WO2012172232A1 - Dispositif et procédé pour immunoessais - Google Patents

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WO2012172232A1
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liquid sample
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Hélène BRIAND
Bruno Colin
Cécile PARIS
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bioMérieux
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    • G01N33/56988—HIV or HTLV

Definitions

  • the present invention provides a device and method for performing a so-called side flow assay to determine the presence or absence of an analyte in a sample.
  • the invention relates to new functional checks of the device.
  • Rapid test devices are used to determine the presence of a large number of analytes, such as antibodies, antigens, hormones, proteins, chemical molecules in liquid samples.
  • analytes such as antibodies, antigens, hormones, proteins, chemical molecules in liquid samples.
  • These devices generally comprise a support and a matrix that allows the migration of the liquid sample.
  • There are classically distinguished several zones at the level of the matrix which are an application zone of the liquid sample, a marking zone and a reaction zone, the latter comprising a capture zone and a control zone. These different zones are in fluid communication.
  • the analyte to be detected if it is present in the sample deposited at the area of application, binds to a first labeled binding partner at the level of the marking zone, the complex thus formed then migrates. to the reaction zone where it is immobilized at the capture zone by reaction with a second binding partner and the user can determine if the analyte is present by demonstrating a detectable signal which is determined by the type of marker associated with the first link partner.
  • the presence of the analyte in the sample is materialized as a detectable line, usually referred to as a test line.
  • the reaction zone also includes a sample migration control zone that will indicate to the user that at least a portion of the sample has passed through the matrix, upstream of the control zone, and particularly at the catchment area. It can be by example by the revelation of a control line of a predetermined color. By way of example, mention may be made of patent applications WO 2004/003559, WO 2006/092103, WO 2007/081330 and US 2004/0161859.
  • the limits of the control means currently used in rapid strip tests, integrated or not in a cassette, are that they require additional means in the control area. For example, it may be an anti-immunoglobulin immobilized at the control zone which will be able to capture and immobilize an antibody or first labeled binding partner.
  • the present invention now provides an extremely simple device that does not require additional means in that it uses the labeled particles bound to the first binding partner as a means of revealing and controlling the migration of the sample from the area of the applying the sample to the reaction zone to eliminate the risk of false negative results.
  • the device of the invention comprises:
  • a porous matrix 1 fixed on the support, which allows the migration of the liquid sample, said matrix comprising:
  • a labeling zone 3 comprising at least a first binding partner linked to labeled particles, said first binding partner being capable of binding to said at least one analyte, if it is present in the liquid sample, and
  • reaction zone 4 comprising:
  • a display area of the results of the assay comprising at least a second immobilized binding partner that is capable of binding to said at least one analyte, and a control zone 6 which makes it possible to control the proper functioning of the device downstream from the viewing zone of the results of the test 5,
  • the first binding partner and the second binding partner are selected from the group consisting of antibody, antibody mixture, antibody fragment, antibody fragment mixture, nanofitin, nanofitin mixture, antigen, antigen mixture, protein, protein mixture, polypeptide, polypeptide mixture, peptide, peptide mixture.
  • the first binding partner is bound to particles which are labeled with a detectable label, ie a compound, a substance which can be detected by visual, fluorescent, instrumental means and in particular the labeled particles comprise an elastomeric material preferably a latex, or colloidal gold. But the particle can also be a magnetic particle.
  • a detectable label ie a compound, a substance which can be detected by visual, fluorescent, instrumental means and in particular the labeled particles comprise an elastomeric material preferably a latex, or colloidal gold.
  • the particle can also be a magnetic particle.
  • a symbol for example in the form of a straight line which is substantially perpendicular to the main direction of the flow of the liquid sample.
  • the symbol may also form a path with several distinct tangents, in particular a curvilinear path or a broken line pattern, such as a zig-zag.
  • the control zone 6 comprises a groove formed in one of the faces of the porous matrix 1, ie in the visible face for the user or in the face in contact with the support, which allows the formation of the symbol.
  • the groove may result from the plastic deformation of the porous matrix by crushing the porous matrix. It is within the general knowledge of those skilled in the art to determine the useful crushing force which may depend on the nature of the porous membrane, the crushing means and the contact surface of the crushing means. compared to the membrane.
  • the crushing may be effected by means of a device which exerts a localized pressure and frontal, continuous or discontinuous, on the membrane or by means of a device which exerts a successive localized pressure, continuous or discontinuous, on the membrane during of his displacement.
  • crushing means examples include a blade, a cylinder or a rotary member such as a wheel or a wheel.
  • the device that exerts a localized pressure and frontal, continuous or discontinuous, on the membrane can be a cylinder and the pressure exerted by the crushing force can be between 5 and 50 newtons, preferably between 10 and 45 newtons for example between 10 and 15 newtons, between 20 and 25 newtons, between 30 and 35 newtons or between 40 and 45 newtons.
  • nitrocellulose membranes By way of illustration only, three types of nitrocellulose membranes can be mentioned: the Millipore TM membrane HF 135 (reference: HFB 135 UB, lot R9PN61117), the Sartorius TM membrane CN 140 (reference 1UN14ER05002, lot 0509195010900833) and the Sartorius TM membrane CN 150 (reference 1UN15LR05002, lot 07101L3011000933).
  • Table 1 below gives some examples of pressure that can be applied to different crushing forces on the aforementioned nitrocellulose membranes by a cylinder having a diameter of 1.2 mm.
  • the letter A corresponds to the Millipore HF 135 membrane
  • the letter B means the CN 140 sartorius membrane
  • the letter C refers to the Sartorius CN 150 membrane.
  • the groove results from a thermal deformation of the structure, for example by means of a laser.
  • the cross section of the groove may be in the form of a "U", a "V” or a rectangle.
  • the support is made of a liquid-impermeable material, preferably a synthetic synthetic material.
  • a cassette is arranged around the matrix and has at least two openings, a first opening arranged to allow access to the application zone of the sample 2 and at least a second opening arranged to allow the user to see the reaction zone 4.
