CN1117872C - 生产乳糖胺衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

公开的是生产带有β1-4键含乳糖胺结构的化合物的方法，包括在Bullera singularis或与从Bullera singularis得到的E.C.组3·2糖苷酶基本相同结构的E.C组3·2糖苷糖的存在下，至少一个其中R为有机基团的GalβOR供体物质与至少一个具有式GlcNR″-R″′的吡喃葡糖胺衍生物的受体物质反应形成乳糖胺衍生物；并非强制性地分离带有β1-4键含乳糖胺结构的化合物，其中NR″是叠氮基，2-N-乙酰基-，2-N-苯邻二甲酰亚胺基，或连接到乳糖胺的2-N-基上的有机基团，其中R″′是糖苷性连接的氟或O-，C-，N-或S-糖苷性连接的脂族或芳族化合物，条件是如果NR″是NHAc则R″′不是OH，如果NR″不是NHAc则R″′可以是OH。

Description

生产乳糖胺衍生物的方法
                      引言和背景
本发明描述了用于生产某些含与糖共轭物(glyco conjugate)相关的化合物的碳水化合物，即乳糖胺衍生物和从其衍生的物质的新方法。本发明另一个方面涉及由上述方法生产的产品及产生的产品的用途。
糖共轭物含具有1至最多20个单糖单位的糖链、其中某些序列已经显示具有生物活性，例如将不同的细胞、病原体、毒素，及抗体或其它蛋白质联接到细胞表面，在癌症转移，发炎过程，例如在将白血细胞联接到血管壁上的选择性碳水化合物相互作用，作为生物活性和糖蛋白稳定性的改进剂，作为致免疫物质，它在接种抗不同的疾病方面具有潜力(见例如Annual Review of Biochemistry，Vol.58(1989)，P309-350，和Current opinion in structurolBiology，例如在Vol3(1993)中的综述文章和其中的参考文献)。
含有序列Galβ1-4 GlcNAc，下面称作N-乙酰基-乳糖胺的结构尤其重要并在例如乳糖胺类型的糖共轭物寡糖中被发现。该结构被在血型结构，例如Lewis-X(例如Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)，唾液酸基化的Lewis-X和3′-硫酸化的Lewis-X中发现，并且对例如选择性碳水化合物相互作用重要(如J.B.Lowe，在Molecular Glycobiology，P163-205，Fukuda andAindsgaul.Eds.，IRL Press at Oxferd University Press，Oxford，1994中综述的；也见Curr.Opin.Struct.Biol Vol.3(1993))。
有兴趣的是能够大量生产乳糖胺衍生物用于生物学/临床研究/试验，例如用于在体内抑制选择性碳水化合物相互作用以抑制/改进细胞介导的发炎过程(例如在急性脓毒性休克，ARDS，再灌注损伤，风湿性关节炎，病毒诱导的肺炎，牛皮癣等中)。
生产N-乙酰基-乳糖胺和其衍生物的已知化学方法需要多步合成，因而通常昂贵且劳动强度大。在本方法之前所用的酶法主要基于使用半乳糖转移酯(EC2.4)，一种需要UDP-半乳糖作为糖基供体的辅助因子依赖性酶的使用(例如，Wong et.al.，J.Org.Chem.(1982)，P5416-5418)。这类酶也具有如高的受体选择性的缺点，并对非天然受体，例如葡糖胺显示低效率(例如Khan和Hindsgaul 在Molecular Glycobiology，P206-229，Fukuda和Hindsgaul，Eds.，IRL Press at Oxford Univesity Press，Oxford，1994中综述的)。对于酶法的一般性综述，见K.G.I.Nilesson，Trends in Biotechnology，1988，P.256-264(在该综述文章和在本申请中的命名法服从相同的IUPAC-规则)。糖苷酶已被用于从半乳糖苷和N-乙酰基-葡糖胺生产N-乙酰基-乳糖胺和N-乙酰基-别乳糖胺(Sakai et al.，J.Carbohyd.Chem，11：553-565，1992)。
更早的用糖苷酸(EC 3.2)生产N-乙酰基-乳糖胺衍生物的方法由于低的或错的区域选择性而一般给出低产率。因而，当乳糖被用作糖基供体而GLCN Pht被用作受体时，由E.Coli或由醋密剂-试验得到的β-半乳糖苷酶给出唯一的Galβ1-6Glc Npht.(K.G.I.Nilsson，未发表的结果；Pht表示苯邻二甲酰亚氨基，它一般在葡糖胺的氨基上作为临时保护基)。
                      发明概述
本发明描述了在用丰富的供体物质如乳糖和其它低价格的半乳糖基供体物质合成不同的乳糖胺衍生物时以出乎意料地高的专一性产生β1-4键的方法。在本发明的一个方案中，方法通过用酵母Bullera singularis作为催化剂(根据Yeast，second edition bybarnett et al.，Cambridge University Press，1990分类为Bullerasingularis)进行。
