CN105705948A

CN105705948A - 用于生物分析的装置和方法

Info

Publication number: CN105705948A
Application number: CN201480043623.5A
Authority: CN
Inventors: N·莱纳德
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-07-31
Also published as: US20160169884A1; FR3009386A1; CN105705948B; WO2015015130A1; EP3028045A1

Abstract

本申请提供了旨在用于夹心型生物分析框架内的分析物的结合伴侣(至少两个，P1和P2)的生物对照的装置、方法和用途。所述装置包含所述分析物的至少第一类似物CTRL1和所述分析物的至少第二类似物CTRL2作为对照，所述第一类似物CTRL1通过结合于固定的第一结合伴侣P1而是可固定的，所述第二类似物CTRL2被固定于所述装置内，从而与可固定的第二结合伴侣P2结合并且由此固定第二结合伴侣P2。

Description

用于生物分析的装置和方法

技术领域

本发明涉及在生物分析过程中检测和/或量化液体样品中的分析物的领域。本发明的目的特别是用于进行夹心型免疫测定以便检测和/或量化样品中的至少一种分析物的装置和方法。具体地说，本发明能够实现了在所述夹心型免疫测定的框架内所用的分析物结合伴侣的生物对照(功能/操作特性对照)，以便防止在所用的所有或一些结合伴侣有缺陷时获得假阴性结果。

背景技术

夹心型免疫测定广泛应用于生物分析以检测和/或量化给定的分析物。这些夹心型免疫测定(或者简称为“夹心免疫测定”)使用第一结合伴侣(被称为“捕获结合伴侣”)和第二结合伴侣(被称为“检测结合伴侣”)，第一结合伴侣通常被固定在固相上以特异性结合所寻找的分析物，第二结合伴侣被标记且被设计成特异性结合所寻找的分析物，从而显示捕获结合伴侣和分析物之间的结合，并因此显示该分析物的存在。换句话说，发现所寻找的分析物自身被“夹”在所述第一结合伴侣和第二结合伴侣之间，该第一(“捕获”)结合伴侣一般相对于所寻找的分析物是过量存在的。捕获结合伴侣可以例如被固定在固相支持体上(通过共价键合、吸附或任何其他适当的方法)，并且量通常必须使得在捕获结合伴侣上存在的结合位点的数目大于在标准溶液或未知溶液中存在的抗原分子的数目。标记的检测结合伴侣可以例如同时或者在最初孵育和洗涤后被加入，并结合于之前固定在捕获结合伴侣上的抗原。

简单的洗涤操作用于使捕获结合伴侣-分析物-(标记的)检测结合伴侣复合物与过量存在的游离的标记检测结合伴侣分离。

对于能够结合已参加与捕获结合伴侣反应的分析物的标记检测结合伴侣而言，使两种结合伴侣识别分析物的不同区域是必要的。

检测结合伴侣的标记可以例如借助于放射性同位素或者通过酶促方法。无论如何，在各种标记情况中，对应于捕获结合伴侣–分析物–标记的检测结合伴侣复合物的信号是表示存在于测试样品中的(一种或多种)分析物的量的信号。

通常，在夹心型免疫测定中，捕获结合伴侣和检测结合伴侣是识别不同于所寻找的分析物的表位的抗体，在此实施方式中所寻找的分析物由抗原组成。被用作捕获结合伴侣(“第一结合伴侣”)和检测结合伴侣(“第二结合伴侣”)的抗体可以是例如多价多克隆抗体或各种特异性单克隆抗体。

使用对分析物的两个不同位点(例如抗原的两个不同表位)具有识别特异性的两个结合伴侣(例如抗体，如单克隆抗体)使得该方法具有非常良好的灵敏度。因此，为了获得对应于与关注的分析物混淆的检测分子的“假阳性”，该分子必须具有与寻找的分析物相同的所述两个表位。通过正确选择所述表位，从而能够极其显著地减少其它高同源性分子的干扰。

夹心型免疫测定，由于其具有高灵敏度，可以成为各种类型试验的基础。举例来说，在EIA(“酶免疫测定”)框架内可以提及的有夹心ELISA试验(“酶联免疫吸附测定”)。广义地说，该试验如下进行：