  • the invention also relates to a method for manufacturing a device as described above which comprises the steps of:
  • the modification of the matrix can be performed by plastic deformation of the matrix by exerting a localized pressure, preferably by rolling at least one rotary member bearing on the external face of the matrix or by exerting a localized and frontal pressure, preferably by applying a pressure member pressing on the outer face of the matrix or bearing on the outer face of the support.
  • the rotary member has a rolling diameter of at least 1 mm, preferably a rolling diameter of between 1 and 150 mm and the pressing member has an outer diameter or width of preferably between 0.1 mm and 4 mm. mm, preferably between 0.5 mm and 1.5 mm and the pressure is exerted by a crushing force of between 5 and 50 newtons, preferably between 10 and 45 newtons, for example between 10 and 15 newtons, between 20 and 50 newtons, and 25 newtons, between 30 and 35 newtons or between 40 and 45 newtons.
  • the term "matrix” refers to any type of material that is capable of ensuring the flow and transfer of a fluid. The transfer of the fluid can be ensured by capillary force.
  • the matrix may be, for example in at least one material bibulous. Bibulous materials are materials that easily absorb a liquid and through which the liquid is transported by capillarity. By way of nonlimiting examples, nitrocellulose, polyester, glass fibers, etc., may be mentioned as a crumbly material.
  • Liquid sample means any sample taken from a patient or individual, and which may contain an analyte as defined below.
  • This sample may be in particular a liquid biological sample such as a sample of blood, serum, plasma, saliva, urine, cerebrospinal fluid, pleural fluid, peritoneal fluid.
  • the biological sample also includes semi-solid or solid samples to the extent that they can be transformed into a liquid sample by any appropriate method, for example a food sample, a stool sample, a tissue sample, cell cultures, a collection of mucous membranes. This biological sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art.
  • the sample may also be an environmental sample, ie a liquid, solid or semi-solid sample from the environment, such as effluents, sludge, soils, plants etc.
  • an environmental sample ie a liquid, solid or semi-solid sample from the environment, such as effluents, sludge, soils, plants etc.
  • the sample is solid or semi-solid, it must be pretreated to be transformed into a liquid sample.
  • Analyte means primarily an antigen, an antibody, a hormone, a protein or a chemical molecule.
  • the analyte is a protein or antigen it can be detected by binding partners, for example, receptors, antibodies, antibody fragments, nanofitines TM and any other ligand capable of binding to a protein or antigen.
  • binding partners for example, receptors, antibodies, antibody fragments, nanofitines TM and any other ligand capable of binding to a protein or antigen.
  • the binding partner antibodies are, for example, either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunizing an animal with the appropriate immunogen, followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by taking the serum of said animal, and separating said antibodies from the other constituents of the serum, in particular by chromatography. affinity on a column to which is attached an antigen specifically recognized by the antibodies.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique whose general principle is recalled below.
  • an animal is immunized with the appropriate immunogen, whose B cells are then able to produce antibodies against this antigen.
  • These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" myeloma cells (murine in the example) to give rise to hybridomas.
  • the cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely are then selected.
  • Each hybridoma is multiplied in the form of a clone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose protein recognition properties can be tested, for example by ELISA, by immunoblot (Western blot) in one or two-dimensional, in immunofluorescence, or with a biosensor.
  • the monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified, in particular according to the affinity chromatography technique described above.
  • the monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • Nanofitins are small proteins that, like antibodies, are able to bind to a biological target, allowing it to be detected, captured or simply targeted within an organism.
  • the specific binding partners of the protein or antigen sought in the method of the invention may be used as a capture reagent, as a detection reagent or as capture and detection reagents.
  • the analyte is an antibody it can be detected by binding partners, for example proteins, peptides, anti-immunogmobulins and any other ligand capable of binding to the antibody.
  • binding partners for example proteins, peptides, anti-immunogmobulins and any other ligand capable of binding to the antibody.
  • the specific binding partners of the antibody sought in the method of the invention may be used as a capture reagent, as a detection reagent or as capture and detection reagents.
  • the visualization of the immunological reactions ie of the protein / binding partner, antigen / binding partner, antibody / binding partner binding can be performed by any means of detection via a marking, the link partner.
  • the binding partner can be bound to labeled particles capable of generating a detectable signal, ie comprising a compound, a substance that can be detected by visual, fluorescent, instrumental means.
  • marker reagents consists of: metal or alloy particles, such as colloidal gold particles,
  • the polymer particles such as the colored latex particles
  • the signal generated at the viewing area of the results and the signal generated at the positive control area will preferably be of the same nature and will have the same colors.
  • Figure 1A is a top view of an embodiment of the device of the invention, before application of the sample.
  • the device of the invention comprises a support (not shown), a matrix 1 comprising an application zone of the sample 2, a marking zone 3, a reaction zone 4 comprising a viewing zone of the test results. Comprising means for viewing the test results and a sample migration control area 6.
  • the matrix 1 may also include an absorption zone of the sample 7.
  • FIG. 1B illustrates the results obtained with the device of FIG. 1A after application of a negative sample for an analyte to be determined.
  • a negative sample for an analyte to be determined.
  • FIG. 1C illustrates the results obtained with the device of FIG. 1A after application of a positive sample for an analyte to be determined.
  • there are materializations of two signals one at the level of the viewing area of the results 5 and the other at the level of the control zone 6, each in the form of a rectilinear line perpendicular to the main direction of the sample flow.
  • FIG. 2A is a side view of two embodiments of the device shown in Figure 1A.
  • FIG. 2A represents an embodiment of the matrix 1 which consists of at least 3 membranes of identical or different material, in fluid communication with respect to each other.
  • the 3 membranes are of different materials, for example a glass fiber membrane which constitutes the zone of application of the liquid sample 2, a polyester membrane which constitutes the marking zone 3 and a nitrocellulose membrane. which constitutes the reaction zone 4.
