収率は98.7%であった。
　次いで、EGTA (33.8 mg、0.08 mmol) をDMSO 240 μl及びトリエチルアミン 180 μlに溶解し、DIEA (154.5 μl、0.88 mmol) と、縮合剤としてHBTU (269.5 mg、0.71 mmol) を添加し、10分間撹拌した。2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAc(188 mg、0.4 mmol)をDMSO (1000 μl) に溶解して先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応した。TLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =6/4/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により反応の進行を追跡し、目的生成物のスポット濃度が変化しない72時間後に反応を終了した。反応液をD.W.で平衡化したBiogel P-2 Extra fineカラムクロマトグラフィー (φ35×600 mm) に供した。1.5 ml/min、D.W.で溶出し、各試験管に15 mlずつ分取後、各フラックションにつき210 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（同条件）による分析を行い、F-1 (Fr.No.45～63) を回収・濃縮した。次に、F-1画分を15% MeOHで平衡化したODSカラムクロマトグラフィー (φ20×500 mm) に供した。流速2.0 ml/min、同溶媒により溶出し、各試験管26 mlずつ分取した。各フラクションにつき210 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（同条件）、RP-18F（展開溶媒：15% MeOH, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により分析し、F-2 (Fr.No.33～37) を回収・濃縮した。F-2の画分を濃縮・凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及びMALDI-TOF-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-2としてLacNAc四価配糖体（化合物１１）を得た。LacNAc四価配糖体は収量143.1 mg (0.0654 mmol) で受容体当たりの収率は81.7%であった。
　LacNAc四価配糖体； MALDI-TOF-MS：m/z 2211.800 [M＋Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.58 (d, 4H, J1,2 8.0 Hz, H-1), 4.48 (d, 4H, J1’,2’8.0 Hz, H-1’), 4.00 (4H, H-6b), 3.98 (4H, H-αb), 3.98 (4H, H-4’), 3.84 (4H, H-6a), 3.81-3.71 (20H, H-6’, H-2, H-5’, H-4, H-3), 3.69-3.60 (40H, H-d, H-3’, H-β, H-αa, H-γ, H-c, H-5), 3.55 (dd, 4H, J1’,2’ 7.5 Hz, J2,310.0 Hz, H-2’), 3.44 (m, 8H, H-δ), 3.36 (s, 8H, H-a), 2.85 (t, 4H, H-b), 2.05 (s, 12H, CH3 CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.2 (CH3 CONH-), 176.5 (-NHCO-), 105.7 (C-1’), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5’), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3’), 73.8 (C-2’), 72.4 (C-d), 72.3 (C-β), 71.8 (C-α), 71.7 (C-γ), 71.5 (C-c), 71.4 (C-4’), 63.8 (C-6’), 63.0 (C-6), 61.3 (C-a), 57.9 (C-2), 57.1 (C-b), 41.5 (C-δ), 25.1 (CH3CONH-)
＜化合物１２の合成＞
　上記化合物１２は、以下のようにして合成した。
　受容体基質LacNAc四価配糖体 (65.7 mg、0.03 mmol)、供与体基質UDP-GlcNAc・2Na (117.2 mg、0.18 mmol)、補因子MnCl2・4H2O (19.0 mg、0.96 mmol) を50 mM Tris-HCl buf. (pH 6.8) 10.29 mlに溶解し、防腐剤として1% (w/v) NaN3 (0.12 ml) を加え、部分精製酵素β3GnTII (221.4 mU、1.59 ml) を添加し、37℃で静置反応を行い、上記と同様にして、原料及び中間生成物のピークがなくなり、GlcNAcが4箇所に転移された目的生成物のピークが定常に達した220時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液にUDP-Gal・２Na (128.1 mg、0.21 mmol) を加え、β4GalTＩ (1000 mU、1 ml) を添加し、37℃で静置反応を行った。GlcNAc転移反応と同様に反応液を経時的に採取して、HPLCにより分析し、ガラクトースが4箇所に転移された目的生成物のピークが定常に達した48時間後に100℃で10分間煮沸して反応を停止した。