在第二个方案中，本发明的方法通过使用酶(属于糖苷酶组，EC组3.2)完成，优选地以粗的，部分分离的或分离的形式，尤其是从Bullera singularis得到的β-半乳糖苷酶，也可以是其β-半乳糖苷酶例如与从Bullera singularis得到的酶相同结构或相似结构(例如，含相似活性位置结构)的重组体。
                     发明详述
根据本发明更详细的方面，生产乳糖胺衍生物的方法可作为平衡(逆水解)反应或优选作为动力学(转糖基化)反应而进行。如本专业已知的，平衡反应和动力学反应是公知的(例如，见K.G.I.Nilsson，Trends in Biotechnol.(1988)，P256-264)。
在其中反应作为转糖基化反应进行的情况下，糖基供体是糖苷，例如在C-1位(异头位)修饰的D-半乳糖(Gal)，但也可以是寡糖，如乳糖(Galβ1-4 Glc)或其非糖苷，例如：
R可以是糖苷连接的有机基团，例如糖(例如CnH2nOn或CnH2n-2On-l如葡萄糖)，低级烷基(例如-Me，-Et)或芳香基(例如苯基(-Ph)，umberriferyl或m-，O-，或p-硝基苯基)，优选地R是Glc(葡萄糖)或硝基苯基。其它糖苷(例如F-，N-或S-糖苷)也可被选择。
本专业已知糖苷酶允许糖基供体的糖基部分(即在本发明中的半乳糖部分)有某些修饰。因此，除GalβOR之外，其中半乳糖基部分已被以仍使转糖基化反应发生，以在糖基供体的糖基部分和葡糖胺衍生物之间产生β1-4键的方式部分修饰的供体可被专业技术人员选择以用于本发明的方法。糖基的这类修改的例子有其中至少一个羟基被转变构型(例如在位置4的转变意味着Gal被Glc取代，即GlcβOR，即β-葡糖基，被用作供体)，或其中Gal的一个羟基被修饰或被一个无机(例如-F，-H)或有机基团，例如低级烷基(例如甲基)，烯丙基或乙酰基取代的修饰。在本发明方法中这类供体的选择给出其中半乳糖基部分被相应修饰的β1-4键连的产物。当R′-Gal相关于被修饰的糖基供体的糖基时，R′-Galβ1-4 Glc NR″-R_类型的产物可这样被制备。在转糖基化反应的情况下，示于如下的糖基供体R′-Gal-R是-β-糖苷：
在转糖基化反应中， 反应速度比平衡反应高，因为糖苷或二糖比在平衡反应中用作供体的非活化糖D-半乳糖更活泼。低纯度的酶，甚至未纯化的酶，可被用于反应中，因为该酶类是底物/键专一性的、而沾染的酶(例如，α-半乳糖苷酶)将不与GalβOR反应给出β-键连的产物。因此，完整的细胞(例如酵母)可被用作部分纯化的酶或更高纯度的酶。
根据反应条件，GalβOR的水解也可某种程度地发生。较低或较高的温度(例如，室温或更高，例如25°-65℃)可被选择，有机(共)溶剂(丙酮，乙腈，四氢呋喃)可被使用，pH典型地选自4至8的范围，底物浓度根据底物的溶解性在反应混合物中酶的稳定性，反应的具体目标和底物类型典型地为30mM至几个M的浓度(例如7M)。
反应将越过产物形成的最大值并必须被跟踪(例如，优选地由HPLC)并在适当的时间之后通过例如在例如80°-100℃热处理例如3分钟而终止。一般地，供体消耗被跟踪，而反应在合适的时间后终止，这取决于条件，经常在≥40％供体消耗时。反应根据酵母细胞的生长(如果使用发酵条件)，酶的量、温度，pH，底物浓度，和其它因素可进行几分钟至几小时。
反应可用TLC，HPLC或用分光光度计测量释放的非糖(例如硝基苯酚，400nm)监测。用硫酵焦化的TLC板可被用于测定糖。当所需产率的产物被得到时，反应通过例如热处理使酶变性而终止。加热至85℃或更高3-5分钟(最后接着加入乙醇至浓度约80％)通常是足够的。如果用固定化酶，反应可通过离心或过滤而终止。
在上述各类反应中，D-吡喃葡糖氨基衍生物被用作受体(GlcNR″-R″)，其中R″和R_如下定义。
在N-乙酰基-葡糖胺(R″＝-HAC基在2位，即在2-葡糖胺的N-位；在葡糖胺的2-位含有一个-NHAC)的情况下，R_代表不是异头羟基(即R_不是OH)的非糖，如果R″不是-HAC基，则R_可以是OH但也可以代表如在R″是-HAC的情况下的异头羟基的变体。
本发明的方法可被用于以高纯度(用400MHz NMR没有观察到其它键)产生Galβ1-4 GlcNR″-R_，分离后的产物可被用于生物学/治疗目的或根据本发明的进一步合成。该方法也可被用于生产Galβ1-4 Galβ1-4 GlcNR″-R_。因而，用相同酶在进一步反应中将如下式所示得到Galβ1-4 Galβ1-4GlcNR″-R_：
GlcNR″-R_(用作受体的葡糖胺的衍生物)，具有下例所示的一般结构：