  • the matrix may comprise a 4 th membrane into an absorbent material that is an area of absorptivity of the sample, as shown by 7 in this figure.
  • FIG. 2B represents another embodiment of matrix 1 which consists of a single membrane made of a bibulous material at which the zone of application of the sample 2, the marking zone 3, the reaction zone are defined. 4, plus possibly the area of absorptivity 7.
  • FIG. 3A shows a pressing member 8 for applying a crushing force F to the die 1.
  • the force F is applied uniformly and perpendicular to the surface of the die 1.
  • the pressing member 8 comes into contact with the matrix 1 at a determined force F involving the deformation of the matrix.
  • the pressing member 8 has a contact surface with the die 1 having a width L and a length at least equal to the width of the die 1.
  • the pressure is a localized and frontal pressure.
  • FIG. 3B shows a pressing member 9 for applying a crushing force F to the die 1.
  • the force F is applied uniformly and perpendicularly to the surface of the die 1.
  • the pressing member 9 comes into contact with the matrix 1 at a determined force F involving the deformation of the matrix.
  • the pressing member 9 has a radius R and a length at least equal to the width of the die 1.
  • the pressure is a localized and frontal pressure.
  • FIG. 3C shows a rotary member 10 for applying a crushing force F to the matrix 1.
  • the force F is applied in a progressive manner, perpendicular to the surface of the matrix 1, by moving the rotary member 10 on the matrix.
  • the pressure is a localized and successive pressure.
  • the porous matrix 1 is represented in the form of a rectangular strip whose longitudinal axis is in a horizontal position.
  • Zones 2, 3 and 4 are in fluid communication.
  • Zone 3 comprises the first binding partner bound to labeled particles, for example an antibody bound to particles carrying or incorporating a visible or visualizable marker, such as colored latex particles, colloidal gold particles, etc.
  • This reagent can freely migrate through the matrix in the presence of the liquid sample deposited at zone 2 and react with the analyte (antigen) to determine if it is present.
  • the second binding partner for example an antibody having a specificity for an epitope of the antigen which is different from that recognized by the first labeled antibody, is immobilized.
  • FIGS. 1B and 1C illustrate the operation of the test in the presence of a negative control and positive samples.
  • the sample being a negative control
  • the sample being positive there is emission of a detectable signal at the viewing area results 5 which is materialized by a line perpendicular to the flow direction of the liquid sample.
  • a detectable symbol at the level of the migration control zone 6, materialized, for example, by a line perpendicular to the flow direction of the liquid sample, which means on the one hand that the positive sample has migrated well to zone 6 and that on the other hand the device is functional.
  • Example 1 Assay of anti-HIV-1 group M, anti-HIV-1 group O and anti-HIV-2 antibodies
  • the assay of the anti-HIV-1 and anti-HIV-2 antibodies by the assay illustrated in FIG. 1 consists of a one-step sandwich-type immunological reaction based on an immunochromatographic technique.
  • Blue latex particles sold by the company Varian (trade name) are coated with a mixture of three peptides specific for the HIV-1 group M, HIV-1 group 0 and HIV-2, respectively. These particles are then distributed over a polyester membrane (Ahlstrom-trade name). The membrane is dried overnight at 37 ° C.
  • Capture peptides identical to the peptides described above are distributed by a BIODOT (trade name) apparatus on 3 different nitrocellulose membranes: an unsupported Millipore membrane, HF 135 (reference HFB 135UB, batch number R9PN61117, membrane A), a supported Sartorius CN 140 membrane (reference 1UN14ER050020, Batch No. 0509195010900833, membrane B) and a laminated Sartorius CN 150 membrane (reference 1UN15LR050025, Lot No. 07101L3011000933, membrane C), at the viewing area 5.
  • the distribution is carried out by the same BIODOT device.
  • the positive control of the test is constituted by a crushing of the nitrocellulose membrane at the level of the control zone 6. After distribution of the capture peptides, each nitrocellulose membrane is dried overnight at 37 ° C.
  • the two membranes of polyester and nitrocellulose are assembled on a fast test support (backing, from the company G & L (trade name)) in combination with a sample pad (fiberglass membrane that serves as a filter for the sample with contact with the particles) and an absorbent pad (an absorbent that has the ability to adsorb the rest the sample after migration along different types of membranes).
  • a sample pad fiberglass membrane that serves as a filter for the sample with contact with the particles
  • an absorbent pad an absorbent that has the ability to adsorb the rest the sample after migration along different types of membranes.
  • the tested samples are well-characterized positive HIV samples.
  • the negative sample tested corresponds to a pool of negative serum from the French Blood Establishment (EFS) in the Rhône - UNE region.
  • EFS French Blood Establishment
  • the reading is performed visually with the aid of a reading card which makes it possible to attribute signal intensities according to the intensity of the blue color observed.
  • This map is graduated from Ll to LIO. A sample is considered positive if a blue color appears with an intensity corresponding to at least L4 of the reading scale.
  • control lines were prepared by crushing each membrane with different crushing forces at the control zone 6, as shown in Table 2 below, using a 1.2 mm cylinder. .
  • Example 2 Preparation of the control line by crushing on the support.
  • the device was prepared according to the protocol described in Example 1. The only difference is that the control lines were prepared by crushing the support to a crushing force of 40 newtons at the control zone 6 , using a 0.6 mm cylinder. The crushing was carried out after assembling the membranes and the support in the outer face of the support causing a deformation of the membrane in its face in contact with the support.
  • a negative sample corresponds to a pool of negative serum from the French Blood Establishment (EFS) of the Rhône-Roche region was passed on each membrane to validate this embodiment of the invention.
