WO2015015130A1 - Dispositif et procédé d'analyses biologiques avec des contrôles pour les partenaires de liaison - Google Patents

Dispositif et procédé d'analyses biologiques avec des contrôles pour les partenaires de liaison Download PDF

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WO2015015130A1
WO2015015130A1 PCT/FR2014/052004 FR2014052004W WO2015015130A1 WO 2015015130 A1 WO2015015130 A1 WO 2015015130A1 FR 2014052004 W FR2014052004 W FR 2014052004W WO 2015015130 A1 WO2015015130 A1 WO 2015015130A1
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binding partner
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Nathalie RENARD
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bioMérieux
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Definitions

  • the present invention relates to the field of the detection and / or quantification of analyte (s) in liquid samples during a biological analysis.
  • the present invention particularly relates to a device and a method for performing a sandwich-type immunoassay for detecting and / or quantifying at least one analyte in a sample.
  • the invention allows the biological control (control of the functional / operational character) of the analyte binding partners used in the context of said sandwich-type immunoassay, in order to avoid obtaining false-negative results when all or part of the connecting partners used are defective.
  • Sandwich type immunoassays are widely used in bioanalysis to detect and / or quantify a given analyte. These sandwich type immunoassays (or more simply “sandwich immunoassays”) use a first binding partner, called “capture binding partner”, generally immobilized on a solid phase to specifically bind the desired analyte, and a second binding partner, called “detection binding partner”, labeled and also intended to bind specifically with the desired analyte, thereby revealing the binding between the capture binding partner and the analyte, and thus the presence of the analyte.
  • capture binding partner generally immobilized on a solid phase
  • detection binding partner labeled and also intended to bind specifically with the desired analyte, thereby revealing the binding between the capture binding partner and the analyte, and thus the presence of the analyte.
  • the desired analyte is "sandwiched" between said first and second binding partners, the first binding partner ("capture") generally being present in excess of the desired analyte.
  • the capture binding partner may, for example, be immobilized on a solid support (by covalent bonding, adsorption or any other suitable method) and the amount must generally be such that the number of binding sites present on the binding partner of the capture is greater than the number of antigen molecules present in the standard or unknown solutions.
  • the labeled detection binding partner may, for example, be added either simultaneously or after a first incubation and washing, and binds to the antigen, previously immobilized to the capture binding partner.
  • a simple wash separates the binding partner-capture-analyte-detection binding partner (labeled) partners from the free labeled detection binding partners present in excess.
  • labeled detection binding partner In order for the labeled detection binding partner to bind to the analyte already engaged in a reaction with the capture binding partner, it is necessary for both binding partners to recognize different areas of the analyte.
  • the labeled detection binding partner may be, for example, via a radioactive isotope or enzymatically.
  • the signal corresponding to the capture binding partner-analyte-labeled detection binding partner-partner complex is a signal representative of the amount of analyte (s) present (s) in the sample tested.
  • the capture and detection binding partners are antibodies recognizing epitopes different from the desired analyte, which in this embodiment consists of an antigen.
  • the antibodies used as capture (“first binding partner”) and detection (“second binding partner”) binding partners may be, for example, multivalent polyclonal antibodies or different specific monoclonal antibodies.
  • Sandwich type immunoassays because of their high sensitivity, can serve as a basis for different types of tests.
  • EIA Enzymatic immunoassays
  • the ELISA test (of the English “Enzyme-linked immunosorbent assay", literally “bound enzyme immunoabsorption assay”) sandwich.
  • this test is as follows: a. a surface (for example a plate, such as a "96-well” plate) is
  • the sample likely to contain the desired antigen is added, so that any antigen present binds to the capture antibody;
  • the so-called “detection” antibody conjugated directly or indirectly with an enzyme, is added and binds to the antigen, thus forming a capture antibody-antigen-detection antibody complex;
  • the plate is rinsed so as to separate this complex from the free labeled detection antibodies present in excess;
  • the chromogenic or fluorogenic enzymatic substrate (referred to as the "ELFA” assay) is added; the latter is converted by the enzyme into a detectable form (colored or fluorescent).
  • the sandwich-type immunoassays can advantageously be implemented using the "Magnotech” technology from Philips.
  • a test of this type namely using the “Magnotech” technology, is described in particular in the publication by Bruis et al. [1].
  • This technology uses a reaction cartridge, preferably made of plastic material, comprising a zone for applying a liquid sample and one or more reaction chambers comprising the various reagents necessary for the test, this reaction zone being connected to the zone of applying the sample by a channel allowing the capillary flow of the liquid sample from the application zone to said reaction zone.
  • the reaction zone comprises in particular magnetic nanoparticles (of the order of a hundred nanometers in diameter, for example superparamagnetic particles) dried and coated with an antibody of interest capable of binding specifically to a first epitope of the analyte sought.
  • said reaction zone comprises, at a region that may be qualified as a "detection region", antibodies capable of specifically recognizing a second epitope of the desired antigen.
  • this reaction cartridge may be disposed within a portable device comprising two electromagnets positioned above and below the reaction cartridge. The result of the immunoassay is read after magnetic actuation, the upper electromagnet serving as the washing magnet, while the lower electromagnet acts as a connecting magnet.
  • This technique also makes it possible to quantify the desired analyte by establishing a calibration curve from the variation of the optical signal as a function of the concentration of magnetic nanoparticles and thus indirectly of the analyte.
  • sandwich type immunoassays are implemented in unit tests, for example in rapid unit tests, such as rapid screening tests (RDTs).
  • RDTs rapid screening tests
  • the latter are generally in the form of a "cassette", like pregnancy tests, and are relatively easy to use.
  • These tests are generally based on the principle of immunochromatography or membrane filtration: the sample (for example whole blood, serum, urine) deposited on the support will, for example, migrate by capillary action. bringing with it reagents already present then will meet binding partners deposited on the membrane when the sample is filtered by this membrane.
  • These rapid unit tests are also referred to as “lateral flow assays” or “lateral flow tests” and have been extensively described in the literature (see for example Yager et al [5] or Wild [6]).
  • side-flow testing devices can be used to determine the presence of many types of analytes, such as antibodies, antigens, hormones, proteins, chemical molecules, present in liquid samples.
  • analytes such as antibodies, antigens, hormones, proteins, chemical molecules
  • the analyte to be detected if it is present in the liquid sample deposited at the area of application, binds to a labeled detection binding partner.
  • the complexes thus formed then migrate to the reaction zone where they are immobilized at the capture zone by binding with a capture binding partner.
  • the user can note the presence of the desired analyte by demonstrating a detectable signal, determined according to the type of marker associated with the detection binding partner.
  • the presence of the analyte of interest in the sample is materialized as a detectable line, usually referred to as a test line.
  • the reaction zone generally comprises a sample migration control region that will indicate to the user that at least a portion of the sample has passed through the matrix, upstream of the control region, and particularly at the catchment area. This can be, for example, by the revelation of a control line of a predetermined color.
  • the patent application WO 2012/066235 discloses a device for performing a rapid unit test, which device incorporates a positive control.
  • a control region is provided within this device, for example downstream of the viewing area of the results, or in parallel with the latter, which control region comprises at least one analogue of the desired analyte capable of bind to the labeled detection binding partner.
  • the fast unitary test object of the application WO 2012/066235 allows not only the detection of the desired analyte but also to test the functional / operational character of the detection link partner.
  • this control is negative, the result of this test is considered uninterpretable and the test must be renewed.
  • the Applicant discovered, against all odds, that the functionality (functional / operational character) of the capture binding partner, generally immobilized / adsorbed on a solid surface, could be affected in whole or in part by external factors, such as light, temperature, etc.
  • this generates "false negatives", in the the analyte, although present in the tested sample, is not detected in the so-called “visualization of results” zone, but the control region makes it possible to confirm the functionality (functional / operational character) of the detection antibody, and therefore the apparent reliability of the test, while the capture partner is failing. The user / operator therefore incorrectly concludes that the desired analyte is not present in the sample tested.
  • an object of the present invention relates to a device for detecting and / or quantifying at least one analyte in a liquid sample during a biological analysis using at least two PI and P2 binding partners of said analyte, the first PI binding partner being immobilized within said device and the second P2 binding partner being immobilizable by forming a sandwich-type complex with the analyte and the first PI binding partner, said device comprising at least two zones fluid communication, namely: a) an application zone of the liquid sample, and
  • reaction zone b) comprising at least a first analogue CTRL1 of said analyte, said first analogue CTRL1 being immobilizable by binding to the first immobilized PI binding partner, and at least one second analog CTRL2 of the analyte, said second analog CTRL2 being immobilized within said device so as to bind to the second immobilizable link partner P2 and thus immobilize the latter
  • said reaction zone b) comprising at least the following three regions: bl ) a first region for detecting and / or quantifying the analyte, by demonstrating the formation of a sandwich-type complex between the first PI binding partner, the analyte and the second P2 binding partner, b.2) a second biological control region (functional / operational control) of the first link partner PI, at which the first link partner PI is immobilized, the detection of a link between the first partner of
  • the device according to the invention comprises a migration zone of the liquid sample c), allowing the migration of the liquid sample from the zone of application of the liquid sample a) to the zone reactional b).
  • the presence of this migration zone of the liquid sample c) is particularly desirable when the device according to the invention is suitable for use in a fast unitary test.
  • the migration zone of the liquid sample c) comprises a matrix.
  • the first and second PI and P2 binding partners consist of antibodies and the first and second analogs of the analyte CRTL1 and CRTL2 comprise at least the epitopes recognized respectively by the first and second PI and P2 antibodies.
  • the first and second analogs of the analyte CRTL1 and CRTL2 are peptides containing at least the epitopes recognized respectively by the first and second antibodies PI and P2.
  • the second binding partner P2 and the first analog of the analyte CTRL1 are initially deposited - advantageously deposited and dried - in the device and are adapted to be resuspended in the presence of the liquid sample.
  • the reaction zone b) of the device according to the invention comprises at least two distinct parts, for example two distinct reaction chambers, without direct communication of fluid between the two parts, the first part comprising the first region bl) and the second part comprising the second and third regions b.2) and b.3).
  • the first part comprises, in addition to the first immobilized PI binding partner, the second immobilizable P2 binding partner and the second part comprises, in addition to the first PI binding partner and the second analog of the immobilized analyte CRTL2, the first analogue of the analyte CTRL1 and the second link partner P2 immobilizable.
  • the reaction zone b) of the device according to the invention comprises at least two distinct parts, for example two distinct reaction chambers, without direct fluid communication between the two parts, the first part comprising the first and third regions bl) and b.3) and the second portion comprising the second region b.2).
  • the first part comprises, besides the first PI binding partner and the second analog of the immobilized analyte CRTL2, the second immobilizable P2 binding partner and the second part comprises, besides the first immobilized PI binding partner, the first analog of the immobilized analyte CRTL2.
  • the reaction zone b) of the device according to the invention comprises at least three distinct parts, for example three reaction chambers, without fluid communication between the three distinct parts, the first part comprising the region b1), the second part comprising region b.2) and the third part comprising region b.3).
  • the first part comprises, in addition to the first immobilized PI binding partner, the second immobilizable P2 binding partner
  • the second part comprises, in addition to the second analogue of the immobilized analyte CTRL2
  • the second third part comprises, besides the first immobilized PI binding partner, the first analogue of the immobilizable analyte CTRL1.
  • the reaction zone b) of the device according to the invention comprises at least one part, for example a reaction chamber, said part comprising:
  • the first analogue of the analyte CTRL1 is associated, directly or indirectly, with an M1 marker making it possible to demonstrate the binding of said first analogue of the analyte CTRL1 with the first binding partner P1 at the level of the regions b1) and b). 2), and / or
  • the second P2 binding partner being associated, directly or indirectly, with a marker M2, different from the marker M1, making it possible to demonstrate the formation of the sandwich-type complex between the second binding partner P2, the analyte and the first partner PI link at the level of regions b1 and b.2),
  • the zone of application of the liquid sample a comprises a filter.
  • Another subject of the invention relates to a method for detecting and / or quantifying at least one analyte in a liquid sample during a biological analysis using at least two binding partners of the PI and P2 analyte, said method comprising the steps of:
  • the invention also relates to the use of at least two analogs of an analyte CTRL1 and CTRL2 for the biological control (functional / operational control), respectively, of at least two PI and P2 binding partners, said partners PI and P2 binding system for detecting and / or quantifying said analyte by demonstrating the formation of a sandwich-type complex between the second P2 binding partner, the analyte and the first binding partner P1.
  • detecting ... at least one analyte it is intended to detect the presence of the desired analyte within the liquid sample of interest.
  • sample By “quantifying at least one analyte”, it is meant to determine the amount (e.g. concentration) / assaying the desired analyte within said liquid sample.
  • sample By “sample” is meant a small or small amount isolated from an entity for analysis. It can be a sample of clinical origin, human or animal, from a biological fluid sample, or a food sample, from any type of food, or a sample of the production or processing environment of food. As previously indicated, this sample is liquid.
  • sample of clinical origin is meant a sample taken from a patient or individual (human or animal), and may contain an analyte as defined below.
  • This sample may be in particular a liquid biological sample such as a sample of blood, serum, plasma, saliva, urine, cerebrospinal fluid, pleural fluid, peritoneal fluid (non-exhaustive list).
  • sample of food origin there may be mentioned, for example, a food sample of water, drink such as milk or fruit juice, yoghurt, meat, eggs, vegetables , mayonnaise, cheese, fish, etc.
  • This food-based sample may also be derived from a feed intended for animals, such as in particular a sample derived from animal meal.
  • sample of environmental origin there may be mentioned, for illustrative purposes, a sample for surface control or water or taken from effluents, sludge, soil, plants, etc. The sample taken can be used as it is, or prior to the biological analysis, undergo an enrichment-type preparation, dilution, extraction, concentration, purification, according to methods known to those skilled in the art.
  • liquid sample By “liquid” sample, it is appropriate to understand the samples taken directly in liquid form but also semi-solid or solid samples to the extent that they can be converted into a liquid sample by any appropriate method known to those skilled in the art. Of course, when the sample is solid or semi-solid, it must be pre-processed to be transformed into a liquid sample. This sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art.
  • analyte should be understood in a broad sense to mean a chemical, biological or biochemical substance that is the subject of one or more analysis (s).
  • analytes there may be mentioned an antigen, an antibody, a hormone, a protein or a chemical molecule (non-exhaustive list).
  • the nature of the analyte sought will dictate the nature of the binding partners to be used.
  • binding partners such as receptors, antibodies, antibody fragments, antibody analogs and any other ligand capable of bind to a protein or an antigen.
  • antibody analogs are meant biological and / or chemical compounds which possess the same binding capacities as antibodies or antibody fragments or similar binding capacities.
  • the antibody analogues include small proteins which, like the antibodies, are able to bind to a biological target, thus allowing it to be detected, captured or simply targeted within an organism or organism. a biological sample.
  • analogue of the analyte is meant a chemical, biological or biochemical species which has physicochemical and biological properties (for example in terms of affinity for a given ligand) close to those of the analyte.
  • the analogue of the analyte is a protein, such as an antibody, a mixture of proteins (for example a mixture of antibodies), a polypeptide, a mixture of polypeptides, a peptide, a mixture of peptides, an antibody fragment, a mixture of antibody fragments, an antibody analog, a mixture of antibody analogs, or combinations thereof.
  • the binding partner is an antibody, an antibody fragment, or an antibody analog
  • the analyte is a protein, a polypeptide, or a peptide
  • the analyte analog is also a protein, a polypeptide or peptide.
  • parts ... without direct fluid communication must be understood, within the meaning of the present application, as designating parts (for example reaction chambers) adapted to receive a fluid, in this case a liquid, said the parts being further adapted so that, once this liquid received, the latter can not freely communicate between said parts (for example between said reaction chambers).
  • the absence of direct fluid communication can be ensured, for example, by the partitioning of the parts (for example reaction chambers) by means of sealed septum (s) and, more generally, any known technical solution of the invention. skilled person.
  • the device according to the invention has a very good sensitivity, namely that the probability of obtaining a "false negative” result is extremely low. almost zero or no.
  • sensitivity is meant the ability to give a positive result when the desired analyte is present in the tested liquid sample.
  • the biological analysis implemented using the device according to the invention covers any immunoassay using at least two binding partners such as a sandwich type immunoassay (also called a sandwich type immunoassay).
  • a sandwich type immunoassay also called a sandwich type immunoassay.
  • immunoassay also called a sandwich type immunoassay.
  • the prefix "immuno" in the term “immunoassay” is not to be considered in the present application as strictly indicating that the binding partner is necessarily a partner of immunological origin, such as an antibody or an antibody fragment.
  • this term is more widely used to designate tests and processes in which the binding partner is not a partner of origin / immunological nature but consists, by for example, an analyte receptor that one wishes to detect and / or quantify.
  • the binding partner concerned is able to bind to the desired analyte, preferably in a specific manner.
  • ligand binding assay which could be translated into French as "assay using binding. to a ligand ", while the term” immuno "is included in the verbatim title corresponding to the acronym ELISA.
  • immuno is used in this application to refer to any biological assay using at least one binding partner adapted to bind to the analyte of interest and detect and / or quantify the latter. preferably, specifically, even when said binding partner is not of a strictly immunological nature or origin.
  • the first PI binding partner and the second P2 binding partner are selected, for example, from the group consisting of antibody, antibody mixture, antibody fragment, antibody fragment mixture, antibody analogue, mixture of Antibody analogs, antigen, antigen mixture, protein, protein mixture, polypeptide, polypeptide mixture, peptide, peptide mixture.