其中NR″可选自含有无机基团(例如N3，NHSO3H)和/或有机基团连接到葡糖胺的2位的化合物，如(a)N-苯邻二甲酰亚胺基；(b)有机羰基NH-C(O)-R其中R是氢，或含有机基团，例如脂族类如烷基(例如甲基、乙基，丙基)烷氧基(例如甲氧基，乙氧基)，烯丙氧基，氨基酸或多肽残基，和/或芳香类如苯基，苄基或苯氧基的化合物，优选的例子包括N-氯甲氧基乙酰基，N-苯氧基乙酰基，NHBoc(Boc＝叔丁氧羰基)，NHAc和NHC(O)(CH2)nCH3(n是等于或大于1的整数)；(c)NHR其中R是含如上所述的脂族和/或芳族基团的化合物，例如低级烷基，优选的例子包括NH(CH2)nCH3(n是等于或大于1的整数)；或(d)NRR′其中R和R′独立地选自含有如前所述的脂族和/或芳族基团的化合物；优选地NR″是叠氮基，Z-N-乙酰基，或2-N-苯邻二甲酰亚胺基；
而R_选自糖苷基连接的无机化合物，例如氟或选自O-，C-，N-或S-糖苷基连接的含脂族和/或芳族基团，例如低级烷氧基(例如甲氧基(-OMe)，乙氧基(-OEt))，低级烷硫基(例如β-键连的乙硫基(-SEt))，芳硫基(例如苯硫基)，-OEtBr，硝基苯氧基，氨基酸，肽，或其衍生物，或影响产品应用的其它有机基团的化合物，或如果NR″不是NHAc，R_可以是-OH，但如果NR″是NHAC则R″不是-OH。
在本发明的方法中用GalβOR作为供体得到的含Galβ1-4GlcN(乳糖胺)的产物具有如下面的例子所示的一般结构：
Figure C9519116700101
缩写Galβ1-4GlcNAc-R_
Figure C9519116700102
缩写Galβ1-4GlcNR″缩写Galβ1-4GlcNR″-R_
其中乳糖胺，或含乳糖胺结构的高级寡糖是通过葡糖胺残基在如上所述的乳糖胺和其衍生物上N-或O-糖苷基连接到氨基酸或肽序列的这类共轭物可用于合成性生产基础研究和用于生物学/医学活性的糖蛋白片段的合成，例如用作疫苗或治疗剂，能够合成上面的结构的寡糖类/衍生物并根据本发明修饰或改进共轭物生物活性。
本发明的合成工艺可在与例如，pH，缓冲液类型，温度和反应物的浓度相关的很不一样的条件下进行。各种共溶剂(N，N-二甲基甲酰胺，乙腈，二甲亚砜，二噁烷，吡啶，甲醇，乙醇，乙二醇等)可以被使用并以不同的浓度与水一起。一般地，疏水受体物质更容易通过用有机共溶剂或升温溶解。而且，反应可在两相体系，例如水-有机溶剂或水-水聚合物的两相体系中进行。用有机基团修饰的受体的使用使在有机相内的产物容易回收。
反应条件不是关键，但首先根据用于相关合成中反应物的性质，也根据实践选择。例如，应该提到，一般方便地用在25-75℃范围的反应温度，在富水介质的条件下，pH通常在4-8的范围。
反应温度也可改变以影响产物产率和酶的活性和稳定性，并且不限制本发明的范围。温度最通常落在4-75℃的范围内，但较低温度和低于0℃的温度可被应用，如果用有机共溶剂可被促进。用高温的优点是，例如，可用高的底物浓度，它降低水的活性并因而增加产物产率。另一优点是酶的活性增加，这意味着在升高的温度下缩短反应时间。温度的上限通过酶和底物在特定反应介质中的热稳定性测定。在一些反应中，酶的热稳定性通过用高的糖底物浓度而增加。底物例如乳糖的高浓度(＞15％ W/W)可通过溶于热的缓冲水中接着冷至所需反应温度而实现。
受体的浓度是一个可被用于影响本发明反应产率的参数。高浓度通常优选地在平衡和转糖基化反应两者中使水解副反应最小化，这通常意味着根据受体的溶解性，使用约0.05-7M的受体浓度。一般地，高底物浓度通过将反应混合物加热到接近沸点几分钟，使溶液冷却至反应温度(通常4-75℃，取决于最大化产率的温度和酶/底物的热稳定性)接着加入酶而得到。共溶剂可被用于增加带有疏水基团的底物的溶解性。
在反应混合物中糖基供体的浓度根据被合成的乳糖胺也根据酶的性质而选择，因此不限制本发明的应用。在一些情况下，以小批量加入供体将是有利的，以使供体也作为受体的危险最小化(除非这是希望的)。乳糖一般被用作供体，因为它是便宜的底物。尽管受体可以过量，但供体与受体的重量化优选地≥1∶1。
酶可以就地使用或在从其天然环境部分或完全纯化后使用。酶在使用前可通过例如均化，沉淀和/或色谱(例如基于离子交换，亲和性，大小)分离。酶可以例如溶解的，固定化的，交联的，结晶形式存在或被包裹在胶囊内。一般地，糖苷酶可以更纯或更不纯的形式并以不同的细胞类型(克隆到合适细胞类型中)体内或体外应用。酶可用重组技术生产。然后，如果需要，在酶的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸可被改变以使酶的性质最佳化，例如热稳定性，催化效率和/或在有机溶剂中的稳定性。用重组技术生产的，具有至少与天然变体的肽链70％同系的糖苷酶变体与天然存在的糖苷酶一起，也对本发明有用。
合成反应可以用酶在体内进行，即在发酵条件下用完整的酵母细胞并且乳糖和受体的浓度，例如，在0.5至25％重量/体积范围内的浓度。过量的乳糖在一些情况下可用于改进受体的半乳糖基化和/或制备前述类型的三糖。需要营养介质/盐的这一和其它发酵条件可以由专业技术人员容易地确定，且不限制本发明的范围。
作为糖基供体，可用乳糖或半乳糖的β-糖苷如烷基或芳香糖苷(例如硝基苯基β-半乳糖苷)。
产物的分离可以一个或多个步骤进行，包括一个或多个如下过程：提取，色谱(可被应用的普通固体支载物是，例如SephadexR，硅胶，逆相硅胶，木炭，木炭-硅藻土)，沉淀。