  • EFS French Blood Establishment

Abstract

La présente invention concerne un dispositif pour réaliser un immunoessai le dispositif comprenant : a) un support, b) une matrice poreuse 1, fixée sur le support, la matrice comprenant : (i) une zone d'application d'un échantillon liquide 2, (ii) une zone de marquage 3 et (iii) au moins une zone réactionnelle (4) qui comprend : une zone de visualisation des résultats de l'essai 5 et une zone de contrôle 6, lesdites zones d'application de l'échantillon liquide 2, de marquage 3 et réactionnelle 4 étant en communication de fluide; le dispositif comprenant au niveau de la zone de contrôle 6, au moins une partie de la matrice poreuse 1 présente des pores dont les dimensions sont inférieures à celles des particules marquées, de sorte qu'au moins une partie des particules marquées de la zone de marquage 3 est stoppée au niveau de ladite zone de contrôle 6 formant un symbole qui est visible ou visualisable pour un utilisateur; ainsi qu'un procédé pour fabriquer le dispositif.

Description

Dispositif et procédé pour immunoessais
La présente invention a pour objet un dispositif et un procédé pour réaliser un essai dénommé dosage à flux latéral pour déterminer la présence ou l'absence d'un analyte dans un échantillon. En particulier, l'invention se rapporte à de nouveaux contrôles de bon fonctionnement du dispositif.
Les dosages à flux latéral, encore appelés tests rapides, sont utilisés couramment dans les domaines d'analyses cliniques, alimentaires, pharmaceutiques et chimiques. Ainsi, les dispositifs de tests rapides sont utilisés pour déterminer la présence d'un grand nombre d'analytes, tels que des anticorps, des antigènes, des hormones, des protéines, des molécules chimiques dans des échantillons liquides. Ces dispositifs généralement comprennent un support et une matrice qui permet la migration de l'échantillon liquide. On distingue classiquement plusieurs zones au niveau de la matrice qui sont une zone d'application de l'échantillon liquide, une zone de marquage et une zone réactionnelle , cette dernière comprenant une zone de capture et une zone de contrôle. Ces différentes zones sont en communication de fluide. Ainsi, l'analyte à détecter, s'il est présent dans l'échantillon déposé au niveau de la zone d'application, se lie à un premier partenaire de liaison marqué au niveau de la zone de marquage, le complexe ainsi formé migre ensuite jusqu'à la zone réactionnelle où il est immobilisé au niveau de la zone de capture par réaction avec un second partenaire de liaison et l'utilisateur peut déterminer si l'analyte est bien présent par mise en évidence d'un signal détectable qui est déterminé par le type de marqueur associé au premier partenaire de liaison. Généralement, la présence de l'analyte dans l'échantillon est matérialisée sous la forme d'une ligne détectable, habituellement dénommée ligne test. La zone réactionnelle comprend également une zone de contrôle de migration de l'échantillon qui va indiquer à l'utilisateur qu'au moins une partie de l'échantillon est bien passée au travers de la matrice, en amont de la zone de contrôle et en particulier au niveau de la zone de capture. Ce peut être par exemple par la révélation d'une ligne de contrôle d'une couleur prédéterminée. On peut citer à titre d'exemple les demandes de brevet WO 2004/003559, WO 2006/092103, WO 2007/081330, US 2004/0161859. Les limites des moyens de contrôle actuellement utilisés dans les tests rapides sur bandelette, intégrée ou non dans une cassette, sont qu'ils nécessitent des moyens additionnels au niveau de la zone de contrôle. Ce peut être par exemple une anti-immunoglobuline immobilisée au niveau de la zone de contrôle qui sera capable de capter et d'immobiliser un anticorps ou premier partenaire de liaison marqué. Ce peut être également au niveau de la zone de contrôle l'addition d'une molécule colorée qui sera susceptible d'être dissoute et déplacée avec l'échantillon révélant à l'utilisateur une couleur différente de celle de la molécule colorée après migration de l'échantillon. La présente invention maintenant fournit un dispositif extrêmement simple qui ne nécessite pas de moyens additionnels en ce qu'il utilise les particules marquées liées au premier partenaire de liaison comme moyen de révélation et de contrôle de la migration de l'échantillon de la zone d'application de l'échantillon jusqu'à la zone réactionnelle pour éliminer le risque de rendre des résultats faussement négatifs.
Le dispositif de l'invention comprend :
a) un support (non représenté) ,
b) une matrice poreuse 1, fixée sur le support, qui permet la migration de l'échantillon liquide, ladite matrice comprenant :
(i) une zone d'application de l'échantillon liquide 2,
(ii) une zone de marquage 3 comprenant au moins un premier partenaire de liaison lié à des particules marquées, ledit premier partenaire de liaison étant susceptible de se lier audit au moins un analyte, s'il est présent dans l'échantillon liquide, et
(iii) au moins une zone réactionnelle 4 comprenant :
une zone de visualisation des résultats de l'essai 5 comprenant au moins un second partenaire de liaison immobilisé qui est susceptible de se lier audit au moins un analyte, et une zone de contrôle 6 qui permet de contrôler le bon fonctionnement du dispositif en aval de la zone de visualisation des résultats de l'essai 5,
lesdites zones d'application de l'échantillon liquide 2, de marquage 3 et réactionnelle 4 étant en communication de fluide ; le dispositif étant caractérisé en ce que :
au niveau de la zone de contrôle 6, au moins une partie de la matrice poreuse (1) présente des pores dont les dimensions sont inférieures à celles des particules marquées, de sorte qu'au moins une partie des particules marquées de la zone de marquage (3) est stoppée au niveau de ladite zone de contrôle (6) formant un symbole qui est visible ou visualisable pour un utilisateur.
Le premier partenaire de liaison et le second partenaire de liaison sont choisis dans le groupe consistant en anticorps, mélange d'anticorps, fragment d'anticorps, mélange de fragments d'anticorps, nanofitine, mélange de nanofitines, antigène, mélange d'antigènes, protéine, mélange de protéines, polypeptide, mélange de polypeptides , peptide, mélange de peptides.
Le premier partenaire de liaison est lié à des particules qui sont marquées par un marqueur détectable, c'est à dire un composé, une substance qui peut être détectée par des moyens visuels, fluorescents, instrumentaux et en particulier les particules marquées comprennent un matériau élastomère, de préférence un latex, ou de l'or colloïdal. Mais la particule peut être également une particule magnétique.