  • the first PI binding partner is a "capture binding partner” insofar as it is immobilized, directly or indirectly, on a solid surface.
  • the second link partner P2 is preferably a "detection link partner” and is associated - directly or indirectly - with a detection element making it possible to demonstrate the presence of this second P2 link partner and, most importantly, any and all elements (analyte (s), reagent (s), etc.) related to it.
  • This detection element may be a marker reagent but, more broadly, any element making it possible to demonstrate the presence of this second P2 binding partner and, especially, any / all element (s) (analyte (s), reagent (s), etc.) related to it.
  • the nanoparticle associated with the detection binding partner acts as a detection element, insofar as the attenuation of the reflected light beam due to this nanoparticle is indicative of the presence of the detection antibody at the level of the detection region and, consequently, the formation of a sandwich-type complex between the detection antibody, the desired analyte and the capture antibody.
  • the detection element is a marker reagent capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • these marker reagents may consist of:
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes,
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanines, radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I, metal particles or alloys, such as colloidal gold particles,
  • polymer particles such as colored latex particles.
  • Indirect detection systems can also be used, for example ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, which is the case, for example, of the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, molecule / receiver. In this case, it is the ligand that carries the binding partner.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the aforementioned marker reagents or be itself detectable by a ligand / anti-ligand.
  • Demonstration of the formation of the sandwich-type complex between the first PI binding partner and the second P2 binding partner may be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by direct visualization of a reaction due to marker reagent associated with the second P2 binding partner or else by means of detection means, for example of the optical type, as is the case under the "Magnotech" operating protocol.
  • At least one of the first and second binding partners PI and P2 - preferably both - are of nature and / or of immunological origin.
  • at least one of said PI and P2 binding partners - preferably both - are antibodies.
  • antibodies is meant a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a humanized antibody, a human antibody or a fragment of said antibodies, in particular the Fab, Fab ', F (ab') 2, ScFv, Fv fragments, fd.
  • said antibodies should be specific for the desired analyte, i.e., as far as possible, they do not cross-react with other analytes; the antibodies with the highest affinities and the weakest dissociation constants being the preferred antibodies for the purposes of the present invention.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunization of an animal with the appropriate immunogen, followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by removal of the serum of said animal, and separation of said antibodies from the other constituents of the serum, in particular by chromatography. affinity on a column on which is immobilized an analyte (antigen) specifically recognized by the antibodies.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique whose general principle is recalled below.
  • an animal is immunized with the appropriate immunogen whose B cells are then able to produce antibodies against this antigen.
  • These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" (usually murine) myeloma cells for give rise to hybridomas.
  • the cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely are then selected.
  • Each hybridoma is multiplied in clone form, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties vis-à-vis the desired antigen can be tested for example by ELISA, by immunoblotting (Western blot) in one or two dimensions, in immunofluorescence, or with a biosensor.
  • the monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified, for example by affinity chromatography.
  • Monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • the desired analyte is referred to as "antigen”
  • the first and second PI and P2 binding partners recognize two distinct epitopes - respectively called E1 and E2 - of this antigen.
  • PI is preferably a "capture antibody”, as long as it is immobilized, directly or indirectly, on a solid surface.
  • the antibody P2 is preferably a "detection antibody” and is associated - directly or indirectly - with a detection element making it possible to demonstrate the presence of this second antibody P2 and, above all, of all / all elements ( s) (analyte (s), reagent (s), etc.) related thereto.
  • This detection element is as defined above.
  • immobilized binding partner means that the binding partner is attached directly or indirectly within the device by any method known to those skilled in the art such as by adsorption or covalent bonding.
  • peptide containing an epitope recognized by an antibody refers to any sequence of amino acids comprising at least the epitope recognized by the binding partner concerned.
  • the peptide may be limited to the epitope itself, or include a few additional amino acids, until the protein is obtained, as long as the peptide retains recognition activity by the relevant binding partner.
  • the peptide may also contain one or more mutated amino acids, since, again, the peptide retains the recognition activity by the relevant binding partner.
  • a capture partner pair also referred to as a capture binding partner
  • a detection partner also referred to as a detection binding partner
  • the peptide may comprise the E1 epitope of the first capture partner and the E2 epitope of the other capture partner.
  • the term "matrix" refers to any type of material capable of ensuring the flow and transfer of a liquid. The transfer of the liquid can be ensured by capillary force. This is particularly advantageous when the device according to the invention is a device for implementing a lateral flow assay.
  • the matrix may be, for example, at least one material bibulous. Bibulous materials are materials that easily absorb a liquid and through which the liquid is transported by capillarity. As a crumbly material, there may be mentioned, for example, nitrocellulose, polyester, glass fibers, etc.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the concept underlying the present invention
  • FIG. 2 is a view from above of a reaction cartridge that can be used in an "Magnotech” type opto-magnetic immunoassay device;
  • FIGS. 3A, 3B, 3C and 3D illustrate the operation of an opto-magnetic immunoassay technology platform such as the "Magnotech” platform;
  • FIG. 4 is a view from above of a device according to a first embodiment of a first aspect of the invention.
  • FIG. 5 schematically illustrates a first configuration of this first embodiment of the invention
  • FIG. 6 schematically represents a second configuration of this first embodiment of the invention
  • FIG. 7 is a view from above of a device according to a second embodiment of a first aspect of the invention.
  • FIG. 9 schematically represents a third embodiment of a first aspect of the invention.
  • FIGS. 10A, 10B, 10C and 10D represent top views of a lateral flow test as described in application WO 2012/066235, in the name of the Applicant;
  • FIGS. 11A, 11B, 11C, 11D, 11E and 11F are diagrammatic views from above of a device according to a second aspect of the invention, suitable for implementing a unilateral flow measurement. ;
  • FIG. 12 is a schematic representation of the biological control of the P2 binding partner in the context of the detection of troponin I (TnI) as an analyte, PI and P2 being anti-TnI monoclonal antibodies, respectively 19C7 and 560. , and CTRL2 containing an epitope peptide of P2;
  • TnI troponin I
  • FIG. 13 is a schematic representation of a Magnotech cartridge having two reaction chambers, in which the P2 binding partner is biologically controlled, the chamber 1 being coated with two spots, each for the detection of Troponin I (spot PI on which is immobilized the anti-Troponin I 19C7 monoclonal antibody (PI binding partner)), and the chamber 2 is coated with three spots, one of the spots being for the detection of Troponin I (spot PI, identical to the spots PI of chamber 1) and the other two (spot CTRL2-1 and spot CTRL2-2) being for the biological control of anti-Troponin I detection antibodies (monoclonal antibody 560, P2 binding partner) using a CTRL2 control ( epitope peptide coupled protein P2);
  • CTRL2-1 and spot CTRL2-2 epitope peptide coupled protein P2
  • FIG. 14 gives the signal results obtained in chambers 1 and 2 of the Magnotech cartridge according to FIG. 13 with three different samples, namely a negative TnI sample, and two TnI positive samples, having two different concentrations of TnI. ;
  • FIG. 15 is a schematic representation of the biological control of the anti-Troponin I 19C7 monoclonal antibody (PI binding partner), using a CTRL1 control (protein coupled to the epitope peptide of PI and to a magnetic particle), in the part of a Magnotech technology used for the detection of troponin I as an analyte; and FIG. 16 gives the signal results obtained in a chamber exhibiting biological control of the PI binding partner according to FIG. 15, with two different samples, namely a negative TnI sample, and a positive TnI sample.
  • CTRL1 control protein coupled to the epitope peptide of PI and to a magnetic particle
  • Figure 1 is intended to illustrate the concept underlying the present invention. Said concept relates to increasing the detection sensitivity in the context of any type of sandwich-type immunoassay, through the significant reduction - or even the suppression - in the obtaining of false-negative results.
  • a first PI binding partner in this case the antibody 10
  • This antibody is used as a capture antibody.
  • a second P2 binding partner in this case antibody 11, immobilizable by formation of a sandwich-type complex with analyte 12 and capture antibody 10.
  • Antibody 11 is him, called “detection antibodies”.
  • This detection antibody 11 is associated, directly or indirectly, with a detection element 111 making it possible to detect the formation of the "sandwich” between the capture antibody 10, the analyte 12 and the detection antibody 11; forming said sandwich revealing the presence of the desired analyte 12 within the test sample (unnumbered in Figure 1).
  • the type of detection element 111 used depends on the detection means employed.
  • the detection element 111 will consist, respectively, of a fluorogenic or chromogenic element (that is to say to obtain a fluorescent reaction or a colored reaction) , such as an enzyme in the presence of a substrate.
  • a fluorogenic or chromogenic element that is to say to obtain a fluorescent reaction or a colored reaction
  • the sandwich-type immunoassay is implemented via an opto-magnetic technology platform such as the "Magnotech” platform
  • the detection element 111 can simply be constituted by a magnetic particle / ball. Indeed, this magnetic particle will influence the intensity of the reflected light signal at the level of the detection region and, thus, will give an indication of the formation of the "sandwich", thus revealing the presence / quantification or absence of the analyte 12 sought.
  • the inventive concept on which the present invention is based requires the use of two positive controls:
  • a first positive control 13 making it possible to test not only the presence but above all the functional character of the capture antibody 10.
  • This positive control 13 comprises an epitope 131 (for example of peptide type) specifically recognized by the capture antibody 10 and a detection element 132, identical to or different from the detection element 111;
  • control 14 making it possible to test not only the presence but above all the functional character of the detection antibody 11, said control 14 comprising an epitope 141 (for example of peptide type) specifically recognized by the detection antibody 11.
  • the epitopes 131 and 141 may be identical, and therefore the antibodies 10 and 11 too, for example when the analyte has several identical epitopes.
  • the 131 and 141 epitopes are different when the analyte has only different epitopes, as is the case, for example, for Troponin I.
  • test result When there is no signal at the region of detection and / or quantification of the analyte and there is also a lack of signal at the level of the biological control region of the antibody of capture 16 and / or at the level of the biological control region of the detection antibody 17, the test result should be considered uninterpretable. In the absence of biological control of the capture antibody 10, at the level of the biological control region 16, the test result would have been wrongly considered as negative, while the analyte of interest was well and truly present. contained in the tested sample.
  • the device according to the invention clearly makes it possible to identify the binding partner (s) (in this case the capture antibody 10 and / or the detection antibody 11) defective.
  • the binding partner in this case the capture antibody 10 and / or the detection antibody 11
  • This is particularly of interest in the production of kits comprising a support (plate, reaction cartridge, etc.) on which are immobilized (for example by adsorption) capture binding partners and a solution comprising the detection antibodies.
  • reaction cartridge 2 used in an opto-magnetic immunoassay device of the "Magnotech” type is shown in FIG. 2.
  • This reaction cartridge 2 comprises an inlet 21 intended to receive the liquid sample to be tested, a channel 22 allowing the flow (for example natural or by capillarity) of the sample to be tested to the reaction zone 23 comprising, in the example shown in FIG. 2, a single reaction chamber 231.
  • the device according to the invention can be used for different types of immunoassay, and in particular in an opto-immunoassay.
  • magnetic using the platform "Magnotech” developed by the company Philips (Eindhoven, the Netherlands), the principle is recalled below with reference to Figures 3A-3D.
  • the capture and detection antibodies are maintained in dry form.
  • the magnetic particles 33, coated with the detection antibodies 31 are resuspended in the presence of the liquid sample previously introduced at the inlet 21 of the reaction cartridge 2 shown in FIG. 2.
  • the lower electromagnet 35 is activated in order to attract the magnetic particles 33 towards the detection region 36 on which are immobilized (for example by covalent bonding or adsorption) capture antibody 30, thus allowing, when the desired analyte 32 is present, the formation of a sandwich-type complex between the capture antibody 30, the analyte 32 and the detection antibody 31 carried by a particle magnetic 33.
  • the lower electromagnet 35 is deactivated and the upper electromagnet 34 is activated in order to induce the removal of the unbound magnetic particles 33 at the level of the detection region 36 - and thus keeping only, at said detection region 36, the magnetic particles 33 at least one detection antibody 31 of which is bound to at least one capture antibody 30 via at least one desired analyte 32 (formation a sandwich-type complex between the three aforementioned entities), if the analyte of interest is present in the sample tested.
  • the lower electromagnet 35 may be considered as a "connecting" electromagnet, while the upper electromagnet 34 may be considered as a "washing" electromagnet.
  • the particles / magnetic beads present at the detection region 36 are detected using, as detection means 37, a 2-dimensional photographic sensor ("2D ", Such as a CCD sensor), the detection element being constituted by the magnetic particle 33.
  • 2D 2-dimensional photographic sensor
  • the detection step, represented in FIG. 3D is based on the principle of total frustrated total internal reflection (f-TIR), as described, for example, in Bruis et al. [1] or in the patent application WO2013 / 054230.
  • the detection principle is as follows: an incident light beam 38 is emitted (for example by a light source 39 of the LED type) towards the detection region 36 with an incident angle greater than the critical angle (depending on the material constituting the reaction cartridge) so that the entirety of the incident light beam 38 is reflected into a reflected light beam 40 - referred to in this case as an "evanescent beam" - in the direction of the detection means 37.
  • the detection principle is based on the following assumption: the intensity of the reflected light beam 40 is inversely proportional to the quantity of magnetic particles 33 present at the detection region 36. in other words, the decrease in the intensity of the reflected light beam 40 observed at the detection means 37 is proportional to the number of magnetic particles 33 linked to the level of the detection surface 36, and consequently to the concentration of the analyte 32 present in the sample tested.
  • the device according to the invention is adapted to be implemented in an opto-magnetic immunoassay of "Magnotech" type.
  • FIG. 4 A device according to a first embodiment of the first aspect of the invention is shown in FIG. 4 (top view).
  • This device is a reaction cartridge similar to that shown in FIG. 2. It comprises an inlet 41, a channel 42 and a reaction zone 43, except that the reaction zone comprises two reaction chambers 431 and 432, which are not directly connected to the reaction zone 43. fluid communication.
  • FIG. 5 schematically illustrates a first configuration of this first embodiment during the first step of the "Magnotech” operating protocol, as represented in FIG. 3A.
  • the first reaction chamber 431 comprises a region of detection and / or quantification of the analyte 56 at which the antibody of capture 50.
  • the formation of a sandwich-like complex between the detection antibody 51 (associated with the magnetic particle 53), the analyte 52 and the capture antibody 50 will be evidenced at said detection region 56 by attenuation of the reflected light signal 40 at the detection means 37, as shown schematically in FIG. 3D.
  • the second reaction chamber 432 comprises a biological control region of the capture antibody 50, at which level, if the capture antibody 50 is functional, the formation of a complex between the 551 epitope of the biological control 55 (associated with the magnetic particle 53) and the capture antibody 50.
  • the detection at the level of the biological control region of the capture antibody 57, by attenuation of the light beam 40 at the detection means 37, as shown diagrammatically in FIG. 3D.
  • This second reaction chamber 432 also comprises a biological control region of the detection antibody 58, at which, if said detection antibody 51 is operational, a complex will form between said detection antibody 51 (bound to the particle Magnetic 53) and epitope 541 of biological control 54.
  • a biological control region of the detection antibody 58 at which, if said detection antibody 51 is operational, a complex will form between said detection antibody 51 (bound to the particle Magnetic 53) and epitope 541 of biological control 54.
  • the presence of this complex is demonstrated, at the level of the biological control region of the detection antibody 58, via attenuation of the reflected light beam 40 at the level of the detection means 37, as shown schematically in FIG.
  • Figure 6 shows a second configuration of the first embodiment according to a first aspect of the invention.
  • that shown in FIG. 6 comprises two reaction chambers 431 and 432.
  • the reaction chamber 431 comprises both the detection region and / or quantification of the analyte 56 and the biological control region of the detection antibody 58.
  • the reaction chamber 432 for its part, comprises the biological control region of the capture antibody 57.
  • the region biological control of the capture antibody 57 in a reaction chamber separate from the chamber 431, comprising the detection and / or quantification region of the analyte 56 and the biological control region of the antibody 58, avoids a phenomenon of competition between the analyte 52 and the biological control 55 with respect to binding to the capture antibody 50 at the region of detection and / or quantification of the analyte 56.
  • FIG. 7 is a top view of a device according to a second embodiment of the first aspect of the invention. More precisely, this FIG. 7 represents a device according to the invention, in the form of a reaction cartridge, that can be used in an opto-magnetic device of the "Magnotech" type.
  • This reaction cartridge is similar to that shown in FIG. 4, except that the reaction zone 73 does not comprise two distinct reaction chambers but rather three distinct reaction chambers 731, 732 and 733, which are not in direct fluid communication.
  • the first reaction chamber 731 comprises the detection and / or quantification region of the analyte 86, at which the complex between the capture antibody 80, the analyte 82 and the detection antibody 81 is formed. reserve that analyte 82 be present in the sample tested.
  • the reaction chamber 732 comprises the biological control region of the detection antibody 88, at which the complex between the detection antibody 81, bound to the magnetic particle 83, is formed with the epitope 841 of the biological control 84 provided that the detection antibody 81 is functional.
  • the third reaction chamber 733 comprises the biological control region of the capture antibody 87, at which a complex is formed between the 851 epitope, bound to the magnetic particle 83, of the biological control 85 and the capture antibody. 80, provided that the latter is operational / functional.
  • the detection of the presence of these complexes at their respective detection zones 86, 88 and 87 is carried out as indicated above with reference to FIG. 3D.