a.用一定量的所谓的“捕获”抗体覆盖表面(例如板，如“96孔”板)；

b.加入能够含有所寻找抗原的样品，以使存在的任何抗原与捕获抗原结合；

c.洗涤板以消除除分析物以外的所有未固定的分子；

d.加入所谓的“检测”抗体(直接地或结合有酶地)，其与抗原结合，从而形成捕获抗体-抗原-检测抗体复合物；

e.冲洗板以使此复合物与过量存在的游离的标记检测抗体分离；

f.适用时，加入显色酶底物或荧光酶底物(这被称为“ELFA”测定)；所述底物被酶转化成可检测形式(带有颜色或荧光)。

这种“ELISA夹心”试验的结果可以通过肉眼或在专门设计成直接容纳板(例如“96孔”板)的分光光度计中进行分析。

有利地是，可以使用来自Philips的“Magnotech”技术来进行夹心型免疫测定。这种类型(即使用“Magnotech”技术)的试验特别记载于Bruls等人[1]的发表文章中。这种技术采用反应盒(优选由塑料制成)，该反应盒包括液体样品施加区域和一个或多个包含试验所需的各种试剂的反应室，此反应区域经由通道连接至样品施加区域，使来自施加区域的液体样品能够毛细流向所述反应区域。基本上，反应区域特别包括干燥的且涂有所关注的抗体的磁性纳米粒子(具有大约一百纳米的直径，例如超顺磁性粒子)，所述抗体能够与寻找的分析物的第一表位特异性结合。而且，所述反应区域包括在可以表征为“检测区”的区域中的能够特异性识别寻找的抗原的第二表位的抗体。最佳地，此反应盒可以被置于便携式装置中，该便携式装置包括位于该反应盒上方和下方的两个电磁体。使用上方的电磁体作为洗涤磁体，而使用下方的电磁体作为结合磁体，在磁驱动后读取免疫测定结果。这样的技术特别记载于专利申请WO2013/054230。

如Bruls等人[1]或专利申请WO2013/054230中所述，在检测区中存在所述复合物，并因此存在寻找的抗原是通过光学检测的，更具体地是基于受抑全内反射(f-TIR)的原理。检测原理如下所述：在检测区中不存在磁性纳米粒子的情况下，入射光束以最大强度被反射。如果在检测区中存在纳米粒子，部分入射光被这些纳米粒子反射和折射，导致反射光束的强度降低。这种信号减弱与结合至反应区域的检测区的纳米粒子的数目成比例，并因此与测试样品中寻找的分析物的浓度成比例。

这种技术也使其可以通过基于光信号变化作为磁性纳米粒子的浓度的函数(并因此间接地作为分析物的浓度的函数)绘制校准曲线来量化分析物。

“Magnotech”系统的一些应用已记载于文献中，例如总持续时间为5分钟的，在患者全血样品中检测心肌蛋白质肌钙蛋白I(cTnI)的“即时检测(point-of-care)”(POC)试验(特别参见Bruls等人[1]和Dittmer等人[2])。心肌肌钙蛋白I是重度心肌梗死诊断学框架中的参照标准，如Morrow等人[3]中所述。

Jarrige等人[4]描述了“Magnotech”技术平台通过绘制甲状旁腺激素(PTH)的剂量反应曲线来分析“术中甲状旁腺激素”(ioPTH)的应用。

然而，固定在磁性纳米粒子上的结合伴侣的和/或固定在反应区域检测区上的结合伴侣的生物对照(功能/操作特性对照)问题未被包含在上面所述的采用“Magnotech”平台的试验的框架内。测量信号的变化的缺乏因此仅指示不存在寻找的分析物，而这可能是由于上述两个结合伴侣中的一个或多个的缺陷引起的。在后一种情况中，因为实验结果明显是阴性的，因此使用者会错误地得出结论：在测试样品中不存在寻找的分析物。这种类型的结果被称为“假阴性”，并且能证明对受试患者的健康是极其有害的，特别是如果寻找的分析物是需要紧急治疗的严重病理的指示物，如心肌肌钙蛋白I的情况那样。

更常见地是，夹心型免疫测定法被应用在单元试验(unittest)的框架内，如在快速单元试验如快速筛选试验(RST)中。后者通常以“盒”的形式出现，如妊娠试验，并且相对易于使用。这些试验通常是基于免疫层析法或膜过滤的原理：设置在支持体上的样品(例如全血、血清、尿)将例如通过毛细管作用迁移，其携带已存在的一些试剂，然后在通过膜过滤样品时使样品遇到设置(deposited)在膜上的结合伴侣。这些快速单元试验也被称为“侧流(lateralflow)测定”或“侧流试验”，并且已被大量记载在文献(参见例如Yager等人[5]或Wild[6])中。它们常被用于临床、药物、食品和化学分析的目的。因此，侧流试验装置可以被用于测定液体样品中存在的众多类型的分析物(如抗体、抗原、激素、蛋白质和化学分子)的存在。

粗略地，在侧流试验的框架内，如果设置在施加区域中的液体样品中存在待检测的分析物，所述分析物与在标记区域中标记的结合伴侣结合，因此形成的复合物然后迁移至反应区域，在反应区域中它们通过与捕获结合伴侣结合而被固定在捕获区域中。使用者可以通过显示根据与检测结合伴侣缔合的标记物的类型而测定的可检测信号来检测寻找的分析物的存在。一般地，以可检测的线(常被称为测试线)的形式来证明样品中存在所关注的分析物。反应区域通常包括样品迁移对照区，其向使用者指出至少一定比例的样品已通过对照区上游(特别是捕获区域中)的基质。这可以例如通过显示预定颜色的对照线来实现。举例来说，可以提及的有专利申请WO2004/003559、WO2006/092103、WO2007/081330、US2004/0161859。

本申请人的专利申请WO2012/066235公开了可以进行快速单元试验的装置，所述装置包含阳性对照。为了这个目的，在该装置内，例如结果观察区域的下游、或与其平行地提供有对照区，所述对照区包含能够结合标记的检测结合伴侣的寻找的分析物的至少一种类似物。换句话说，申请WO2012/066235所包括的快速单元试验不仅可以检测寻找的分析物，还可以测试检测结合伴侣的功能/操作特性。因此，如果该对照证明为阴性的，该试验的结果被视为是无法解释的，则必须重复该试验。虽然可以获得令人满意的结果，但申请人已发现可以显著提高WO2012/066235中的装置和方法的灵敏度，而且整体还显著提高了夹心型免疫测定的灵敏度。

