JP2000121637A - 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 - Google Patents
酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めるこ
とができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一
元的に管理することができ、さらには作業工程を減らす
ことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提
供、及び簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且
つ測定感度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目
的とする。 【解決手段】 本発明の酵素免疫分析用試薬は過酸化水
素を発生できる酵素を含有する酵素層２と、前記酵素層
２の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層４
と、前記酵素層２の酵素と前記基質層４の基質物との反
応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物
質を含有する発色層３と、を備えた構成を有している。
とができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一
元的に管理することができ、さらには作業工程を減らす
ことで素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提
供、及び簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且
つ測定感度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目
的とする。 【解決手段】 本発明の酵素免疫分析用試薬は過酸化水
素を発生できる酵素を含有する酵素層２と、前記酵素層
２の酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層４
と、前記酵素層２の酵素と前記基質層４の基質物との反
応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色物
質を含有する発色層３と、を備えた構成を有している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素免疫測定法に
用いられる標識酵素存在下で、発色物質とその基質であ
る過酸化水素で構成された発色液により発色する酵素免
疫分析用試薬及びをれを用いた分析方法に関するもので
ある。
用いられる標識酵素存在下で、発色物質とその基質であ
る過酸化水素で構成された発色液により発色する酵素免
疫分析用試薬及びをれを用いた分析方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】従来、ある特定のタンパクの定量方法と
して、定量したいタンパクを抗原とし、その抗原と特異
的に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により生化学的
に定量する方法が行われてきた。この免疫分析法は標識
として用いられる抗体に標識される物質により異なる。
ラジオアイソトープで標識した抗体と生体より採取した
試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定
抗原を定量分析するラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ）、蛍光物質を標識した抗体と生体より採取した試料
中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原
を定量分析する蛍光免疫分析法（ＦＩＡ）、酵素を標識
した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体
反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する酵素免
疫分析法（ＥＩＡ）の３つの方法がある。これらの方法
にはそれぞれ特徴があるが、簡便で、広く一般的に使用
されている方法として酵素免疫分析法がある。
して、定量したいタンパクを抗原とし、その抗原と特異
的に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により生化学的
に定量する方法が行われてきた。この免疫分析法は標識
として用いられる抗体に標識される物質により異なる。
ラジオアイソトープで標識した抗体と生体より採取した
試料中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定
抗原を定量分析するラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ）、蛍光物質を標識した抗体と生体より採取した試料
中の抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の特定抗原
を定量分析する蛍光免疫分析法（ＦＩＡ）、酵素を標識
した抗体と生体より採取した試料中の抗原との抗原抗体
反応を利用して試料中の特定抗原を定量分析する酵素免
疫分析法（ＥＩＡ）の３つの方法がある。これらの方法
にはそれぞれ特徴があるが、簡便で、広く一般的に使用
されている方法として酵素免疫分析法がある。
【０００３】なお以上は抗原について説明したが、抗体
を抗原、抗原を抗体に置き換えても全く同様であり、以
下修飾したタンパクが抗原の場合を説明するが、抗体を
定量する場合も同様であり、詳細については省略する。
を抗原、抗原を抗体に置き換えても全く同様であり、以
下修飾したタンパクが抗原の場合を説明するが、抗体を
定量する場合も同様であり、詳細については省略する。
【０００４】これら代表的な酵素免疫分析法の一つであ
るサンドイッチＥＬＩＳＡ（EnzymeLinked Immuno So
lvent Assay)法を例に挙げ酵素免疫分析法について説
明する。
るサンドイッチＥＬＩＳＡ（EnzymeLinked Immuno So
lvent Assay)法を例に挙げ酵素免疫分析法について説
明する。
【０００５】まず抗原を捕まえる為の抗体を免疫測定に
用いられるポリプロピレンのプレートに非特異的吸着に
より固定して固相化する。これに測定したいタンパクを
含むサンプル溶液を注入して抗原と抗体の特異的な結合
により測定したいタンパクを捕捉する。さらにペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗体を抗原と反応させる
ことにより、抗原量に応じた標識抗体が結合する。ここ
にあらかじめ溶液化した発色剤にペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）の基質物である過酸化水素を加えた発色試薬を作
成しておき、標識抗体結合後プレートに添加する。一定
時間反応後、反応を停止させ測定を行う。使用した発色
剤の最大吸収波長で吸光度の測定を行い測定対象のタン
パクの定量を行うものである。
用いられるポリプロピレンのプレートに非特異的吸着に
より固定して固相化する。これに測定したいタンパクを
含むサンプル溶液を注入して抗原と抗体の特異的な結合
により測定したいタンパクを捕捉する。さらにペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗体を抗原と反応させる
ことにより、抗原量に応じた標識抗体が結合する。ここ
にあらかじめ溶液化した発色剤にペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）の基質物である過酸化水素を加えた発色試薬を作
成しておき、標識抗体結合後プレートに添加する。一定
時間反応後、反応を停止させ測定を行う。使用した発色
剤の最大吸収波長で吸光度の測定を行い測定対象のタン
パクの定量を行うものである。
【０００６】
【発明は解決しようとする課題】上記従来の酵素免疫分
析用試薬及び分析方法では、発色溶液を作成するにあた
り、発色物質の他に過酸化水素を標識酵素の基質物とし
て別途加える必要がある。しかし過酸化水素は溶液の形
態でしか存在せず、安定性にも欠け、また微量の添加を
するためには専用の器具が必要となり、作業工程を増や
す要因になっているため、熟練した者が操作を行わなく
てはならないが、利便性と分析の正確性を欠けるという
課題を有していた。
析用試薬及び分析方法では、発色溶液を作成するにあた
り、発色物質の他に過酸化水素を標識酵素の基質物とし
て別途加える必要がある。しかし過酸化水素は溶液の形
態でしか存在せず、安定性にも欠け、また微量の添加を
するためには専用の器具が必要となり、作業工程を増や
す要因になっているため、熟練した者が操作を行わなく
てはならないが、利便性と分析の正確性を欠けるという
課題を有していた。
【０００７】本発明は上記従来の課題を解決するもの
で、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることがで
き、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に
管理することができ、さらには作業工程を減らすことで
素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供、及び
簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感
度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目的とす
る。
で、酵素免疫分析を正確に安全で簡単に進めることがで
き、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に