  • FIG. 9 A third embodiment according to a first aspect of the invention is shown diagrammatically in FIG. 9.
  • the latter relates to a device according to the invention in the form of a reaction cartridge comprising a single reaction chamber, as shown in FIG.
  • the single reaction chamber 99 comprises: a region for detecting and / or quantifying the analyte 96, at which a complex is formed between the capture antibody 90, the analyte 92 and the antibody detector 91 (associated with the magnetic particle 93) in the presence of the desired analyte 92;
  • a biological control region of the detection antibody 98 at which a complex is formed between the detection antibody 91, bound to the magnetic particle 93, and the 941 epitope of the biological control 94, when the latter is functional;
  • a biological control region of the capture antibody 97 at the level of which a complex is formed between the latter and the epitope 951, bound to the magnetic particle 93, of the biological control 95 (bound to a magnetic particle 93 ) when said capture antibody 90 is functional.
  • the detection antibody 91 be present in excess with respect to its possible binding sites (consisting of analyte 92 and biological control 94) in order to avoid the competition phenomenon presented supra.
  • capture antibody 90 it is also important that capture antibody 90 be present in excess of its possible binding sites (i.e. antigen 92 and 951 epitope of biological control 95).
  • the epitope 951 of the biological control 95 in order to prevent the specific binding of the epitope 951 of the biological control 95 to the capture antibody 90, at the level of the detection and / or quantification region 96, preventing the formation of a complex of the type at the level of said detection and / or quantification region 96. It is also important that the epitope 951 of the biological control is not present in excess large quantity for the same reason. This is particularly important when the analyte is present in small amounts in the sample to be assayed.
  • the epitope 951 of the biological control 95 binds not only to the capture antibody 90 at the biological control region of the capture antibody 97 but also at the region of detection and / or quantification of the analyte 96, it is important or even primordial that the magnetic particles 93 associated with the biological control 95 are associated, directly or indirectly with a marker 932 for detecting which complexes, at regions 96 and 97, are due to the binding of the biological control 95 to the capture antibody 90, and thereby indirectly infer which complexes are actually indicative of the presence of the analyte 92 in the test sample.
  • the differentiation between different regions can also be performed using differently colored particles or particles of different diameter.
  • the magnetic particles 93 associated with the detection antibodies 91 are labeled with a marker 931, in order to directly identify the sandwich-type complexes at the region of detection and / or quantification of the analyte 96.
  • the magnetic particles 93 associated with the biological control 95 and the magnetic particles 93 associated with the detection antibodies 91 are respectively labeled with a marker 932 and 931, said markers 932 and 931 being different from one of the other.
  • the present invention is applicable in various types of sandwich type immunoassay and in particular in rapid unit tests, also called tests / lateral flow assays.
  • the patent application WO 2012/066235 in the name of the Applicant, discloses a device for performing a rapid unit test, which device incorporates a positive control. The operation of this device of the prior art is illustrated in FIGS. 10A-10D.
  • the device according to WO 2012/066235 is a cassette comprising a support (not represented), a matrix 1001 comprising an application zone of the liquid sample 1002, a marking zone 1003, a viewing zone of the results 1005 a positive control zone 1006, an optional migration control zone 1007 and, optionally, an absorption zone of the sample 1008.
  • Zone 1001 is shown as a rectangular strip whose longitudinal axis is in a horizontal position.
  • Zones 1002, 1003, 1005, 1006, 1007 and 1008 are in fluid communication.
  • Zone 1003 comprises a detectably labeled detection antibody (e.g., a colored latex particle, a gold particle, etc.).
  • This labeled antibody can freely migrate through the 1001 template and react with the desired analyte (antigen in the present case) if it is present in the test sample.
  • a capture antibody with a specificity for an antigen epitope different from that recognized by the detection antibody is immobilized (for example by covalent linkage or adsorption).
  • an antigen analog is either immobilized directly or indirectly or can migrate freely in the presence of the fluid stream at the zone 1006 until it is immobilized by the capture antibody at the positive control zone 1006.
  • Figures 10A, 10B and 10C summarize the operation of the test according to the patent application WO2012 / 066235.
  • FIG. 10D comparable a priori to FIG. 10A, also illustrates the representation of a false negative result obtained using the aforementioned cassette as explained below.
  • Figure 10B illustrates the result obtained with a positive control sample.
  • the emission of a detectable signal 10051 ("test line") at the viewing area of the results 1005 is noted.
  • This detectable signal 10051 is due to the formation of a complex sandwich type between the capture antibody, the antigen and the detection antibody, at the display area of the results 1005.
  • the detectable signal 10051 strictly speaking, is due to the marker associated with the antibody of detection.
  • test is such that it indicates that the sample comprises the analyte and is considered to be interpretable according to the patent application WO2012 / 066235.
  • FIG. 10C illustrates a result regarded as "uninterpretable" in that no signal is detected either at the result viewing area 1005 or at the positive control region 1006.
  • FIG. 10D By multiplying the tests with positive control samples (ie including the desired analyte), the Applicant surprisingly uncovered, in very small proportions, the profile shown in FIG. 10D, identical to that object of the present invention.
  • Fig. 10A i.e., having no signal at the result display area 1005, but a signal 10061 at the positive control region 1006 and a signal 10071 at the migration control region 1007.
  • FIGS. 11A, 11B, 11C, 11D, 11E and 11F illustrate the operation of a cassette similar to that described in WO2012 / 066235 but having an increased detection sensitivity.
  • Figs. 11A-11F show top views of a lateral flow metering device according to a second aspect of the invention.
  • this device comprises a support (not shown), a matrix 1101 (represented in the form of a rectangular strip whose longitudinal axis is in a horizontal position), said matrix comprising a zone of application of the sample 1102, a labeling zone 1103 and a reaction zone 1800.
  • This reaction zone comprises a detection region of the analyte (in this case an antigen) 1105, a positive control region of the capture binding partner 1109 (for example, an antibody), a positive control binding region of the detection binding partner 1106 (e.g., an antibody) and, optionally, a migration control region 1107.
  • the template 1101 may further optionally include an absorption zone of the sample 1108.
  • the first analogue of the analyte CTRL1 (consisting for example of an epitope peptide of PI coupled to a marker or a precursor labeling) is disposed downstream (following the direction of migration of the liquid) of this detection region of the analyte 1105 but upstream of the positive control line of the capture antibody at which PI is immobilized, namely at the level of the region 1104 (located between the regions 1105 and 1109 ), or at a subregion of the positive control region of the capture antibody 1109, located upstream of said positive control line of the capture antibody, at which the antibody is immobilized.
  • the positive control region of the detection antibody P2 1106, for its part, comprises the second analogue of the analyte CTRL2 immobilized at the level of the positive control line of the detection antibody P2.
  • the marking area 1103 comprises the excess detection antibody P2.
  • the positive control region of the capture partner PI 1109 where appropriate including the aforesaid subregion upstream of said positive control line of the capture antibody, as indicated above, can also be found after the control region. positive detection partner P2 1106 (not shown).
  • the reaction zone 1800 then comprises, in order, a detection region of the analyte (in this case an antigen) 1105, a positive control region of the detection antibody 1106, a positive control region of the analyte. 1109 capture antibody and, optionally, a migration control region 1107.
  • the template 1101 may further optionally include an absorption zone of the sample 1108.
  • FIG. 11B illustrates the results obtained with the device of the invention after application of a so-called "negative control" sample, ie not containing the desired analyte. Since the sample is a negative control, there is, by definition, no emission of a detectable signal at the detection region of analyte 1105 (specifically at the test line). On the other hand, a detectable signal is emitted at the level of the positive control region of the capture antibody 1109 (signal 11091 at the positive control line of the capture antibody), at the level of the Positive control region of the detection antibody 1106 (signal 11061 at the positive control line of the detection antibody) and at the migration area 1107 (signal 11071 at the migration control line ), when the latter is present.
  • a detectable signal is emitted at the level of the positive control region of the capture antibody 1109 (signal 11091 at the positive control line of the capture antibody), at the level of the Positive control region of the detection antibody 1106 (signal 11061 at the positive control line of the detection antibody) and at
  • Figure 11C illustrates the results obtained with the device of the invention after applying a positive sample for a predetermined analyte. As shown in FIG.
  • the sample being positive for the predetermined analyte (antigen)
  • there is emission of a detectable signal at the detection region of analyte 1105 (signal 11051 at the line test), at the level of the positive control region of the capture antibody 1109 (11091 signal at the positive control line of the capture antibody) at the positive control region of the detection antibody 1106 (signal 11061 at the positive control line of the detection antibody ), as well as at the migration zone 1107 (signal 11071) when the latter is present.
  • Figures 11D, 11E and 11F illustrate results obtained after applying a seemingly negative sample for an analyte to be determined.
  • the presence of a signal 11091 at the positive control region of the capture antibody 1109 indicates that it is functional.
  • the absence of a signal at the level of the positive control region of the detection antibody 1106 indicates that the functional character of this detection antibody is at least partially impaired. It can not be concluded that the sample is negative. We can only conclude that the test is uninterpretable.
  • the device may comprise two segments S1 and S2, each comprising a zone for applying the sample.
  • the first segment S1 comprises, besides the zone of application of the sample, a marking zone and a reaction zone comprising an analyte detection region and a positive control region of the detection link partner P2
  • the second segment S2 comprises, in addition to the sample application area, the positive control region of the capture binding partner P1, the latter comprising a subregion at which the capture partner PI is immobilized (for example in the form of a positive control line of PI), the control CTRL1 being disposed upstream (in the direction of migration of the liquid) of said subregion as explained above.
  • This embodiment is particularly interesting because the user can use this second segment S2 only if the reading of the first segment indicates prima facie the absence of analyte in the sample tested but the control CTRL2 partner detection link P2 is positive. In such a case, the user does not know if the result obtained is a true negative, namely that the desired analyte is absent from the tested sample, or if the capture binding partner PI is faulty. The user can easily decide between these two hypotheses thanks to the second segment S2 (for example by visual or optical reading of the latter). Moreover, this makes it possible to be able to replace the sample of the second segment S2 by an appropriate buffer interchangeable with the sample at this segment.
  • Peptide synthesis Peptides containing the epitopes recognized by the anti-Troponin I 19C7 (SASRKLQLK) and 560 (ELTGLGFAELQ) antibodies (Hytest, Turku, Finland) were produced by chemical synthesis according to the procedures well known to those skilled in the art such as synthesis. solid phase peptide described by Merrifield, 1962 (Merrifield, 1962, J. Am Chem Soc 85: 2149) and Fields et al, 1990 (Fields GB, Noble RL, 1990, Int J Pept Protein Res., 35 (3): 161-214), using a polystyrene polymer containing 0.1-1.0 mMol amines / g of polymer.
  • the peptides are deprotected and cleaved from the polymer in the presence of a mixture of trifluoroacetic acid-ethanedithiol-triisopropylsilane-water (94 / 2.5 / 1 / 2.5 V / V / V / V) for about 2 hours. .
  • the peptides are extracted by precipitation in diethyl ether at 0 ° C. They are purified by techniques such as high performance liquid chromatography. Lyophilization of the appropriate purification fractions leads to a homogeneous peptide which is characterized by standard physicochemical techniques such as mass spectrometry, high performance liquid chromatography, amino acid analysis.
  • Each epitope peptide is coupled to bovine serum albumin (BSA, Proliant, Ankeny, IA, USA) via sulfo-SMCC (25 mg / ml, Thermo Fischer Scientific Inc, Rockford, IL, USA).
  • BSA bovine serum albumin
  • sulfo-SMCC 25 mg / ml, Thermo Fischer Scientific Inc, Rockford, IL, USA. This chemical modification is performed at a ratio of 1: 10 BSA / SMCC during an incubation of 1 h at 30 ° C. +/- 1 ° C. and is followed by dialysis against a 50 mM PO 4 buffer, 150 mM NaCl pH 6.8.
  • Each epitope peptide diluted to 5g / L in 50mM PO 4 buffer, 150mM NaCl, 5mM EDTA pH 6.8 is then contacted with BSA-SMMC in a ratio of 3 epitope peptide molecules per BSA molecule. After 18 h of incubation at 2-8 ° C, the coupling reaction is blocked by the addition of 2-aminoethanethiol (2MEA, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) at a concentration respecting the equimolarity between the molecules. 2MEA and SMCC and incubation for 20 minutes with shaking. Each BSA-epitope peptide control is dialyzed against PBS buffer, 0.9g / L azide and stored at 2-8 ° C.
  • EXAMPLE 2 Biological Control of the P2 Linking Partner with the CTRL2 Epitope Peptide
  • the principle of this control in a test for the detection of troponin I as an analyte is shown in FIG. 12, PI 1200 and P2 1201 being antibodies anti-TnI monoclonals, respectively 19C7 and 560, P2 1201 being coupled to a magnetic particle 1203 as previously described and CTRL2 1204 being a P2 12041 epitope peptide coupled to BSA 12042, as previously described.
  • the cartridge Magnotech (Philips, Eindhoven, Netherlands) consists of three elements that are: the optical part 1209, a sheet 1210 and a filtration unit on which is deposited the sample (not shown).
  • the optical part is the lower part of the cartridge. It comprises the point of entry of the filtered sample, connected to two reaction chambers (chamber 1 and chamber 2) by a microfluidic channel.
  • the sheet is a biocompatible adhesive film which constitutes the upper part of the cartridge and ensures the closure of the reaction chambers and fluidized channels etched in the optical part.
  • the anti-Troponin I 19C7 antibody (PI binding partner) is deposited as a spot in each reaction chamber (spot PI 1300) by printing (sciFLEXARRAYER, SU, Scienion AG), as described in FIG. the article by Dittmer et al [7] (Journal of immunological methods, 338: 40-46), at a concentration of 40 ⁇ g / ml of antibody.
  • Control CTRL2 1204 (BSA coupled to the epitope peptide of anti-Troponin I antibody 560), prepared in Example 1.2. and used as a biological control of the P2 binding partner (anti-troponin antibody ⁇ 560 coupled to particles Magnetic functionalized as described in Example 1.3. except that the antibody concentration is 60 ⁇ g of antibody per mg of magnetic particles), is also deposited in spot form at a concentration of 0.1 of CTRL2 (spot CRTL2-1 13041) or 1 ng / mL of CTRL2 (spot CRTL2-2 13042).
  • the P2 bonding partner is deposited on the surface of the 1209 sheet of each reaction chamber using Nanodrop NS-2Stage (Innovadyne Technologies, Inc. Carnforth, UK). The three elements are then assembled and preserved in the presence of desiccant at
  • the graphs in FIG. 14 show that: when the Troponin negative sample was assayed, a signal considered negative (less than 0.4%) was observed at the PI 1300 spots in both chambers, while the biological control of the P2 binding partner gave a positive signal (CTRL2-1 spot 13041 and CTRL2-2 spot 13042). This confirms that the 560 antibodies coupled to the beads are functional and that the sample is a true negative. In addition, it also shows that it is possible to perform the positive control indifferently in a chamber separate from the chamber where the analyte is detected or in the same chamber.
  • troponin positive samples with concentrations of 1.05 ⁇ g / ml and 2.43 g / ml, respectively, show an increasing signal at the PI 1300 spots (signals from 14% to 41%). It is also observed that at the CTRL2 spots 13041 and 13042, no significant change between the signals obtained with the troponin I positive samples and those from the negative sample was detected. This also shows that troponin ⁇ present in the sample does not affect biological control because magnetic beads coupled with anti-troponin I 560 (P2) antibody are
  • CTRL2 (CTRL2 spots 13041 and 13042), even at a high concentration of Troponin I.
  • PI 1500 being an anti-TnI 19C7 monoclonal antibody
  • CTRL1 1505 being an epitope peptide of PI 15051 coupled to the beads.
  • magnetic 1503 as previously described.
  • the cartridge is prepared as described in 2.1. above, except that the CTRLl 1505 control prepared in 1.3. above (magnetic ball 1503 coupled to the epitope peptide of the anti-troponin monoclonal antibody I 19C7 15051) is deposited on the sheet 1510 at the reaction chamber, opposite the binding partner PI 1500 (monoclonal antibody 19C7 fixed on the optical part (spot PI, not shown)).
  • CTRLl 1505 control prepared in 1.3. above (magnetic ball 1503 coupled to the epitope peptide of the anti-troponin monoclonal antibody I 19C7 15051) is deposited on the sheet 1510 at the reaction chamber, opposite the binding partner PI 1500 (monoclonal antibody 19C7 fixed on the optical part (spot PI, not shown)).
  • the graphs in FIG. 16 show that: when the Troponin I negative sample was assayed, a mean positive signal of 59% was obtained (spot CTRL1, not shown), which demonstrates that the binding partner PI 1500 ( 19C7 antibody) is functional;

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Abstract

Dispositif, procédé et utilisation destinés au contrôle biologique des partenaires de liaison (au moins deux, PI et P2) d'un analyte dans le cadre d'une analyse biologique de type sandwich. Le dispositif comprend comme contrôles au moins un premier analogue CTRLl dudit analyte, ledit premier analogue CTRLl étant immobilisable par liaison au premier partenaire de liaison PI immobilisé, et au moins un deuxième analogue CTRL2 de l'analyte, ledit deuxième analogue CTRL2 étant immobilisé au sein dudit dispositif de façon à se lier au deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et immobiliser ainsi ce dernier.