この反応液を濃縮し、D.Wで平衡化したODSカラムクロマトグラフィー (φ20×500 mm) に供した。流速2.7 ml/min、同溶媒により1100 ml溶出した後、20% MeOHに溶媒を切り替え溶出させた。各試験管27 mlずつ分取し、210 nm、260 nmの吸光度測定及びTLC Silica gel 60（展開溶媒：CHCl3/CH3OH/H2O =6/4/1, 呈色試薬：オルシノール硫酸）、RP-18F（展開溶媒：15% MeOH, 呈色試薬：オルシノール硫酸）により分析し、210 nmでのみ吸収のあったピークを回収・濃縮しF-1 (Fr.No.52～58) を得た。F-1を凍結乾燥し、1H-NMR、13C-NMR及び MALDI-TOF-MSにより構造解析を行なった。その結果、F-1として、糖鎖延長型LacNAc四価配糖体（化合物１２）を得た。糖鎖延長型LacNAc四価配糖体の収量は90.5 mg (0.025 mmol)、受容体あたりの収率は82.6%であった。
糖鎖延長型LacNAc四価配糖体； MALDI-TOF-MS：m/z 3675.252 [M＋Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ4.73 (d, 4H, H-1”), 4.58 (d, 4H, J1,28.0 Hz, H-1), 4.50-4.45 (8H, H-1''', H-1’), 4.17 (4H, H-4’), 4.01-3.94 (16H, H-6'''b, H-4''', H-6b, H-αb), 3.89-3.54 (108H, H-6'''b, H-5''', H-3''', H-2''', H-6”, H-5”, H-4”, H-3”, H-2”, H-6’, H-5’, H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-αa, H-β, H-γ, H-c, H-d), 3.44 (m, 8H, H-δ), 3.36 (s, 8H, H-a), 2.83 (t, 4H, H-b), 2.05 (s, 24H, CH3 CONH”-, CH3 CONH-)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.7 (CH3 CONH”-), 177.2 (CH3 CONH-), 176.5 (-NHCO-), 105.75 (C-1’), 105.71 (C-1'''), 105.5 (C-1”), 103.8 (C-1), 84.9 (C-3’), 81.4 (C-4), 81.1 (C-4”), 78.2 (C-5'''), 77.7 (C-5’), 77.6 (C-5), 77.4 (C-5”), 75.4 (C-3), 75.3 (C-3'''), 75.0 (C-3”), 73.8 (C-2'''), 72.8 (C-2’), 72.4 (C-d), 72.3 (C-β), 71.8 (C-α), 71.7 (C-γ), 71.5 (C-c), 71.4 (C-4'''), 71.1 (C-4’), 63.84 (C-6'''), 63.77 (C-6’), 62.9 (C-6), 62.7 (C-6”), 61.3 (C-a), 58.0 (C-2”), 57.8 (C-2), 57.1 (C-b), 41.3 (C-δ), 25.1 (CH3CONH”-), 25.0 (CH3CONH-)
＜化合物１３の合成＞
　6-Trifluoroacetamidohexanoic acid (238.4 mg、0.105 mmol) をDMSO 1000 μlに溶解させ、DIEA (608.5 μl、3.50 mmol) とHBTU (265.3 mg、0.70 mmol) を添加し、15分間撹拌した。2-(2-Aminoethoxy)ethylβ-LacNAc (329 mg、0.7 mmol) を溶解したDMSO (2750 μl) 溶液を、先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応を行い、上記と同様にして、2-[2-(5-Trifluoroacetamidopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAcを得た。
　次いで、2-[2-(5-Trifluoroacetamidopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAc (122.8 mg、0.181 mmol) に0.1 M NaOH (1.5 ml) を加えて溶解し、室温で反応を行って、常法により、脱アシル化し、アミノ基に変換して、2-[2-(5-Aminopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAcを得た。
　EGTA (25.3 mg、0.067 mmol) をDMSO 210 μl及びトリエチルアミン 140 μlに溶解し、DIEA (115.9 μl、0.67 mmol) と、縮合剤としてHBTU (252.7 mg、0.53 mmol) を添加し、15分間撹拌した。2-[2-(5-Aminopentanecarboxyamidoethoxy)]ethylβ-LacNAc (175.2 mg、0.30 mmol) をDMSO (16000 μl) に溶解して、先ほどの反応液に加え、室温で攪拌しながら反応を行い、前記と同様にして、スペーサー延長型LacNAc四価配糖体（化合物１３）を得た。スペーサー延長型LacNAc四価配糖体は収量144.1 mg (0.0546 mmol) で受容体当たりの収率は81.5%であった。