事实上，申请人已出乎意料地发现，通常被固定/吸附在固体表面上的捕获结合伴侣的功能性(功能/操作特性)可明显地全部或部分地受到外部因素如光、温度等的影响。在如申请WO2012/066235描述的装置的框架内或者在采用"Magnotech"平台(参见上文)的免疫测定的框架内，这产生“假阴性”，在此情况下，分析物尽管存在于测试样品中，在所谓的“结果观察”区域中却未被检测到，但是当捕获伴侣有缺陷时，对照区可以证实检测抗体的功能性(功能/操作特性)，并因此证实试验的表观可靠性。使用者/操作者因而由此错误地得出结论：在测试样品中不存在寻找的分析物。

发明内容

本发明的一个目的涉及可以在生物分析期间检测和/或量化液体样品中的至少一种分析物的装置，该装置采用所述分析物的至少两个结合伴侣P1和P2，第一结合伴侣P1被固定在所述装置内，第二结合伴侣P2通过与该分析物和第一结合伴侣P1形成夹心型复合物而是可固定的，所述装置包括处于流体连通的至少两个区域，即：

a)液体样品施加区域，和

b)用于检测和/或量化所述至少一种分析物的反应区域，所述装置包括所述分析物的至少第一类似物CTRL1和所述分析物的至少第二类似物CTRL2，所述第一类似物CTRL1通过与固定的第一结合伴侣P1结合而是可固定的，所述第二类似物CTRL2被固定在所述装置内以便与可固定的第二结合伴侣P2结合，并因此固定第二结合伴侣P2，

所述反应区域b)包括至少以下三个区：

b.1)第一区，用于通过显示在第一结合伴侣P1、分析物和第二结合伴侣P2之间形成夹心型复合物来检测和/或量化分析物，

b.2)用于第一结合伴侣P1的第二生物对照区(功能/操作特性对照)，其中固定有第一结合伴侣P1，显示第一结合伴侣P1和第一分析物类似物CTRL1之间的结合，这表明是第一结合伴侣P1的阳性对照，和

b.3)用于第二结合伴侣P2的第三生物对照区(功能/操作特性对照)，其中固定有第二分析物类似物CTRL2，显示第二结合伴侣P2和第二分析物类似物CTRL2之间的结合，这表示是第二结合伴侣P2的阳性对照。

根据一个具体实施方式，本发明的装置包括液体样品迁移区域c)，使液体样品能够从液体样品施加区域a)向反应区域b)迁移。如果本发明的装置适合用于快速单元试验，则此液体样品迁移区域c)的存在是特别期望的。优选地，液体样品迁移区域c)含有基质。

优选地，第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2由抗体组成，并且第一分析物类似物CRTL1和第二分析物类似物CRTL2至少包含分别被第一抗体P1和第二抗体P2识别的表位。有利地，第一分析物类似物CRTL1和第二分析物类似物CRTL2是至少含有分别被第一抗体P1和第二抗体P2识别的表位的肽。

有利地，第二结合伴侣P2和第一分析物类似物CTRL1最初被设置--有利地是设置和干燥--在装置内，并适合在液体样品的存在下再悬浮。

根据本发明的第一实施方式，本发明的装置的反应区域b)包括至少两个不同的部分，例如两个不同的反应室，在这两个部分之间没有直接的流体连通，第一部分包括第一区b.1)，第二部分包括第二区b.2)和第三区b.3)。有利地，第一部分除固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除均被固定的第一结合伴侣P1和第二分析物类似物CRTL2之外，还包含均为可固定的第一分析物类似物CTRL1和第二结合伴侣P2。

根据本发明的第二实施方式，本发明的装置的反应区域b)包括至少两个不同的部分，例如两个不同的反应室，在这两个部分之间没有直接的流体连通，第一部分包括第一区b.1)和第三区b.3)，第二部分包括第二区b.2)。有利地，第一部分除均被固定的第一结合伴侣P1和第二分析物类似物CRTL2之外，还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第一分析物类似物CTRL1，优选地，可固定的第二结合伴侣P2过量存在于所述第一部分中。

根据本发明的第三实施方式，本发明的装置的反应区域b)包括至少三个不同的部分，例如三个反应室，在这三个不同的部分之间没有流体连通，第一部分包括区b.1)，第二部分包括区b.2)，第三部分包括区b.3)。有利地，第一部分除固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除固定的第二分析物类似物CTRL2之外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第三部分固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第一分析物类似物CTRL1。

如果反应区域b)包括几个部分，如上面所述第一、第二和第三实施方式的情况那样，这些部分平行或串联地设置在液体样品路径上，优选平行地。

根据本发明的第四实施方式，本发明的装置的反应区域b)包括至少一个部分，例如一个反应室，所述部分包括：

-三个区b.1)、b.2)和b.3)，

-第二结合伴侣P2和第一分析物类似物CTRL1，这二者均是可固定的，

第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2过量存在，并且其中：

-第一分析物类似物CTRL1直接地或间接地与标记物M1缔合，从而显示在区b.1)和b.2)中所述第一分析物类似物CTRL1与第一结合伴侣P1之间的结合，和/或

-第二结合伴侣P2直接地或间接地与不同于标记物M1的标记物M2缔合，从而显示在区b.1)和b.2)中第二结合伴侣P2、分析物和第一结合伴侣之间形成夹心型复合物，

从而在所述区b.1)和b.2)中将所述第一分析物类似物CTRL1与第一结合伴侣P1的结合区分于在第二结合伴侣P2、分析物和第一结合伴侣P1之间形成的夹心型复合物。