Description

DISPOSITIF ET PROCÉDÉ D'ANALYSES BIOLOGIQUES AVEC DES
CONTRÔLES POUR LES PARTENAIRES DE LIAISON
Domaine technique La présente invention concerne le domaine de la détection et/ou quantification d'analyte(s) dans des échantillons liquides au cours d'une analyse biologique. La présente invention a notamment pour objet un dispositif et un procédé pour réaliser un immunodosage de type sandwich afin de détecter et/ou quantifier au moins un analyte dans un échantillon. En particulier, l'invention permet le contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) des partenaires de liaison de l'analyte, utilisés dans le cadre dudit immunodosage de type sandwich, afin d'éviter l'obtention de résultats faux-négatifs lorsque tout ou partie des partenaires de liaison utilisés sont défectueux.
Etat de la technique
Les immunodosages de type sandwich sont largement employés en bioanalyse afin de détecter et/ou quantifier un analyte donné. Ces immunodosages de type sandwich (ou plus simplement « immunodosages sandwich ») utilisent un premier partenaire de liaison, dit « partenaire de liaison de capture », généralement immobilisé sur une phase solide pour lier, de manière spécifique, l'analyte recherché, et un deuxième partenaire de liaison, dit « partenaire de liaison de détection », marqué et également destiné à se lier de manière spécifique avec l'analyte recherché, révélant ainsi la liaison entre le partenaire de liaison de capture et l'analyte, et donc la présence de l'analyte. En d'autres termes, l'analyte recherché se trouve pris « en sandwich » entre lesdits premier et deuxième partenaires de liaison, le premier partenaire de liaison (« de capture ») étant généralement présent en excès par rapport à l'analyte recherché. Le partenaire de liaison de capture peut, par exemple, être immobilisé sur un support solide (par liaison covalente, adsorption ou tout autre méthode appropriée) et la quantité doit généralement être telle que le nombre de sites de liaison présents sur le partenaire de liaison de capture soit supérieur au nombre de molécules d'antigènes présentes dans les solutions étalons ou inconnues. Le partenaire de liaison de détection marqué peut, par exemple, être ajouté, soit simultanément, soit après une première incubation et un lavage, et se fixe sur l'antigène, préalablement immobilisé au partenaire de liaison de capture. Un simple lavage permet de séparer les complexes partenaire de liaison de capture-analyte- partenaire de liaison de détection (marqué) des partenaires de liaison de détection marqués libres, présents en excès. Pour que le partenaire de liaison de détection marqué puisse se lier à l'analyte déjà engagé dans une réaction avec le partenaire de liaison de capture, il est nécessaire que les deux partenaires de liaison reconnaissent des zones différentes de l'analyte.
Le partenaire de liaison de détection marqué peut l'être, par exemple, par l'intermédiaire d'un isotope radioactif ou de manière enzymatique. En tout état de cause, dans les différents cas de marquage, le signal correspondant au complexe partenaire de liaison de capture- analyte-partenaire de liaison de détection marqué est un signal représentatif de la quantité d'analyte(s) présent(s) dans l'échantillon testé. Traditionnellement, dans les immunodosages de type sandwich, les partenaires de liaison de capture et de détection sont des anticorps reconnaissant des épitopes différents de l'analyte recherché, lequel, dans ce mode de réalisation, consiste en un antigène. Les anticorps utilisés au titre de partenaires de liaison de capture (« premier partenaire de liaison ») et de détection (« deuxième partenaire de liaison ») peuvent être, par exemple, des anticorps polyclonaux multivalents ou des anticorps monoclonaux spécifiques différents.
L'utilisation de deux partenaires de liaison (par exemple des anticorps, tels que des anticorps monoclonaux) possédant une spécificité de reconnaissance pour deux sites différents de l'analyte (par exemple deux épitopes distincts d'un antigène) confère une très bonne sensibilité à cette méthode. Ainsi, pour obtenir un « faux positif » correspondant à une molécule détectée et confondue avec l'analyte d'intérêt, cette molécule doit posséder les deux mêmes épitopes que l'analyte recherché. En choisissant bien lesdits épitopes, les interférences avec d'autres molécules présentant une forte homologie peuvent donc être réduites de manière extrêmement significative.
Les immunodosages de type sandwich, de par leur grande sensibilité, peuvent servir de base à différents types de tests. A titre illustratif, l'on peut citer, dans le cadre des immunodosages enzymatiques EIA (« Enzyme Immuno Assays »), le test ELISA (de l'anglais « Enzyme-Linked immunosorbent assay », littéralement « dosage d'immunoabsorption par enzyme liée ») sandwich. Dans les grandes lignes, ce test se déroule comme suit : a. une surface (par exemple une plaque, telle qu'une plaque « 96 puits ») est
recouverte avec une quantité d'anticorps dits « de capture » ;
b. l'échantillon susceptible de contenir l'antigène recherché est ajouté, de sorte que tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture ;
c. la plaque est lavée de façon à éliminer toutes les molécules autres que l'analyte non fixées ;
d. l'anticorps dit « de détection », conjugué directement ou non à une enzyme, est ajouté et se lie à l'antigène, formant ainsi un complexe anticorps de capture- antigène-anticorps de détection ;
e. la plaque est rincée de façon à séparer ce complexe des anticorps de détection marqués libres, présents en excès ;
f. le cas échéant le substrat enzymatique chromogène ou fluorogène (on parle alors de dosage « ELFA ») est ajouté ; ce dernier est converti par l'enzyme en une forme détectable (colorée ou fluorescente).
Le résultat de ce test « ELISA sandwich » peut être analysé à l'œil nu ou dans un spectrophotomètre spécialement conçu pour accepter directement les plaques (par exemple les plaques « 96 puits »).
Les immunodosages de type sandwich peuvent être mis en œuvre, de façon avantageuse, en utilisant la technologie « Magnotech » de la société Philips. Un test de ce type, à savoir utilisant la technologie « Magnotech », est décrit notamment dans la publication de Bruis et al. [1]. Cette technologie met en œuvre une cartouche réactionnelle, de préférence en matière plastique, comprenant une zone d'application d'un échantillon liquide et une ou plusieurs chambres réactionnelles comprenant les différents réactifs nécessaires au test, cette zone réactionnelle étant connectée à la zone d'application de l'échantillon par un canal permettant l'écoulement par capillarité de l'échantillon liquide de la zone d'application vers ladite zone réactionnelle. En substance, la zone réactionnelle comprend notamment des nanoparticules magnétiques (de l'ordre d'une centaine de nanomètres de diamètre, par exemple des particules superparamagnétiques) séchées et revêtues d'un anticorps d'intérêt capable de se lier spécifiquement à un premier épitope de l'analyte recherché. Par ailleurs, ladite zone réactionnelle comporte, au niveau d'une région que l'on peut qualifier de « région de détection », des anticorps capables de reconnaître spécifiquement un deuxième épitope de l'antigène recherché. De manière optimale, cette cartouche réactionnelle peut être disposée au sein d'un dispositif portatif comprenant deux électroaimants positionnés au-dessus et au-dessous de la cartouche réactionnelle. La lecture du résultat de l'immunodosage est effectuée après actuation magnétique, l'électroaimant supérieur servant d'aimant de lavage, tandis que l'électroaimant inférieur sert d'aimant de liaison. Une telle technologie est décrite notamment dans la demande de brevet WO2013/054230. Tel que décrit dans Bruis et al. [1] ou dans la demande de brevet WO2013/054230, la détection de la présence desdits complexes au niveau de la région de détection - et donc de l'antigène recherché - s'effectue par détection optique et, de manière plus spécifique, se base sur le principe de la réflexion interne totale frustrée (« frustrated total internai reflection » (f-TIR), en langue anglaise). Le principe de détection est le suivant : en l'absence de nanoparticules magnétiques au niveau de la région de détection, le faisceau lumineux incident est reflété avec une intensité maximale. Lorsque des nanoparticules sont présentes au niveau de la région de détection, une partie de la lumière incidente est reflétée et diffusée par ces nanoparticules, résultant en une diminution de l'intensité du faisceau lumineux réfléchi. Cette diminution de signal est proportionnelle au nombre de nanoparticules liées au niveau de la région de détection de la zone réactionnelle et, par conséquent, à la concentration en analyte recherché dans l'échantillon testé.
Cette technique permet également de quantifier l'analyte recherché en établissant une courbe de calibration à partir de la variation du signal optique en fonction de la concentration en nanoparticules magnétiques et donc indirectement de l'analyte.
Plusieurs applications du système « Magnotech » ont été décrites dans la littérature, par exemple, un test « au chevet du patient » (« point-of-care » (POC) en langue anglaise) d'une durée totale de cinq minutes pour détecter la protéine cardiaque, troponine I (cTnl) dans un échantillon de sang total d'un patient (cf. notamment Bruis et al. [1] et Dittmer et al. [2]). La troponine I cardiaque est un standard de référence dans le cadre du diagnostic de l'infarctus du myocarde sévère, comme décrit dans Morrow et al. [3]. Jarrige et al. [4] décrivent une application de la plateforme technologique « Magnotech » pour le dosage de l'hormone parathyroïdienne intraopérative (« Intraoperative parathyroid hormone » ou ioPTH, en langue anglaise) via l'établissement d'une courbe dose-réponse de l'hormone parathyroïdienne (PTH).
Toutefois, la problématique du contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) du partenaire de liaison immobilisé sur les nanoparticules magnétiques et/ou de celui immobilisé sur la région de détection de la zone réactionnelle n'est pas abordée dans le cadre des tests décrits ci-dessus, mettant en œuvre la plateforme « Magnotech ». L'absence de variation du signal mesuré est donc uniquement indicative de l'absence de l'analyte recherché, alors qu'elle pourrait être due à une défaillance d'un ou des deux partenaires de liaison susmentionnés. Dans ce dernier cas, puisque le résultat apparent du test serait négatif, l'utilisateur en conclurait donc, à tort, que l'analyte recherché n'est pas présent dans l'échantillon testé. Un résultat de ce type est dénommé « faux négatif » et peut s'avérer extrêmement préjudiciable eu égard à la santé du patient testé, en particulier si l'analyte recherché est un indicateur d'une pathologie grave, nécessitant un traitement d'urgence, comme cela est le cas avec la troponine I cardiaque.
Plus couramment, les immunodosages de type sandwich sont mis en œuvre dans le cadre de tests unitaires, par exemple dans les tests unitaires rapides, tels que les tests de dépistage rapide (TDR). Ces derniers se présentent généralement sous forme d'une « cassette », à l'instar des tests de grossesse, et sont d'une relative facilité d'utilisation. Ces tests se basent, en général, sur le principe de l'immuno-chromatographie ou de la filtration sur membrane : l'échantillon (par exemple sang total, sérum, urine) déposé sur le support va, par exemple, migrer par capillarité en entraînant avec lui des réactifs déjà présents puis va rencontrer des partenaires de liaison déposés sur la membrane lorsque l'échantillon est filtré par cette membrane. Ces tests unitaires rapides sont également dénommés « dosages à flux latéral » ou encore « tests à flux latéral » et ont été abondamment décrits dans la littérature (voir par exemple Yager et al. [5] ou encore Wild [6]). Ils sont couramment utilisés aux fins d'analyses cliniques, pharmaceutiques, alimentaires, et chimiques. Ainsi, les dispositifs de tests à flux latéral peuvent être employés pour déterminer la présence de nombreux types d'analytes, tels que des anticorps, des antigènes, des hormones, des protéines, des molécules chimiques, présents au sein d'échantillons liquides. En schématisant, dans le cadre d'un test à flux latéral, l'analyte à détecter, s'il est présent dans l'échantillon liquide déposé au niveau de la zone d'application, se lie à un partenaire de liaison de détection marqué, au niveau de la zone de marquage, les complexes ainsi formés migrant ensuite jusqu'à la zone réactionnelle où il sont immobilisés au niveau de la zone de capture par liaison avec un partenaire de liaison de capture. L'utilisateur peut constater la présence de l'analyte recherché par mise en évidence d'un signal détectable, déterminé en fonction du type de marqueur associé au partenaire de liaison de détection. Généralement, la présence de l'analyte d'intérêt dans l'échantillon est matérialisée sous la forme d'une ligne détectable, habituellement dénommée ligne test. La zone réactionnelle comprend généralement une région de contrôle de migration de l'échantillon qui va indiquer à l'utilisateur qu'au moins une partie de l'échantillon est bien passée au travers de la matrice, en amont de la région de contrôle et en particulier au niveau de la zone de capture. Ce peut être, par exemple, par la révélation d'une ligne de contrôle d'une couleur prédéterminée. L'on peut citer, à titre d'exemple, les demandes de brevet WO 2004/003559, WO 2006/092103, WO 2007/081330, US 2004/0161859.
La demande de brevet WO 2012/066235, au nom de la Demanderesse, divulgue un dispositif permettant de réaliser un test unitaire rapide, lequel dispositif intègre un contrôle positif. A cet effet, une région de contrôle est prévue au sein de ce dispositif, par exemple en aval de la zone de visualisation des résultats, ou parallèlement à cette dernière, laquelle région de contrôle comprend au moins un analogue de l'analyte recherché susceptible de se lier au partenaire de liaison de détection marqué. En d'autres termes, le test unitaire rapide objet de la demande WO 2012/066235 permet non seulement la détection de l'analyte recherché mais également de tester le caractère fonctionnel/opérationnel du partenaire de liaison de détection. Ainsi, si ce contrôle s'avère négatif, le résultat de ce test est considéré comme ininterprétable et le test doit être renouvelé. Bien que permettant d'obtenir des résultats satisfaisants, la Demanderesse a découvert que la sensibilité du dispositif et du procédé objet de WO 2012/066235, et au-delà des immunodosages de type sandwich d'une manière générale, pouvait être significativement améliorée.
En effet, la Demanderesse a découvert, contre toute attente, que la fonctionnalité (caractère fonctionnel/opérationnel) du partenaire de liaison de capture, généralement immobilisé/adsorbé sur une surface solide, pouvait être affectée en tout ou partie notamment par des facteurs externes, tels que la lumière, la température, etc. Dans le cadre d'un dispositif tel que celui décrit au sein de la demande WO 2012/066235 ou dans le cadre d'un immunodosage mis en œuvre via la plateforme « Magnotech » (cf. supra), ceci génère des « faux négatifs », dans la mesure où l'analyte, bien que présent dans l'échantillon testé, n'est pas détecté au niveau de la zone dite de « visualisation des résultats » mais que la région de contrôle permet de confirmer la fonctionnalité (caractère fonctionnel/opérationnel) de l'anticorps de détection, et par conséquent la fiabilité apparente du test, alors que le partenaire de capture est défaillant. L'utilisateur/l'opérateur en conclut donc, à tort, que l'analyte recherché n'est pas présent au sein de l'échantillon testé.
Exposé de l'invention
C'est pourquoi un objet de la présente invention concerne un dispositif permettant de détecter et/ou quantifier au moins un analyte dans un échantillon liquide au cours d'une analyse biologique mettant en œuvre au moins deux partenaires de liaison PI et P2 dudit analyte, le premier partenaire de liaison PI étant immobilisé au sein dudit dispositif et le deuxième partenaire de liaison P2 étant immobilisable par formation d'un complexe de type sandwich avec l'analyte et le premier partenaire de liaison PI, ledit dispositif comprenant au moins deux zones en communication de fluide, à savoir : a) une zone d'application de l'échantillon liquide, et
b) une zone réactionnelle pour la détection et/ou quantification dudit au moins un analyte, ledit dispositif comprenant au moins un premier analogue CTRL1 dudit analyte, ledit premier analogue CTRL1 étant immobilisable par liaison au premier partenaire de liaison PI immobilisé, et au moins un deuxième analogue CTRL2 de l'analyte, ledit deuxième analogue CTRL2 étant immobilisé au sein dudit dispositif de façon à se lier au deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et immobiliser ainsi ce dernier, ladite zone réactionnelle b) comprenant au moins les trois régions suivantes : b.l) une première région de détection et/ou quantification de l'analyte, par mise en évidence de la formation d'un complexe de type sandwich entre le premier partenaire de liaison PI, l'analyte et le deuxième partenaire de liaison P2, b.2) une deuxième région de contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) du premier partenaire de liaison PI, au niveau de laquelle est immobilisé le premier partenaire de liaison PI, la mise en évidence d'une liaison entre le premier partenaire de liaison PI et le premier analogue de l'analyte CTRL1 indiquant un contrôle positif du premier partenaire de liaison PI, et
b.3) une troisième région de contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) du deuxième partenaire de liaison P2, au niveau de laquelle est immobilisé le deuxième analogue de l'analyte CTRL2, la mise en évidence d'une liaison entre le deuxième partenaire de liaison P2 et le deuxième analogue de l'analyte CTRL2 indiquant un contrôle positif du deuxième partenaire de liaison P2.
Selon un mode de réalisation particulier, le dispositif selon l'invention comprend une zone de migration de l'échantillon liquide c), permettant la migration de l'échantillon liquide de la zone d'application de l'échantillon liquide a) vers la zone réactionnelle b). La présence de cette zone de migration de l'échantillon liquide c) est particulièrement souhaitable lorsque le dispositif selon l'invention est adapté pour être utilisé dans un test unitaire rapide. De préférence, la zone de migration de l'échantillon liquide c) comprend une matrice.
De préférence, les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 consistent en des anticorps et les premier et deuxième analogues de l'analyte CRTLl et CRTL2 comprennent au moins les épitopes reconnus respectivement par les premier et deuxième anticorps PI et P2. Avantageusement, les premier et deuxième analogues de l'analyte CRTLl et CRTL2 sont des peptides contenant au moins les épitopes reconnus respectivement par les premier et deuxième anticorps PI et P2.