　スペーサー延長型LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 2666.006 [M + Na]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.59 (d, 4H, J1, 28.0 Hz, H-1), 4.49 (d, 4H, J1', 2' 8.0 Hz, H-1'), 4.02 (4H, H-6b), 3.99 (m, 4H, H-ab), 3.95 (4H, H-4'), 3.85 (dd, 4H, J5, 6a 5.5 Hz, J6a, 6b12.5 Hz, H-6a), 3.80-3.68 (52H, H-6', H-2, H-5', H-4, H-3, H-d, H-b, H-aa, H-g, H-c, H-5), 3.56 (dd, 4H, J1’, 2’ 8.0 Hz, J2’, 3’ 10.0 Hz, H-2’), 3.38 (m, 8H, H-δ), 3.31 (s, 8H, H-a), 3.24 (t, 2H, H-ι), 2.82 (t, 4H, H-b), 2.27 (t, 8H, H-ε), 2.05 (s, 12H, CH 3CONH-), 1.62 (8H, H-ζ) 1.55 (8H, H-θ), 1.33 (8H, H-η)；13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 179.6 (-NHCO- of spacer), 177.2 (CH3 CONH-), 176.0 (-NHCO- of EGTA), 105.7 (C-1'), 103.8 (C-1), 81.4 (C-4), 78.2 (C-5'), 77.6 (C-5), 75.4 (C-3) 75.3 (C-3’), 73.8 (C-2'), 72.5 (C-d), 72.3 (C-b), 71.8 (C-a), 71.8 (C-g, C-c), 71.4 (C-4'), 63.8 (C-6'), 62.9 (C-6), 61.5 (C-a), 57.9 (C-2), 57.5 (C-b), 41.8 (C-ι), 41.7 (C-δ), 38.4 (C-ε), 31.1 (C-θ), 28.5 (C-η), 27.8 (C-ζ), 25.1 (CH3CONH-)
＜化合物１４の合成＞
　上記化合物１４は以下のようにして合成した。
　CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びLacNAc四価配糖体；化合物１１ (21.9 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体を得た。Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は22.7 mg (6.78 μmol)、受容体当たりの収率は67.7%であった。
Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3355.584 [M + H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.61 (4H, H-1), 4.46 (d, 4H, J1', 2' 8.0 Hz, H-1'), 4.01-3.40 (124H, H-9”, H-8”, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6', H-5’, H-4’, H-3’, H-2’, H-6, H-5, H-4, H-3, H-2, H-a, H-b, H-g, H-δ, H-a, H-c, H-d), 2.85 (4H, H-b), 2.69 (dd, 4H, H-3”eq), 2.08 (s, 12H, CH 3CONH”-), 2.05 (s, 12H, CH 3CONH-), 1.73 (t, 4H, H-3”ax)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 177.8 (CH3 CONH-), 177.2 (CH3 CONH”-), 176.5 (C-1”), 176.3 (-NHCO-), 106.3 (C-1'), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5'), 76.5 (C-5), 75.40 (C-6”), 75.37 (C-3), 75.3 (C-3’), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2’), 72.3 (C-b, C-d), 71.8 (C-a), 71.7 (C-g), 71.3 (C-4”, C-4), 71.0 (C-7”, C-c), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 61.4 (C-a), 57.6 (C-2, C-b), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 41.6 (C-δ), 25.2 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-) 
＜化合物１５の合成＞
　上記化合物１５は以下のようにして合成した。
　CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びLacNAc四価配糖体；化合物１１ (21.9 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 509 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び100 mU/178 μl α2,3-SiaT 89 μl (50 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体（化合物１５）を得た。Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体の収量は13.5 mg (4.03 μmol)、受容体当たりの収率は38.0%であった。
Neu5Acα2,3LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3356.970 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.59-4.56 (8H, H-1, H-1'), 4.13 (4H, H-5’), 4.02-3.98 (12H, H-6b, H-ab, H-4'), 3.92-3.85 (16H, H-9”, H-8”, H-6’b), 3.77-3.57 (76H, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6'a, H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-aa, H-b, H-g, H-c, H-d), 3.45 (m, 8H, H-δ), 3.58 (s, 8H, H-a), 2.84 (t, 4H, H-b), 2.78 (dd, 4H, H-3”eq), 2.05 (s, 24H, CH 3CONH”-, CH 3CONH-), 1.82 (t, 4H, H-3”ax)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 177.8 (CH3 CONH”-), 177.2 (CH3 CONH-), 176.7 (C-1”), 176.5 (-NHCO-), 105.4 (C-1'), 103.9 (C-1), 102.7 (C-2”), 81.2 (C-4), 78.3 (C-5'), 78.0 (C-3’), 77.6 (C-5), 75.7 (C-6”), 75.3 (C-3), 74.6 (C-8”), 72.4 (C-d), 72.3 (C-b), 72.2 (C-2'), 71.8 (C-a), 71.7 (C-g), 71.5 (C-c), 71.5 (C-4”), 70.9 (C-7”), 70.3 (C-4’), 65.4 (C-9”), 63.8 (C-6’), 62.9 (C-6), 61.3 (C-a), 57.9 (C-2, C-b), 54.5 (C-5”), 42.5 (C-3”), 41.6 (C-δ), 25.1 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)
＜化合物１６の合成＞
　上記化合物１６は以下のようにして合成した。
　CMP-Neu5Ac・2Na (29.6 mg、45 μmol) 及び糖鎖延長型LacNAc四価配糖体；化合物１２ (36.5 mg、10 μol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、前記と同様にして、糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体（化合物１６）を得た。糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は10.7 mg (2.22 μmol)、受容体当たりの収率は22.2%であった。
糖鎖延長型Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 4819.738 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ 4.57 (d, 4H, J1, 2 8.0 Hz, H-1), 4.48 (8H, H-1''', H-1’), 4.17 (4H, H-4’), 4.03-3.54 (152H, H-9"", H-8"", H-7"", H-6"", H-5"", H-4"", H-6''', H-5''', H-4''', H-3''', H-2''', H-6”, H-5”, H-4”, H-3”, H-2”, H-6’, H-5’, H-3’, H-2’, H-6, H-5, H-4, H-3, H-2, H-α, H-β, H-γ, H-c, H-d), 3.46 (16H, H-δ, H-a), 2.89 (t, 4H, H-b), 2.69 (t, 4H, H-3""eq), 2.07 (s, 12H, CH 3CONH""-), 2.05 (s, 24H, CH 3CONH”-, CH 3CONH-) 1.73 (4H, H-3""ax)；13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ177.8 (CH3 CONH""-), 177.7 (CH3 CONH”-), 177.2 (CH3 CONH-), 176.7 (C-1""), 176.3 (-NHCO-), 106.3 (C-1'''), 105.7 (C-1'), 105.4 (C-1”), 103.9 (C-1), 103.0 (C-2""), 84.8 (C-3’), 83.3 (C-4”), 81.4 (C-4), 77.7 (C-5'), 77.6 (C-5), 77.1 (C-5”), 76.5 (C-5'''), 75.4 (C-6""), 