管理することができ、さらには作業工程を減らすことで
素人にも簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供、及び
簡単で安全性、安定性と利便性に優れ、正確且つ測定感
度が高い酵素免疫分析方法を提供することを目的とす
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
に本発明の酵素免疫分析用試薬及び分析方法は次の構成
からなる。
に本発明の酵素免疫分析用試薬及び分析方法は次の構成
からなる。
【０００９】本発明の酵素免疫分析用試薬は、過酸化水
素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の
酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前
記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって
発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有す
る発色層と、を備えた構成を有している。
素を発生できる酵素を含有する酵素層と、前記酵素層の
酵素に特異的に反応する基質物を含有する基質層と、前
記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との反応によって
発生する過酸化水素を用いて発色する発色物質を含有す
る発色層と、を備えた構成を有している。
【００１０】この構成により、酵素免疫分析を正確に安
全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより一元的に管理することができ、さらに
は作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免
疫分析用試薬を提供することができる。
全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより一元的に管理することができ、さらに
は作業工程を減らすことで素人にも簡単にできる酵素免
疫分析用試薬を提供することができる。
【００１１】また、本発明の酵素免疫分析方法は、請求
項１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試
薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原
が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度
を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有し
ている。
項１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試
薬を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原
が混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度
を測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有し
ている。
【００１２】この構成により、抗原濃度分析を正確に安
全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとと
もに、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度を
測定することができる。
全で簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤
で扱うことにより、作業工程を減らすことができるとと
もに、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原濃度を
測定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の請求項１に記載の発明
は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、
前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する
基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との
反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色
物質を含有する発色層と、を備えた構成を有している。
は、過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵素層と、
前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を含有する
基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基質物との
反応によって発生する過酸化水素を用いて発色する発色
物質を含有する発色層と、を備えた構成を有している。
【００１４】これにより、過酸化水素を発生できる酵素
や酵素に特異的に反応する基質物及び発色物質を１つの
錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまと
めた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が
可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に発色溶液の
作成ができるという作用を有する。
や酵素に特異的に反応する基質物及び発色物質を１つの
錠剤にまとめてしまうことにより、溶液中に１つにまと
めた錠剤を添加することで、いつでも一定試薬の添加が
可能となり、誰でも正確に安全でかつ簡単に発色溶液の
作成ができるという作用を有する。
【００１５】ここで、過酸化水素を発生できる酵素とし
ては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ、スクロースオキシダーゼ、アスクコルビン酸オキ
シダーゼ、コレスラロ−ルオキシダーゼが用いられる。
ては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ、スクロースオキシダーゼ、アスクコルビン酸オキ
シダーゼ、コレスラロ−ルオキシダーゼが用いられる。
【００１６】酵素に特異的に反応する基質物としては、
グルコース、ガラクトース、スクロース、アスクコルビ
ン酸、コレスラロールが用いられる。
グルコース、ガラクトース、スクロース、アスクコルビ
ン酸、コレスラロールが用いられる。
【００１７】酵素層としては、酵素を安定するため、タ
ンパク質が媒体として用いられる。タンパク質として
は、アルブミン、ゼラチン、カゼインが用いられる。過
酸化水素を発生できる酵素の量をａとし、タンパク質の
量をｂとすると、ａ：ｂは１：７〜１１、好ましくは
１：８〜１０の割合で好適に用いられる。ａとｂが所定
割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固め
たものが用いられる。ａ：ｂは１：８より小さくなるに
つれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また
１：１０よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが
高くなるという傾向が認められるので、いずれも好まし
くない。
ンパク質が媒体として用いられる。タンパク質として
は、アルブミン、ゼラチン、カゼインが用いられる。過
酸化水素を発生できる酵素の量をａとし、タンパク質の
量をｂとすると、ａ：ｂは１：７〜１１、好ましくは
１：８〜１０の割合で好適に用いられる。ａとｂが所定
割合で混合して熱が発生しないように圧力をかけて固め
たものが用いられる。ａ：ｂは１：８より小さくなるに
つれ保存安定性が低くなるという傾向が認められ、また
１：１０よりも大きくなるにつれ、バックグラウンドが
高くなるという傾向が認められるので、いずれも好まし
くない。
【００１８】発色層としては、発色物質の固めたものが
用いられる。基質層としては、酵素に特異的に反応する
基質物を安定するため、糖類が媒体として用いられる。
糖類としては、ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、フルクトースが用いられる。基質物の量をｃとし、
糖類の量をｄとすると、ｃ：ｄは１：８５〜１１０、好
ましくは１：９０〜１００の割合で好適に用いられる。
ｃとｄを混合して圧力をかけて圧着されたものが用いら
れる。ｃ：ｄは１：９０より小さくなるにつれ保存安定
性が低くなるという傾向が認められ、また１：１００よ
りも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなると
いう傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
用いられる。基質層としては、酵素に特異的に反応する
基質物を安定するため、糖類が媒体として用いられる。
糖類としては、ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、フルクトースが用いられる。基質物の量をｃとし、
糖類の量をｄとすると、ｃ：ｄは１：８５〜１１０、好
ましくは１：９０〜１００の割合で好適に用いられる。
ｃとｄを混合して圧力をかけて圧着されたものが用いら
れる。ｃ：ｄは１：９０より小さくなるにつれ保存安定
性が低くなるという傾向が認められ、また１：１００よ
りも大きくなるにつれ、バックグラウンドが高くなると
いう傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００１９】酵素層が試薬全量に対して１ｗｔ％〜２５
ｗｔ％、好ましくは４ｗｔ％〜１８ｗｔ％に形成され