Avantageusement, le deuxième partenaire de liaison P2 et le premier analogue de l'analyte CTRL1 sont initialement déposés - avantageusement déposés et séchés - dans le dispositif et sont adaptés pour être remis en suspension en présence de l'échantillon liquide. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la zone réactionnelle b) du dispositif selon l'invention comprend au moins deux parties distinctes, par exemple deux chambres réactionnelles distinctes, sans communication directe de fluide entre les deux parties, la première partie comprenant la première région b.l) et la deuxième partie comprenant les deuxième et troisième régions b.2) et b.3). Avantageusement, la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et la deuxième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI et le deuxième analogue de l'analyte CRTL2 immobilisés, le premier analogue de l'analyte CTRL1 et le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisables.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, la zone réactionnelle b) du dispositif selon l'invention comprend au moins deux parties distinctes, par exemple deux chambres réactionnelles distinctes, sans communication directe de fluide entre les deux parties, la première partie comprenant les première et troisième régions b.l) et b.3) et la deuxième partie comprenant la deuxième région b.2). Avantageusement, la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI et le deuxième analogue de l'analyte CRTL2 immobilisés, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et la deuxième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé le premier analogue de l'analyte CTRL1 immobilisable, de préférence le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable étant présent en excès dans ladite première partie.
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, la zone réactionnelle b) du dispositif selon l'invention comprend au moins trois parties distinctes, par exemple trois chambres réactionnelles, sans communication de fluide entre les trois parties distinctes, la première partie comprenant la région b.l), la deuxième partie comprenant la région b.2) et la troisième partie comprenant la région b.3). Avantageusement, la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable, la deuxième partie comprend, outre le deuxième analogue de l'analyte CTRL2 immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable, et la troisième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le premier analogue de l'analyte CTRL1 immobilisable.
Lorsque la zone réactionnelle b) comprend plusieurs parties, comme cela est le cas concernant les premier, deuxième et troisième modes de réalisation susvisés, ces parties sont positionnées en parallèle ou en série sur le chemin de l'échantillon liquide, de préférence en parallèle. Selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, la zone réactionnelle b) du dispositif selon l'invention comprend au moins une partie, par exemple une chambre réactionnelle, ladite partie comprenant :
les trois régions b.l), b.2) et b.3),
- le deuxième partenaire de liaison P2 et le premier analogue de l'analyte CTRLl immobilisables,
les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 étant présents en excès, et dans lequel :
le premier analogue de l'analyte CTRLl est associé, directement ou indirectement, à un marqueur Ml permettant de mettre en évidence la liaison dudit premier analogue de l'analyte CTRLl avec le premier partenaire de liaison PI au niveau des régions b.l) et b.2), et/ou
le deuxième partenaire de liaison P2 étant associé, directement ou indirectement, à un marqueur M2, différent du marqueur Ml, permettant de mettre en évidence la formation du complexe de type sandwich entre le deuxième partenaire de liaison P2, l'analyte et le premier partenaire de liaison PI au niveau des régions b.l) et b.2),
de façon à distinguer la liaison dudit premier analogue de l'analyte CTRLl avec le premier partenaire de liaison PI de la formation du complexe de type sandwich entre le deuxième partenaire de liaison P2, l'analyte et le premier partenaire de liaison PI, au niveau desdites régions b.l) et b.2).
De préférence, et quel que soit le mode de réalisation de l'invention considéré, la zone d'application de l'échantillon liquide a) comprend un filtre. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection et/ou quantification d'au moins un analyte dans un échantillon liquide au cours d'une analyse biologique mettant en œuvre au moins deux partenaires de liaison de l'analyte PI et P2, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
(i) mettre en contact l'échantillon liquide avec un dispositif tel que défini supra,
(ii) interpréter le résultat obtenu à partir dudit dispositif lorsque le contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) du partenaire de liaison PI et le contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel) du partenaire de liaison P2 sont positifs, respectivement au niveau des régions b.2) et b.3),
(iii) dans le cas contraire considérer le résultat obtenu comme ininterprétable. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins deux analogues d'un analyte CTRL1 et CTRL2 pour le contrôle biologique (contrôle du caractère fonctionnel/opérationnel), respectivement, d'au moins deux partenaires de liaison PI et P2, lesdits partenaires de liaison PI et P2 permettant de détecter et/ou quantifier ledit analyte par la mise en évidence de la formation d'un complexe de type sandwich entre le deuxième partenaire de liaison P2, l'analyte et le premier partenaire de liaison Pl.
Par « détecter... au moins un analyte », l'on entend déceler la présence de l'analyte recherché au sein de l'échantillon liquide d'intérêt.
Par « quantifier au moins un analyte », l'on entend le fait de déterminer la quantité (par exemple la concentration) / doser l'analyte recherché au sein dudit échantillon liquide. Par « échantillon », l'on entend une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité aux fins d'analyse. Ce peut être un échantillon d'origine clinique, humain ou animal, issu d'un prélèvement de fluide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliments, ou un échantillon de l'environnement de production ou de transformation d'aliments. Tel qu'indiqué précédemment, cet échantillon est liquide.
A titre d'échantillon d'origine clinique, l'on entend un échantillon prélevé chez un patient ou individu (humain ou animal), et susceptible de contenir un analyte tel que défini ci-dessous. Cet échantillon peut être notamment un échantillon biologique liquide tel qu'un échantillon de sang, sérum, plasma, salive, urine, liquide céphalo-rachidien, liquide pleural, liquide péritonéal (liste non exhaustive).
A titre d'échantillon d'origine alimentaire, l'on peut citer, par exemple, un échantillon alimentaire d'eau, de boisson telle que le lait ou le jus de fruits, de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromages, de poissons, etc. Cet échantillon d'origine alimentaire peut également être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment un échantillon issu de farines animales. A titre d'échantillon d'origine environnementale, l'on peut citer, à titre illustratif, un échantillon pour contrôle de surface ou d'eau ou encore prélevé à partir d'effluents, les boues, les sols, les végétaux etc. L'échantillon prélevé peut être utilisé tel quel, ou préalablement à l'analyse biologique, subir une préparation de type enrichissement, dilution, extraction, concentration, purification, selon les méthodes connues de l'homme du métier.
Par échantillon « liquide », il convient de comprendre les échantillons directement prélevés sous forme liquide mais également les échantillons semi- solides ou solides dans la mesure où ils peuvent être transformés en échantillon liquide par toute méthode appropriée connue de l'homme du métier. Bien entendu, quand l'échantillon est solide ou semi-solide, il doit être prétraité pour être transformé en échantillon liquide. L'on dispose de cet échantillon par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier.
Le terme "analyte " doit être compris, au sens large, comme désignant une substance chimique, biologique ou biochimique qui fait l'objet d'une ou plusieurs analyse(s). A titre d'exemple d'analytes, l'on peut citer un antigène, un anticorps, une hormone, une protéine ou une molécule chimique (liste non exhaustive).
Comme cela est connu de l'homme du métier, la nature de l'analyte recherché va dicter la nature des partenaires de liaison à utiliser. Par exemple, lorsque l'analyte recherché est une protéine ou un antigène, il peut être détecté et/ou quantifié par des partenaires de liaison tels que des récepteurs, anticorps, fragments d'anticorps, analogue d'anticorps et tout autre ligand capable de se lier à une protéine ou à un antigène. Par " analogues d'anticorps ", l'on entend des composés biologiques et/ou chimiques qui possèdent les mêmes capacités de liaison que les anticorps ou fragments d'anticorps ou des capacités de liaison similaires. En particulier, les analogues d'anticorps incluent de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme ou d'un échantillon biologique. Les champs d'applications de ces analogues d'anticorps sont pratiquement aussi vastes que ceux des anticorps. A titre d'exemple, on peut citer les Nanofitines™, petites protéines commercialisées par la société Affilogic. Par « analogue de l'analyte », l'on entend une espèce chimique, biologique ou biochimique qui présente des propriétés physicochimiques et biologiques (par exemple en termes d'affinité pour un ligand donné) voisines de celles de l'analyte. De préférence, l'analogue de l'analyte est une protéine, telle qu'un anticorps, un mélange de protéines (par exemple un mélange d'anticorps), un polypeptide, un mélange de polypeptides, un peptide, un mélange de peptides, un fragment d'anticorps, un mélange de fragments d'anticorps, un analogue d'anticorps, un mélange d'analogues d'anticorps, ou leurs associations. Généralement, lorsque le partenaire de liaison est un anticorps, un fragment d'anticorps ou un analogue d'anticorps, l'analyte est une protéine, un polypeptide ou un peptide, et l'analogue de l'analyte est également une protéine, un polypeptide ou un peptide.
L'expression « parties... sans communication directe de fluide » doit être comprise, au sens de la présente demande, comme désignant des parties (par exemples des chambres réactionnelles) adaptées pour recevoir un fluide, en l'espèce un liquide, lesdites parties étant en outre adaptées pour que, une fois ce liquide reçu, ce dernier ne puisse pas communiquer librement entre lesdites parties (par exemple entre lesdites chambres réactionnelles). L'absence de communication directe de fluide peut être assurée, par exemple, par le cloisonnement des parties (par exemple des chambres réactionnelles) au moyen de cloison(s) étanche(s) et, plus généralement, de toute solution technique connue de l'homme du métier.
Grâce au contrôle biologique de la fonctionnalité (caractère fonctionnel/opérationnel) des premier et deuxième partenaires de liaison, le dispositif selon l'invention possède une très bonne sensibilité, à savoir que la probabilité d'obtenir un résultat « faux négatif » est extrêmement faible voire quasi-nulle ou nulle. Par sensibilité, l'on entend la capacité à donner un résultat positif lorsque l'analyte recherché est présent dans l'échantillon liquide testé.
L'analyse biologique mise en œuvre grâce au dispositif selon l'invention couvre tout immunodosage mettant en œuvre au moins deux partenaires de liaison tel qu'un immunodosage de type sandwich (également dénommé dosage immunologique de type sandwich). Bien entendu, le préfixe « immuno » dans le terme « immunodosage », par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est nécessairement un partenaire d'origine immunologique, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps. En effet, comme cela est bien connu de l'homme du métier, ce terme est plus largement utilisé pour désigner des tests et procédés dans lesquels le partenaire de liaison n'est pas un partenaire d'origine/de nature immunologique mais consiste, par exemple, en un récepteur de l'analyte que l'on souhaite détecter et/ou quantifier. La condition étant que le partenaire de liaison concerné soit capable de se lier à l'analyte recherché, de préférence de manière spécifique. Ainsi, il est connu de parler du dosage ELISA pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques stricto sensu, appelés plus largement en anglais « ligand binding assay », que l'on pourrait traduire en langue française par « dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'intitulé in extenso correspondant à l'acronyme ELISA. Dans un souci de clarté et d'uniformité, le terme « immuno » est employé dans la présente demande pour désigner toute analyse biologique utilisant au moins un partenaire de liaison adapté pour se lier à l'analyte recherché et détecter et/ou quantifier ce dernier, de préférence de manière spécifique, même quand ledit partenaire de liaison n'est pas de nature ou d'origine immunologique au sens strict.
Le premier partenaire de liaison PI et le deuxième partenaire de liaison P2 sont choisis, par exemple, dans le groupe consistant en anticorps, mélange d'anticorps, fragment d'anticorps, mélange de fragments d'anticorps, analogue d'anticorps, mélange d'analogues d'anticorps, antigène, mélange d'antigènes, protéine, mélange de protéines, polypeptide, mélange de polypeptides, peptide, mélange de peptides.
De préférence, le premier partenaire de liaison PI est un « partenaire de liaison de capture », dans la mesure où il est immobilisé, directement ou indirectement, sur une surface solide. Le deuxième partenaire de liaison P2 est, de préférence, un « partenaire de liaison de détection » et est associé - directement ou indirectement - à un élément de détection permettant de mettre en évidence la présence de ce deuxième partenaire de liaison P2 et, surtout, de tout/tous élément(s) (analyte(s), réactif(s), etc.) lié(s) à celui-ci. Cet élément de détection peut être un réactif marqueur mais, plus largement, tout élément permettant de mettre en évidence la présence de ce deuxième partenaire de liaison P2 et, surtout, de tout/tous élément(s) (analyte(s), réactif(s), etc.) lié(s) à celui-ci. A titre illustratif, dans le cadre de la plateforme « Magnotech » susvisée, la nanoparticule associée au partenaire de liaison de détection (anticorps de détection dans le présent cas d'espèce) joue le rôle d'élément de détection, dans la mesure où l'atténuation du faisceau lumineux réfléchi due à cette nanoparticule est révélatrice de la présence de l'anticorps de détection au niveau de la région de détection et, par conséquent, de la formation d'un complexe de type sandwich entre l'anticorps de détection, l'analyte recherché et l'anticorps de capture.
Selon un mode de réalisation particulier, l'élément de détection est un réactif marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. A titre purement illustratif (et non limitatif), ces réactifs marqueurs peuvent consister en :
les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I, - les particules métalliques ou d'alliages, telles que des particules d'or colloïdal,
les particules de polymère, telles que les particules de latex colorées.
Des systèmes indirects de détection peuvent également être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, molécule/récepteur. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte le partenaire de liaison. L'anti-ligand peut être détectable directement par les réactifs marqueurs susvisés ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra notamment se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou encore WO-A-95/08000 au nom de la Demanderesse.
La mise en évidence de la formation du complexe de type sandwich entre le premier partenaire de liaison PI et le deuxième partenaire de liaison P2 peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par visualisation directe d'une réaction due au réactif marqueur associé au deuxième partenaire de liaison P2 ou encore par le biais d'un moyen de détection, par exemple de type optique, comme cela est le cas dans le cadre du protocole opératoire « Magnotech ».
Avantageusement, au moins un des premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 - de préférence les deux - sont de nature et/ou d'origine immunologique. De préférence, au moins un desdits partenaires de liaison PI et P2 - de préférence les deux - sont des anticorps. Par « anticorps », l'on entend un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal, un anticorps humanisé, un anticorps humain ou un fragment desdits anticorps, en particulier les fragments Fab, Fab', F(ab')2, ScFv, Fv, Fd. La condition requise est que lesdits anticorps doivent être spécifiques de l'analyte recherché, c'est à dire que, dans la mesure du possible, ils ne présentent pas de réactions croisées avec d'autres analytes ; les anticorps présentant les affinités les plus élevées et les constantes de dissociation les plus faibles étant les anticorps préférés aux fins de la présente invention.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec l'immunogène approprié, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est immobilisé un analyte (antigène) spécifiquement reconnu par les anticorps.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-dessous.
Dans un premier temps, l'on immunise un animal, généralement une souris avec l'immunogène approprié, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre cet antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (généralement murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, l'on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène recherché pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert (Western blot) en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés sont, par la suite, purifiés par exemple par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux peuvent également être des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Dans le mode de réalisation selon lequel les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 sont des anticorps, l'analyte recherché est dénommé « antigène », et les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 (anticorps) reconnaissent deux épitopes distincts - respectivement dénommés El et E2 - de cet antigène.
Lorsque PI et P2 sont des anticorps, PI est, de préférence, un « anticorps de capture », dans la mesure où il est immobilisé, directement ou indirectement, sur une surface solide. L'anticorps P2 est, de préférence, un « anticorps de détection » et est associé -directement ou indirectement - à un élément de détection permettant de mettre en évidence la présence de ce deuxième anticorps P2 et, surtout, de tout/tous élément(s) (analyte(s), réactif(s), etc.) lié(s) à celui-ci. Cet élément de détection est tel que défini supra. L'expression « partenaire de liaison ... immobilisé » signifie que le partenaire de liaison est fixé de façon directe ou indirecte au sein du dispositif par toute méthode connue de l'homme du métier telle que par adsorption ou liaison covalente.
L'expression « peptide contenant un épitope reconnu par un anticorps » fait référence à tout enchaînement d'acides aminés comprenant au moins l'épitope reconnu par le partenaire de liaison concerné. Le peptide peut être limité à l'épitope lui-même, ou comprendre quelques acides aminés supplémentaires, jusqu'à arriver à la protéine, dans la mesure où le peptide conserve l'activité de reconnaissance par le partenaire de liaison concerné. Le peptide peut également contenir un ou plusieurs acides aminés mutés, dans la mesure où, là encore, le peptide conserve l'activité de reconnaissance par le partenaire de liaison concerné. Dans le cadre d'un couple partenaire de capture (également dénommé partenaire de liaison de capture) et partenaire de détection (également dénommé partenaire de liaison de détection), il peut être préférable que le contrôle du partenaire de capture ne contienne pas l'épitope du contrôle du partenaire de détection et vice versa. Néanmoins dans le cas de l'utilisation de plusieurs partenaires pour la même fonction (par exemple deux partenaires de capture), le peptide peut comprendre l'épitope El du premier partenaire de capture et l'épitope E2 de l'autre partenaire de capture. Le terme « matrice » fait référence à tout type de matériau capable d'assurer le flux et le transfert d'un liquide. Le transfert du liquide peut être assuré par force de capillarité. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le dispositif selon l'invention est un dispositif permettant la mise en œuvre d'un dosage à flux latéral. La matrice peut être, par exemple, en au moins un matériau bibuleux. Les matériaux bibuleux sont des matériaux qui absorbent facilement un liquide et au travers desquels le liquide est transporté par capillarité. A titre de matériau bibuleux, l'on peut citer, par exemple, la nitrocellulose, le polyester, les fibres de verre etc.