Le bon fonctionnement du dispositif et de migration de l'échantillon peut être visualisé par la formation d'un symbole par exemple sous le forme d'une ligne rectiligne qui est sensiblement perpendiculaire à la direction principale du flux de l'échantillon liquide. Mais le symbole peut également former un tracé admettant plusieurs tangentes distinctes, en particulier un tracé curviligne ou un tracé en ligne brisée, tel qu'un zig-zag.
La zone de contrôle 6 comprend une rainure ménagée dans l'une des faces de la matrice poreuse 1, c'est à dire dans la face visible pour l'utilisateur ou dans la face en contact avec le support, qui permet la formation du symbole. La rainure peut résulter de la déformation plastique de la matrice poreuse par écrasement de cette dernière. Il est à la portée des connaissances générales de l'homme du métier de déterminer la force d'écrasement utile qui pourra dépendre de la nature de la membrane poreuse, des moyens d'écrasement et de la surface de contact des moyens d'écrasement par rapport à la membrane. L'écrasement peut être effectué au moyen d'un dispositif qui exerce une pression localisée et frontale, continue ou discontinue, sur la membrane ou au moyen d'un dispositif qui exerce une pression localisée successive, continue ou discontinue, sur le membrane au cours de son déplacement. On peut citer par exemple comme moyens d'écrasement une lame, un cylindre ou un organe rotatif tel qu'une roue ou une roulette. Par exemple, le dispositif qui exerce une pression localisée et frontale, continue ou discontinue, sur la membrane peut être un cylindre et la pression exercée par la force d'écrasement peut être comprise entre 5 et 50 newtons, de préférence entre 10 et 45 newtons, par exemple entre 10 et 15 newtons, entre 20 et 25 newtons, entre 30 et 35 newtons ou entre 40 et 45 newtons.
A titre purement illustratif on peut citer 3 types de membranes de nitrocellulose : la membrane Millipore™ HF 135 (référence : HFB 135 UB, lot R9PN61117), la membrane Sartorius™ CN 140 (référence 1UN14ER05002, lot 0509195010900833) et la membrane Sartorius™ CN 150 (référence 1UN15LR05002 , lot 07101L3011000933) .
Le tableau 1 ci-dessous donne quelques exemples de pression qui peuvent être appliqués à différentes forces d'écrasement sur les membranes de nitrocellulose sus-mentionnées par un cylindre présentant un diamètre de 1,2 mm.
Dans le tableau 1, la lettre A correspond à la membrane Millipore HF 135, la lettre B signifie la membrane sartorius CN 140 et la lettre C fait référence à la membrane Sartorius CN 150. Tableau 1
Figure imgf000006_0001
Dans un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention, la rainure résulte d'une déformation thermique de la structure, par exemple au moyen d'un laser.
La section transversale de la rainure peut présenter la forme d'un « U », d'un « V » ou d'un rectangle. Le support est en une matière imperméable au liquide, de préférence en un matériau synthétique de synthèse.
Dans un mode de réalisation du dispositif de l'invention, une cassette est disposée autour de la matrice et présente au moins deux ouvertures, une première ouverture agencée pour permettre l'accès à la zone d'application de l'échantillon 2 et au moins une deuxième ouverture agencée pour permettre à l'utilisateur de voir la zone réactionnelle 4. L'invention a aussi pour objet un procédé pour fabriquer un dispositif tel que décrit ci-dessus qui comprend les étapes de :
réaliser un dispositif conforme à l'état de l'art ;
opérer une modification de la matrice de sorte que le diamètre d'une partie de la matrice poreuse 1 au niveau de la zone de contrôle 6 est inférieur au diamètre des particules marquées.
La modification de la matrice peut être opérée par déformation plastique de la matrice en exerçant une pression localisée, de préférence en roulant au moins un organe rotatif en appui sur la face externe de la matrice ou en exerçant une pression localisée et frontale, de préférence en appliquant un organe presseur en appui sur la face externe de la matrice ou en appui sur la face externe du support .
L'organe rotatif a un diamètre de roulement d'au moins 1 mm, de préférence un diamètre de roulement compris entre 1 et 150 mm et l'organe presseur a un diamètre ou une largeur externe de préférence compris entre 0,1 mm et 4 mm, de préférence entre 0,5 mm et 1,5 mm et la pression est exercée par une force d'écrasement comprise entre 5 et 50 newtons, de préférence entre 10 et 45 newtons, par exemple entre 10 et 15 newtons, entre 20 et 25 newtons, entre 30 et 35 newtons ou entre 40 et 45 newtons.
DEFINITIONS
Le terme « matrice » fait référence à tout type de matériau qui est capable d'assurer le flux et le transfert d'un fluide. Le transfert du fluide peut être assuré par force de capillarité. La matrice peut être, par exemple en au moins un matériau bibuleux. Les matériaux bibuleux sont des matériaux qui facilement absorbent un liquide et au travers desquels le liquide est transporté par capillarité. A titre d'exemples non limitatifs on peut citer, comme matériau bibuleux, la nitrocellulose, le polyester, les fibres de verre, etc..
« Echantillon liquide » signifie tout échantillon prélevé chez un patient ou individu, et susceptible de contenir un analyte tel que défini ci-dessous. Cet échantillon peut être notamment un échantillon biologique liquide tel qu'un échantillon de sang, de sérum, de plasma, de salive, d'urine, de liquide céphalo-rachidien, de liquide pleural, de liquide péritonéal . Mais l'échantillon biologique comprend également les échantillons semi-solides ou solides dans la mesure où ils peuvent être transformés en échantillon liquide par toute méthode appropriée, par exemple un prélèvement alimentaire, un prélèvement de selles, un prélèvement de tissus, de cultures cellulaires, un prélèvement de muqueuses. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. L'échantillon peut également être un échantillon d'origine environnementale, c'est à dire un échantillon liquide, solide ou semi-solide issu de l'environnement, tel que les effluents, les boues, les sols, les végétaux etc.. Bien entendu, quand l'échantillon est solide ou semi- solide, il doit être prétraité pour être transformé en échantillon liquide .