优选地，不论所涉及的本发明的实施方式如何，液体样品施加区域a)包括过滤器。

本发明的另一个目的涉及在生物分析期间检测和/或量化液体样品中的至少一种分析物的方法，该方法采用至少两个分析物结合伴侣P1和P2，该方法包括如下步骤：

(i)使液体样品与如上所定义的装置接触，

(ii)如果在区b.2)中结合伴侣P1的生物对照(功能/操作特性对照)和在区b.3)中结合伴侣P2的生物对照(功能/操作特性对照)为阳性的，则解释从所述装置获得的结果，

(iii)否则，获得的结果被视为无法解释的。

本发明还涉及至少两个分析物类似物CTRL1和CTRL2分别用于至少两个结合伴侣P1和P2的生物对照(功能/操作特性对照)的用途，所述结合伴侣P1和P2可通过显示第二结合伴侣P2、分析物和第一结合伴侣P1之间形成夹心型复合物来检测和/或量化所述分析物。

“检测…至少一种分析物”被理解为表示在所关注的液体样品内检测寻找的分析物的存在。

“量化至少一种分析物”被理解为表示测定寻找的分析物在所述液体样品内的量(例如浓度)/对所述液体样品内寻找的分析物进行含量测定。

“样品”被理解为表示小部分的或少量分离的用于分析目的的实体。这可以是来自生物流体样本的人或动物的临床样品、或来自任何食品类型的食物样品、或来自食品生产或加工环境的样品。如上所述，该样品是液体。

临床来源的样品被理解为表示取自患者或个体(人或动物)并能够含有如下所定义的分析物的样品。该样品特别可以为液体生物样品，如血液、血清、血浆、唾液、尿、脑脊液、胸膜液或腹膜液样品(非穷举)。

作为食品来源的样品，可以提及的有例如水、饮品(如奶或果汁)、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等食物样品。这种食品来源的样品也可以来自动物饲料，如特别是来自动物用膳食的样品。

作为环境来源的样品，举例来说，可以提及的有用于表面区域或水体的对照的样品，或者也可以是取自废液、淤泥、土壤、植物等的样品。

所取的样品可以原样使用，或者在进行生物分析之前，根据本领域技术人员已知的方法通过富集、稀释、提取、浓缩或纯化进行制备。

“液体”样品应当被理解为表示直接以液体形式取得的样品，也可以表示半固体或固体样品，在这种情况下，它们可以通过本领域技术人员已知的任何适当的方法转变为液体样品。当然，当样品为固体或半固体时，其必须进行预处理以转变成液体样品。

该样品通过本领域技术人员已知的任何类型的采样方法获得。

术语“分析物”广义上应当被理解为经历一种或多种分析的化学、生物或生物化学物质。作为分析物的实例，可以提及的有抗原、抗体、激素、蛋白质或化学分子(非穷举)。

本领域技术人员已知，寻找的分析物的性质将决定使用的结合伴侣的性质。例如，如果寻找的分析物是蛋白质或抗原，其可以通过结合伴侣如结合受体、抗体、抗体片段、抗体类似物和能够与蛋白质或抗体结合的任何其它配体进行检测和/或量化。“抗体类似物”被理解为表示具有与抗体或抗体片段相同的结合能力或相似的结合能力的生物和/或化学化合物。具体地说，抗体类似物包括小分子蛋白质，其如抗体一样能够与生物靶标结合，因而使其能够在生物体或生物样品内被检测、捕获或单纯靶向。这些抗体类似物的应用领域与抗体的应用领域几乎同样广阔。举例来说，可以提及的有Nanofitins^TM，由Affilogic销售的小分子蛋白质。

“分析物类似物”被理解为表示显示出与分析物类似的物理-化学性质和生物性质(例如对给定配体的亲和力)的化学、生物或生物化学物质。优选地，分析物类似物是蛋白质(如抗体)、蛋白质的混合物(例如抗体的混合物)、多肽、多肽的混合物、肽、肽的混合物、抗体片段、抗体片段的混合物、抗体类似物、抗体类似物的混合物，或它们的缔合物。

一般而言，如果结合伴侣是抗体、抗体片段或抗体类似物，分析物是蛋白质、多肽或肽，分析物类似物也是蛋白质、多肽或肽。

表述“无直接流体连通的部分”在本发明的意义上应当被理解为是指适合接收流体(在本情况中为液体)的部分(例如反应室)，一旦此液体被接收了，所述部分进一步适合使液体不能在所述部分之间(例如在反应室之间)自由连通。可以例如通过借助于防漏分割隔开各部分(例如反应室)以及更一般来说通过本领域技术人员已知的任何技术方案来确保不存在直接流体连通。