Brève description des dessins
L'invention, sa fonctionnalité, ses applications ainsi que ses avantages seront mieux appréhendés à la lecture de la présente description, faite en référence aux figures suivantes, dans lesquelles : - la figure 1 est une représentation schématique du concept sous-tendant la présente invention ;
- la figure 2 est une vue de dessus d'une cartouche réactionnelle utilisable dans un dispositif d'immunodosage opto-magnétique de type « Magnotech » ;
- les figures 3A, 3B, 3C et 3D illustrent le fonctionnement d'une plateforme technologique d'immunodosage opto-magnétique telle que la plateforme « Magnotech » ;
- la figure 4 est une vue de dessus d'un dispositif selon un premier mode de réalisation d'un premier aspect de l'invention ;
- la figure 5 illustre, de manière schématique, une première configuration de ce premier mode de réalisation de l'invention ; - la figure 6 représente, de manière schématique, une deuxième configuration de ce premier mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 7 est une vue de dessus d'un dispositif selon un deuxième mode de réalisation d'un premier aspect de l'invention ;
- la figure 8 représente, de manière schématique, le dispositif selon ce deuxième mode de réalisation ;
- la figure 9 représente, de manière schématique, un troisième mode de réalisation d'un premier aspect de l'invention ;
- les figures 10A, 10B, 10C et 10D représentent des vues de dessus d'un test à flux latéral tel que décrit dans la demande WO 2012/066235, au nom de la Demanderesse ;
- les figures 11A, 11B, 11C, 11D, 11E et 11F représentent, de manière schématique, des vues de dessus d'un dispositif selon un deuxième aspect de l'invention, adapté à la mise en œuvre d'un dosage à flux unilatéral ;
- la figure 12 est une représentation schématique du contrôle biologique du partenaire de liaison P2 dans le cadre de la détection de la troponine I (Tnl)à titre d'analyte, PI et P2 étant des anticorps monoclonaux anti-Tnl, respectivement 19C7 et 560, et CTRL2 contenant un peptide épitopique de P2 ;
- la figure 13 est une représentation schématique d'une cartouche Magnotech possédant deux chambres réactionnelles, dans laquelle le partenaire de liaison P2 est contrôlé biologiquement, la chambre 1 étant revêtue de deux spots, chacun pour la détection de la Troponine I (spot PI sur lequel est immobilisé l'anticorps monoclonal anti-Troponine I 19C7 (partenaire de liaison PI)), et la chambre 2 étant revêtue de trois spots, l'un des spots étant pour la détection de la Troponine I (spot PI, identique aux spots PI de la chambre 1) et les deux autres (spot CTRL2-1 et spot CTRL2-2) étant pour le contrôle biologique des anticorps de détection anti-Troponine I (anticorps monoclonal 560, partenaire de liaison P2) en utilisant un contrôle CTRL2 (protéine couplée au peptide épitopique de P2);
- la figure 14 donne les résultats de signal obtenu dans les chambres 1 et 2 de la cartouche Magnotech selon la figure 13 avec trois échantillons différents, à savoir un échantillon négatif en Tnl, et deux échantillons positifs en Tnl, ayant deux concentrations différentes de Tnl ;
- la figure 15 est une représentation schématique du contrôle biologique de l'anticorps monoclonal anti-Troponine 1 19C7 (partenaire de liaison PI), en utilisant un contrôle CTRL1 (protéine couplée au peptide épitopique de PI et à une particule magnétique), dans le cadre d'une technologie Magnotech utilisée pour la détection de la troponine I à titre d'analyte ; et - la figure 16 donne les résultats de signal obtenu dans une chambre présentant un contrôle biologique du partenaire de liaison PI selon la figure 15, avec deux échantillons différents, à savoir un échantillon négatif en Tnl, et un échantillon positif en Tnl. Description détaillée de l'invention
Tel qu'indiqué supra, la figure 1 vise à illustrer le concept sous-tendant la présente invention. Ledit concept a trait à l'augmentation de la sensibilité de détection dans le cadre de tout type d'immunodosage de type sandwich, au travers de la diminution significative - voire de la suppression - de l'obtention de résultats faux négatifs. A cet effet, l'on utilise un premier partenaire de liaison PI, en l'espèce l'anticorps 10, immobilisé au sein du dispositif selon l'invention. Cet anticorps 10 est utilisé comme anticorps de capture.
Est également requis un deuxième partenaire de liaison P2, en l'espèce l'anticorps 11, immobilisable par formation d'un complexe de type sandwich avec l'analyte 12 et l'anticorps de capture 10. L'anticorps 11 est, quant à lui, dénommé « anticorps de détection ». Cet anticorps de détection 11 est associé, directement ou indirectement, avec un élément de détection 111 permettant de détecter la formation du « sandwich » entre l'anticorps de capture 10, l'analyte 12 et l'anticorps de détection 11 ; la formation dudit sandwich révélant la présence de l'analyte 12 recherché au sein de l'échantillon testé (non numéroté sur la figure 1). Bien évidemment, le type d'élément de détection 111 utilisé dépend du moyen de détection employé. Par exemple, si l'on détecte une réaction fluorescente ou colorée, l'élément de détection 111 va consister, respectivement, en un élément fluorogène ou chromogène (à savoir permettant l'obtention d'une réaction fluorescente ou d'une réaction colorée), tel qu'une enzyme en présence d'un substrat. Si, tel qu'indiqué précédemment, l'immunodosage de type sandwich est mis en œuvre via une plateforme technologique opto-magnétique telle que la plateforme « Magnotech », l'élément de détection 111 pourra simplement être constitué par une particule/bille magnétique. En effet, cette particule magnétique va influer sur l'intensité du signal lumineux réfléchi au niveau de la région de détection et, ainsi, va donner une indication sur la formation du « sandwich », révélant ainsi la présence/quantification ou l'absence de l'analyte 12 recherché. Afin d'augmenter la sensibilité de détection, le concept inventif à la base de la présente invention requiert l'emploi de deux contrôles positifs :
(i) un premier contrôle positif 13 permettant de tester non seulement la présence mais surtout le caractère fonctionnel de l'anticorps de capture 10. Ce contrôle positif 13 comprend un épitope 131 (par exemple de nature peptidique) reconnu de manière spécifique par l'anticorps de capture 10 et d'un élément de détection 132, identique ou différent de l'élément de détection 111 ;
(ii) un deuxième contrôle positif 14 permettant de tester non seulement la présence mais surtout le caractère fonctionnel de l'anticorps de détection 11, ledit contrôle 14 comprenant un épitope 141 (par exemple de nature peptidique) spécifiquement reconnu par l'anticorps de détection 11.
Selon un mode de réalisation particulier, les épitopes 131 et 141 peuvent être identiques, et donc les anticorps 10 et 11 aussi, par exemple lorsque l'analyte possède plusieurs épitopes identiques. De préférence, les épitopes 131 et 141 sont différents lorsque l'analyte ne possède que des épitopes différents, comme cela est le cas, par exemple, pour la Troponine I.
En présence de l'analyte recherché au sein de l'échantillon testé, l'opérateur va détecter
(visuellement ou par l'intermédiaire d'un moyen de détection) :
un signal révélateur de la formation d'un complexe de type sandwich entre l'anticorps de capture 10, l'analyte 12 et l'anticorps de détection 11, au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 15,
un signal révélateur de la formation d'un complexe entre l'anticorps de capture 10 et le contrôle biologique 13, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 16, et
un signal révélateur de la formation d'un complexe entre l'anticorps de détection 11 et le contrôle biologique 14, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 17.
En revanche, si l'échantillon testé ne contient pas l'analyte recherché mais que le test est fonctionnel (à savoir que chacun des anticorps de capture 10 et de détection 11 est opérationnel), seront observés :
une absence de signal au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 15, un signal révélateur de la formation d'un complexe entre l'anticorps de capture 10 et le contrôle biologique 13, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 16,
un signal révélateur de la formation d'un complexe entre l'anticorps de détection 11 et le contrôle biologique 14, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 17.
Lorsque l'on obtient une absence de signal au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 15 et que l'on observe également une absence de signal au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 16 et/ou au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 17, le résultat du test doit être considéré comme ininterprétable. En l'absence de contrôle biologique de l'anticorps de capture 10, au niveau de la région de contrôle biologique 16, le résultat du test aurait été considéré à tort comme négatif, alors que l'analyte d'intérêt se trouvait bel et bien contenu dans l'échantillon testé.
En outre, l'on peut aisément constater sur la figure 1 que le dispositif selon l'invention permet clairement d'identifier le ou les partenaire(s) de liaison (en l'espèce l'anticorps de capture 10 et/ou l'anticorps de détection 11) défectueux. Cela représente notamment un intérêt lors de la production de kits comprenant un support (plaque, cartouche réactionnelle, etc.) sur lequel sont immobilisés (par exemple par adsorption) des partenaires de liaison de capture et une solution comprenant les anticorps de détection. En effet, si en utilisant le concept selon la présente invention, il s'avère que le caractère fonctionnel de l'anticorps de capture 10 est altéré, le support sera considéré comme inutilisable et devra donc être détruit.
Un exemple de cartouche réactionnelle 2 utilisée dans un dispositif d'immunodosage opto- magnétique de type « Magnotech » est présenté en figure 2. Cette cartouche réactionnelle 2 comprend une entrée 21 destinée à recevoir l'échantillon liquide à tester, un canal 22 permettant l'écoulement (par exemple naturel ou par capillarité) de l'échantillon à tester vers la zone réactionnelle 23 comprenant, dans l'exemple représenté sur la figure 2, une seule chambre réactionnelle 231.
Tel qu'indiqué au fil de la présente demande, le dispositif selon l'invention est utilisable pour différents types d'immunodosage, et en particulier dans un immunodosage opto- magnétique utilisant la plateforme « Magnotech » développée par la société Philips (Eindhoven, Pays-Bas), dont le principe est rappelé ci-après en référence aux figures 3A-3D.
Dans la chambre réactionnelle 231 de la cartouche réactionnelle représentée sur la figure 2, les anticorps de capture et de détection sont maintenus sous forme sèche. Lors de la première étape, représentée en figure 3A, les particules magnétiques 33, revêtues des anticorps de détection 31 sont remises en suspension en présence de l'échantillon liquide préalablement introduit au niveau de l'entrée 21 de la cartouche réactionnelle 2 représentée en figure 2.
Ensuite, lors d'une deuxième étape, représentée sur la figure 3B, l'électroaimant inférieur 35 est activé afin d'attirer les particules magnétiques 33 vers la région de détection 36 sur laquelle sont immobilisés (par exemple par liaison covalente ou adsorption) des anticorps de capture 30, permettant ainsi, lorsque l'analyte 32 recherché est présent, la formation d'un complexe de type sandwich entre l'anticorps de capture 30, l'analyte 32 et l'anticorps de détection 31, porté par une particule magnétique 33.
Enfin, lors de la troisième étape, représentée en figure 3C, l'électroaimant inférieur 35 est désactivé et l'électroaimant supérieur 34 est activé afin d'induire le retrait des particules magnétiques 33 non liées au niveau de la région de détection 36 - et de conserver ainsi uniquement, au niveau de ladite région de détection 36, les particules magnétiques 33 dont au moins un anticorps de détection 31 est lié à au moins un anticorps de capture 30 par l'intermédiaire d'au moins un analyte 32 recherché (formation d'un complexe de type sandwich entre les trois entités précitées), si l'analyte d'intérêt est présent dans l'échantillon testé.
A la lumière de ce qui précède, l'électroaimant inférieur 35 peut être considéré comme un électroaimant « de liaison », alors que l'électroaimant supérieur 34 peut être considéré comme un électroaimant « de lavage ».
Après éventuellement plusieurs étapes 2 et 3, représentées en figure 3C, l'on détecte les particules/billes magnétiques présentes au niveau de la région de détection 36 en utilisant, en tant que moyen de détection 37, un capteur photographique 2 dimensions (« 2D », tel qu'un capteur CCD), l'élément de détection étant constitué par la particule magnétique 33. En substance, l'étape de détection, représentée en figure 3D, se base sur le principe de la réflexion interne total frustée (« frustrated total internai reflection » (f-TIR), en langue anglaise), tel que décrit, par exemple, dans Bruis et al. [1] ou dans la demande de brevet WO2013/054230. Dans les grandes lignes, le principe de détection est le suivant : un faisceau lumineux incident 38 est émis (par exemple par une source lumineuse 39 de type LED) en direction de la région de détection 36 avec un angle incident supérieur à l'angle critique (dépendant du matériau constituant la cartouche réactionnelle) de façon à ce que l'intégralité du faisceau lumineux incident 38 soit réfléchi en un faisceau lumineux réfléchi 40 - dénommé dans ce cas « faisceau évanescent » - en direction du moyen de détection 37.
Tel qu'indiqué précédemment, et en résumé, le principe de détection se base sur le postulat suivant : l'intensité du faisceau lumineux réfléchi 40 est inversement proportionnelle à la quantité de particules magnétiques 33 présentes au niveau de la région de détection 36. En d'autres termes, la diminution de l'intensité du faisceau lumineux réfléchi 40 observée au niveau du moyen de détection 37 est proportionnelle au nombre de particules magnétiques 33 liées au niveau de la surface de détection 36, et par conséquent, à la concentration en analyte 32 présent dans l'échantillon testé. Selon un premier aspect de l'invention, le dispositif selon l'invention est adapté pour être mis en œuvre dans un immunodosage opto-magnétique de type « Magnotech ».
Un dispositif selon un premier mode de réalisation du premier aspect de l'invention est représenté en figure 4 (vue de dessus). Ce dispositif est une cartouche réactionnelle semblable à celle représentée en figure 2. Elle comprend une entrée 41, un canal 42 et une zone réactionnelle 43, à ceci près que la zone réactionnelle comprend deux chambres réactionnelles 431 et 432, lesquelles ne sont pas directement en communication de fluide.
La figure 5 illustre, de façon schématique, une première configuration de ce premier mode de réalisation lors de la première étape du protocole opératoire « Magnotech », tel que représentée sur la figure 3A.
La première chambre réactionnelle 431 comprend une région de détection et/ou de quantification de l'analyte 56 au niveau de laquelle se trouve immobilisé l'anticorps de capture 50. La formation d'un complexe de type sandwich entre l'anticorps de détection 51 (associé à la particule magnétique 53), l'analyte 52 et l'anticorps de capture 50 sera mise en évidence au niveau de ladite région de détection 56 par une atténuation du signal lumineux réfléchi 40 au niveau du moyen de détection 37, tel que schématisé sur la figure 3D.
Selon cette première configuration, la deuxième chambre réactionnelle 432 comprend une région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 50, au niveau de laquelle, si l'anticorps de capture 50 est fonctionnel, l'on détecte la formation d'un complexe entre l'épitope 551 du contrôle biologique 55 (associé à la particule magnétique 53) et l'anticorps de capture 50. Tel que décrit précédemment, la détection, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 57, s'effectue par une atténuation du faisceau lumineux 40 au niveau du moyen de détection 37, tel que schématisé sur la figure 3D.
Cette deuxième chambre réactionnelle 432 comprend également une région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 58, au niveau de laquelle, si ledit anticorps de détection 51 est opérationnel, un complexe va se former entre ledit anticorps de détection 51 (lié à la particule magnétique 53) et l'épitope 541 du contrôle biologique 54. Là encore, la présence de ce complexe est mise en évidence, au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 58, via une atténuation du faisceau lumineux réfléchi 40 au niveau du moyen de détection 37, tel que schématisé en figure 3D.
La figure 6 représente une deuxième configuration du premier mode de réalisation selon un premier aspect de l'invention. Tout comme la première configuration représentée en figure 5, celle montrée en figure 6 comprend deux chambres réactionnelles 431 et 432. Toutefois, d'après la configuration représentée en figure 6, la chambre réactionnelle 431 comprend à la fois la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 56 et la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 58. La chambre réactionnelle 432 comprend, quant à elle, la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 57. Ainsi, en disposant la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 57 dans une chambre réactionnelle distincte de la chambre 431, comprenant la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 56 et la région de contrôle biologique de l'anticorps 58, l'on évite un phénomène de compétition entre l'analyte 52 et le contrôle biologique 55 eu égard à la liaison à l'anticorps de capture 50 au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 56.
Dans la deuxième configuration schématisée en figure 6, il est important, voire essentiel, que l'anticorps de détection 51 soit présent en excès par rapport au nombre de sites de liaison constitués par l'analyte 52 et l'épitope 541 du contrôle biologique 54, afin d'éviter un phénomène de compétition eu égard à la liaison dudit anticorps de détection 51 à l'analyte 52 ou au contrôle biologique 54. La figure 7 est une vue de dessus d'un dispositif selon un deuxième mode de réalisation du premier aspect de l'invention. Plus précisément, cette figure 7 représente un dispositif selon l'invention, sous la forme d'une cartouche réactionnelle, utilisable dans un dispositif opto- magnétique de type « Magnotech ». Cette cartouche réactionnelle est similaire à celle représentée en figure 4, à ceci près que la zone réactionnelle 73 ne comprend pas deux chambres réactionnelles distinctes mais bien trois chambres réactionnelles distinctes 731, 732 et 733, lesquelles ne sont pas en communication directe de fluide.
Ces trois chambres réactionnelles 731, 732 et 733 sont représentées, de manière schématique, sur la figure 8.
