LU84402A1 - Procede et dispositif pour determiner la presence d'antigenes dans des fluides biologiques - Google Patents

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Description

«
La présente invention concerne un dispositif et un procédé pour déterminer la présence d'antigènes dans des fluides biologiques.
Des essais de diagnostic immunologique sont 5 largement utilisés peur la détection d'antigènes de fluides corporels, d'hormones, d'agents infectieux et d'anticorps de sérum. Des essais immunologiques rentrent généralement dans les deux catégories suivantes. En premier lieu des essais de précipitation anticorps-antigènes, tels 10 qu'une immunodiffusion radiale, une hémagglutination et une agglutination de particules de latex revêtues. En second lieu des essais avec réactifs marqués, tels qu'un radioimmunc-essai et un immunc-essai avec enzyme liée.
Les essais du type précipitation présentent 15 l'avantage d'être effectués manuellement et ils sont commercialement utilisés avec des appareils à jeter après usage, qui sont lisibles visuellement et qui ne nécessitent pas un instrument. La lecture d'un immuno-essai du type précipitation est usuellement exprimée par la 20 présence ou l'absence d'une réaction d'agglutination pour chacune d'une série de dilutions connues de l'échantillon d'essai ou de l'antigène correspondant. Les inconvénients des essais du type précipitation consistent en ce qu'ils sont bien moins sensibles que des essais avec réactifs 25 marqués, qu'ils font intervenir de longues étapes d'incubation et qu'ils sont affectés par des erreurs subjectives pour l'identification visuelle d'une réaction de précipitation.
Des immunc-essais avec réactifs marqués sont 30 quantitatifs et très sensibles mais néanmoins ils présen-, " tent certains inconvénients. Des radio-immunc-essais utilisent des traceurs radioactifs et par conséquent ils nécessitent un instrument de détection de rayonnement gamma. Les traceurs radioactifs ont une courte durée de 35 conservation, ils créent un danger pour la santé du technicien et ils sont soumis à une législation restrictive. Des essais immunc-abscrbants avec enzyme liée (ELISA) utilisent des réactifs marqués avec une enzyme.
2 L'enzyme est détectée par sa réaction avec un substrat peur former un produit qui peut être aisément mesuré ( par exemple par formation d'une couleur ). L'essai ELISA ne nécessite pas de matières radioactives et utilise des réactifs 5 d'une longue durée de conservation.
L'essai ELISA consiste dans la fixation d'un réactif de référence sur un support en phase solide, par exemple le fond d'une éprouvette plastique On fait réagir un fluide d'essai, mélangé avec un réactif marqué par 10 enzyme avec le réactif de référence fixé. Par un certain nombre ( pouvant atteindre quatorze ) d'étapes de dilution, d'incubation et de lavage, on sépare les réactifs fixés et libres et on amorce une réaction de formation de couleur. L'intensité de la couleur formée pour différentes dilutions 15 de la série établit la mesure quantitative. L'essai ELISA standard a une durée d'environ quatre à douze heures. En conséquence, le gros inconvénient de l'essai ELISA consiste dans le gros nombre d'étapes de dilutation, d'incubation et de lavage, qui sont longues et sujettes à erreurs.
20 Le dispositif selon l'invention est utilisé peur remédier à un grand nombre des difficultés rencontrées avec le type d'essai précité. Spécifiquement, son utilisation se traduit par un essai ELISA perfectionné qui ne nécessite aucune dilution, aucune étape de lavage et une courte pério-25 de d'incubation. L'élément d'essai se présente sous la forme d'une bande stratifiée sèche qui produit une réaction de coloration lorsqu'elle est exposée directement au fluide d'essai. La bande effectue automatiquement les étapes de dilution nécessaires pour la quantification et la séparation 30 de l'anticorps fixé par rapport à l'anticorps libre. La réaction de coloration peut être observée visuellement, ou à l'aide d'un instrument, tel qu'un spectrophctomètre. En outre le dispositif selon l'invention peut être fabriqué sous la forme d'une bande et il peut être utilisé comme une 35 jauge pour détecter rapidement un antigène, par exemple un médicament ou une hormone dans l'urine. Un exemple d'application spécifique consiste dans la détection rapide d'une dose excessive de médicament dans la salle d'urgence eu bien s 3 dans un test de grossesse à la maison.