根据如果使用完整的酵母细胞(发酵条件)或如果粗的，部分分离或分离的酶离被使用，也相关底物的溶解性和稳定性，反应可在不同条件进行，优选地在最适于特定反应的条件下。这类条件由专业技术人员选择，并且不限制本发明的范围。如果粗的，部分分离的，或分离的酶制剂被应用，则可用普通pH(例如由乙酸或磷酸缓冲液得到的4-8)和低温，室温或升高的温度(例如在0-50℃的范围)。
反应可在惰性有机共溶剂存在下进行以增加受体的溶解性(例如疏水受体)或避免水解反应。如果有机共溶剂(例如丙酮，乙腈，四氢呋喃)与缓冲水一起作为反应溶剂，在某些情况下可以选择低于0℃(例如-30℃)的温度。然后底物的浓度一般在30mM-7M的范围。
酶可以溶解的形式使用或可通过例如吸收，包裹，螯合，沉淀或共价连接到固体支载物，如聚合物，或其衍生物上，它在质子性或非质子性溶剂中不溶，而固定化(Methods in Enzymology，Vol.135.Academic Press)。选择的形式对本发明不重要。如果酶以溶解的形式使用，将首先需要以适当的方法被化学修饰以例如增加在有机共溶剂中的热稳定性或稳定性。固定化到不溶聚合物包括，例如，琼脂糖，纤维素，丙烯酸羟乙基酯，玻璃，二氧化硅、聚丙烯酰胺，聚丙烯酸基塑料，等等上的酶容易从产物混合物分离，而酶因而可再用。
固定化的例子有将酶吸收或共价连接到合适的固定相如玻璃，硅藻土，二氧化硅，多糖(例如纤维素，琼脂糖)，或塑料(例如聚苯乙烯)，如本专业已知的用合适的共价连接酶的反应活性基团活化(见例如Metholds in Enzymology，Vol.44，104和135)。
如果用完整的酵母细胞，可由专业技术人员选择反应条件，而且不限制本发明的范围。优选的条件正常地是pH4-7，20-35℃，在含有在下面的非限制性实施例中举例的酵母细胞的营养物的缓冲水中。
产生与从Bullera singularis得到的酶具有相同结构或相似结构(例如，含有相似的三维三级结构和活性位点结构)的酶的微生物也可被应用。
如果用高浓度的乳糖，当用粗的，部分纯化或分离的酯，相当大量的葡萄糖将形成(在用完整的酵母细胞的发酵条件下，酵母将消耗大量形成的葡萄糖)。形成的葡萄糖将与对于半乳糖基-酶中间体的受体(并带有水)竞争，因而抑制产物的合成。因而在本发明的反应期间要用专一性地除去葡萄糖的第二种酶，如异构酶(例如葡萄糖异构酶)或氧化酶。而且，产物可通过用另一种专一性酶，转移酶，专一性地将产物转化为另一所需产物的硫酸酯酶而除去，这样使产物的二级水解最小化和/或避免在用于进一步合成所需要分离乳糖胺产物。
该产物可被用于用糖苷酶或糖基转移酶的进一步酶合成。例如，α-唾液酸基转移酶可被用于催化唾液酸基化的Gal-GlcNAC衍生物的形成，而α-岩藻糖基转移酶可被用于形成Gal-(Fuc)GlcNA C-R类的寡糖衍生物，它然后可最终被硫酸化，唾液酸化和/或被用于进一步化学合成，等等。
用本发明的方法得到的产物可被直接用于生物学应用或被用于进一步合成用酶和/或化学方法(见例如下面的实施例7)得到各种含乳糖胺的产物，用于例如各种临床，诊断，下游过程或食品补充目的。乳糖胺的化学修饰和修饰的乳糖胺的可解的化学转化的例子的参考文献见例如Binkley：Modern GarbohydrateChemistry，Marcel Dekker，1988带参考文献；Paulsen，Chem.Soc.Rev.13，P15-45；Khan和hindsgaul in MolecularGlycobiology、P206-229，Funkuda和Hindsgaul Edltors，IRLPress，Oxford。在各种糖苷的合成中用乙硫基糖苷或在三-、四-和更大的糖的会聚块合成中用作糖基供体的参考文献见例如在Khan和Hindsgaul论文中引用的参考文献。
本发明的方法得到的产物也可通过酶法用例如脂酶，硫酸酯酶，糖基转移酶和氧化酶而转化。以这种方式，半乳糖基或葡糖胺部分的羟基可分别用例如酰基，硫酸基，糖基和其它有机基团选择性地修饰，因而进一步扩展本发明方法在制备不同衍生物和高级含乳糖胺基的糖方面的应用。具体的例子有由本发明的方法制备的合适的乳糖胺衍生物用于与例如唾液酸转移酶或硫酸酯酶的反应分别得到例如含乳糖胺基的(α2-3)唾液酸基化的乳糖胺衍生物或3′-O-硫酸化的衍生物的选择性。酶修饰的参考文献见例如上面的khah和Hindsgaul(糖基转移酯)和Wang和Whitesides的Enzymes in Synthetic Organic Chemistry，Pergamon(1994)，Elsevier Science LTD.；也见Enzyme Nomendauture，AcademicPress(1984)。