La première chambre réactionnelle 731 comprend la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 86, au niveau de laquelle se forme le complexe entre l'anticorps de capture 80, l'analyte 82 et l'anticorps de détection 81, sous réserve que l'analyte 82 soit présent dans l'échantillon testé.
La chambre réactionnelle 732 comprend la région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 88, au niveau de laquelle se forme le complexe entre l'anticorps de détection 81, lié à la particule magnétique 83, avec l'épitope 841 du contrôle biologique 84, à condition que l'anticorps de détection 81 soit bien fonctionnel.
La troisième chambre réactionnelle 733 comprend la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 87, au niveau de laquelle un complexe se forme entre l'épitope 851, lié à la particule magnétique 83, du contrôle biologique 85 et l'anticorps de capture 80, à condition que ce dernier soit opérationnel/fonctionnel. La détection de la présence de ces complexes au niveau de leurs zones de détection respectives 86, 88 et 87 s'effectue comme indiqué précédemment en référence à la figure 3D.
Un troisième mode de réalisation selon un premier aspect de l'invention est schématisé en figure 9. Ce dernier concerne un dispositif selon l'invention sous forme de cartouche réactionnelle comprenant une seule chambre réactionnelle, tel que montré en figure 2. Dans ce troisième mode de réalisation, l'unique chambre réactionnelle 99 comprend : une région de détection et/ou de quantification de l'analyte 96, au niveau de laquelle un complexe se forme entre l'anticorps de capture 90, l'analyte 92 et l'anticorps de détection 91 (associé à la particule magnétique 93) en présence de l'analyte 92 recherché ;
une région de contrôle biologique de l'anticorps de détection 98, au niveau de laquelle un complexe se forme entre l'anticorps de détection 91, lié à la particule magnétique 93, et l'épitope 941 du contrôle biologique 94, lorsque ce dernier est fonctionnel ;
- une région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 97, au niveau de laquelle un complexe se forme entre celui-ci et l'épitope 951, lié à la particule magnétique 93, du contrôle biologique 95 (lié à une particule magnétique 93) lorsque ledit anticorps de capture 90 est fonctionnel. Tel que mentionné en référence à la figure 6, il est important que l'anticorps de détection 91 soit présent en excès par rapport à ses sites de liaison possibles (constitués par l'analyte 92 et le contrôle biologique 94) afin d'éviter le phénomène de compétition présenté supra. En outre, dans ce troisième mode de réalisation, il est également important que l'anticorps de capture 90 soit présent en excès par rapport à ses sites de liaison possibles (à savoir l'antigène 92 et l'épitope 951 du contrôle biologique 95) afin d'éviter que la liaison spécifique de l'épitope 951 du contrôle biologique 95 à l'anticorps de capture 90, au niveau de la région de détection et/ou de quantification 96, n'empêche la formation d'un complexe de type sandwich au niveau de ladite région de détection et/ou de quantification 96. Il est également important que l'épitope 951 du contrôle biologique ne soit pas présent en trop grande quantité pour la même raison. Ceci est particulièrement important lorsque l'analyte est présent en faible quantité dans l'échantillon à doser.
Selon ce mode de réalisation, et dans la mesure où il est possible que l'épitope 951 du contrôle biologique 95 se lie non seulement à l'anticorps de capture 90 au niveau de la région de contrôle biologique de l'anticorps de capture 97 mais également au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 96, il est important voire primordial que les particules magnétiques 93 associées au contrôle biologique 95 soient associées, directement ou indirectement avec un marqueur 932 permettant de détecter quels complexes, au niveau des régions 96 et 97, sont dus à la liaison du contrôle biologique 95 avec l'anticorps de capture 90, et en déduire ainsi indirectement quels complexes sont réellement révélateurs de la présence de l'analyte 92 dans l'échantillon testé.
La différentiation entre les différentes régions peut également être effectuée en utilisant des particules de couleur différente ou des particules de diamètre différent.
Selon une alternative, seules les particules magnétiques 93 associées aux anticorps de détection 91 sont marquées avec un marqueur 931, afin d'identifier directement les complexes de type sandwich au niveau de la région de détection et/ou de quantification de l'analyte 96.
Selon un mode de réalisation particulier, les particules magnétiques 93 associées au contrôle biologique 95 et les particules magnétiques 93 associées aux anticorps de détection 91 sont respectivement marquées avec un marqueur 932 et 931, lesdits marqueurs 932 et 931 étant différents l'un de l'autre.
Tel qu'indiqué précédemment, la présente invention trouve à s'appliquer dans divers types d'immunodosage de type sandwich et notamment dans les tests unitaires rapides, également dénommés tests/dosages à flux latéral. Comme mentionné supra, la demande de brevet WO 2012/066235, au nom de la Demanderesse, divulgue un dispositif permettant de réaliser un test unitaire rapide, lequel dispositif intègre un contrôle positif. Le fonctionnement de ce dispositif de l'art antérieur est illustré en figures 10A-10D. En résumé, le dispositif selon WO 2012/066235 est une cassette comprenant un support (non représenté), une matrice 1001 comprenant une zone d'application de l'échantillon liquide 1002, une zone de marquage 1003, une zone de visualisation des résultats 1005, une zone de contrôle positif 1006, une zone optionnelle de contrôle de migration 1007 et, de manière facultative et, une zone d'absorption de l'échantillon 1008.
Tel que représenté sur les figures 10A-10D, la matrice 1001 est représentée sous la forme d'une bande rectangulaire dont l'axe longitudinal est en position horizontale. Les zones 1002, 1003, 1005, 1006, 1007 et 1008 sont en communication de fluide. La zone 1003 comprend un anticorps de détection marqué de manière visible (par exemple une particule de latex coloré, une particule d'or etc.). Cet anticorps marqué peut migrer librement au travers de la matrice 1001 et réagir avec l'analyte (antigène dans le présent cas d'espèce) recherché si ce dernier est présent dans l'échantillon testé. Dans la zone de visualisation des résultats 1005 de la matrice 1001, un anticorps de capture ayant une spécificité pour un épitope de l'antigène différent de celui reconnu par l'anticorps de détection, est immobilisé (par exemple par liaison covalente ou adsorption). Dans la zone de contrôle positif 1006 de la matrice 1001, un analogue de l'antigène est soit immobilisé directement ou indirectement ou peut migrer librement en présence du flux de fluide au niveau de la zone 1006 jusqu'à ce qu'il soit immobilisé par l'anticorps de capture au niveau de la zone de contrôle positif 1006.
Les figures 10A, 10B et 10C résument le fonctionnement de l'essai selon la demande de brevet WO2012/066235.
La figure 10D, comparable a priori à la figure 10A, illustre également la représentation d'un résultat faux négatif obtenu à l'aide de la cassette susvisée comme expliqué ci-après.
De manière plus spécifique, lorsque l'échantillon est un contrôle négatif (à savoir que l'analyte recherché n'est pas présent au sein dudit échantillon), et comme illustré sur la figure 10A, il n'y a pas d'émission d'un signal détectable au niveau de la zone de visualisation des résultats 1005. En revanche, l'on note la présence d'un signal détectable 10061 (« ligne de contrôle positif ») au niveau de la région de contrôle positif 1006, ainsi qu'au niveau de la région de contrôle de migration 1007 (signal 10071 ; également dénommé « ligne de contrôle de migration »). D'après la demande de brevet WO 2012/066235, cela signifie d'une part que l'échantillon contrôle négatif a bien migré jusqu'à la zone 1006 et que d'autre part le dispositif est fonctionnel. La fonctionnalité du dispositif se déduit du caractère fonctionnel de l'anticorps de détection, révélée par le signal 10061 (« ligne de contrôle positif ») au niveau de la région de contrôle positif 1006. En d'autres termes, le test est tel qu'il indique que l'échantillon ne comprend pas d'analyte et est considéré comme interprétable selon la demande de brevet WO2012/066235.
La figure 10B illustre le résultat obtenu avec un échantillon contrôle positif. Comme représenté sur cette figure 10B, l'on note l'émission d'un signal détectable 10051 (« ligne test ») au niveau de la zone de visualisation des résultats 1005. Ce signal détectable 10051 est dû à la formation d'un complexe de type sandwich entre l'anticorps de capture, l'antigène et l'anticorps de détection, au niveau de la zone de visualisation des résultats 1005. Le signal détectable 10051, à proprement parler, est dû au marqueur associé à l'anticorps de détection. Il y a également émission d'un signal détectable 10061 au niveau de la zone de contrôle positif 1006, la demande de brevet WO 2012/066235 concluant que cela signifie d'une part que l'échantillon a bien migré et que d'autre part le dispositif est fonctionnel. En d'autres termes, le test est tel qu'il indique que l'échantillon comprend l'analyte et est considéré comme interprétable selon la demande de brevet WO2012/066235. La figure 10C illustre un résultat regardé comme « ininterprétable » dans la mesure où aucun signal n'est détecté ni au niveau de la zone de visualisation des résultats 1005, ni au niveau de la région de contrôle positif 1006.
En multipliant les tests avec des échantillons contrôle positif (à savoir comprenant l'analyte recherché), la Demanderesse a, de manière surprenante, mis au jour, dans de très faibles proportions, le profil représenté en figure 10D, identique à celui objet de la figure 10A, à savoir ne présentant aucun signal au niveau de la zone de visualisation des résultats 1005 mais bien un signal 10061 au niveau de la région de contrôle positif 1006 et un signal 10071 au niveau de la région de contrôle de migration 1007.
Dans la mesure où l'échantillon contrôle positif utilisé avec le rendu de ce test comprend, par définition, l'analyte recherché, la Demanderesse a donc conclu qu'en mettant en œuvre les enseignements de la demande WO2012/066235, il était encore possible d'obtenir des résultats faux négatifs. Contre toute attente, la Demanderesse a mis en évidence qu'en ajoutant un contrôle de l'anticorps de capture à la cassette, cette dernière présentait une sensibilité de détection supérieure à la cassette décrite dans la demande WO 2012/066235.
Les figures 11A, 11B, 11C, 11D, 11E et 11F illustrent le fonctionnement d'une cassette voisine de celle décrite dans WO2012/066235 mais présentant une sensibilité de détection accrue. Les figures 11A-11F représentent des vues du dessus d'un dispositif de dosage à flux latéral selon un deuxième aspect de l'invention.
Comme représenté en figure 11A, ce dispositif comprend un support (non représenté), une matrice 1101 (représentée sous la forme d'une bande rectangulaire dont l'axe longitudinal est en position horizontale), ladite matrice comprenant une zone d'application de l'échantillon 1102, une zone de marquage 1103 et une zone réactionnelle 1800. Cette zone réactionnelle comprend une région de détection de l'analyte (en l'espèce un antigène) 1105, une région de contrôle positif du partenaire de liaison de capture 1109 (par exemple un anticorps), une région de contrôle positif du partenaire de liaison de détection 1106 (par exemple un anticorps) et, de manière optionnelle, une région de contrôle de migration 1107. La matrice 1101 peut en outre comprendre, de manière facultative, une zone d'absorption de l'échantillon 1108. Pour éviter le phénomène de compétition entre l'analyte de l'échantillon à doser et le premier analogue de l'analyte CTRL1 au niveau de la région de détection de l'analyte 1105, le premier analogue de l'analyte CTRL1 (consistant par exemple en un peptide épitopique de PI couplé à un marqueur ou un précurseur de marquage) est disposé en aval (en suivant le sens de migration du liquide) de cette région de détection de l'analyte 1105 mais en amont de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de capture au niveau de laquelle est immobilisé PI, à savoir soit au niveau de la région 1104 (située entre les régions 1105 et 1109), soit au niveau d'une sous-région de la région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109, située en amont de ladite ligne de contrôle positif de l'anticorps de capture, au niveau de laquelle est immobilisé l'anticorps de capture Pl.
La région de contrôle positif de l'anticorps de détection P2 1106, quant à elle, comprend le deuxième analogue de l'analyte CTRL2 immobilisé au niveau de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de détection P2. La zone de marquage 1103 comprend l'anticorps de détection P2 en excès. La région de contrôle positif du partenaire de capture PI 1109, le cas échéant comprenant la susdite sous-région en amont ladite ligne de contrôle positif de l'anticorps de capture, tel qu'indiqué précédemment, peut également se trouver après la région de contrôle positif du partenaire de détection P2 1106 (non montré). La zone réactionnelle 1800 comprend alors, dans l'ordre, une région de détection de l'analyte (en l'espèce un antigène) 1105, une région de contrôle positif de l'anticorps de détection 1106, une région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 et, de manière optionnelle, une région de contrôle de migration 1107. La matrice 1101 peut en outre comprendre, de manière facultative, une zone d'absorption de l'échantillon 1108.
La façon dont les différents composants sont inclus dans le dispositif, par immobilisation ou non, est connue de l'homme du métier et est décrite, par exemple, dans la demande de brevet WO2012/066235.
La figure 11B illustre les résultats obtenus avec le dispositif de l'invention après application d'un échantillon dit « contrôle négatif », à savoir ne contenant pas l'analyte recherché. L'échantillon étant un contrôle négatif, il n'y a, par définition, pas d'émission d'un signal détectable au niveau de la région de détection de l'analyte 1105 (plus précisément au niveau de la ligne test). En revanche, il y a émission d'un signal détectable au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 (signal 11091 au niveau de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de capture), au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de détection 1106 (signal 11061 au niveau de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de détection) et au niveau de la zone de migration 1107 (signal 11071 au niveau de la ligne de contrôle de migration ), lorsque cette dernière est présente. Ceci signifie d'une part que l'échantillon contrôle négatif a bien migré au moins jusqu'à la zone 1106, voire jusqu'à la zone de migration 1107 (lorsque cette dernière est présente) et que d'autre part à la fois l'anticorps de capture et l'anticorps de détection sont présents et fonctionnels. La figure 11C illustre les résultats obtenus avec le dispositif de l'invention après application d'un échantillon positif pour un analyte prédéterminé. Comme illustré sur la figure 11C, l'échantillon étant positif pour l'analyte (antigène) prédéterminé, il y a émission d'un signal détectable au niveau de la région de détection de l'analyte 1105 (signal 11051 au niveau de la ligne test ), au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 (signal 11091 au niveau de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de capture) au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de détection 1106 (signal 11061 au niveau de la ligne de contrôle positif de l'anticorps de détection), ainsi qu'au niveau de la zone de migration 1107 (signal 11071) lorsque cette dernière est présente. Ceci signifie d'une part que l'échantillon a bien migré au moins jusqu'à la zone 1106, voire jusqu'à la zone 1107 lorsque celle-ci est présente, et que l'anticorps de capture et l'anticorps de liaison sont tous deux présents et fonctionnels.
Les figures 11D, 11E et 11F illustrent des résultats obtenus après application d'un échantillon apparemment négatif pour un analyte à déterminer.
Comme représenté sur la figure 11D, la présence d'un signal 11091 au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 indique que ce dernier est fonctionnel. En revanche, l'absence de signal au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de détection 1106 indique que le caractère fonctionnel de cet anticorps de détection est au moins partiellement altéré. On ne peut pas conclure que l'échantillon est négatif. On peut juste conclure que le test est ininterprétable.
Concernant les résultats illustrés en figure 11E, il s'agit du scénario inverse, mais comparable. En effet, même si la présence d'un signal détectable 11061 au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de détection 1106 indique le caractère fonctionnel de cet anticorps de détection, l'absence de signal détectable au niveau de la région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 indique que ce dernier est au moins partiellement altéré. Par rapport au dispositif de l'art antérieur représenté en figure 10D, la présence d'une région de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 permet d'identifier le résultat obtenu comme étant potentiellement un faux négatif et non comme semblant indiquer une absence d'analyte dans l'échantillon testé. Tel que mentionné précédemment, ceci permet d'accroître de manière drastique la sensibilité de ce dosage à flux latéral. Enfin, comme représenté sur la figure 11F, le fait de ne détecter aucun signal au niveau des zones de contrôle positif de l'anticorps de capture 1109 et de l'anticorps de détection 1106 indique que le caractère fonctionnel des deux types d'anticorps est au moins partiellement altéré, le résultat du test étant, bien évidemment, ininterprétable. Selon un autre mode de réalisation (non montré), le dispositif peut comprendre deux segments SI et S2 comprenant chacun une zone d'application de l'échantillon. Les deux segments, séparés physiquement, sont définis ci-après : - le premier segment SI comprend, outre la zone d'application de l'échantillon, une zone de marquage et une zone réactionnelle comprenant une région de détection de l'analyte et une région de contrôle positif du partenaire de liaison de détection P2, et le deuxième segment S2 comprend, outre la zone d'application de l'échantillon, la région de contrôle positif du partenaire de liaison de capture PI, cette dernière comprenant une sous-région au niveau de laquelle est immobilisé le partenaire de capture PI (par exemple sous la forme d'une ligne de contrôle positif de PI), le contrôle CTRL1 se trouvant disposé en amont (dans le sens de migration du liquide) de ladite sous-région, tel qu'expliqué précédemment. Ce mode de réalisation s'avère particulièrement intéressant car l'utilisateur peut ne se servir de ce deuxième segment S2 que si la lecture du premier segment indique prima facie l'absence d'analyte dans l'échantillon testé mais que le contrôle CTRL2 du partenaire de liaison de détection P2 est positif. Dans un tel cas, l'utilisateur ignore si le résultat obtenu est un vrai négatif, à savoir que l'analyte recherché est absent de l'échantillon testé, ou si le partenaire de liaison de capture PI est défaillant. L'utilisateur peut trancher aisément entre ces deux hypothèses grâce au deuxième segment S2 (par exemple par lecture visuelle ou optique de ce dernier). Par ailleurs, cela permet de pouvoir remplacer l'échantillon du deuxième segment S2 par un tampon approprié interchangeable avec l'échantillon au niveau de ce segment.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif mais non limitatif.