« Analyte » signifie principalement, un antigène, un anticorps, une hormone, une protéine ou une molécule chimique.
Lorsque l' analyte est une protéine ou un antigène il peut être détecté par des partenaires de liaison, par exemple les récepteurs, anticorps, fragments d'anticorps, nanofitines™ et tout autre ligand capable de se lier à une protéine ou à un antigène.
Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec l'immunogène approprié, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps .
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-dessous.
Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, avec l'immunogène approprié, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre cet antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la protéine pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert (Western blot) en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui comme les anticorps sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.
Les partenaires de liaison spécifiques de la protéine ou de l'antigène recherché dans le procédé de l'invention peuvent être utilisés comme réactif de capture, comme réactif de détection ou comme réactifs de capture et de détection.
Lorsque l'analyte est un anticorps il peut être détecté par des partenaires de liaison, par exemple les protéines, les peptides, les anti-immunogmobulines et tout autre ligand capable de se lier à l'anticorps.
Les partenaires de liaison spécifiques de l'anticorps recherché dans le procédé de l'invention peuvent être utilisés comme réactif de capture, comme réactif de détection ou comme réactifs de capture et de détection .
La visualisation des réactions immunologiques , c'est-à-dire de la liaison protéine/partenaire de liaison, antigène/partenaire de liaison, anticorps/partenaire de liaison peut être effectuée par tout moyen de détection par l'intermédiaire d'un marquage, du partenaire de liaison .
Ainsi, la partenaire de liaison peut être lié à des particules marquées, capables de générer un signal détectable, c'est à dire comprenant un composé, une substance qui peut être détecté par des moyens visuels, fluorescents, instrumentaux.
Une liste non limitative de ces réactifs marqueurs consiste en : - les particules métalliques ou d'alliages, telles que les particules d'or colloïdal,
les particules de polymère, telles que les particules de latex colorés,
les particules magnétiques,
- les molécules fluorescentes,
les molécules chimioluminescentes . Dans les modes de réalisation de l'invention, le signal généré au niveau de la zone de visualisation des résultats et le signal généré au niveau de la zone contrôle positif seront, de préférence, de la même nature et présenteront les mêmes couleurs.
A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci- dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » et de « compétition ».
FIGURES
Figure 1 :
La figure 1A est une vue de dessus d'un mode de réalisation du dispositif de l'invention, avant application de l'échantillon. Le dispositif de l'invention comprend un support (non représenté), une matrice 1 comprenant une zone d'application de l'échantillon 2, une zone de marquage 3, une zone réactionnelle 4 comprenant une zone de visualisation des résultats de l'essai 5 comprenant des moyens pour visualiser les résultats de l'essai et une zone de contrôle de la migration de l'échantillon 6. Facultativement, la matrice 1 peut également comprendre une zone d'absorption de l'échantillon 7.
La figure 1B illustre les résultats obtenus avec le dispositif de la figure 1A après application d'un échantillon négatif pour un analyte à déterminer. Comme représenté à la figure 1B, il y a matérialisation d'un signal au niveau de la zone de contrôle 6, sous la forme d'une ligne rectiligne perpendiculaire à la direction principale du flux de l'échantillon.
La figure 1C illustre les résultats obtenus avec le dispositif de la figure 1A après application d'un échantillon positif pour un analyte à déterminer. Comme représenté à la figue 1C, il y a matérialisation de deux signaux, l'un au niveau de la zone de visualisation des résultats 5 et l'autre au niveau de la zone de contrôle 6, chacun sous la forme ligne rectiligne perpendiculaire à la direction principale du flux de l'échantillon.
Figure 2 :
La figure 2 est une vue de profil de deux modes de réalisation du dispositif représenté à la figure 1A. La figure 2A représente un mode de réalisation de la matrice 1 qui est constituée d'au moins 3 membranes de matériaux bibuleux, identiques ou différents, en communication de fluide l'une par rapport à l'autre. De préférence, les 3 membranes sont en des matériaux différents, par exemple une membrane de fibre de verre qui constitue la zone d'application de l'échantillon liquide 2, une membrane de polyester qui constitue la zone de marquage 3 et une membrane de nitrocellulose qui constitue la zone réactionnelle 4. De plus la matrice peut comprendre une 4eme membrane en un matériau absorbant qui constitue une zone d' absorptivité de l'échantillon, telle que représentée en 7 dans cette figure.
La figure 2B représente un autre mode de réalisation de matrice 1 qui est constituée d'une seule membrane en un matériau bibuleux au niveau de laquelle sont définies la zone d'application de l'échantillon 2, la zone de marquage 3, la zone réactionnelle 4, plus éventuellement la zone d' absorptivité 7.
Figure 3 :
La figure 3A représente un organe presseur 8 pour appliquer une force d'écrasement F sur la matrice 1. La force F est appliquée uniformément et perpendiculairement à la surface de la matrice 1. Dans ce mode de réalisation, non limitatif, l'organe presseur 8 entre en contact avec la matrice 1 à une force déterminée F impliquant la déformation de la matrice. L'organe presseur 8 présente une surface de contact avec la matrice 1 ayant une largeur L et une longueur au moins égale à la largeur de la matrice 1. La pression est une pression localisée et frontale .
La figure 3B représente un organe presseur 9 pour appliquer une force d'écrasement F sur la matrice 1. La force F est appliquée uniformément et perpendiculairement à la surface de la matrice 1. Dans ce mode de réalisation, non limitatif, l'organe presseur 9 entre en contact avec la matrice 1 à une force déterminée F impliquant la déformation de la matrice. L'organe presseur 9 présente un rayon R et une longueur au moins égale à la largeur de la matrice 1. La pression est une pression localisée et frontale.
La figure 3C représente un organe rotatif 10 pour appliquer une force d'écrasement F sur la matrice 1. La force F est appliquée de manière progressive, perpendiculairement à la surface de la matrice 1, par déplacement de l'organe rotatif 10 sur la matrice. La pression est une pression localisée et successive.