由于第一和第二结合伴侣的功能性生物对照(功能/操作特性)，本发明的装置具有非常良好的灵敏度，即获得“假阴性”结果的可能性极其低，达到几乎或完全不存在的程度。灵敏度被理解为表示寻找的分析物存在于测试液体样品中时得到阳性结果的能力。

借助于本发明的装置应用的生物分析涵盖了应用至少两个结合伴侣的任何免疫测定，如夹心型免疫测定(也被称为夹心型免疫学测定)。

当然，术语“免疫测定”中的前缀“免疫”，在本申请中不应被视为严格表明结合伴侣必然是免疫学来源的伴侣，如抗体或抗体片段。事实上，如本领域技术人员所熟知的那样，该术语更广泛地用来指其中结合伴侣不是免疫学来源/性质的伴侣而是例如期望检测和/或量化的分析物的受体。结合伴侣所涉及的条件是能够与寻找的分析物结合，优选为特异性结合。因此，已知ELISA测定是在严格意义上使用非免疫学结合伴侣的测定，更广泛地被称为“配体结合测定”，而术语“免疫”自身被包括在首字母缩略词ELISA的完整版本中。出于清楚和一致的目的，术语“免疫”在本申请中用来指使用至少一个适合与寻找的分析物结合的结合伴侣并检测和/或量化寻找的分析物(优选特异性地)，甚至是当在严格意义上所述结合伴侣不具有免疫学性质或来源的任何生物分析。

第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2选自例如抗体、抗体的混合物、抗体片段、抗体片段的混合物、抗体类似物、抗体类似物的混合物、抗原、抗原的混合物、蛋白质、蛋白质的混合物、多肽、多肽的混合物、肽、肽的混合物。

优选地，第一结合伴侣P1是“捕获结合伴侣”，在此情况下，其被直接或间接地固定在固体表面上。第二结合伴侣P2优选地是“检测结合伴侣”，并直接地或间接地与检测元件缔合，从而可以显示此第二结合伴侣P2的存在、并且尤其是与其结合的任何元件(分析物、试剂等)的存在。这种检测元件可以是标记试剂，但更广泛地说，可以是使得可以显示此第二结合伴侣P2的存在、尤其是与其结合的任何元件(分析物、试剂等)的存在的任何元件。举例来说，在上述“Magnotech”平台的框架内，与检测结合伴侣(在讨论中的本情况下为检测抗体)缔合的纳米粒子起检测元件的作用，在此情况下，该纳米粒子引起的反射光束的减弱显示检测区存在检测抗体，并因此显示在检测抗体、寻找的分析物和捕获抗体之间形成了夹心型复合物。

根据一个具体实施方式，检测元件是能够直接地或间接地生成可检测信号的标记试剂。仅用于举例说明的目的(非限制性的)，这些标记试剂可以包括：

-产生例如通过比色法、荧光、发光(luminescence)产生可检测的信号的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

-发色团，如荧光、发光和染色化合物，

-荧光分子，如Alexas或藻青蛋白，

-放射性分子，如³²P、³⁵S或¹²⁵I，

-金属或合金粒子，如胶体金粒子，

-聚合物粒子，如有色胶乳粒子。

也可以使用间接检测系统，举例来说，如能够与抗配体反应的配体。配体/抗配体对是本领域技术人员所熟知的，其是例如具有以下对的情况：生物素/链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、分子/受体。在这种情况中，配体是携带结合伴侣的。抗配体可以是可被上述标记试剂直接检测的，或其自身是可被配体/抗配体检测的。

这些间接检测系统可以在某些条件下导致信号放大。这种信号放大技术是本领域技术人员所熟知的，特别可以提及以本申请人的在先专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术，特别是通过直接观察标记试剂缔合第二结合伴侣P2的反应或使用检测工具，例如光学类型检测工具，如在“Magnotech”操作方法框架下的情况那样，来显示第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2之间形成夹心型复合物。

有利地，第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2中的至少一个--优选两者都--具有免疫学性质和/或来源。优选地，所述结合伴侣P1和P2中的至少一个--优选两者都--是抗体。“抗体”被理解为表示多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体，或所述抗体的片段，特别是片段Fab、Fab’、F(ab’)2、ScFv、Fv、Fd。必要条件是所述抗体对于寻找的分析物必须是特异性的，即，只要可能，它们不具有与其它分析物的交叉反应；具有最高亲和力和最低解离常数的抗体是优选用于本发明目的的抗体。

可以通过如下方法获得多克隆抗体：用适当的免疫原使动物免疫，之后通过采集所述动物的血清并使寻找的抗体与血清的其它成分分离，特别是通过在固定有被该抗体特异性识别的分析物(抗原)的柱子上进行亲和色谱法，来回收纯化形式的所述抗体。

单克隆抗体可以通过杂交瘤技术来获得，杂交瘤技术的一般原理在下文进行重述。

在第一阶段，用适当的免疫原使动物(通常为小鼠)免疫，然后该动物的B淋巴细胞能够产生对抗该抗原的抗体。这些产生抗体的淋巴细胞然后与“无限增殖的”骨髓瘤细胞(通常为鼠源性的)融合以产生杂交瘤细胞。然后从因此获得的异种细胞混合物中选择能够产生特定抗体并能够无限繁殖的细胞。每个杂交瘤细胞以克隆的形式复制，各自导致产生单克隆抗体，其对于寻找的抗原的识别性能能够例如经由ELISA、通过一维或二维免疫转移(蛋白质印迹)、经由免疫荧光、或借助于生物传感器进行测试。然后对因此选出的单克隆抗体例如通过亲和色谱法进行纯化。