Exemple 1 : Préparation des peptides épitopiques pour le contrôle biologique des partenaires de liaison
1.1. Synthèse peptidique Des peptides contenant les épitopes reconnus par les anticorps anti-Troponine I 19C7 (SASRKLQLK) et 560 (ELTGLGFAELQ) (Hytest, Turku, Finlande) ont été produits par synthèse chimique selon les procédures bien connues de l'homme du métier telles que la synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifield, 1962 (Merrifield, 1962, J. Am. Chem. Soc. 85:2149) et Fields et al, 1990 (Fields GB, Noble RL., 1990, Int J Pept Protein Res., 35(3):161-214), utilisant un polymère de type polystyrène contenant 0,1-1,0 mMol amines/g de polymère. En fin de synthèse chimique, les peptides sont déprotégés et clivés du polymère en présence d'un mélange d'acide trifluoroacétique-éthanedithiol- triisopropylsilane-eau (94/2.5/1/2.5 V/V/V/V) pendant environ 2 heures. Après élimination du polymère, les peptides sont extraits par précipitation dans de l'éther diéthylique à 0°C. Ils sont purifiés par des techniques telles que la chromatographie liquide haute performance. La lyophilisation des fractions de purifications appropriées conduit à un peptide homogène qui est caractérisé par des techniques physicochimiques standard telles que la spectrométrie de masse, la chromatographie liquide haute performance, l'analyse d'acides aminés.
1-2. Couplage des peptides épitopiques à l'albumine sérique bovine
Chaque peptide épitopique est couplé à l'albumine sérique bovine (BSA, Proliant, Ankeny, ÎA, USA) par l'intermédiaire de sulfo-SMCC (25 mg/ml, Thermo Fischer Scientific Inc, Rockford, IL, USA). Cette modification chimique se fait selon un ratio BSA/SMCC de 1/10 pendant une incubation de lh à 30°C +/- 1°C et est suivie par une dialyse contre un tampon P04 50mM, NaCl 150mM pH 6.8. Chaque peptide épitopique dilué à 5g/L dans un tampon P04 50mM, NaCl 150mM, EDTA 5mM pH 6.8 est ensuite mis au contact de la BSA-SMMC selon un rapport de 3 molécules de peptide épitopique par molécule de BSA. Après 18h d'incubation à 2-8°C, la réaction de couplage est bloquée par l'ajout de 2-aminoethanethiol (2MEA, Thermo Fischer Scientific Inc, Rockford, IL, USA) à une concentration respectant l'équimolarité entre les molécules de 2MEA et de SMCC et une incubation de 20 minutes sous agitation. Chaque contrôle BSA-peptide épitopique est dialysé contre du tampon PBS, azide 0.9g/L et conservé à 2-8°C.
1.3. Couplage des peptides épitopiques à des particules magnétiques Les particules super-paramagnétiques de 500 nm de diamètre (Ademtech, Pessac, France) sont fonctionnalisées avec des groupes carboxyliques comme décrit par Jarrige V" et al, 2011 (5) et Dittmer et al, 2010 (3). Le contrôle - BSA couplée au peptide épitopique de l'anticorps monoclonal 19C7 - est fixé sur les particules magnétiques à des concentrations respectives de 20 μ-g/de BSA-peptide épitopique par mg de particules magnétiques.
Exemple 2 : Contrôle biologique du partenaire de liaison P2 avec le peptide épitopique CTRL2 Le principe de ce contrôle dans un test pour la détection de la troponine I à titre d'analyte est montré sur la figure 12, PI 1200 et P2 1201 étant des anticorps monoclonaux anti-Tnl, respectivement 19C7 et 560, P2 1201 étant couplé à une particule magnétique 1203 comme décrit précédemment et CTRL2 1204 étant un peptide épitopique de P2 12041 couplé à la BSA 12042, comme décrit précédemment.
2.1. Préparation de la cartouche
La cartouche Magnotech (Philips, Eindhoven, Netherlands) est constituée de trois éléments que sont : la partie optique 1209, un feuillet 1210 et une unité de filtration sur laquelle est déposé l'échantillon (non représentée).
La partie optique est la partie inférieure de la cartouche. Elle comprend le point d'entrée de l'échantillon filtré, relié à deux chambres réactionnelles (chambre 1 et chambre 2) par un canal micro-fluidique.
Le feuillet est un film adhésif biocompatible qui constitue la partie supérieure de la cartouche et assure la fermeture des chambres réactionnelles et des canaux fiuidiques gravés dans la partie optique.
Comme montré sur la figure 13, l'anticorps anti-Troponine I 19C7 (partenaire de liaison PI) est déposé sous forme de spot dans chaque chambre réactionnelle (spot PI 1300) par impression (sciFLEXARRAYER, SU, Scienion AG), comme décrit dans l'article de Dittmer etal [7] (Journal of immunological methods, 338 : 40-46), à une concentration de 40 μg/mL d'anticorps.
Le contrôle CTRL2 1204 (BSA couplée au peptide épitopique de l'anticorps anti- Troponine I 560), préparé à l'exemple 1.2. et utilisé à titre de contrôle biologique du partenaire de liaison P2 (anticorps anti-Troponine ί 560 couplé à des particules magnétiques fonctionnalisées comme décrit dans l'exemple 1.3. à ceci près que la concentration en anticorps est de 60μg d'anticorps par mg de particules magnétiques), est également déposé sous forme de spot à une concentration de 0,1
Figure imgf000038_0001
de CTRL2 (spot CRTL2-1 13041) ou 1 ng/mL de CTRL2 (spot CRTL2-2 13042).
Le partenaire de liaison P2 est déposé à la surface du feuillet 1209 de chaque chambre réactionnelle grâce au Nanodrop NS-2Stage (Innovadyne Technologies, Inc. Carnforth, UK). Les trois éléments sont ensuite assemblés et conservés en présence de dessicant à
4°C.
2.2. Dosage des échantillons Trois types d'échantillons sont dosés 10 fois par la technologie Magnotech (Philips,
Eindhoven, Netherlands), à savoir un échantillon dit négatif en Tnl, constitué de plasma hépariné, avec des concentrations en Troponine I inférieures à 0,01 ug/L, et deux échantillons positifs en Tnl, préparés également avec le même plasma hépariné mais surchargé avec de la Troponine cardiaque humaine purifiée (complexe ITC, Hytest, Turku, Finlande) pour atteindre des concentrations de 1,05
Figure imgf000038_0002
et 2,43 .g/mL. Les résultats sont moyennés et sont exprimés en unités arbitraires appelées « Signal Change » représentant la différence entre un signal sans particules fixées dans la zone de détection (i.e. sans analytes) et un signal avec des particules fixées (i.e. en présence d'analytes). Ce « signal change » est exprimé en pourcentage. Les résultats sont donnés sur la figure 14.
Les graphes sur la figure 14 montrent que : lors du dosage de l'échantillon négatif en Troponine, un signal considéré comme négatif (inférieur à 0,4%) a été observé au niveau des spots PI 1300 dans les deux chambres, alors que le contrôle biologique du partenaire de liaison P2 a donné un signal positif (spot CTRL2-1 13041 et spot CTRL2-2 13042). Ceci confirme que les anticorps 560 couplés aux billes sont fonctionnels et que l'échantillon est un vrai négatif. De plus, cela montre aussi qu'il est possible d'effectuer le contrôle positif indifféremment dans une chambre distincte de la chambre où s'effectue la détection de l'analyte ou dans la même chambre.
le dosage d'échantillons positifs en troponine avec des concentrations respectives de 1,05 μ-g/mL et 2,43 g/'mL montrent un signal croissant au niveau des spots PI 1300 (signaux de 14% à 41%). On observe également qu'au niveau des spots CTRL2 13041 et 13042, aucune modification significative entre les signaux obtenus avec les échantillons positifs en troponine I et ceux provenant de l'échantillon négatif n'a été détectée. Cela montre également que la troponine ί présente dans l'échantillon n'affecte pas le contrôle biologique car on observe une fixation des billes magnétiques couplées à l'anticorps anti-troponine I 560 (P2) sur le
CTRL2 (spots CTRL2 13041 et 13042), même à une forte concentration de Troponine I.
Exemple 3 : Contrôle biologique du partenaire de liaison PI avec le peptide épitopique CTRLl
Le principe de ce contrôle dans un test pour la détection de la troponine I à titre d'analyte est montré sur la figure 15, PI 1500 étant un anticorps monoclonal anti-Tnl 19C7 et CTRLl 1505 étant un peptide épitopique de PI 15051 couplé aux billes magnétiques 1503, comme décrit précédemment.
3.1. Préparation de la cartouche
La cartouche est préparée comme décrit dans le point 2.1. ci-dessus, à ceci près que le contrôle CTRLl 1505 préparé dans le point 1.3. ci-dessus (bille magnétique 1503 couplée au peptide épitopique de l'anticorps monoclonal anti-troponine I 19C7 15051) est déposé sur le feuillet 1510 au niveau de la chambre réactionneile, en regard du partenaire de liaison PI 1500 (anticorps monoclonal 19C7 fixé sur la partie optique (spot PI ; non représenté)). 3.2. Dosage des échantillons
Deux types d'échantillons sont dosés 5 fois par la technologie Magnotech (Philips, Eindhoven, Netherlands), à savoir un échantillon dit négatif en Tnl, constitué de plasma hépariné, avec des concentrations en Troponine I inférieures à 0,01 g/'L, et un échantillon positif en Tnl, préparé également avec le même plasma hépariné, mais surchargé avec de la Troponine cardiaque humaine purifiée (complexe ITC) pour atteindre une concentration de 20 g/L. Les résultats sont la moyenne et sont exprimés en Signal Change (%). Ils sont donnés sur la figure 16.
Les graphes sur la figure 16 montrent que : lors du dosage de l'échantillon négatif en Troponine I, un signal positif moyen de 59% a été obtenu (spot CTRL1 ; non représenté), ce qui démontre que le partenaire de liaison PI 1500 (anticorps 19C7) est fonctionnel ;
lors du dosage de l'échantillon positif en Troponine I, un signal positif moyen de 60% a été obtenu. Ce niveau de signal, similaire à celui de l'échantillon négatif, montre le contrôle biologique du partenaire de liaison PI 1500 (anticorps 19C7) et démontre également que la reconnaissance du CTRL1 1505 (contrôle BSA-peptide épitopique de PI) par l'anticorps 19C7 (PI 1500) n'est pas affectée par la présence de troponine I dans l'échantillon.
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Claims

Revendications
1. Dispositif permettant de détecter et/ou quantifier au moins un analyte dans un échantillon liquide au cours d'une analyse biologique mettant en œuvre au moins deux partenaires de liaison PI et P2 dudit analyte, le premier partenaire de liaison PI étant immobilisé au sein dudit dispositif et le deuxième partenaire de liaison P2 étant immobilisable par formation d'un complexe de type sandwich avec l'analyte et le premier partenaire de liaison PI, ledit dispositif comprenant au moins deux zones en communication de fluide, à savoir : a) une zone d'application de l'échantillon liquide, et b) une zone réactionnelle pour la détection et/ou quantification dudit au moins un analyte, ledit dispositif comprenant au moins un premier analogue CTRLl dudit analyte, ledit premier analogue CTRLl étant immobilisable par liaison au premier partenaire de liaison PI immobilisé, et au moins un deuxième analogue CTRL2 de l'analyte, ledit deuxième analogue CTRL2 étant immobilisé au sein dudit dispositif de façon à se lier au deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et immobiliser ainsi ce dernier, ladite zone réactionnelle b) comprenant au moins les trois régions suivantes : b.l) une première région de détection et/ou quantification de l'analyte, par mise en évidence de la formation d'un complexe de type sandwich entre le premier partenaire de liaison PI, l'analyte et le deuxième partenaire de liaison P2, b.2) une deuxième région de contrôle biologique du premier partenaire de liaison PI, au niveau de laquelle est immobilisé le premier partenaire de liaison PI, la mise en évidence d'une liaison entre le premier partenaire de liaison PI et le premier analogue de l'analyte CTRLl indiquant un contrôle positif du premier partenaire de liaison PI, et b.3) une troisième région de contrôle biologique du deuxième partenaire de liaison P2, au niveau de laquelle est immobilisé le deuxième analogue de l'analyte CTRL2, la mise en évidence d'une liaison entre le deuxième partenaire de liaison P2 et le deuxième analogue de l'analyte CTRL2 indiquant un contrôle positif du deuxième partenaire de liaison P2.
2. Dispositif selon la revendication 1, ledit dispositif comprenant une zone de migration de l'échantillon liquide c), permettant la migration de l'échantillon liquide de la zone d'application de l'échantillon liquide a) vers la zone réactionnelle b).
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 consistent en des anticorps et les premier et deuxième analogues de l'analyte CRTL1 et CRTL2 comprennent au moins les épitopes reconnus respectivement par les premier et deuxième anticorps PI et P2, de préférence les premier et deuxième analogues de l'analyte CRTL1 et CRTL2 étant des peptides contenant au moins les épitopes reconnus respectivement par les premier et deuxième anticorps PI et P2.
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le deuxième partenaire de liaison P2 et le premier analogue de l'analyte CTRL1 sont initialement déposés dans le dispositif et sont adaptés pour être remis en suspension en présence de l'échantillon liquide.
5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la zone réactionnelle b) comprend au moins deux parties distinctes, par exemple deux chambres réactionnelles distinctes, sans communication directe de fluide entre les deux parties, la première partie comprenant la première région b.l) et la deuxième partie comprenant les deuxième et troisième régions b.2) et b.3).
6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et la deuxième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI et le deuxième analogue de l'analyte CRTL2 immobilisés, le premier analogue de l'analyte CTRL1 et le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisables.
7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la zone réactionnelle b) comprend au moins deux parties distinctes, par exemple deux chambres réactionnelles distinctes, sans communication directe de fluide entre les deux parties, la première partie comprenant les première et troisième régions b.l) et b.3) et la deuxième partie comprenant la deuxième région b.2).
8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI et le deuxième analogue de l'analyte CRTL2 immobilisés, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable et la deuxième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le premier analogue de l'analyte CTRL1 immobilisable, de préférence le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable étant présent en excès dans ladite première partie.
9. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la zone réactionnelle b) comprend au moins trois parties distinctes, par exemple trois chambres réactionnelles, sans communication de fluide entre les trois parties distinctes, la première partie comprenant la région b.l), la deuxième partie comprenant la région b.2) et la troisième partie comprenant la région b.3).
10. Dispositif selon la revendication 9, dans lequel la première partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable, la deuxième partie comprend, outre le deuxième analogue de l'analyte CTRL2 immobilisé, le deuxième partenaire de liaison P2 immobilisable, et la troisième partie comprend, outre le premier partenaire de liaison PI immobilisé, le premier analogue de l'analyte CTRL1 immobilisable.
11. Dispositif selon l'une des revendications 5 à 10, dans lequel les parties sont positionnées en parallèle ou en série sur le chemin de l'échantillon liquide, de préférence en parallèle.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la zone réactionnelle b) comprend au moins une partie, par exemple une chambre réactionnelle, ladite partie comprenant :
les trois régions b.l), b.2) et b.3),
le deuxième partenaire de liaison P2 et le premier analogue de l'analyte CTRL1 immobilisables, les premier et deuxième partenaires de liaison PI et P2 étant présents en excès, et dans lequel : - le premier analogue de l'analyte CTRL1 est associé, directement ou indirectement, à un marqueur Ml permettant de mettre en évidence la liaison dudit premier analogue de l'analyte CTRL1 avec le premier partenaire de liaison PI au niveau des régions b.l) et b.2), et/ou
le deuxième partenaire de liaison P2 étant associé, directement ou indirectement, à un marqueur M2, différent du marqueur Ml, permettant de mettre en évidence la formation du complexe de type sandwich entre le deuxième partenaire de liaison P2, l'analyte et le premier partenaire de liaison PI au niveau des régions b.l) et b.2).
13. Dispositif selon l'une des revendications 2 à 12, dans lequel la zone de migration de l'échantillon liquide c) comprend une matrice.
14. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel la zone d'application de l'échantillon liquide a) comprend un filtre.
15. Procédé de détection et/ou quantification d'au moins un analyte dans un échantillon liquide au cours d'une analyse biologique mettant en œuvre au moins deux partenaires de liaison de l'analyte PI et P2, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
(i) mettre en contact l'échantillon liquide avec un dispositif tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 14,
(ii) interpréter le résultat obtenu à partir dudit dispositif lorsque le contrôle biologique du partenaire de liaison PI et le contrôle biologique du partenaire de liaison P2 sont positifs, respectivement au niveau des régions b.2) et b.3),
(iii) dans le cas contraire considérer le résultat obtenu comme ininterprétable.
16. Utilisation d'au moins deux analogues d'un analyte CTRL1 et CTRL2 pour le contrôle biologique, respectivement, d'au moins deux partenaires de liaison PI et P2, lesdits partenaires de liaison PI et P2 permettant de détecter et/ou quantifier ledit analyte par la mise en évidence de la formation d'un complexe de type sandwich entre le deuxième partenaire de liaison P2, l'analyte et le premier partenaire de liaison Pl.
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