MODES DE REALISATION
Dans un mode de réalisation, en référence à la figure 1, la matrice poreuse 1 est représentée sous la forme d'une bande rectangulaire dont l'axe longitudinal est en position horizontale. Les zones 2, 3 et 4 sont en communication de fluide. La zone 3 comprend le premier partenaire de liaison lié à des particules marquées, par exemple un anticorps lié à des particules portant ou incorporant un marqueur visible ou visualisable, telles que des particules de latex coloré, des particules d'or colloïdal etc. Ce réactif peut migrer librement au travers de la matrice en présence de l'échantillon liquide déposé au niveau de la zone 2 et réagir avec l'analyte (antigène) à déterminer s'il est présent. Dans la zone 5 de la matrice 1, le second partenaire de liaison, par exemple un anticorps ayant une spécificité pour un épitope de l'antigène qui est différent de celui reconnu par le premier anticorps marqué, est immobilisé. Au niveau de la zone 6 de la matrice poreuse 1, une modification est opérée de sorte que les dimensions des pores soient inférieures à celles des particules marquées pour pouvoir stopper lesdites particules marquées et former un symbole qui est visualisé ou visualisable par l'utilisateur après passage du flux du fluide. Les figures 1B et 1C illustrent le fonctionnement de l'essai en présence d'un contrôle négatif et d'échantillons positifs.
Comme illustré à la figure 1B, l'échantillon étant un contrôle négatif, il n'y a pas d'émission d'un signal détectable au niveau de la zone de visualisation des résultats 5. Par contre, il y a formation d'un symbole détectable au niveau de la zone de contrôle de migration 6, matérialisé, par exemple, par une ligne perpendiculaire au sens du flux de l'échantillon liquide, ce qui signifie d'une part que l'échantillon contrôle négatif a bien migré jusqu'à la zone 6 et que d'autre part le dispositif est fonctionnel.
Comme illustré à la figure 1C, l'échantillon étant positif, il y a émission d'un signal détectable au niveau de la zone de visualisation des résultats 5 qui est matérialisé par une ligne perpendiculaire au sens du flux de l'échantillon liquide. Il y a également formation d'un symbole détectable au niveau de la zone de contrôle de migration 6, matérialisé, par exemple, par une ligne perpendiculaire au sens du flux de l'échantillon liquide, ce qui signifie d'une part que l'échantillon positif a bien migré jusqu'à la zone 6 et que d'autre part le dispositif est fonctionnel.
EXEMPLES :
Exemple 1 : Dosage d'anticorps anti-HIV-1 groupe M, anti-HIV-1 groupe O et anti-HIV-2
Le dosage des anticorps anti-HIV-1 et anti-HIV-2 par l'essai illustré à la figure 1 consiste en une réaction immunologique de type sandwich en une étape basée sur une technique immunochromatographique .
Des particules de latex bleues commercialisées par la société VARIAN (nom commercial) sont coatées par un mélange de trois peptides spécifiques du virus HIV-1 groupe M, HIV-1 groupe 0 et HIV-2, respectivement. Ces particules sont ensuite réparties sur une membrane de polyester (Ahlstrom-nom commercial) . La membrane est séchée une nuit à 37°C.
Des peptides de capture identiques aux peptides décrits ci-dessus sont coatés par répartition avec un appareil BIODOT (nom commercial) sur 3 membranes de nitrocellulose différentes : une membrane Millipore, HF 135 non supportée ( référence HFB 135UB, N° de lot R9PN61117, membrane A) , une membrane Sartorius CN 140 supportée (référence 1UN14ER050020, N° de lot 0509195010900833, membrane B) et une membrane Sartorius CN 150 laminée (référence 1UN15LR050025, N° de lot 07101L3011000933, membrane C) , au niveau de la zone de visualisation des résultats de l'essai 5. La répartition est réalisée par le même appareil BIODOT, Le contrôle positif du test est constitué par un écrasement de la membrane de nitrocellulose au niveau de la zone de contrôle 6. Après répartition des peptides de capture, chaque membrane de nitrocellulose est séchée une nuit à 37°C.
Après séchage, les deux membranes de polyester et de nitrocellulose, sont assemblées sur un support de test rapide (backing, de la société G&L (nom commercial )) en association avec un sample pad (membrane en fibre de verre qui sert de filtre pour l'échantillon avec contact avec les particules) et un absorbant pad (un absorbant qui a la capacité d'adsorber le reste l'échantillon après migration le long des différents type de membranes) . Le montage dans les cassettes est réalisé après découpage sous forme de bandelette.
Les échantillons testés sont des échantillons HIV positifs bien caractérisés. L' échantillons négatif testé correspond à un pool de sérum négatif en provenance de l'Etablissement Français du Sang (EFS) de la région Rhône-Alpes .
La lecture est réalisée visuellement à l'aide d'une carte de lecture qui permet d'attribuer des intensités de signal selon l'intensité de la couleur bleue observée.
Cette carte est graduée de Ll à LIO. Un échantillon est considéré positif si une couleur bleue apparaît avec une intensité correspondant au minimum à L4 de l'échelle de lecture.
Les lignes de contrôle ont été préparées par écrasement de chaque membrane à différentes force d'écrasement au niveau de la zone de contrôle 6, comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous, à l'aide d'un cylindre de 1,2 mm.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous :
Tableau 2
Figure imgf000014_0001
* : échantillon négatif
** : échantillon positif
Les résultats montrent que dans le cas d'un échantillon négatif, seul le contrôle positif est détecté, au niveau de la ligne contrôle : une intensité de couleur forte (L7,L8) quelque soit le type de membrane utilisée. Ces résultats permettent de confirmer que l'absence de signal au niveau de la ligne test 5 est liée à la négativité de l'échantillon et non à un défaut fonctionnel de la cassette utilisée pour le dosage. Dans le cas d'un échantillon positif, la ligne test et la ligne de contrôle sont visualisées avec une intensité de couleur forte, ce qui signifie que les anticorps présents dans l'échantillon ont bien été capturés par les peptides liés aux particules de latex bleues (particules de latex fonctionnalisées) pour former un complexe marqué qui a ensuite été immobilisé avec les peptides de capture au niveau de la ligne test 5 et que l'excès de particules de latex fonctionnalisées a bien été stoppé au niveau de la zone de contrôle 6, confirmant la fonctionnalité de la cassette.