本发明得到的含乳糖胺的产物的非糖部分不仅可被用于糖基化反应(形成其它糖苷或用于合成含乳糖胺序列的寡糖)也可被用于共价连接到其它分子如蛋白质，颗粒或固体支载物上，产生的产物然后被用于各种目的。因此，硝基苯基糖苷例如用于在还原为氨基苯基糖苷之后共价连接到各种蛋白质或固体支载物上，然后可被用于诊断试剂中，在下游工艺中用于分离各种蛋白质和包括糖基转移酶具有各种蛋白质专一性的酶和包括糖基转移酶具有含乳糖胺序列的受体专一性的酶，或用于寡糖类的固相合成(见例如上面Wang和Whitesides关于寡糖类的固相合成的参考文献)。
下列实施例举例说明本发明：
                      实施例  I
Galβ1-4GlcNphtβSEt的合成可如下进行：
Bullera singulais在如下组合物的介质中搅拌下于25℃孵育：5％乳糖，1％ GlcNph+βSEt，它已用酵母提取液(Difco，0.75％ W/W，在乙酸钠中，pH5.0)无菌过滤。反应在27℃进行直到乳糖被消耗到适当程度。产物通过如下过程被分离为均一性(用NMR没有其它糖被检测到)：通过离心(或过滤)分离酵母细胞后，用乙酸乙酯提取水相以除去过量受体，接着用丁醇提取水相，蒸发丁醇相，接着将剩余物溶于水-乙醇中，蒸发乙醇，从水中沉淀产物。
产物的分离例如通过用合适的溶剂，例如乙酸乙酯提取水相而进行，它除去未反应的受体，水相然后可用更极性的溶剂如正丁醇提取。从介质如水中沉淀产物可用于进一步纯化。其它可用于与提取结合的例子有用典型的材料如硅胶，活性碳或Sephadex_作固相的柱色谱，沉淀或结晶。本专业已知的任何合适分离方法可被使用。
用本发明的酶法的一个重要优点是受体不被毁坏(尤其是用温和的反应条件和分离的酶时)，而用未修饰的受体或当化学法被用于合成时可能发生毁坏。未反应的受体因而一般可通过例如上面的直接提取过程回收。
实施例1：Galβ1-4GlcNphtβ-SEt(化合物I)(SEt＝SCH2CH3基)的合成：
乳糖  葡萄糖典型地，化合物I在发酵反应中或用部分纯化的β-半乳糖苷制剂(在高压(600bar)下崩解酵母细胞之后离心用于合成的固体物质而得到)制备。
在典型反应中，乳糖(糖基供体)和GlcNphtβ-SEt(受体；化合物II)的初始浓度在酵母介质(如上所述)中分别为5和1.2％(W/V)。加入酵母细胞(Bullera singularis)(加入酵母细胞后OD600约为1)，发酵在27℃中等振动(150rpm)在pH5.5进行5天。另外，部分纯化的半乳糖苷酶制剂被用作反应的催化剂。代替乳糖作为糖基供体，半乳糖的β-键联的半乳糖的硝基苯基糖苷(例如Galβ-OphNO2-P)可被用作糖基供体。
反应用TLC和通过在405nm(对硝基苯基底物)测量释放的硝基苯酚跟踪。对于上面的各个反应，产物的分离通过用乙酸乙酯提取II，用丁醇提取产物，蒸发溶剂接着层析(典型地用Sephadex_G10)和/或结晶而实现。
产物用NMR(400MHz，Jeol)鉴定，键的位置以过乙酰基化的形式用标准操作(键位置的特征位移用1H-1H COSY NMR测定)测定。对于产物I选择的NMR数据(13C；未校正)：
产物的二糖部分：103.93(C′-1)，80.32(C-1)，70.21(C-3)，79.61(C-4)，55.65(C-2)；
苯邻二甲酰亚胺基：123.33，123.61，130.76，130.96，135.02，135.09，167.39和167.63(2C＝0基)；
SEt基：14.92和23.27。
实施例2：合成Galβ1-4GlcNphtβ-OMe(化合物III OMe＝OCH3)：
Figure C9519116700171
或
典型地，化合物III如实施例1在发酵反应中或用粗的β-半乳糖苷酶制剂(在600bar压力下在乙酸钠，5mM，pH5中崩解酵母细胞之后得到)制备。离心给出用于合成的固体物质。在典型的反应中，乳糖(糖基供体)和GlcNpht-SEt(受体；化合物IV)在40ml-50mM乙酸钠，pH6.0中的初始浓度分别是7和2.5％(W/V)。加入粗的β-半乳糖苷酶制剂(约3g)，反应在30℃，pH6.0轻轻搅拌下进行两天。代替乳糖作为糖基供体，β-键连的半乳糖的硝基苯基糖苷，Galβ-OphNO2-O，被用作糖基供体(0.15M)。
反应用TLC和通过在405nm(对硝基苯基底物)测量释放的硝基苯酚跟踪。对于上面的各个反应，产物的分离通过用乙酸乙酯提取IV，接着层析并冻干而实现。以此方式，产物I被得到，而未反应的受体被回收并可再用。
产物用NMR(400MHz，Jeol)鉴定，键位置用标准操作测定(键位置的特征位移由1H-1H COSY NMR测定)。产物III选择的NMR数据(13C；未校正)：
产物的二糖部分：103.94(C′-1)，99.90(C-1)，70.44(C-3)，79.96(C-4)，57.03(C-2)；
苯邻二甲酰亚胺基：123.71，124.44，131.68(2C)，135.89(2C)，170.36(2C；C＝0)；
甲基：57.44。
实施例3：合成Galβ1-4GlcNpht(化合物V)：
Figure C9519116700181