Selon un aspect, la présente invention concerne un dispositif pour déterminer la présence d'antigènes, qui comprend une première zone contenant des antigènes et des 5 anticorps avec enzyme liée qui sont capables de réagir immu-nologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant placés dans la première zone de manière qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des antigènes passant dans cette première zone, sans être cepen-10 dant enlevés de cette première zone en l'absence desdits antigènes, et une seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits anticorps avec enzyme liée pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits anticorps.
15 Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé nouveau pour déterminer la présence d'antigènes dans un fluide biologique, consistant à amener ledit fluide au contact d'un dispositif ou matrice comportant une première zone contenant des antigènes et des 20 anticorps avec enzyme liée qui sont capables de réagir immunolcgiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant placés dans la première zone de façon qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des antigènes passant dans ladite première zone, sans être 25 cependant enlevés de cette première zone en l’absence desdits antigènes, et une seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits anticorps avec enzyme liée pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits anticorps ; à laisser ledit 30 fluide pénétrer dans ledit dispositif ou matrice ; et à observer la présence ou l'absence d'un changement de couleur dans ladite seconde zone pour déterminer ainsi la présence eu l'absence de l'antigène en question dans ledit fluide.
On va maintenant donner une description des 35 dessins.
La figure 1 est une représentation schématique du dispositif 10 conforme à l’invention, qui est composé de trois couches distinctes 12, 14 et 16. Les couches 12 et 4 14 forment la première zone 18. La couche 16 forme la seconde zone 20. Le dispositif 10 est représenté comme étant placé sur un élément porteur 22. La couche 12 est 5 fermée d'une matière poreuse dans laquelle sont dispersés des antigènes liés à des enzymes solubles 24. La couche 14 est également formée d'une matière poreuse et elle comporte des antigènes 26 fixés. La couche 16 est de même formée d'une matière poreuse et elle contient un réactif fixé de 10 formation de couleur 17, c'est-à-dire une matière qui réagit avec une enzyme pour produire une couleur.
La fig. 2 est une représentation schématique mettant en évidence le procédé selon l'invention, utilisant le dispositif de la fig. 1. Spécifiquement, un fluide, désigné 15 dans son ensemble par la référence 28, est déposé sur la surface 30 de la couche 12. Quand le fluide diffuse au travers de la matrice, un antigène libre 32 entre en contact et se combine avec des anticorps 24 liés à des enzymes.
Après une courte période d'incubation, les anticorps liés 20 à des enzymes et comportant des sites de détection de saturation diffusent librement au travers de la première zone 18 et dans la seconde zone 20 ( ou couche 16 ), où l'enzyme réagit avec le réactif de formation de couleur pour produire une couleur distinctive qui indique la présence d'un anti-25 gène dans le fluide utilisé.
La fig. 3 est une représentation schématique mettant en évidence le procédé selon l'invention, utilisant le dispositif de la fig. 1 et montrant ce qui se produit quand le fluide à tester est dépourvu d'antigène. Spécifique-30 ment un fluide, désigné dans son ensemble par 34, est déposé sur la surface 30 de la couche 12. Quand le fluide diffuse au travers de la couche 12 de la matrice, des anticorps avec enzyme liée 24 sont solubilisés et pénètrent dans la couche 14 où ils entrent en contact avec et sont fixés 35 aux antigènes fixés 26. En conséquence, aucun anticorps n'atteint le réactif de formation de couleur 17 se trouvant dans la couche 16 ( seconde zone 20 ) et on n'observe aucune modification de couleur. Cela indique évidemment j 5 qu'aucun antigène ne se trouve dans le fluide 34.