Exemple 2 : Préparation de la ligne de contrôle par écrasement sur le support .
Le dispositif a été préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 1. La seule différence consiste en ce que les lignes de contrôle ont été préparées par écrasement du support à une force d'écrasement de 40 newtons au niveau de la zone de contrôle 6, à l'aide d'un cylindre de 0,6 mm. L'écrasement a été effectué après assemblage des membranes et du support dans la face externe du support entraînant une déformation de la membrane dans sa face en contact avec le support.
Un échantillons négatif correspond à un pool de sérum négatif en provenance de l'Etablissement Français du Sang (EFS) de la région Rhône-Alpes a été passé sur chaque membrane pour valider ce mode de réalisation de l'invention.
La lecture est réalisée visuellement à l'aide d'une carte de lecture qui permet d'attribuer des intensités de signal selon l'intensité de la couleur bleue observée comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3
Membrane A Ligne Test Ligne Contrôle
Négatif Ll L8
Membrane B Ligne Test Ligne Contrôle
Négatif Ll L8
Membrane B Ligne Test Ligne Contrôle
Négatif Ll L8
Les résultats ci-dessus valident ce mode de réalisation du dispositif de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
Dispositif pour réaliser un essai pour déterminer la présence ou l'absence d'au moins un analyte dans un échantillon liquide comprenant :
a) un support,
b) une matrice poreuse (1), fixée sur le support, qui permet la migration de l'échantillon liquide, ladite matrice comprenant :
(i) une zone d'application de l'échantillon liquide (2),
(ii) une zone de marquage (3) comprenant au moins un premier partenaire de liaison lié à des particules marquées, ledit premier partenaire de liaison étant susceptible de se lier audit au moins un analyte, s'il est présent dans l'échantillon liquide, et
(iii) au moins une zone réactionnelle (4) comprenant :
une zone de visualisation des résultats de l'essai (5) comprenant au moins un second partenaire de liaison immobilisé qui est susceptible de se lier audit au moins un analyte, et
une zone de contrôle (6) qui permet de contrôler le bon fonctionnement du dispositif en aval de la zone de visualisation des résultats de l'essai (5),
lesdites zones d'application de l'échantillon liquide (2), de marquage (3) et réactionnelle (4) étant en communication de fluide ;
le dispositif étant caractérisé en ce que :
au niveau de la zone de contrôle (6) , au moins une partie de la matrice poreuse (1) présente des pores dont les dimensions sont inférieures à celles des particules marquées, de sorte qu'au moins une partie des particules marquées de la zone de marquage (3) est stoppée au niveau de ladite zone de contrôle (6) formant un symbole qui est visible ou visualisable pour un utilisateur.
2. Dispositif selon la revendications 1, dans lequel le premier partenaire de liaison et le second partenaire de liaison sont choisis dans le groupe consistant en anticorps, mélange d'anticorps, fragment d'anticorps, mélange de fragments d'anticorps, nanofitine, mélange de nanofitines, antigène, mélange d'antigènes, protéine, mélange de protéines, polypeptide, mélange de polypeptides , peptide, mélange de peptides.
3. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel les particules marquées comprennent un matériau élastomère, de préférence du latex.
4. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel les particules de marquées comprennent de l'or colloïdal.
5. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le symbole est une ligne rectiligne qui est perpendiculaire à la direction principale du flux de l'échantillon liquide.
6. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le symbole forme un tracé admettant plusieurs tangentes distinctes, en particulier un tracé curviligne ou un tracé en ligne brisée par exemple en zig-zag.
7. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la zone de contrôle (6) comprend une rainure ménagée dans une des faces de la matrice poreuse (1) .
8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel la rainure résulte d'une déformation plastique de la matrice poreuse (1) .
9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel la rainure résulte d'une déformation thermique de la matrice poreuse (1), par exemple au moyen d'une lame chauffante ou d'un laser.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel une section transversale de la rainure a la forme d'un « U », d'un « V » ou d'un rectangle.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support est en une matière imperméable au liquide, de préférence en un matériau plastique de synthèse.
12. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comprenant une cassette disposée autour de la matrice, la cassette présentant une première ouverture agencée pour permettre l'accès à la zone d'application de l'échantillon (2) et au moins une deuxième ouverture agencée pour permettre à un utilisateur de voir la zone réactionnelle (4) .
13. Procédé, pour fabriquer un dispositif selon l'une des revendications précédentes, le procédé comprenant les étapes :
réaliser un dispositif conforme au préambule de la revendication 1 ;
opérer une modification de la matrice poreuse (1) de sorte qu'une partie de ladite matrice présente, au niveau de la zone de contrôle (6) des pores dont les dimensions sont inférieures à celles des particules marquées .
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la modification de la matrice est opérée par déformation plastique de la matrice en exerçant une pression localisée, de préférence en roulant au moins un organe rotatif en appui sur la face externe de la matrice.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l'organe rotatif a un diamètre de roulement d'au moins 1 mm, de préférence un diamètre de roulement compris entre 1 et 150 mm.
16. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la modification de la matrice est opérée par une déformation plastique de la matrice en exerçant une pression localisée et frontale, de préférence en appliquant un organe presseur en appui sur la face externe de la matrice.
17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel l'organe presseur a un diamètre ou une largeur externe compris entre 0 , 1 mm et 4 mm .
18. Procédé selon l'une des revendications 13 à 17, dans lequel la pression localisée est exercée par une force d'écrasement comprise entre 5N et 50N, de préférence entre ION et 40N.
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