75.31 (C-3) 75.28 (C-3'''), 75.1 (C-3”), 74.5 (C-8""), 73.6 (C-2'''), 72.8 (C-2'), 72.3 (C-b, C-d), 71.9 (C-a), 71.6 (C-g), 71.3 (C-4"", C-4''') 71.2 (C-4’), 71.1 (C-c), 71.0 (C-7""), 66.2 (C-6'''), 65.5 (C-9""), 63.8 (C-6'), 63.0 (C-6), 62.9 (C-6”), 61.7 (C-a), 57.8 (C-2”, C-2, C-b), 54.7 (C-5""), 42.9 (C-3""), 41.8 (C-δ), 25.14 (CH3CONH”-), 25.09 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH""-) 
＜化合物１７の合成＞
　上記化合物１７は以下のようにして合成した。
　CMP-Neu5Ac・2Na (32.9 mg、50 μmol) 及びスペーサー延長LacNAc四価配糖体；化合物１３ (26.4 mg、10 μmol) を100 mM MOPS buf. (pH 7.4) 625 μl、D.W. 73 μlに溶解し、200 mM MnCl2・4H2O 12.5 μl及び100 mg/ml BSA 12.5 μlを加えた。7500 U/410 μl APase 2 μl及び595.4 mU/ml α2,6-SiaT含有カイコ体液 525 μl (313 mU) を添加し、37℃で静置反応を行って、上記と同様にして、スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体（化合物１７）を得た。スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体の収量は23.6 mg (6.31 μmol)、受容体当たりの収率は63.1%であった。
スペーサー延長Neu5Acα2,6LacNAc四価配糖体；MALDI-TOF-MS：m/z 3809.790 [M + 4H]+； 1H-NMR (D2O, 500 MHz)：δ4.61 (d, 4H, J1, 2 8.0 Hz, H-1), 4.46 (d, 4H, J1', 2'8.0 Hz, H-1'), 4.03-3.99 (12H, H-6b, H-6’b, H-ab), 3.94 (4H, H-4'), 3.90-3.53 (92H, H-9”, H-8”, H-7”, H-6”, H-5”, H-4”, H-6'a, H-5', H-3’, H-2’, H-6a, H-5, H-4, H-3, H-2, H-aa, H-b, H-g, H-c, H-d), 3.50 (s, 8H, H-a), 3.39 (m, 8H, H-δ), 3.26 (t, 2H, H-ι), 2.93 (4H, H-b), 2.68 (dd, 4H, H-3”eq), 2.27 (t, 8H, H-ε), 2.07 (s, 12H, CH 3CONH”-), 2.04 (s, 12H, CH 3CONH-), 1.73 (t, 4H, H-3”ax), 1.61 (8H, H-ζ), 1.54 (8H, H-θ), 1.33 (8H, H-η)； 13C-NMR (D2O, 500 MHz)：δ179.6 (-NHCO- of spacer), 177.7 (CH3 CONH-), 177.3 (CH3 CONH”-), 176.4 (C-1”), 176.2 (-NHCO- of EGTA), 106.3 (C-1'), 103.7 (C-1), 103.0 (C-2”), 83.6 (C-4), 77.3 (C-5'), 76.5 (C-5), 75.4 (C-6”), 75.4 (C-3) 75.3 (C-3’), 74.5 (C-8”), 73.6 (C-2'), 72.3 (C-b), 72.2 (C-d), 71.9 (C-a), 71.8 (C-g), 71.2 (C-4”, C-4'), 71.1 (C-7”), 71.0 (C-c), 66.2 (C-6’), 65.5 (C-9”), 63.2 (C-6), 62.0 (C-a), 59.4 (C-b), 57.6 (C-2), 54.8 (C-5”), 42.9 (C-3”), 42.2 (C-ι), 41.8 (C-δ), 38.4 (C-ε), 30.8 (C-θ), 28.4 (C-η), 27.8 (C-ζ), 25.2 (CH3CONH-), 24.9 (CH3CONH”-)
［実施例１］
＜多価配糖体のインフルエンザウィルス感染阻害評価＞
（１）　Ｏ結合型多価配糖体
　上記のＯ結合型多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体である化合物７、化合物９、化合物１１、化合物１４、化合物１２及び化合物１６のインフルエンザウィルスに対する吸着評価として、コンフルエント状態となったＭＤＣＫ細胞を用いてヒトインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］（１００ＰＦＵ／ウェル）に対するプラークアッセイを常法により行った。吸着は１時間行い、余剰のウィルス液を除去した後、１％寒天培地を重層化して３５℃４８時間の培養によりプラークを発生させた。プラークの数をカウントし、コントロール（インフルエンザウィルスのみをインキュベートしたもの）と比較し、各ペプチドに対するインフルエンザウィルス感染阻害率を計算した。ポジティブコントロールとして、タミフルを用いた。
　結果を図１に示す。なお図１において、Ａ～Ｇはそれぞれ以下のとおりである。