La fig. 4 montre un autre mode de réalisation de l'invention où le dispositif ou matrice 11 est formé de deux couches distinctes 36 et 38. Dans ce cas, la couche 36 5 est la première zone 40 contenant un antigène de référence fixé 44 qui est combiné avec un anticorps lié à enzyme 46.
La couche 38 est la seconde zone 42 et elle contient un réactif de formation de couleur 17.
Comme indiqué sur la fig. 5, lorsque le fluide 10 à tester 48 contient suffisamment d'antigène libre 50 pour contrebalancer l'antigène fixé 44, l'anticorps lié à enzyme est déplacé et diffuse dans la zone 42 pour produire une réaction de coloration 52.
Inversement, comme indiqué sur la fig. 6, lorsque 15 le fluide à tester 54 est dépourvu d'antigène, il ne se produit aucune compétition et par conséquent aucun anticorps lié à enzyme ne diffuse dans la seconde zone 42 et aucune couleur n'est produite.
On va maintenant décrire la mise en pratique de 20 l'invention. La présente invention est basée sur le principe de compétition entre des antigènes fixés et libres pour un nombre fixe de sites de caractérisation sur un anticorps marqué par enzyme. Elle constitue un procédé perfectionné d'exécution de l’essai du type ELISA. Les réactifs de 25 l'essai sont imprégnés dans une bande d'essai à zones multiples. On laisse l'échantillon liquide à tester diffuser passivement dans la bande d'essai. Les antigènes fixés et libres sont automatiquement séparés pendant la diffusion. Cette séparation est effectuée en immobilisant l'antigène de 30 référence en phase solide dans une première zone qui est séparée d'une seconde zone contenant le substrat a enzyme.
On laisse un anticorps lié à une enzyme soluble, qui comporte des sites de caractérisation, se mélanger avec l’échantillon d'essai et diffuser au travers des couches. Les antigènes 35 solubles contenus dans l'échantillon d'essai entrent en compétition avec l'antigène de référence immobilisé pour se combiner avec l'antigène lié à enzyme. En conséquence, la quantité d'anticorps liés à enzyme qui atteint finalement 6 la seconde zone contenant le substrat dépend de la concentration de l'antigène en train d'être testé dans l'échantillon. Le substrat de la bande d'essai réagit avec l'enzyme pour produire une réaction de coloration.
5 Pour obtenir une quantification, la bande d'essai est constituée de plusieurs zones séparées contenant chacune une quantité différente d'antigène de référence immobilisé. La position du changement de couleur sur la bande d'essai est par conséquent fonction de la concentra-10 tion de l'antigène dans l'échantillon d'essai.
Comme indiqué ci-dessus, le dispositif selon l'invention comprend une première zone qui contient un antigène fixé et un anticorps spécifique lié à enzyme ainsi qu'une seconde zone qui contient un réactif ou substrat de 15 formation de codeur. Les anticorps avec enzyme liée sont positionnés dans la première zone de manière à pouvoir être enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec un antigène non fixé pénétrant ou passant au travers mais à ne pas être enlevés de la première zone en l'absence d'un tel 20 antigène.
Dans la mise en pratique préférée de l'invention, le dispositif d'immuno-essai est constitué par une structure sandwich de trois couches matricielles poreuses ( cf fig.l ). La première couche poreuse est imprégnée d'un anticorps 25 spécifique avec enzyme liée. La seconde couche poreuse contient un antigène de référence immobilisé ( fixé ). L'antigène est du type spécifiquement agréé par l'anticorps dans la première couche poreuse. La troisième couche contient un substrat de formation de couleur qui réagit avec l'enzyme 30 liée à l'anticorps. Le fonctionnement du dispositif est le suivant ( cf. figures 2 et 3 ).