单克隆抗体也可以是通过基因工程通过本领域技术人员熟知的技术获得的重组抗体。

在第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2是抗体的实施方式中，寻找的分析物被称为“抗原”，并且第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2(抗体)识别该抗原的两个不同的表位，分别被称为E1和E2。

如果P1和P2是抗体，P1优选地为“捕获抗体”，在此情况下，其被直接或间接地固定在固体表面上。抗体P2优选地为“检测抗体”，并直接或间接地与检测元件缔合，从而可以显示此第二结合伴侣P2、尤其是与其结合的任何/所有元件(分析物、试剂等)的存在。该检测元件如上文所定义。

表述“固定…结合伴侣”表示通过本领域技术人员已知的任何方法，如通过吸附或共价键合直接地或间接地将结合伴侣固定在装置内。

表述“含有被抗体识别的表位的肽”是指包含至少被所涉及的结合伴侣识别的表位的任何氨基酸序列。肽可以被限制为表位自身或包含一些额外的氨基酸，直至整个蛋白质，在此情况下肽保留被所涉及的结合伴侣识别的活性。肽还可以含有一个或多个沉默的(muted)氨基酸，再次地，在此情况下肽保留被所涉及的结合伴侣识别的活性。在捕获伴侣(也被称为捕获结合伴侣)和检测伴侣(也被称为检测结合伴侣)对的框架内，捕获伴侣对照不含有检测伴侣对照表位，反之亦然。但是如果使用几个伴侣用于相同功能(例如两个捕获伴侣)，肽可以包含第一捕获伴侣表位E1和另一捕获伴侣表位E2。

术语“基质”是指能够确保液体的流动和转移的任何类型的材料。液体可以通过毛细作用力发生转移。如果本发明的装置是可以应用侧流测定的装置，这是特别有利的。基质可以例如由至少一种吸潮材料制成。吸潮材料是容易吸收液体并且通过毛细管作用运输液体穿过其的材料。作为吸潮材料，可以提及例如硝化纤维、聚酯、玻璃纤维等。

附图说明

通过结合以下附图阅读本说明书将更好地理解本发明、其功能性、其应用及其优点，其中：

-图1是本发明原理的示意图；

-图2是可用于“Magnotech”型光-磁性免疫测定装置的反应盒的顶视图；

-图3A、3B、3C和3D举例说明光-磁性免疫测定技术平台如“Magnotech”平台的操作；

-图4是本发明的第一方面的第一实施方式的装置的顶视图；

-图5示意性地举例说明本发明的第一实施方式的第一配置；

-图6示意性地表示本发明的第一实施方式的第二配置；

-图7是本发明的第一方面的第二实施方式的装置的顶视图；

-图8示意性地表示第二实施方式的装置；

-图9示意性地表示本发明的第一方面的第三实施方式；

-图10A、10B、10C和10D表示本申请人的申请WO2012/066235所述的侧流试验的顶视图；

-图11A、11B、11C、11D、11E和11F示意性地表示适合应用单侧流测定的本发明第二方面的装置的顶视图；

-图12示意性地表示在检测肌钙蛋白I(TnI)作为分析物，P1和P2分别为抗-TnI单克隆抗体19C7和560，且CTRL2含有P2的表位肽的框架内结合伴侣P2的生物对照；

-图13示意性地表示具有两个反应室的Magnotech盒，其中结合伴侣P2具有生物对照，室1涂有两个点，均用于检测肌钙蛋白I(P1点，其上固定有抗-肌钙蛋白I单克隆抗体19C7(结合伴侣P1))，室2涂有三个点，一个点用于检测肌钙蛋白I(P1点，与室1的P1点相同)，其它两个点(CTRL2-1点和CTRL2-2点)使用对照CTRL2(与P2的表位肽偶联的蛋白质)用于抗-肌钙蛋白I检测抗体(单克隆抗体560，结合伴侣P2)的生物对照；

-图14描述了使用三个不同的样品，即一个TnI阴形样品和具有两种不同TnI浓度的两个TnI阳性样品，在根据图13的Magnotech盒的室1和室2中获得的信号结果；

-图15示意性地表示在用于作为分析物的检测肌钙蛋白I的Magnotech技术的框架内，使用对照CTRL1(与P1d表位肽及磁粒子偶联的蛋白)的抗-肌钙蛋白I单克隆抗体19C7(结合伴侣P1)的生物对照；以及

-图16描述了使用两个不同的样品，即一个TnI阴性样品和一个TnI阳性样品，在图15的具有结合伴侣P1的生物对照的室中获得的信号结果。

具体实施方式

如上所述，图1旨在举例说明作为本发明的原理。所述原理涉及通过显著减少--或甚至消除--假阴性结果，增加任何类型的夹心型免疫测定框架内的检测灵敏度。为此，我们使用固定在本发明的装置内的第一结合伴侣P1，在本情况中为抗体10。该抗体10被用作捕获抗体。