　Ａ：化合物７、Ｂ：化合物９、Ｃ：化合物１１、Ｄ：化合物１４、Ｅ：化合物１２、Ｆ：化合物１６、Ｇ：タミフル。
　図１に示されるように、評価を行ったいずれの化合物、即ちＯ結合型多価配糖体も、糖シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖の糖鎖部の種類に拘わらず、インフルエンザウィルスの感染を阻害できることがわかる。
　特に、四量体のアシアロ糖鎖配糖体の化合物１１と、シアロ糖鎖配糖体の化合物１４は、いずれの濃度でもタミフルよりも強い阻害率を示した。
（２）　Ｎ結合型多価配糖体
　上記のＮ結合型多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ－１及び化合物Ｎ－２について、インフルエンザウィルスに対する吸着評価を行った。評価は、化合物種を変更した以外は上記（１）と同様にして、ヒトインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］（１００ＰＦＵ／ウェル）に対するプラークアッセイにより行った。ポジティブコントロールとして、タミフルを用いた。
　結果を図２に示す。なお図２において、Ｈ、Ｉ及びＧはそれぞれ以下のとおりである。
　Ｈ：化合物Ｎ－１、Ｉ：化合物Ｎ－２、Ｇ：タミフル。
　図２に示されるように、評価を行ったいずれの化合物、即ちＮ結合型多価配糖体も、Ｏ結合型の化合物と同様に、インフルエンザウィルスの感染を阻害できることがわかる。
　また、Ｏ型配糖体及びＮ型配糖体について、上記評価に用いたインフルエンザウィルス［Ａ／Ｋａｄｏｍａ／２／２００６（Ｈ３Ｎ２）］とは別の株であるインフルエンザウィルス［Ａ／Ｎａｒｉｔａ／１／２００９（Ｈ１Ｎ１）］に対する阻害評価を行ったところ、Ｏ結合型アシアロ糖鎖配糖体である化合物１１、Ｏ結合型シアロ糖鎖配糖体である化合物１７、Ｎ結合型アシアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ－１及びＮ結合型シアロ糖鎖配糖体である化合物Ｎ－２で、５０％以上の感染阻害率を示すことがわかった。特に、化合物１１、化合物Ｎ－１及び化合物Ｎ－２の３種は、１００μｇ／ｍｌの化合物濃度で８０％以上の感染阻害率を示し、中でも化合物Ｎ－１及び化合物Ｎ－２は、１０μｇ／ｍｌの化合物濃度でも７０％以上の感染阻害率を示すことがわかった。
　２０１０年３月４日に出願された日本国特許出願第２０１０－０４８４６３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
 

Claims (9)

  1. 　下記一般式（Ｉ）で示される多価シアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖配糖体を有効成分とするウィルス阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     
    （式（Ｉ）中、Ｗ１及びＷ２はそれぞれ水酸基又はＮ－アセチルノイラミン酸残基を表し、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基を表し、Ｙは、下記一般式（Ｙ－１）又は（Ｙ－２）で表される２価の連結基を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは２～４の整数を表し、Ｚは単結合又は四価～二価の連結基を表す。ただし、Ｗ１及びＷ２が共にＮ－アセチルノイラミン酸残基になることはない。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     
    （式（Ｙ－１）及び（Ｙ－２）中、Ｌ１は、炭化水素基、アミド結合を含む炭化水素基及びエーテル基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表し、Ｌ２はオキシアルキレン基、アミド基及びアルキレン基からなる群より選択された少なくとも１種からなる２価の連結基を表す。）
  2. 　前記Ｌ１中の炭化水素基が炭素数１～３０の炭化水素基である請求項１記載のウィルス阻害剤。
  3. 　前記Ｌ１が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基又はこれらを２つ以上アミド結合で連結させたものである請求項１又は請求項２記載のウィルス阻害剤。
  4. 　前記Ｚは、下記（Ｚ－１）～（Ｚ－３）のいずれか１つである請求項１～請求項３のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     
    （式（Ｚ－３）中、ｐは１～２０の整数を表す。）
  5. 　前記Ｗ１及びＷ２がいずれも水酸基を表すアシアロ糖鎖配糖体である請求項１～請求項４のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
  6. 　前記ウィルス阻害剤がインフルエンザウィルス阻害剤である請求項１～請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤。
  7. 　請求項１～請求項６のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を担体上に固定化させたウィルス吸着担体。
  8. 　請求項１～請求項５のいずれか１項記載のウィルス阻害剤を患者へ投与することを含むウィルス疾患の治療又は予防方法。
  9. 　前記ウィルス疾患がインフルエンザウィルス疾患である請求項８記載のウィルス疾患の治療又は予防方法。
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