L'échantillon de fluide, contenant l'antigène à tester, est placé au contact de la première couche. L'antigène libre se trouvant dans l'échantillon à tester diffuse 35 dans la seconde couche puis dans la troisième couche. L'antigène libre de l'échantillon entre en compétition avec l'antigène de référence immobilisé eu fixé de la seconde couche pour se combiner avec l'anticorps avec enzyme liée.
7
Si l'anticorps avec enzyme liée se combine avec l'antigène libre, il diffuse librement dans la troisième couche et produit une réaction de coloration. Si l'échantillon de fluide ne contient pas d'antigène, la totalité de l'anti-5 corps avec enzyme liée comporte des sites libres de fixation et l'anticorps se combine avec l'antigène immobilisé dans la seconde couche. L'anticorps avec enzyme liée qui se combine avec l'antigène immobilisé dans la seconde couche ne diffuse pas dans la troisième couche et il ne se produit 10 aucune réaction de coloration. La différence concernant la quantité de substrat dégradée ( et l'intensité de couleur produite ) est proportionnelle à la quantité d'antigène se trouvant dans l'échantillon testé. Pour une quantité donnée d'anticorps marqués par enzyme dans la première 15 couche, la sensibilité du dispositif est déterminée par la quantité d'antigènes de référence existant dans la seconde couche. Typiquement, un dispositif d'essai contient une série de structures composites sandwich contenant chacune une quantité différente d'antigène de référence. Les séries 20 de concentrations d'antigène de référence ont été précédemment déterminées de manière à couvrir une gamme de sensibilités appropriées pour la solution d'essai à mesurer.
Il est à noter que, dans la bande d'essai ELISA, une réaction de coloration positive indique la présence de l'antigène 25 en train d'être testé.
Les matières utilisées pour fabriquer le dispositif selon l'invention sont bien connues dans ce domaine. Cependant en pratique, il s'est avéré souhaitable de former les zones ou couches du dispositif préféré en utilisant des 30 fibres intertissées telles que du papier de nitrocellulose eu de diazobenzyloxymethyle (DMB). Du papier de nitrocellulose fixe directement des protéines et il s'est avéré utile pour · immobiliser des antigènes. Une matrice DBM fixe le DNA» le RI\A et ; des protéines au moyen de liaisons covalentes avec le I 35 groupe diazonium. On peut utiliser additionnellement un gel poreux tel que du polyacrylamide, de l'agarose eu du collagène. L'antigène peut être emprisonné dans les pores du gel ou bien il peut être fixé par réticulation sur le gel » 8 % par l'intermédiaire de groupes amine du liant et de groupes carboxyliques de la matrice. Egalement des particules ou des perles contenant le liant fixé et emprisonné dans une 5 matrice de fibres en cellulose ou en matière plastique peuvent être utilisées. Dans un exemple satisfaisant, on a utilisé des perles de polyacrylamide, d'un diamètre de 5 à 10 microns, avec de l'antigène fixé en surface par l'intermédiaire d'une liaison peptidique. Les perles·· 10 sont emprisonnées dans une matrice de fibres de cellulose d'une dimension de pores de 1 à 2 microns.
Des substrats ou réactifs de formation de couleur appropriés sont bien connus dans le domaine. A cet égard, un certain nombre de types différents d'enzymes 15 purifiées constituent couramment des réactifs marqués utilisables dans des immuno-essais tels que l'essai ELISA.
A cet égard, on peut citer la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline et la beta-galactcsidase. Cependant la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation de ces 20 enzymes pour marquer l'anticorps ou l'antigène. L'enzyme utilisée pour marquer l'anticorps peut produire une couleur dans la seconde zone du dispositif d'essai en agissant directement ou indirectement avec l'agent de formation de couleur. Par exemple des substrats bien connus dans ce 25 domaine, tels que la diaminobenzidine ou le p-nitrophenyl-phosphate réagissent avec la peroxydase de raifort en présence de peroxyde d'hydrogène pour former une coloration brune a noire. Dans un mode de mise en oeuvre de la présente invention, du peroxyde d'hydrogène est ajouté de façon 30 exogène pendant l'utilisation du dispositif. En variante, la zone lyophilisée de formation de couleur peut contenir de l'oxydase de glucose fixé et la première zone peut contenir du glucose. Lors de l'utilisation du dispositif, le glucose de la première zone diffuse dans la seconde zone 35 et produit du peroxyde d'hydrogène par réaction avec la glucosoxydase.