还需要通过与分析物12和捕获抗体10形成夹心型复合物而为可固定的第二结合伴侣P2，在本情况中为抗体11。抗体11就其本身而言被称为“检测抗体”。检测抗体11直接地或间接地与检测元件111缔合，从而可以检测在捕获抗体10、分析物12和检测抗体11之间形成“夹心”；所述夹心的形成显示在测试样品(在图1中未编号)中存在寻找的分析物12。当然，所用的检测元件111的类型取决于所应用的检测工具或手段(detectionmeans)。例如，如果检测荧光或有色反应，检测元件111将分别包含荧光元件或显色元件(即，从而可以获得荧光反应或有色反应)，如在底物存在下的酶。如果如上所述，经由光-磁性技术平台如“Magnotech”平台使用夹心型免疫测定，检测元件111可以仅包含磁粒子/球。事实上，这种磁粒子将影响在检测区反射的光信号的强度，并因此将提供关于“夹心”的形成的指示，从而显示存在寻找的分析物12/量化寻找的分析物12或显示寻找的分析物12不存在。

为了增加检测灵敏度，本发明的发明原理需要使用两种阳性对照：

(i)第一阳性对照13，从而可以不仅测试捕获抗体10的存在，而且尤其是测试捕获抗体10的功能特性。该阳性对照13包含被捕获抗体10特异性识别的表位131(例如肽性质的)和检测元件132，检测元件132与检测元件111相同或不同；

(ii)第二阳性对照14，从而可以不仅测试检测抗体11的存在，而且尤其是测试检测抗体11的功能特性，所述对照14包含被检测抗体11特异性识别的表位141(例如肽性质的)。

根据一个具体实施方式，表位131和141可以是相同的，因此，抗体10和11也可以是相同的，例如如果分析物具有几个相同的表位。优选地，如果分析物仅具有不同的表位，表位131和141是不同的，例如肌钙蛋白I的情况那样。

在测试样品内存在寻找的分析物的情况下，操作者将检测到(通过视觉或使用检测工具或手段)：

-在分析物15的检测和/或量化区域中，显示在捕获抗体10、分析物12和检测抗体11之间形成夹心型复合物的信号，

-在捕获抗体生物对照区16中，显示在捕获抗体10和生物对照13之间形成复合物的信号，和

-在检测抗体生物对照区17中，显示在检测抗体11和生物对照14之间形成复合物的信号。

反过来，如果测试样品不含有寻找的分析物但该试验是功能性的(即，如果捕获抗体10和检测抗体11中的每一个都是可使用的)，将观察到以下结果：

-在分析物检测和/或量化区15中不存在信号，

-在捕获抗体生物对照区16中，显示在捕获抗体10和生物对照13之间形成复合物的信号，

如果在分析物检测和/或量化区15中未获得信号，并且在捕获抗体生物对照区16和/或在检测抗体生物对照区17中也未观察到信号，则试验结果必须被视为是无法解释的。在生物对照区16不存在捕获抗体10的生物对照的情况下，试验结果会被错误地视为阴性的，而所关注的分析物实际上包含在测试样品中。

而且，在图1中可以容易地观察到本发明的装置可以明确鉴别有缺陷的结合伴侣(在此情况中为捕获抗体10和/或检测抗体11)。这显然代表了在生产试剂盒方面的优点，所述试剂盒包含支持体(板、反应盒等)，在该支持体上固定(例如通过吸附)有捕获结合伴侣和包含检测抗体的溶液。实际上，如果使用本发明的原理证明捕获抗体10的功能特性已发生改变时，支持体将被视为不能用的，并因此必然受到破坏。

在“Magnotech”型光-磁免疫测定装置中使用的反应盒2的实例在图2中示出。该反应盒2包括设计成接收待测试的液体样品的进口21、使待测试的样品能够向反应区域23流动(例如自然地或通过毛细管作用)的通道22，在图2所示的实例中反应区域23包括单个反应室231。

如本申请全篇所述，本发明的装置可用于各种类型的免疫测定，特别是用在使用由Philips(Eindhoven，荷兰)开发的“Magnotech”平台的光-磁免疫测定中，该免疫测定的原理将在下文参照图3A-3D进行重述。

在图2所示的反应盒的反应室231中，捕获抗体和检测抗体保持为干燥形式。在图3A所示的第一步骤中，将涂有检测抗体31的磁粒子33在之前经由图2所示的反应盒2的进口21引入的液体样品的存在下再悬浮。

然后，在图3B所示的第二步骤中，激活下方的电磁体35，以便向检测区36吸引磁粒子33，在检测区36上固定有(例如通过共价键合或吸附)捕获抗体30，从而如果存在寻找的分析物32则能够在捕获抗体30、分析物32和磁粒子33所携带的检测抗体31之间形成夹心型复合物。

最后，在图3C所示的第三步骤中，使下方的电磁体35失活并激活上方的电磁体34，以便诱导不与检测区36结合的磁粒子33的回收--并因此如果在测试样品中存在所关注的分析物，则在所述检测区36仅保留其上至少一个检测抗体31借助于所寻找的至少一种分析物32结合至至少一个捕获抗体30(在上述三个实体之间形成夹心型复合物)的磁粒子33。

鉴于以上所述，下方的电磁体35可以被视为“结合”电磁体，而上方的电磁体34可以被视为“洗涤”电磁体。

可能地，在步骤2和在图3C中示出的步骤3之后，使用作为检测工具37的二维摄像传感器(“2D”，如CCD传感器)检测存在于检测区36的磁粒子/磁性球，所述检测元件包含磁粒子33。