典型地，化合物V如实施例1中在发酵反应中或用粗β-半乳糖苷酶制剂(在高压(600bar)下崩解，悬浮于乙酸钠，50mM，PH5中母细胞而得到)制备，并离心给出用于合成的固体物质。在典型的反应中，乳糖(糖基供体)和GlcNpht(受体；化合物VI)在75ml 50mM乙酸钠，pH6.0中的初始浓度分别为7和3％(W/V)。加入粗的β-半乳糖苷酶制剂(约6g)，反应在30℃，轻轻搅拌下，在pH6.0进行两天。代替乳糖作为糖基供体，半乳糖的β-键连的硝基苯基糖苷，Galβ-OphNO2-O，被用作糖基供体。
反应用TLC和通过在405nM(硝基苯基底物)测量释放的硝基苯酚跟踪。对上面的各个反应，产物的分离通过层析(Sephadex和C18-硅胶)实现。
产物用NMR(400MHz，Jeol)鉴定，键的位置用标准操作测定(键位置的特征位移用1H-1H COSY NMR测定)。产物V选择的NMR数据(13C；未校正)：
产物的二糖部分：105.14(C1-1)，93.84(C-1)，71.09(C-3)，81.46(C-4)，59.22(C-2)；
苯邻二甲酰亚胺基：124.04，124.27，133.05(2C)，135.50(2C)，169.76(2C；C＝0)。
实施例4：合成Galβ1-4GlcN3β-OMe(化合物VII；N3＝叠氮基)：典型地，化合物VII如实施例1在发酵反应中或用粗的β-半乳糖苷酶制剂(在高压(600bar)下崩解乙酸钠，50mM，PH5中的酵母细胞并离心给出用于合成的固体物质得到)制备。在典型的反应中，乳糖(糖基供体)和GlcN3β-OMe(受体；化合物VIII)在75ml 50mM乙酸钠，pH6.0中的初始浓度分别为7和3％(W/V)。加入粗的β-半乳糖苷酶制剂(约6g)，反应在30℃，轻轻搅拌下在pH6.0进行两天。代替乳糖作为糖基供体，半乳糖的β-键连的硝基苯基糖苷，Galβ-OphNO2-O，被用作糖基供体。
反应用TLC和在405nm(硝基苯基底物)测量释放的硝基苯酚而跟踪。对上述的各个反应，未反应的底物的回收和产物的分离通过层析(C18-硅胶Sephadex)实现。
产物用NMR(400MHz，Jeol)鉴定，键的位置以过乙酰化的形式用标准操作测定(键的位置的特征位移用1H-1H COSYNMR测定)。产物VII选择的NMR数据(13C；未校正的)：
产物的二糖部分：103.87(C′-1)，102.90(C-1)，73.44(C-3)，79.12(C-4)，66.03(C-2)；
甲基：58.11。
实施例5：合成Galβ1-4GlcNAcβ-SEt(化合物IX)：典型地，化合物IX如实施例1在发酵反应中或用粗β-半乳糖苷酶制剂(在高压(600bar)下崩解于乙酸钠，50mM，pH5中的酵母细胞后离心给出用于合成的固体物质而得到)制备。在典型反应中，乳糖(糖基供体)和GlcNAcβ-SEt(受体；化合物X)在75ml 50mM乙酸钠，pH6.0中的初始浓度分别为7和5％(W/V)。加入粗的β-半乳糖苷酶制剂(约6g)，反应在30℃，轻轻搅拌下，在pH6.0进行两天。代替乳糖作为糖基供体，半乳糖的β-键连的硝基苯基糖苷，Galβ-OphNO2-O，被用作糖基供体。
反应用TLC和通过在405nm(硝基苯基底物)释放的硝基苯酚跟踪。对上面的各个反应，未反应的底物的回收和产物的分离通过色谱(Sephadex)和结晶实现。以这种方式，产物IX被得到，未反应的底物被回收并可再用。
产物用NMR(400MHz，Jeol)鉴定，键的位置用标准操作测定(键位置的特征位移用1H-1H COSY NMR测定)。产物IX选择的NMR数据(13C；未校正)：
产物的二糖部分：103.76(C1-1)，84.85(C-1)，76.27(C-3)，74.66(C-4)，61.93、61.14(C-6，6’)，55.24(C-2)，175.30(C＝0，NHAC基中的)；
25.39，23.13，15.21(SEt基和NHAC中的甲基)。
实施例6：合成Galβ1-4GlcNAcβ-OphNO2-P(化合物XI)：
Figure C9519116700211
典型地，此化合物从乳糖(7％ W/W)并用如上所述得到的粗β-半乳糖苷酶，用P-硝基苯基β-D-N-乙酰基-葡糖胺化物(0.6％ W/W)作受体在30℃两天而制备。化合物通过用乙酸乙酯提取，接着柱层析(Sephadex G10)水相而分离。产物如上所述用NMR表征。
在上面所有反应中，当Galβ-OphNO2-O被用作供体时，二糖的糖苷Galβ1-4Galβ-OphNO2-O作为附加的产物被得到。
实施例1-3中的受体物质通过本专业技术人员已知的标准化学技术从2-氨基-2-脱氧-D-葡糖胺(GlcNH2)经过乙酰化的苯邻二甲酰亚胺基衍生物(过乙酰化的GlcNpht)制备。实施例4中的叠氮基受体底物根据本专业技术人员已知的标准化学技术从葡糖经己烯糖接着叠氮硝化而制备。实施例5和6中的受体底物由本专业技术人员已知的标准化学技术经过乙酰化的GlcNAc得到。
上面制备的化合物可以直接用于生物学应用或用于合成其它乳糖胺衍生物，高级寡糖(R1＝糖；R2可以是H2，乙酰基或其它基团：其它R为OH)；和/或用于与其它类型包括蛋白质，抗体，肽，氨基酸和酶的分子共轭(R1＝蛋白质，抗体，肽，氨基酸，修饰的氨基酸，或糖苷性连接到乳糖胺序列上的酶)。