L'enzyme liée à 1'anticorps peut produire une couleur dans la seconde zone par un moyen indirect, par ft 9 exemple la création d'une perméabilité dans ladite zone.
Un exemple de ce processus qui s'est avéré approprié pour la présente invention consiste dans l'utilisation de ccllogenase fortement purifié comme enzyme liée à l'anti-5 corps. Cette enzyme produit une dégradation du ccllcgène sous la forme de petits peptides. Peur détecter le marqueur collogénase, deux réactifs qui se combinent peur former une couleur sont séparés par une barrière fermée par une matrice de ccllogène. La présence de l'anticorps marqué par 10 ccllogénase est détectée du fait que la collogénase produite une dégradation de lâbarrière de collogène et permet au réactif séparé de se mélanger à nouveau et de former une couleur. Une collogénase appropriée est celle obtenue à partir de clostridium histolyticium purifié par des moyens 15 bien connus dans ce domaine. Une matrice de ccllogène appropriée est celle formée par du collogène bovin de type I sous une forme bélicale triple ( naissante ) ou dénaturée ( gélatine ).
On a donné dans la suite des exemples spécifi-20 ques de mise en pratique de la présente invention.
EXEMPLE 1 ESSAI : Mode de réalisation à trois couches conforme à l'invention pour une détection de grossesse 25 Matières utilisées : a) antigène : gonadotrophine chorionique humaine (hCG) b) anticorps : antisérum de lapin pour hCG humaine c) enzyme liée à anticorps : peroxydase de raifort d) substrat d'enzyme de formation de couleur : diaminc 30 benzidine e) matière matricielle formant des couches poreuses : nitrocellulcse.
Processus :
Etape 1 : Préparation d'une couche contenant un réactif de 35 formation de couleur : des feuilles matricielles de nitro-cellulose de 0,2 mm d'épaisseur ont été découpées en bandes de 2 cm de largeur et de 10 cm de longueur. Les feuilles ont été imprégnées pendant trente minutes d'une solution i 10 contenant 0,1 mg/ml de diamincbenzidène dans de l'eau distillée. Les feuilles ont été ensuite congelées en les recouvrant de plaquettes de glace sèche. Les feuilles congelées ont été lyophilisées dans un appareil de lyophi-5 lisation classique.
Etape 2 : Préparation d'une couche contenant un antigène : on a dissous l'antigène dans une solution saline tamponnée par phosphate avec une concentration de 5,0 I.U./ml et on a établi une série de degrés de dilutions : 1 : 1, 1:2, 1:4, 10 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 et 1:100.
Huit groupes de feuilles de nitrccellulose ont été chacun imprégnés avec une dilution différente de la solution d'antigène pendant trente minutes à 4eC. Toutes les feuilles ont été ensuite imprégnées dans une solution 15 contenant 1 % d'albumine tirée de sérum bovin dans une solution saline tamponnée par phosphate pendant deux heures à 4°C de manière à produire une saturation de tous les sites de fixation de protéine libres sur la nitrocellulose.
(Tobin et al Proc. Natl. Acad, of Sei. 76 4350-4354, 1979).