る。酵素層が４ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低
下という傾向が認められ、また１８ｗｔ％よりも多くな
るにつれ、同じく吸光度の低下という傾向が認められる
ので、いずれも好ましくない。
ｗｔ％、好ましくは４ｗｔ％〜１８ｗｔ％に形成され
る。酵素層が４ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低
下という傾向が認められ、また１８ｗｔ％よりも多くな
るにつれ、同じく吸光度の低下という傾向が認められる
ので、いずれも好ましくない。
【００２０】発色層が試薬全量に対して０．５ｗｔ％〜
５ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜３ｗｔ％に形成され
る。発色層が２ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低
下という傾向が認められ、また３ｗｔ％よりも多くなる
につれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められ
るので、いずれも好ましくない。
５ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜３ｗｔ％に形成され
る。発色層が２ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度の低
下という傾向が認められ、また３ｗｔ％よりも多くなる
につれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認められ
るので、いずれも好ましくない。
【００２１】基質層が試薬全量に対して６０ｗｔ％〜９
８ｗｔ％、好ましくは７５ｗｔ％〜９５ｗｔ％に形成さ
れる。基質層が７５ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度
の低下という傾向が認められ、また９５ｗｔ％よりも多
くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認
められるので、いずれも好ましくない。
８ｗｔ％、好ましくは７５ｗｔ％〜９５ｗｔ％に形成さ
れる。基質層が７５ｗｔ％より少なくなるにつれ吸光度
の低下という傾向が認められ、また９５ｗｔ％よりも多
くなるにつれ、バックグラウンドの上昇という傾向が認
められるので、いずれも好ましくない。
【００２２】本発明の請求項２に記載の発明は、請求項
１に記載の発明において、発色層が、前記酵素層と前記
基質層の間に積層されてた構成を有している。
１に記載の発明において、発色層が、前記酵素層と前記
基質層の間に積層されてた構成を有している。
【００２３】これにより、請求項１により得られる作用
の他、酵素層と基質層と発色層が積層構造で形成される
ことにより、酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の変
質反応を防ぐことができるという作用を有する。
の他、酵素層と基質層と発色層が積層構造で形成される
ことにより、酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の変
質反応を防ぐことができるという作用を有する。
【００２４】ここで、酵素免疫分析用試薬が酵素層、発
色層、基質層の順にそれぞれの割合で加圧によって積層
し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にし
たものが用いられる。
色層、基質層の順にそれぞれの割合で加圧によって積層
し、積層したペレットが得られ、すなわち錠剤の形にし
たものが用いられる。
【００２５】本発明の請求項３に記載の発明は、請求項
１又は２の内いずれか１項に記載の発明において、酵素
がグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であり、及び／又
は前記酵素に特異的に反応する基質物がグルコースであ
った構成を有している。
１又は２の内いずれか１項に記載の発明において、酵素
がグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であり、及び／又
は前記酵素に特異的に反応する基質物がグルコースであ
った構成を有している。
【００２６】これにより、請求項１又は２により得られ
る作用の他、過酸化水素を発生できる酵素が長期で保存
でき、安定性に優れるという作用を有する。
る作用の他、過酸化水素を発生できる酵素が長期で保存
でき、安定性に優れるという作用を有する。
【００２７】本発明の請求項４に記載の発明は、請求項
１乃至３の内いずれか１項に記載の発明において、発色
物質がオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’
−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォン酸）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン
（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）の少な
くとも１種であった構成を有している。
１乃至３の内いずれか１項に記載の発明において、発色
物質がオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’
−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォン酸）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン
（ＴＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）の少な
くとも１種であった構成を有している。
【００２８】これにより、請求項１乃至３により得られ
る作用の他、各発色物質特有の発色を有することができ
るという作用を有する。
る作用の他、各発色物質特有の発色を有することができ
るという作用を有する。
【００２９】ここで、発色物質としては、オルトフェニ
レンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（Ｔ
ＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）が用いられ
るが、他の発色できるものでもよい。
レンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンゼン（Ｔ
ＭＢ）、５−アミノサリチルサン（ＡＳＡ）が用いられ
るが、他の発色できるものでもよい。
【００３０】吸光度を測定する波長としては、ＯＰＤと
ＡＳＡ発色物質に対して４９０ｎｍ、ＴＭＢ発色物質に
対して４５０ｎｍ、ＡＢＴＳ発色物質に対して４０５ｎ
ｍが用いられる。
ＡＳＡ発色物質に対して４９０ｎｍ、ＴＭＢ発色物質に
対して４５０ｎｍ、ＡＢＴＳ発色物質に対して４０５ｎ
ｍが用いられる。
【００３１】本発明の請求項５に記載の発明は、請求項
１乃至４の内いずれか１項に記載の発明において、前記
酵素層と前記発色層と前記基質層の間に少なくとも１層
のでんぷん層が配設された構成を有している。
１乃至４の内いずれか１項に記載の発明において、前記
酵素層と前記発色層と前記基質層の間に少なくとも１層
のでんぷん層が配設された構成を有している。
【００３２】これにより、請求項１乃至４により得られ
る作用の他、吸湿による試薬の劣化を防ぐことができる
という作用を有する。
る作用の他、吸湿による試薬の劣化を防ぐことができる
という作用を有する。
【００３３】ここで、でんぷん層としては、酵素層と発
色層と基質層の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１
ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に形成されている。
色層と基質層の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは１
ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん層に形成されている。
【００３４】でんぷん層の量が発色層の半分で好適に用
いられるが、酵素層と発色層と基質層を接着できる量で
もよい。
いられるが、酵素層と発色層と基質層を接着できる量で
もよい。
【００３５】本発明の請求項６に記載の発明は、請求項
１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬
を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が
混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を
測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有して
いる。
１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬
を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗体と抗原が
混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を
測定し、吸光値による抗原濃度を測定した構成を有して
いる。
【００３６】これにより、抗原濃度分析を正確に安全で
簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱
うことにより、作業工程を減らすことができるととも
に、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容
易に抗原濃度を測定することができる。
簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱
うことにより、作業工程を減らすことができるととも