实施例7  合成产物
化合物                        产物
用标准化学技术过酰化或其它修饰化合物I，III或V，分离后给出在葡糖胺部分用游离的3-OH基团保护的化合物。这类修饰的化合物可被用于生产Lewis-X化合物(Lewis-X＝Galβ1-4(Fucα1-3)GlCNAc；在上图中R3是α-键的吡喃岩藻糖基；R2是乙酰基而RO基是HO-基)和衍生物以及在2-N基，3-OH基(R3＝不是L-岩藻糖的糖，例如代替α-吡喃岩藻糖基，3-OH位可用其它糖修饰，甘露糖，半乳糖，等以α-或β-构型连接，或用其它基团修饰)上被修饰的其它化合物，和/或，在葡糖胺残基的异头位，乙硫基二糖常规地被用于合成其它二糖苷如氨基酸糖苷(R1＝氨基酸)或作为糖基供体与受体糖用于会聚块合成三-或高级寡糖。
因此，对于Lewis-X和其它衍生物化合物I，III或V的化学制备可以首先在羟基上经例如过乙酰化(吡啶+乙酐)部分修饰。与其它产物分离后给出R1上分别带有游离的3-羟基和-SEt，-OMe或OAc基的过乙酰化的化合物I，III或V。产生的化合物然后可与吡喃岩藻糖基化合物(例如过乙酰化的L-吡喃岩藻糖)反应给出Lewis-X衍生物。除去R基和其它保护基和NH2基的乙酰化之后，得到Galβ1-4(Furα1-3)GlcNAc(Lewis-X)。
更具体地，化合物I(Galβ1-4GlcNphtβ-SEt)的乙硫基，或优选地过乙酰化的化合物I(IB)，可被转化为其中R1是包括一-、二-或更高级的寡糖的有机化合物的过乙酰化的Galβ1-4GlcNphtβOR1或Galβ1-4GlcNphtβSR1。N-苯邻二甲酰亚胺基可用本专业已知的标准技术(例如肼)除去，而形成的NH2基可被用于转化为例如，其中R为甲基，乙基或其它有机基团(见前面NR″的定义)的Galβ1-4GlcNC(O)R，或其中R为一无机基团(例如硫酸基)的Galβ1-4GlcNR或含有有机基团(脂族和/或芳族)的化合物。
化合物I可被例如过乙酰化(吡啶+乙酐)形成下面类型的化合物(IB)：
Figure C9519116700231
化合物IB可与例如过酰化的L-吡喃岩藻糖反应形成化合物IC：
Figure C9519116700232
IB，L-Fuc或非岩藻糖的其它糖的其它修饰的形式可被选择以给出其它化合物或更高产率。
保护基的其它类型可由本专业技术人员选择以实现更高产率。
化合物IC的乙酰基和苯邻二甲酰亚胺基可通过标准技术除去，而NH2基乙酰化形成化合物ID(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβSEt；Lewis-X的乙硫基糖苷)；SEt也可被除去形成化合物IE(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc；Lewis-X)。
化合物IC的苯邻二甲酰亚胺基也可被除去，与R-X和/或-SEt基偶合的NH2基被用于与糖或含化合物R1OH的羟基偶合形成化合物IF(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNR-R1；Lewis-X的衍生物)，其中R是无机或有机基团，而R1是糖，-OH，或包括氨基酸或肽的有机基团。
实施例8  化学酶修饰以得到含乳糖胺的产物
几种糖基转移酶(属于EC组2·4)如Galβ1-4GlcNAcα2-3唾液酸基转移酶和Galβ1-3/4Glc-NAcα3/4岩藻糖基转移酶可将唾液酸基和岩藻糖基分别转移到不同类型的在2-N-位修饰的乳糖胺衍生物上。唾液酸基，缩写为NeuAc，在本文被用作唾液酸和可被唾液酸基转移酶转移的唾液酸类似物结构的缩写。岩藻糖基，缩写为Fuc，本文被用作L-吡喃岩藻糖和被岩藻糖基转移酶转移的L-吡喃岩藻糖类似物的结构的缩写。
因而，根据本发明用Bullera singularis或糖苷酶制备的合适乳糖胺衍生物可被本专业技术人员选择(或在羟基，酶法生产的乳糖胺衍生物的R″和/或R_基的化学或酶转化，例如通过用脂酶部分酰化例如葡糖胺部分之后得到的)用作受体，α2-3唾液酸基转移酶作为催化剂而合适的CMP-NeuAc作为糖基供体得到相应的α2-3唾液酸基化的乳糖胺衍生物NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNR″-R_。
类似地，根据本发明用Bullera singularis或糖苷酶制备的合适的乳糖胺衍生物可由本专业技术人员选择(或在羟基，酶法生产的乳糖胺衍生物的R″和/或R_基团的化学或酶转化，例如通过用脂酶部分酰化例如葡糖胺部分之后得到的)用作受体，α1-3岩藻糖基转移酶作为催化剂和合适的GDP-Fuc作为糖基供体得到相应的α2-3唾液酸基化的乳糖胺衍生物(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNR″-R_。