20 Etape 3 : Les feuilles ont été ensuite lyophilisées comme décrit ci-dessus pour la préparation de la couche contenant un anticorps avec enzyme liée : l'enzyme constituée par la peroxydase a été associée à l'anticorps par le procédé périodate classique de Wilson et Nakane (1978 dans le document de 25 W. Knapp et al (ed) Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevier Co., Amsterdam, p. 215-225). Après épuration i de la combinaison par des procédés standard, elle a été préparée au en PBS à une concentration de 1 mg/ml. On a déterminé la concentration de l'anticorps avec enzyme liée 30 à imprégner dans la couche en diluant la solution d'anticorps avec enzyme liée jusqu'à ce qu'une gouttelette de 20 microlitres déposée sur la surface de la feuille de nitrocellulose contenant un antigène irnr.unobilisé, avec un degré de dilution de 1 : 32 mette en évidence une fixation 35 complète de tout l'anticorps sur l'antigène immunobilisé ( établissement d'une courbe de dilution standard ). L'an-ticcrps liée à enzyme avec cette concentration a été imprégné dans des bandes d'un papier de cellulose et a été 11 lyophilisé comme décrit dans l'étape 1 ci-dessus.
Etape 4 : Préparation d'une structure sandwich à trois couches : des éléments carrés de 1 cm de côté de chaque couche lyophilisée ont été découpés dans les bandes. On a 5 utilisé comme support solide une bande de pclycarbonate transparent de 10 cm x 1 cm x 0,1 mm d'épaisseur. Huit carrés de nitrocellulose contenant le substrat de formation de couleur ont été collés sur le support en matière plastique à l'aide d'une colle à base de latex. On a collé sur les 10 surfaces supérieures de ces carrés les feuilles contenant l'antigène en utilisant un ciment de latex sur le périmètre. Les huit concentrations différentes d'antigène ont été utilisées. Finalement, on a collé sur les surfaces supérieures des couches d’antigène les couches d'anticorps 15 lié à enzyme.
Etape 5 : Pour effectuer l'essai, on a déposé cinquante microlitres de la solution de test sur la surface de la couche supérieure. La solution de test était constituée d'un antigène standard dans une solution saline tamponnée 20 par phosphate d'un pH de 7,4 et contenant 0,1 % de peroxyde d'hydrogène. La sensibilité de l'élément d’essai a été de 0,3 IU de hCG, qui a présenté une réaction de coloration pour un degré de dilution de 1 : 32 de l'antigène immobilisé.
Résultats 25 La bande d'essai ELISA fabriquée comme décrit ci-dessus a été comparée, en ce qui concerne la senbibilité, à une réaction d'hémagglutination standard.
L'échantillon d'essai a été constitué par de l'urine humaine provenant de six patientes ayant été précé- 30 demment déterminées comme étant enceintes.
DILUTION DE hCG ESTIME BANDE HEMAGGLUTINATION
L'ECHANTILLON DETECTE ELISA CLASSIQUE
D'URINE_ _ _ _ 1 : 1 2,5 IU (+) (+) 35 1:2 1,2 IU (+) (+) 1 : 4 0,6 IU (+) (-) 1 : 8 0,3 IU (+) (-) 1 : 16 0,01 IU (-) {-) 12
La sensibilité de la bande ELISA est plus grande que celle de la réaction d'hémagglutination classique .
EXEMPLE 2 5 TEST : (a) Déterminer le temps de formation de couleur peur différentes concentrations d'un anticorps avec enzyme liée qui a été imprégné dans la première couche de la structure à trois couches.
(b) Déterminer la possibilité de détection de 10 l'antigène humain d'hépatite B (HBA).
Processus :
La bande d'essai a été réalisée en utilisant des méthodes identiques à celles décrites dans l'exemple 1.
On a fait intervenir une première couche contenant une 15 matrice de cellulose lyophilisée qui a été imprégnée avec les dilutions suivantes de anti-HBA conjugué avec peroxy-dase : 1/2, 1/5, 1/50, 1/225, 1/625, 1/3125. Dans le test a), la seconde couche ne contenait pas d'antigène. Dans le test b), la seconde couche contenait HBA fixé à une concen-20 tration de 500 nanogrammes par centimètre carré. La troisième couche contenait un substrat DAB préparé comme dans l'Exemple 1 pour la détection de hCG.