に、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容
易に抗原濃度を測定することができる。
【００３７】本発明の請求項７に記載の発明は、請求項
１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬
を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗原と抗体が
混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を
測定し、吸光値による抗体濃度を測定した構成を有して
いる。
１乃至５の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬
を、発色度を決定する標識物質を修飾した抗原と抗体が
混入された被検液に投入し、次いで発色物質の吸光度を
測定し、吸光値による抗体濃度を測定した構成を有して
いる。
【００３８】これにより、抗体濃度分析を正確に安全で
簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱
うことにより、作業工程を減らすことができるととも
に、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容
易に抗体濃度を測定することができる。
簡単に進めることができ、試薬をすべて１つの錠剤で扱
うことにより、作業工程を減らすことができるととも
に、発色物質の吸光度を測定するだけで、吸光値より容
易に抗体濃度を測定することができる。
【００３９】本発明の請求項８に記載の発明は、請求項
６又は７の内いずれか１項に記載の発明において、標識
物質がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であった構成を有し
ている。
６又は７の内いずれか１項に記載の発明において、標識
物質がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であった構成を有し
ている。
【００４０】これにより、請求項６又は７により得られ
る作用の他、発色反応の触媒活性を向上できるという作
用を有する。
る作用の他、発色反応の触媒活性を向上できるという作
用を有する。
【００４１】以下、本発明の実施の形態について、図面
を用いて説明する。 （実施の形態１）図１は本発明の実施の形態１の酵素免
疫分析用試薬の斜視図である。
を用いて説明する。 （実施の形態１）図１は本発明の実施の形態１の酵素免
疫分析用試薬の斜視図である。
【００４２】図１において、１は実施の形態１の酵素免
疫分析用試薬、２は過酸化水素を発生できる酵素と酵素
を安定するタンパク質は所定の割合で混合して熱が発生
しないように圧力をかけて固めた酵素層、３は発色物質
をそのまま固めたもので最終的に酵素層２に隣接して圧
着された発色層、４は過酸化水素を発生できる酵素に特
異的に反応する基質物と糖類は所定の割合で混合して圧
力をかけて最終的に発色層３に隣接して圧着された基質
層である。
疫分析用試薬、２は過酸化水素を発生できる酵素と酵素
を安定するタンパク質は所定の割合で混合して熱が発生
しないように圧力をかけて固めた酵素層、３は発色物質
をそのまま固めたもので最終的に酵素層２に隣接して圧
着された発色層、４は過酸化水素を発生できる酵素に特
異的に反応する基質物と糖類は所定の割合で混合して圧
力をかけて最終的に発色層３に隣接して圧着された基質
層である。
【００４３】実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１が酵
素層２、発色層３、基質層４の順にそれぞれの試薬割合
で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、す
なわち錠剤の形にしたものである。
素層２、発色層３、基質層４の順にそれぞれの試薬割合
で加圧によって積層し、積層したペレットが得られ、す
なわち錠剤の形にしたものである。
【００４４】次に実施の形態１の酵素免疫分析用試薬１
を用いて免疫分析について説明する。
を用いて免疫分析について説明する。
【００４５】ここでは最も一般的なサンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法を用いて説明する。まず測定対象である抗原に特
異的な抗体をプレートの上に非特異的吸着により固定化
を行い、十分洗浄して吸着していない抗体をｐＨ７．
０、０．１Ｍのリン酸緩衝液で液洗い流す。次に抗原な
どの非特異的な吸着を防ぐため、未吸着部分に非特異的
吸着のブロッキング剤としてアルブミンを吸着させる。
ここでも十分に洗浄を行い未吸着のアルブミンをｐＨ
７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を
０．０５％含む、Ｔｗｅｅｎ２０、関東化学株式会社
製、商品名）で洗い流す。次に検量線を作成するために
既知濃度の抗原を３倍希釈を繰り返して１０系列標準サ
ンプルを作成する。同様に未知濃度の測定溶液について
も３倍希釈で１０系列測定試料を作成する。作成した１
０系列の標準サンプル及び測定試料をアルブミンを洗い
流したプレートに注入して抗原抗体反応を行わせる。一
定時間後、十分にプレート上の未結合の抗原をｐＨ７．
０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０
５％含む）で洗い流す。洗浄後、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）を標識した抗体を注入して抗原抗体反応行わせ
る。洗浄を行い未反応の標識抗体をｐＨ７．０、０．１
Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）
で洗い流す。ここまで終了した時点で抗原が２つの抗体
に挟まれた形でプレートに固定化されている。
ＳＡ法を用いて説明する。まず測定対象である抗原に特
異的な抗体をプレートの上に非特異的吸着により固定化
を行い、十分洗浄して吸着していない抗体をｐＨ７．
０、０．１Ｍのリン酸緩衝液で液洗い流す。次に抗原な
どの非特異的な吸着を防ぐため、未吸着部分に非特異的
吸着のブロッキング剤としてアルブミンを吸着させる。
ここでも十分に洗浄を行い未吸着のアルブミンをｐＨ
７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を
０．０５％含む、Ｔｗｅｅｎ２０、関東化学株式会社
製、商品名）で洗い流す。次に検量線を作成するために
既知濃度の抗原を３倍希釈を繰り返して１０系列標準サ
ンプルを作成する。同様に未知濃度の測定溶液について
も３倍希釈で１０系列測定試料を作成する。作成した１
０系列の標準サンプル及び測定試料をアルブミンを洗い
流したプレートに注入して抗原抗体反応を行わせる。一
定時間後、十分にプレート上の未結合の抗原をｐＨ７．
０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０
５％含む）で洗い流す。洗浄後、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）を標識した抗体を注入して抗原抗体反応行わせ
る。洗浄を行い未反応の標識抗体をｐＨ７．０、０．１
Ｍのリン酸緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）
で洗い流す。ここまで終了した時点で抗原が２つの抗体
に挟まれた形でプレートに固定化されている。
【００４６】次に発色反応をさせるために、酵素層２の
グルコースオキシダーゼ、基質層４のグルコース、発色
層３のオルトフェニレンジアミンを含有した本実施の形
態１の酵素免疫分析用試薬１をｐＨ５．０のクエン酸緩
衝液に溶かして３０分間放置する。このとき溶液中では
以下の反応（１）が起こり過酸化水素が発生する。
グルコースオキシダーゼ、基質層４のグルコース、発色
層３のオルトフェニレンジアミンを含有した本実施の形
態１の酵素免疫分析用試薬１をｐＨ５．０のクエン酸緩
衝液に溶かして３０分間放置する。このとき溶液中では
以下の反応（１）が起こり過酸化水素が発生する。
【００４７】 グルコース＋グルコースオキシダーゼ＋Ｈ2Ｏ→ Ｈ2Ｏ2＋グルコノラクトン （１） ３０分後、洗浄を行ったプレートに酵素免疫分析用試薬
を溶液したものを定量注入を行い１５分間反応を起こさ
せる。ここでプレートに固定化されたペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）を触媒として以下の反応（２）が起こる。
を溶液したものを定量注入を行い１５分間反応を起こさ
せる。ここでプレートに固定化されたペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）を触媒として以下の反応（２）が起こる。
【００４８】 Ｈ2Ｏ2＋オルトフェニレンジアミン→ Ｈ2Ｏ＋オルトニトロアニリン（発色） （２） １５分後、硫酸を注入して酵素を失活させて反応を停止
させる。反応停止後４９０ｎｍの吸収光の測定をおこな
う。得られた検量線のデータから線形的に変化している
濃度範囲を抜き出して抗原濃度と吸光度の関係から検量
線を作成する。測定試料で吸光度が検量線の範囲に入っ
ているものを選んで、検量線の式から逆算して抗原濃度
を算出することができる。
させる。反応停止後４９０ｎｍの吸収光の測定をおこな
う。得られた検量線のデータから線形的に変化している
濃度範囲を抜き出して抗原濃度と吸光度の関係から検量
線を作成する。測定試料で吸光度が検量線の範囲に入っ
ているものを選んで、検量線の式から逆算して抗原濃度
を算出することができる。
【００４９】尚、以上の手順で未知濃度の試料の抗原濃
度の測定を行う。同様に未知濃度の抗体に関しては抗原
と抗体を入れ替えて同様の手順で測定することができ
る。
度の測定を行う。同様に未知濃度の抗体に関しては抗原
と抗体を入れ替えて同様の手順で測定することができ
る。
【００５０】（実施の形態２）図２は本発明の実施の形