而且，用乳糖胺衍生物作为第一受体的两个糖基转移酶反应的结合可由本专业技术人员选择并用于得到NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNR″-R_的衍生物。
上述衍生物然后可被转化为其它衍生物(例如通过如所述的R″和/或R_基的化学修饰，或通过进一步的酶反应)。上述衍生物适当地可被用于如上所述的各种类型的应用。例子有临床，诊断，下游操作应用。
前述的进一步变化和修饰对本专业人员将是显而易见的，这些变化和修饰被包含在权利要求中。
于1994年1月6日提交的瑞士优先申请94000346被引作参考。

Claims (17)

1.一种生产带有β1-4键的乳糖胺衍生物的方法，所说的方法包括
(1)反应
(a)一种供体物质GalβOR，和其中R具有通式CnH2nOn或CnH2n-2On-1的糖；低级烷基或芳香基，且其中O或为F，N，或S，Gal或为Glc；
(b)一种受体物质，该受体物质为具有式GlcNR″-R_的吡喃葡糖胺基衍生物，
其中NR″是
-N3或NHSO3H，
-N-苯邻二甲酰亚氨基，
-NH-C(O)-X，其中X是：H，脂族基，烷氧基，烯丙氧基，芳基，或氨基酸或多肽残基，
-NHX1，其中X1是脂族基或芳基，和
-NXX1，其中X和X1独立地选自脂族基或芳基，
其中R_是糖苷结合的F，或是O-，C-，N或S-糖苷基结合的化合物，所述化合选自低级烷氧基，低级烷硫基，芳硫基，-OEtBr或硝基苯氧基，
条件是如果NR″是NHAc，则R_不是OH，如果NR″不是NHAc，则R_可以是OH，
(c)在Bullera singularis或与从Bullera singularis得到的E.C.组3.2糖苷酶的结构和功能基本相同的E.C.组3.2糖苷酶存在下，形成所说的乳糖胺衍生物；和
(2)选择性地分离所说的乳糖胺衍生物。
2.权利要求1的方法，其中供体物质GalβOR中R为葡萄糖，甲基或乙基，苯基，umberriferyl，和硝基苯基。
3.根据权利要求1的方法，其中NR″中的脂族基为烷基，NR″中的芳香基为苯基、苄基或苯氧基，且其中NR″中的烷氧基是甲氧基或乙氧基。
4.根据权利要求1的方法，其中NR″中的脂族基为甲基或乙基。
5.根据权利要求1的方法，其中NR″为2-N-苯邻二甲酰亚胺基，叠氮基，2-N-乙酰基，N-氯甲氧乙酰基，N-苯氧乙酰基，NHBoC，NHAC或NH(O)(CH2)nCH3，其中n≥1
6.根据权利要求1的方法，其中所说R_中的低级烷氧基是甲氧基或乙氧基，R_中的低级烷硫基是β-联乙硫基(SEt)，芳硫基是苯硫基。
7.根据权利要求1的方法，其中所说的乳糖胺衍生物是Galβ1-4GlcNphtβ-SEt，Galβ1-4GlcNphtβ-OMe，Galβ1-4 GlcNpht，Galβ1-4GlcN3β-OMe，Galβ1-4GlcNAcβ-SEt或Galβ1-4GlcNAcβ-OphNO2-P。
8.根据权利要求1的方法，其中所说的方法进一步包括加入专一性地除去葡萄糖的第二种酶。
9.根据权利要求8的方法，其中所说的第二种酶是异构酶或氧化酶。
10.根据权利要求9的方法，其中所说的异构酶是葡萄糖异构酶。
11.根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(c)利用Bullerasingularis形成所说的乳糖胺衍生物。
12.根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(c)利用与从Bullerasingularis得到的E.C.组3.2糖苷酶结构相同或结构相似的E.C.组3.2糖苷酶以形成所说的乳糖胺衍生物。
13.根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(c)利用含有从Bullerasingularis或从可产生与来自Bullera singularis的酶具有相同或相似结构的酶的微生物得到的粗的、部分分离的或分离的β-半乳糖苷酶的可溶性的或固定化的制剂。
14.根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(c)利用与来自Bullerasingularis的β-半乳糖苷酶具有相同功能的重组β-半乳糖苷酶。
15.根据权利要求1的方法，其中所说的糖苷酶经沉淀，吸附，包裹，螯合，或共价键连而固定化到在质子性或非质子性溶剂中不溶的聚合物或其衍生物上。
16.根据权利要求14的方法，其中所说的聚合物是多糖，塑料，或玻璃，它已被活化并含有选自氰酸基，有机磺酸基，醛基，重氮鎓基，环氧基，二乙烯基砜基，和三嗪基的反应性基团。
17.根据权利要求15的方法，其中所说的多糖是纤维素或琼脂糖，而所说的塑料是聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，或聚苯乙烯。
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