RESULTATS Expérience a) L'échantillon d'essai a été constitué de 25 sérum humain normal dilué à 1/10 dans une solution saline tamponnée par phosphate et contenant 0,1 % de peroxyde d hydrogène.
REACTION DE COULEUR
Dilution Temps : 10 secondes 30 secondes 1 minute 30 1/2 brun foncé -noir idem idem 1/5 brun foncé- noir idem idem 1/50 brun noir idem idem 1/225 brun brun foncé idem 1/625 brun clair brun brun foncé 35 1/3125 pas de couleur brun très brun clair clair 13
Conclusion : La concentration optimale de l'anticorps avec enzyme liée est de 1:625 quand la seconde couche contient 500 nanogrammes de HBA par centimètre carré. La possibilité de détection de HBA est mise en évidence par la présence de 5 l'antigène libre en compétition avec l'antigène de référence fixé pour une concentration de 1/625.
Expérience (b).1 Détermination d'une concentration maximale optimale d'un anticorps avec enzyme liée de la première 10 couche, qui est complètement fixé sur l'antigène de référence de la seconde couche quand l'échantillon à tester est dépourvu d'antigène.
Dilution de Anti-HBA Réaction de couleur au bout conjugué avec enzyme d'une minute 15 dans la première couche __ 1/5 brun 1/5^ brun clair 1/225 brun très clair 1/625 pas de coloration 20 (fixation complète par antigène de référence ) 1/3125 pas de coloration
Expérience (b).2
Une dilution de 1/625 ( extraite du tableau 25 (b)l ci-dessus ) a été choisie pour une détection de HBA en correspondance avec une concentration de 100 nancgrammes/ml. Echantillon d'essai Réaction de coloration 30 secondes 1 minute HBA présent brun léger brun 30 HBA absent pas de coloration pas de colo ration
La technique selon l'invention est également applicable aussi bien à la détection d'anticorps qu'à une détection d'antigènes. Les rôles de l'antigène et de l'anti-35 corps sont simplement inversés. Pour la détection d'anticorps, l'antigène est marqué avec une enzyme et l'anticorps de référence est immobilisé dans la première zone. L'antigène marqué par enzyme est fixé sur l'anticorps immobilisé dans 14 la première zone en l'absence d'anticorps de compétition dans l'échantillon contrôlé et il ne peut diffuser dans la seconde zone pour former une couleur. S'il existe des anticorps dans l'échantillon à contrôler, ils entrent en 5 compétition avec les anticorps de référence immobilisés.
Dans ce cas, une réaction de coloration positive indique la présence des anticorps dans l'échantillon contrôlé.
Lorsque la présente invention est adaptée à la détection d'anticorps, on utilise un dispositif qui comprend 10 une première zone contenant des antigènes avec enzyme liée et des anticorps qui sont capables de réagir immonclogique-ment avec lesdits antigènes, ces antigènes étant placés dans la première zone de manière qu'ils soient enlevés de ladite première zone lors d'une réaction avec des anticorps 15 passant dans ou au travers de la première zone mais lesdits antigènes ne sont pas enlevés de la première zone en l'absence desdits anticorps? en outre le dispositif comprend une seconde zone contenant une matière capable de réagir, soit directement, soit indirectement, avec lesdits antigènes 20 avec enzyme liée pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits antigènes.
Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et 25 d'autres formes de réalisation, sans pour cela sortir du cadre de l'invention.
J

Claims (19)

15
1. Dispositif peur déterminer la présence d'anti gènes, caractérisé en ce qu'il comprend une première zone contenant des antigènes et des anticorps liés à enzyme qui 5 sont capables de réagir immunolcgiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant positionnés dans la première zone de façon qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des antigènes passant au travers de ladite première zone mais qu'ils ne 10 soient pas enlevés de ladite première zone en l'absence desdits antigènes ; et une seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits anticorps liés à enzyme pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits anticorps.