態２の酵素免疫分析試薬の斜視図である。
態２の酵素免疫分析試薬の斜視図である。
【００５１】図２において、５は実施の形態２の酵素免
疫分析試薬、６は実施の形態１で形成した３層の試薬の
境界に形成されたでんぷん層である。尚、実施の形態１
と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
疫分析試薬、６は実施の形態１で形成した３層の試薬の
境界に形成されたでんぷん層である。尚、実施の形態１
と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
【００５２】実施の形態２の酵素免疫分析試薬５が酵素
層２と発色層３及び発色層３と基質層４の間に０．５ｍ
ｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん
層に設けられたものである。
層２と発色層３及び発色層３と基質層４の間に０．５ｍ
ｍ〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１．５ｍｍのでんぷん
層に設けられたものである。
【００５３】酵素層２と発色層３又は発色層３と基質層
４の間にでんぷん層を挟むことにより、ある程度の吸湿
に対する緩衝作用を持ち、吸湿した場合に起こる過酸化
水素発生酵素とこの酵素に特異的に反応する基質物の反
応を押さえることができる。
４の間にでんぷん層を挟むことにより、ある程度の吸湿
に対する緩衝作用を持ち、吸湿した場合に起こる過酸化
水素発生酵素とこの酵素に特異的に反応する基質物の反
応を押さえることができる。
【００５４】実施の形態２の酵素免疫分析試薬５の使用
方法は実施の形態１と同様であるので説明を省略する。
方法は実施の形態１と同様であるので説明を省略する。
【００５５】なお、以上の説明では、酵素層２と発色層
３又は発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍの
でんぷん層が設けられた例で説明したが、実施の形態１
の酵素免疫分析試薬１の表面にでんぷんのスラリーを塗
りかけて膜を形成したものについても同様に実施可能で
ある。
３又は発色層３と基質層４の間に０．５ｍｍ〜２ｍｍの
でんぷん層が設けられた例で説明したが、実施の形態１
の酵素免疫分析試薬１の表面にでんぷんのスラリーを塗
りかけて膜を形成したものについても同様に実施可能で
ある。
【００５６】また、以上の説明では、円柱状の酵素免疫
分析試薬を用いて説明したが、他の多角柱状、板状、球
状のものについても同様に実施可能である。
分析試薬を用いて説明したが、他の多角柱状、板状、球
状のものについても同様に実施可能である。
【００５７】以上のように本実施の形態によれば、酵素
免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬
をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理する
ことができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも
簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供できると共に、
抗原濃度又は抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進める
ことができ、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原
濃度又は抗体濃度を測定することができる。
免疫分析を正確に安全で簡単に進めることができ、試薬
をすべて１つの錠剤で扱うことにより一元的に管理する
ことができ、さらには作業工程を減らすことで素人にも
簡単にできる酵素免疫分析用試薬を提供できると共に、
抗原濃度又は抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進める
ことができ、発色物質の吸光度を測定するだけで、抗原
濃度又は抗体濃度を測定することができる。
【００５８】
【実施例】次に、本発明の具体例を説明する。
【００５９】（実施例１）実施の形態１の酵素免疫分析
用試薬１を用いて酵素免疫分析の確認実験を行った。
用試薬１を用いて酵素免疫分析の確認実験を行った。
【００６０】測定に使用する緩衝液は、クエン酸一水和
物を２１ｇとクエン酸三ナトリウム二水和物２９．４ｇ
秤量し、８００ｍｌ程度の蒸留水を加えて溶解した。そ
の後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ５．０
になるように調製した。調整後、蒸留水をさらに加えて
１ｌにした。
物を２１ｇとクエン酸三ナトリウム二水和物２９．４ｇ
秤量し、８００ｍｌ程度の蒸留水を加えて溶解した。そ
の後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ５．０
になるように調製した。調整後、蒸留水をさらに加えて
１ｌにした。
【００６１】作成したクエン酸緩衝液１０ｍｌに対して
オルトフェニレンジアミンを４ｍｇを添加し、グルコー
スを１ｇ添加して発色溶液（黄色）の調製を行った。な
お他の発色溶液の色は次のようになるＡＳＡ（淡黄
色）、ＴＭＢ（深緑色）、ＡＢＴＳ（青色）。
オルトフェニレンジアミンを４ｍｇを添加し、グルコー
スを１ｇ添加して発色溶液（黄色）の調製を行った。な
お他の発色溶液の色は次のようになるＡＳＡ（淡黄
色）、ＴＭＢ（深緑色）、ＡＢＴＳ（青色）。
【００６２】作成したクエン酸緩衝液１ｍｌに対して５
０００μｇの麹かび由来のグルコースオキシダーゼを添
加する。作成したグルコースオキシダーゼ溶液を３００
μｌ分注し、同様のクエン酸緩衝液を６００μｌ加えて
３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グル
コースオキシダーゼ溶液を作成する。
０００μｇの麹かび由来のグルコースオキシダーゼを添
加する。作成したグルコースオキシダーゼ溶液を３００
μｌ分注し、同様のクエン酸緩衝液を６００μｌ加えて
３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グル
コースオキシダーゼ溶液を作成する。
【００６３】０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面
活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ
−Ｔ１ｍｌに対して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μ
ｌずつ分注する。調製した発色溶液を１００μｌ添加す
る。さらに作成した希釈グルコースオキシダーゼ溶液を
それぞれセルに５０μｌずつ添加する。添加後２分間反
応を行い、２Ｎの硫酸５０μｌ添加して反応を停止さ
せ、４９０ｎｍ（ＯＰＤ）の吸光度の測定を行った。な
お、他の発色液を使用する場合は４９０ｎｍ（ＡＳ
Ａ）、４５０ｎｍ（ＴＭＢ）、４０５ｎｍ（ＡＢＴＳ）
の波長で測定を行う。同様の操作を行い反応時間１０，
１５，２０，３０分間について測定を行った。その結果
を図３に示す。
活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ
−Ｔ１ｍｌに対して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）を０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μ
ｌずつ分注する。調製した発色溶液を１００μｌ添加す
る。さらに作成した希釈グルコースオキシダーゼ溶液を
それぞれセルに５０μｌずつ添加する。添加後２分間反
応を行い、２Ｎの硫酸５０μｌ添加して反応を停止さ
せ、４９０ｎｍ（ＯＰＤ）の吸光度の測定を行った。な
お、他の発色液を使用する場合は４９０ｎｍ（ＡＳ
Ａ）、４５０ｎｍ（ＴＭＢ）、４０５ｎｍ（ＡＢＴＳ）
の波長で測定を行う。同様の操作を行い反応時間１０，
１５，２０，３０分間について測定を行った。その結果
を図３に示す。
【００６４】図３はグルコースオキシダーゼ濃度と、酵
素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレ
ンジアミンの発色の関係を示す図である。
素反応により発生した過酸化水素によるオルトフェニレ
ンジアミンの発色の関係を示す図である。
【００６５】図３において、曲線Ａは反応時間３０分
間、曲線Ｂは反応時間２０分間、曲線Ｃは反応時間１０
分間、曲線Ｄは反応時間５分間の吸光曲線を示してい
る。
間、曲線Ｂは反応時間２０分間、曲線Ｃは反応時間１０
分間、曲線Ｄは反応時間５分間の吸光曲線を示してい
る。
【００６６】図３から明らかなように、グルコースオキ
シダーゼ量はすべての反応時間において１０μｇ／ｍｌ
〜１００μｇ／ｍｌの範囲で、高いシグナルを示し、５
０μｇ／ｍｌでこの時高感度の測定を可能とすることが
分かった。
シダーゼ量はすべての反応時間において１０μｇ／ｍｌ
〜１００μｇ／ｍｌの範囲で、高いシグナルを示し、５
０μｇ／ｍｌでこの時高感度の測定を可能とすることが
分かった。
【００６７】次に酵素量に対する最適なグルコース量を
決定する。まず４ｇのグルコースを蒸留水に溶かして最
終的にグルコース溶液を１０ｍｌ作成する。作成したグ
ルコース溶液を１ｍｌ分注し、２ｍｌの蒸留水を加えて
３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グル
コース溶液を作成する。
決定する。まず４ｇのグルコースを蒸留水に溶かして最
終的にグルコース溶液を１０ｍｌ作成する。作成したグ
ルコース溶液を１ｍｌ分注し、２ｍｌの蒸留水を加えて
３倍に希釈する。同様の操作を行い１０種類の希釈グル
コース溶液を作成する。
【００６８】測定は、０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢ
Ｓ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加
えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）を０．００５μｇ／ｍｌ加えた酵素溶液をセルに
５０μｌずつ分注する。前記クエン酸緩衝液１０ｍｌに
対してグルコースオキシダーゼを４００μｇ添加し、オ
ルトフェニレンジアミンを４ｍｇ添加して作成した発色
液をセルに１００μｌずつ添加する。さらにそれぞれの
濃度のグルコース溶液をセルに５０μｌずつ添加して１
５分間反応させる。反応終了後２Ｎの硫酸を加えて反応
を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を
行った。その結果を図４に示す。
Ｓ）に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加
えたＰＢＳ−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）を０．００５μｇ／ｍｌ加えた酵素溶液をセルに
５０μｌずつ分注する。前記クエン酸緩衝液１０ｍｌに
対してグルコースオキシダーゼを４００μｇ添加し、オ
ルトフェニレンジアミンを４ｍｇ添加して作成した発色
液をセルに１００μｌずつ添加する。さらにそれぞれの
濃度のグルコース溶液をセルに５０μｌずつ添加して１
５分間反応させる。反応終了後２Ｎの硫酸を加えて反応
を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度の測定を
行った。その結果を図４に示す。
【００６９】図４はグルコース濃度と吸光度の関係を表
すグラフである。図４から明らかなように、グルコース
量は１μｇ／ｍｌ以上が望ましく、この時高感度の測定
を可能とすることが分かった。
すグラフである。図４から明らかなように、グルコース
量は１μｇ／ｍｌ以上が望ましく、この時高感度の測定
を可能とすることが分かった。
【００７０】次にグルコースオキシダーゼとグルコース
の反応により発生する過酸化水素の適量に達する時間の
決定を行った。
の反応により発生する過酸化水素の適量に達する時間の
決定を行った。
【００７１】０．１Ｍのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）に界面
活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ
−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を
０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分
注する。実施の形態２で作成した発色液を１００μｌ加
えて２，５，１０，１５，２０，３０，８０，１７０分
間のそれぞれの時間反応させて、反応終了後２Ｎの硫酸
を５０μｌ加えて停止させる。反応停止後４９０ｎｍの
吸光度の測定を行った。その結果を図５に示す。
活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を０．０５％加えたＰＢＳ
−Ｔ１ｍｌに対して、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を
０．００５μｇ加えた酵素溶液をセルに５０μｌずつ分
注する。実施の形態２で作成した発色液を１００μｌ加
えて２，５，１０，１５，２０，３０，８０，１７０分
間のそれぞれの時間反応させて、反応終了後２Ｎの硫酸
を５０μｌ加えて停止させる。反応停止後４９０ｎｍの
吸光度の測定を行った。その結果を図５に示す。
【００７２】図５はオルトフェニレンジアミンの発色時
間と吸光度の関係を表すグラフである。
間と吸光度の関係を表すグラフである。
【００７３】図５から明らかなように、過酸化水素発生
時間は３０分間が望ましく、この時高感度の測定を可能
にすることが分かった。
時間は３０分間が望ましく、この時高感度の測定を可能
にすることが分かった。
【００７４】（実施例２）実施の形態１の酵素免疫分析
用試薬１を用いて酵素免疫分析の検量線実験を行った。
用試薬１を用いて酵素免疫分析の検量線実験を行った。
【００７５】ペレットの形成はオルトフェニレンジアミ
ン４ｍｇ、グルコース３０ｍｇ、グルコースオキシダー
ゼ３００μｇのそれぞれの物質について圧縮してペレッ
ト状に形成する。そして各ペレットをさらに圧着して１
つのペレットに形成したものである。
ン４ｍｇ、グルコース３０ｍｇ、グルコースオキシダー
ゼ３００μｇのそれぞれの物質について圧縮してペレッ
ト状に形成する。そして各ペレットをさらに圧着して１
つのペレットに形成したものである。
【００７６】１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６０
０μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操
作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸
緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬１を１錠添加
して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反
応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して
反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測
定を行った。その結果を図６に示す。
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６０
０μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操
作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸
緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬１を１錠添加
して作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反
応させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して
反応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測
定を行った。その結果を図６に示す。
【００７７】図６は酵素免疫分析用試薬での検量線作成
結果を表すグラフである。図６から明らかなように、
０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌの範囲で線
形的な変化を示し、この範囲で測定できることが分かっ
た。
結果を表すグラフである。図６から明らかなように、
０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌの範囲で線
形的な変化を示し、この範囲で測定できることが分かっ
た。
【００７８】（実施例３）実施の形態１の酵素免疫分析
用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の安定性実験を行っ
た。
用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の安定性実験を行っ
た。
【００７９】グルコースとグルコースオキシダーゼが隣
り合った酵素免疫分析用試薬と実施の形態１で作成した
と酵素免疫分析用試薬１を湿度１００％の容器内で１時
間保持して、１週間３℃の冷蔵庫で保管した後に測定に
使用した。
り合った酵素免疫分析用試薬と実施の形態１で作成した
と酵素免疫分析用試薬１を湿度１００％の容器内で１時
間保持して、１週間３℃の冷蔵庫で保管した後に測定に
使用した。
【００８０】１ｍｌのＰＢＳ−Ｔに０．００５μｇのペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６０
０μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操
作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸
緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬を１錠添加し
て作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応
させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反
応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定
を行った。その結果を図７に示す。
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加して、作成したペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）溶液から３００μｌ分注し、６０
０μｌのＰＢＳ−Ｔを加えて３倍に希釈する。同様の操
作を行い１０種類の希釈ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液を作成する。各濃度のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶
液をセルにそれぞれ５０μｌ分注する。これにクエン酸
緩衝液１０ｍｌに酵素免疫分析用発色試薬を１錠添加し
て作成した発色液を１００μｌ添加して、１５分間反応
させる。反応終了後、２Ｎの硫酸を５０μｌ添加して反
応を停止させる。反応停止後４９０ｎｍの吸光度を測定
を行った。その結果を図７に示す。
【００８１】図７は酵素免疫分析用試薬の安定性を比較
した結果を表したグラフである。図７において、曲線Ａ
はグルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質
がある場合、曲線Ｂはグルコースオキシダーゼとグルコ
ースが隣り合っている場合の吸光曲線である。
した結果を表したグラフである。図７において、曲線Ａ
はグルコースオキシダーゼとグルコースの間に発色物質
がある場合、曲線Ｂはグルコースオキシダーゼとグルコ
ースが隣り合っている場合の吸光曲線である。
【００８２】図７から明らかなように、グルコースオキ
シダーゼとグルコースの間に発色物質を挟むことにより
吸湿による劣化を防ぐことができる。また測定範囲も
０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用で
きることが分かった。
シダーゼとグルコースの間に発色物質を挟むことにより
吸湿による劣化を防ぐことができる。また測定範囲も
０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌまで使用で
きることが分かった。
【００８３】（実施例４）実施の形態２の酵素免疫分析
用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の保存安定性実験を行
った。
用試薬を用いて酵素免疫分析試薬の保存安定性実験を行
った。
【００８４】図２に示すように、グルコースオキシダー
ゼ、グルコース、発色剤の層の間にでんぷん層を挟んだ
構造のペレットを形成したものである。グルコースオキ
シダーゼ、グルコース、発色剤の割合は実施の形態２に
示した数値と同様であり、間に挟んだでんぷん層の割合
は各層の接着及び吸湿ができればどのような割合でもよ
い。ここで形成した発色溶液作成試薬を使用して発色溶
液を調合し、この発色溶液を用いて測定を行った。なお
比較を行うために作成した発色溶液作成試薬を湿度１０
０％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させ
たものと、そうでないものを１週間３℃の冷蔵庫で保存
した後に使用した。
ゼ、グルコース、発色剤の層の間にでんぷん層を挟んだ
構造のペレットを形成したものである。グルコースオキ
シダーゼ、グルコース、発色剤の割合は実施の形態２に
示した数値と同様であり、間に挟んだでんぷん層の割合
は各層の接着及び吸湿ができればどのような割合でもよ
い。ここで形成した発色溶液作成試薬を使用して発色溶
液を調合し、この発色溶液を用いて測定を行った。なお
比較を行うために作成した発色溶液作成試薬を湿度１０
０％の容器内で１時間保持して、十分に水分を吸収させ
たものと、そうでないものを１週間３℃の冷蔵庫で保存
した後に使用した。
【００８５】マイクロプレートに１μｇ／ｍｇのＤｅｒ
ｆＩＩ抗体を５０μｌ注入し、２時間プレートに固定化
する。その後洗浄を行い、２％のアルブミンを含むＰＢ
Ｓ（ＰＢＳ−Ｂ）を２００μｌ注入して３０分間反応さ
せる。その後、界面活性剤を含んだＰＢＳ−Ｔで洗浄を
行い、ＰＢＳ−Ｔに溶かしたＤｅｒｆＩＩ抗原を注入し
２時間反応させ、さらに洗浄、そして０．５μｇ／ｍｌ
のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＤｅｒｆＩＩ抗体を
５０μｌ添加して反応させる。洗浄後、作成した各発色
溶液を１００μｌ添加して１５分間反応させ、２Ｎの硫
酸を５０μｌ添加して反応を止めて４９０ｎｍの吸光度
の測定を行った。その結果を図８に示す。
ｆＩＩ抗体を５０μｌ注入し、２時間プレートに固定化
する。その後洗浄を行い、２％のアルブミンを含むＰＢ
Ｓ（ＰＢＳ−Ｂ）を２００μｌ注入して３０分間反応さ
せる。その後、界面活性剤を含んだＰＢＳ−Ｔで洗浄を
行い、ＰＢＳ−Ｔに溶かしたＤｅｒｆＩＩ抗原を注入し
２時間反応させ、さらに洗浄、そして０．５μｇ／ｍｌ
のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＤｅｒｆＩＩ抗体を
５０μｌ添加して反応させる。洗浄後、作成した各発色
溶液を１００μｌ添加して１５分間反応させ、２Ｎの硫
酸を５０μｌ添加して反応を止めて４９０ｎｍの吸光度
の測定を行った。その結果を図８に示す。
【００８６】図８は本発明の実施の形態２の酵素免疫分
析試薬５の保存安定性を比較するグラフである。
析試薬５の保存安定性を比較するグラフである。
【００８７】図８において、曲線Ａは発色溶液作成試薬
を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分
を吸収させたもの、曲線Ｂは全く水を吸湿させてないも
のを表している。
を湿度１００％の容器内で１時間保持して、十分に水分
を吸収させたもの、曲線Ｂは全く水を吸湿させてないも
のを表している。
【００８８】図８から明らかなように、でんぷんを各層
の間に挟むことにより吸湿による劣化を抑えることがで
き、測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／
ｍｌまで使用できることが分かった。
の間に挟むことにより吸湿による劣化を抑えることがで
き、測定範囲も０．００１μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／
ｍｌまで使用できることが分かった。
【００８９】
【発明の効果】以上のように本発明においては、以下の
優れた効果を実現できる。
優れた効果を実現できる。
【００９０】本発明の請求項１に記載の発明によれば、
（１）過酸化水素発生酵素、過酸化水素発生酵素に特異
的に反応する基質物、発色物質を１つの錠剤にまとめて
しまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加
することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰
でも正確に安全でかつ簡単に抗原濃度又は抗体濃度を測
定することができる。
（１）過酸化水素発生酵素、過酸化水素発生酵素に特異
的に反応する基質物、発色物質を１つの錠剤にまとめて
しまうことにより、溶液中に１つにまとめた錠剤を添加
することで、いつでも一定試薬の添加が可能となり、誰
でも正確に安全でかつ簡単に抗原濃度又は抗体濃度を測
定することができる。
【００９１】本発明の請求項２に記載の発明によれば、
請求項１に記載の効果に加えて、（２）酵素免疫分析用
試薬が長期で保存でき、吸湿による試薬の変質を抑制す
ることができる。
請求項１に記載の効果に加えて、（２）酵素免疫分析用
試薬が長期で保存でき、吸湿による試薬の変質を抑制す
ることができる。
【００９２】本発明の請求項３に記載の発明によれば、
請求項１又は２の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（３）酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、危険
な過酸化水素を使用せず安定性に優れ、低原価で量産で
きる。
請求項１又は２の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（３）酵素免疫分析用試薬が長期で保存でき、危険
な過酸化水素を使用せず安定性に優れ、低原価で量産で
きる。
【００９３】本発明の請求項４に記載の発明によれば、
請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（４）酵素免疫分析用試薬が各発色物質特有の発色
を有することにより、酵素免疫分析の正確性を向上する
事ができる。
請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（４）酵素免疫分析用試薬が各発色物質特有の発色
を有することにより、酵素免疫分析の正確性を向上する
事ができる。
【００９４】本発明の請求項５に記載の発明によれば、
請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（５）酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の劣化
を防ぐことができる。
請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（５）酵素免疫分析用試薬が吸湿による試薬の劣化
を防ぐことができる。
【００９５】本発明の請求項６に記載の発明によれば、
（６）抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることが
でき、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業
工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度
を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定す
ることができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便
性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供でき
る。
（６）抗原濃度分析を正確に安全で簡単に進めることが
でき、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業
工程を減らすことができるとともに、発色物質の吸光度
を測定するだけで、吸光値より容易に抗原濃度を測定す
ることができるとともに、簡単で安全性、安定性と利便
性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を提供でき
る。
【００９６】本発明の請求項７に記載の発明によれば、
（７）抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることが
でき、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業
工程を減らすことができるとともに、発色物質の生成物
の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度
を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定