2. Dispositif selon la revendication 1, carac térisé en ce que lesdites première et seconde zones se trouvent dans une relation de juxtaposition.
3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone contient des anticorps 20 liés à enzyme et qui sont combinés avec des antigènes spécifiques.
4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone se compose d'au moins deux couches individuelles, une desdites couches contenant des 25 anticorps liés à enzyme et l'autre couche contenant un antigène spécifique immobilisé dans ladite couche.
5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone est formée de nitrocellulose.
6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé 30 en ce que ladite première zone est formée d'un gel de polymère poreux.
7. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première zone est formée de particules contenant un antigène immobilisé ou un anticorps emprisonné 35 dans une matrice fibreuse.
8. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite seconde zone est formée de nitrocellulose.
9. Procédé de détermination de la présence d'antigè- ·* ψ ' 16 nés dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il consiste à amener un fluide à tester peur la présence d'antigènes en contact avec un dispositif comportant une première zone contenant des antigènes ou des anticorps 5 liés à enzyme qui sent capables de réagir immunologiquement avec lesdits antigènes, lesdits anticorps étant disposés dans ladite première zone de manière qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des antigènes passant au travers de ladite première zone et qu'ils 10 ne scient pas enlevés de la première zone en l'absence desdits antigènes, ainsi qu'une seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits anticorps liés à enzyme pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits anticorps ; à laisser ledit 15 fluide pénétrer par perméation au travers du dispositif ; et à observer la présence eu l'absence d'une variation de couleur dans la seconde zone pour déterminer ainsi la présence ou l'absence de l'antigène testé dans ledit fluide.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites première et seconde zones sont en relation de juxtaposition.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première zone contient des|anticorps liés à 25 enzyme qui sont combinés avec des antigènes spécifiques.
12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première zone se compose d'au moins deux couches individuelles, une desdites couches contenant des anticorps liés à enzyme et l'autre couche contenant un 30 antigène spécifique immobilisé dans ladite couche.
13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite première zone est formée de nitrocellulose.
14. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite seconde zone est formée de nitrocellulose.
15. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'antigène intervenant dans ledit dispositif est de la gonadatrophine chorionique humaine.
16. Procédé selon la revendication 9, caractérisé > » 17 en ce que l'antigène intervenant dans ledit dispositif est de l'antigène d'hépatite.
17. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'antigène intervenant dans ledit dispositif est 5 une protéine de virus rubella.
18. Dispositif pour déterminer la présence d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend une première zone contenant des antigènes liés à enzyme et des anticorps qui sont capables de réagir immunclogiquement avec lesdits 10 antigènes, lesdits antigènes étant disposés dans ladite première zone de manière qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des anticorps passant au travers de ladite première zone mais qu'ils ne soient pas enlevés de cette première zone en l'absence desdits anticorps> 15 et une seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits antigènes.liés à enzyme pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits antigènes .
19. Procédé pour déterminer la présence d'anticorps 20 dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il consiste à amener un fluide à tester peur la présence d'antigènes en contact avec un dispositif comportant une première zone contenant des antigènes liés à enzyme et des anticorps qui sont capables de réagir immunologiquement avec lesdits 25 antigènes, lesdits antigènes étant disposés dans la première zone de manière qu'ils soient enlevés de cette première zone lors d'une réaction avec des anticorps passant au travers de la première zone mais qu'ils ne soient pas enlevés de cette première zone en l'absence desdits anticorps, et une 30 seconde zone contenant une matière capable de réagir avec lesdits antigènes liés à enzyme pour produire une réaction de formation de couleur qui indique la présence desdits antigènes ; à laisser le fluide pénétrer par perméation dans ledit dispositif ; et à observer la présence ou l'absence 35 d'une variation de couleur dans ladite seconde zone pour déterminer ainsi la présence ou l'absence des anticorps testés dans ledit fluide.
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