性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を
提供できる。
（７）抗体濃度分析を正確に安全で簡単に進めることが
でき、試薬をすべて１つの錠剤で扱うことにより、作業
工程を減らすことができるとともに、発色物質の生成物
の吸光度を測定するだけで、吸光値より容易に抗体濃度
を測定することができるとともに、簡単で安全性、安定
性と利便性に優れ、正確且つ測定感度が高い分析方法を
提供できる。
【００９７】本発明の請求項８に記載の発明によれば、
請求項６又は７の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（８）酵素免疫分析用試薬が発色反応の触媒活性を
有することができ、酵素免疫分析の感度を向上すること
ができる。
請求項６又は７の内いずれか１項に記載の効果に加え
て、（８）酵素免疫分析用試薬が発色反応の触媒活性を
有することができ、酵素免疫分析の感度を向上すること
ができる。
【図１】本発明の実施の形態１の酵素免疫分析用試薬の
斜視図
斜視図
【図２】本発明の実施の形態２の酵素免疫分析用試薬の
斜視図
斜視図
【図３】グルコースオキシダーゼ濃度と、酵素反応によ
り発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミン
の発色の関係を示す図
り発生した過酸化水素によるオルトフェニレンジアミン
の発色の関係を示す図
【図４】グルコース濃度と吸光度の関係を表すグラフ
【図５】オルトフェニレンジアミンの発色時間と吸光度
の関係を表すグラフ
の関係を表すグラフ
【図６】酵素免疫分析用試薬での検量線作成結果を表す
グラフ
グラフ
【図７】酵素免疫分析用試薬の安定性を比較した結果を
表すグラフ
表すグラフ
【図８】実施の形態２の酵素免疫分析試薬の保存安定性
を比較するグラフ
を比較するグラフ
１ 実施の形態１の酵素免疫分析用試薬 ２ 酵素層 ３ 発色層 ４ 基質層 ５ 実施の形態２の酵素免疫分析用試薬 ６ でんぷん層
Claims (8)
- 【請求項１】過酸化水素を発生できる酵素を含有する酵
素層と、前記酵素層の酵素に特異的に反応する基質物を
含有する基質層と、前記酵素層の酵素と前記基質層の基
質物との反応によって発生する過酸化水素を用いて発色
する発色物質を含有する発色層と、を備えていることを
特徴とする酵素免疫分析用試薬。 - 【請求項２】前記発色層が、前記酵素層と前記基質層の
間に積層されていることを特徴とする請求項１に記載の
酵素免疫分析用試薬。 - 【請求項３】前記酵素がグルコースオキシダーゼ（ＧＯ
Ｄ）であり、及び／又は前記酵素に特異的に反応する基
質物がグルコースであることを特徴とする請求項１又は
２の内いずれか１項に記載の酵素免疫分析用試薬。 - 【請求項４】前記発色物質が、オルトフェニレンジアミ
ン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルフォン酸）、３，３’，５，５’
−テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）、５−アミノサリチ
ルサン（ＡＳＡ）の少なくとも１種であることを特徴と
する請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の酵素免疫
分析用試薬。 - 【請求項５】前記酵素層と前記発色層と前記基質層の間
に少なくとも１層のでんぷん層が配設されていることを
特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の酵
素免疫分析用試薬。 - 【請求項６】請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の
酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修
飾した抗体と抗原が混入された被検液に投入し、次いで
発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗原濃度を測
定することを特徴とする酵素免疫分析方法。 - 【請求項７】請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の
酵素免疫分析用試薬を、発色度を決定する標識物質を修
飾した抗原と抗体が混入された被検液に投入し、次いで
発色物質の吸光度を測定し、吸光値による抗体濃度を測
定することを特徴とする酵素免疫分析方法。 - 【請求項８】前記標識物質がペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）であることを特徴とする請求項６又は７に記載の酵
素免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29036198A JP3622532B2 (ja) | 1998-10-13 | 1998-10-13 | 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29036198A JP3622532B2 (ja) | 1998-10-13 | 1998-10-13 | 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000121637A true JP2000121637A (ja) | 2000-04-28 |
| JP3622532B2 JP3622532B2 (ja) | 2005-02-23 |
Family
ID=17755046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29036198A Expired - Fee Related JP3622532B2 (ja) | 1998-10-13 | 1998-10-13 | 酵素免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3622532B2 (ja) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5763454A (en) * | 1980-08-07 | 1982-04-16 | Syva Co | Immuno assay method and assay apparatus |
| JPS57118160A (en) * | 1980-09-02 | 1982-07-22 | Syva Co | Single test composition for immuno-assay |
| JPS5817365A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-02-01 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 不透過性の輻射線散乱・遮へい層を有する多重層分析素子 |
| JPS61181965A (ja) * | 1984-11-27 | 1986-08-14 | オ−ジエニクス リミテツド | 検定装置 |
| JPS61264262A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-22 | ベーリングヴェルケ・アクチェンゲゼルシャフト | 改良１段階ヘテロジニアスアツセイ |
| JPH07194396A (ja) * | 1993-11-12 | 1995-08-01 | Eastman Kodak Co | 分析物の化学ルミネセンス検出のための乾式分析要素、試験デバイス、試験キットおよび方法 |
| JPH09502799A (ja) * | 1993-08-25 | 1997-03-18 | ソシエテ ディアグノスティカースターゴ | マルチメンブランシステムを用いる免疫物質の固定方法 |
-
1998
- 1998-10-13 JP JP29036198A patent/JP3622532B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5763454A (en) * | 1980-08-07 | 1982-04-16 | Syva Co | Immuno assay method and assay apparatus |
| JPS57118160A (en) * | 1980-09-02 | 1982-07-22 | Syva Co | Single test composition for immuno-assay |
| JPS5817365A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-02-01 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 不透過性の輻射線散乱・遮へい層を有する多重層分析素子 |
| JPS61181965A (ja) * | 1984-11-27 | 1986-08-14 | オ−ジエニクス リミテツド | 検定装置 |
| JPS61264262A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-22 | ベーリングヴェルケ・アクチェンゲゼルシャフト | 改良１段階ヘテロジニアスアツセイ |
| JPH09502799A (ja) * | 1993-08-25 | 1997-03-18 | ソシエテ ディアグノスティカースターゴ | マルチメンブランシステムを用いる免疫物質の固定方法 |
| JPH07194396A (ja) * | 1993-11-12 | 1995-08-01 | Eastman Kodak Co | 分析物の化学ルミネセンス検出のための乾式分析要素、試験デバイス、試験キットおよび方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3622532B2 (ja) | 2005-02-23 |
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