实质上，图3D中所示的检测步骤是基于例如Bruls等人[1]或专利申请WO2013/054230中所述的受抑全内反射(f-TIR)的原理。简而言之，检测原理如下所述：入射光束38(例如通过LED型光源39)以大于临界角(取决于反应盒的组成材料)的入射角射向检测区36，从而使入射光束38全部作为反射光束40(在此情况中被称为“逐渐消散的光束”)向检测工具37反射。

如上所述，概而言之，检测原理是基于以下前提：所反射的光束40的强度与检测区36存在的磁粒子33的量成反比。换句话说，在检测工具37中观察到的反射光束40的强度降低与结合至检测表面36的磁粒子33的数目成比例，并因此与测试样品中存在的分析物32的浓度成比例。

根据本发明的第一方面，本发明的装置适合应用于“Magnotech”型光-磁免疫测定中。

本发明的第一方面的第一实施方式的装置在图4(顶视图)中示出。该装置是与图2所示反应盒类似的反应盒，其包括进口41、通道42和反应区域43，不同之处在于反应区域包括两个反应室431和432，这两个反应室不处于直接流体连通。

图5示意性地举例说明在图3A所示的“Magnotech”操作方法的第一步骤期间，本发明的第一实施方式的第一配置。

第一反应室431包括分析物检测和/或量化区56，其中固定有捕获抗体50。如图3D所示，通过检测工具37中反射光信号40的减弱显示，在所述检测区56中形成了检测抗体51(与磁粒子53缔合)、分析物52和捕获抗体50之间的夹心型复合物。

根据此第一配置，第二反应室432包括捕获抗体50的生物对照区，其中如果捕获抗体50是功能性的，检测到在生物对照55(与磁粒子53缔合)的表位551和捕获抗体50之间形成复合物。如上所述，如图3D所示，通过减弱检测工具37中的光束40，进行捕获抗体生物对照区57中的检测。

该第二反应室432还包括检测抗体生物对照区58，其中如果所述检测抗体51是可用的，将在所述检测抗体51(结合至磁粒子53)和生物对照54的表位541之间形成复合物。在此也一样，如图3D所示，通过减弱检测工具37中的光束40，显示在检测抗体生物对照区58中存在这种复合物。

图6示出本发明第一方面的第一实施方式的第二配置。正如图5所示的第一配置，图6所示的配置包括两个反应室431和432。然而，根据图6所示的配置，反应室431包括分析物检测和/或量化区56和检测抗体生物对照区58。反应室432就其本身而言包括捕获抗体生物对照区57。

因此，通过将捕获抗体生物对照区57放置在反应室中，该反应室不同于包括分析物检测和/或量化区56和抗体生物对照区58的室431，在分析物检测和/或量化区56防止分析物52和生物对照55之间就结合捕获抗体50出现竞争现象。

在图6示意性示出的第二配置中，重要的是或者甚至是必要的是，检测抗体51相对于由分析物52和生物对照54的表位541构成的结合位点的数目是过量存在的，以便防止所述检测抗体51与分析物52或生物对照54的结合出现竞争现象。

图7是本发明第一方面的第二实施方式的装置的顶视图。更具体地说，此图7显示了本发明的可用于“Magnotech”型光-磁装置中的反应盒形式的装置。该反应盒类似于图4所示的反应盒，不同之处在于反应区域73不包括两个不同的反应室，而是包括三个不同的反应室731、732和733，这三个反应室不处于直接流体连通。

这三个反应室731、732和733在图8中示意性地示出。

第一反应室731包括分析物检测和/或量化区86，其中假如在测试样品中存在分析物82，则在捕获抗体80、分析物82和检测抗体81之间形成复合物。

反应室732包括检测抗体生物对照区88，其中假如检测抗体81是功能性的，则在结合至磁粒子83的检测抗体81与生物对照84的表位841之间形成复合物。

第三反应室733包括捕获抗体生物对照区87，其中假如捕获抗体80是可用的/功能性的，则在生物对照85的与磁粒子83结合的表位851和捕获抗体80之间形成复合物。

参照图3D所述，检测这些复合物在其各自检测区域86、88和87中的存在。

本发明的第一方面的第三实施方式在图9中示意性地示出。后者涉及如图2所示包括单个反应室的反应盒形式的本发明的装置。

在此第三实施方式中，唯一的反应室99包括：

-分析物检测和/或量化区96，其中在寻找的分析物92的存在下，在捕获抗体90、分析物92和检测抗体91(与磁粒子93缔合)之间形成复合物；

-检测抗体生物对照区98，其中如果生物对照94的表位941是功能性的，在与磁粒子93结合的检测抗体91和生物对照94的表位941之间形成复合物；

-捕获抗体生物对照区97，其中如果捕获抗体90是功能性的，则在捕获抗体90和生物对照95(与磁粒子93结合)的与磁粒子93结合的表位951之间形成复合物。

如参照图6所述，对检测抗体91来说相对于其可能的结合位点(由分析物92和生物对照94构成)过量存在是重要的，以便防止上文所述的竞争现象。而且，在该第三实施方式中，对捕获抗体90来说相对于其可能的结合位点(即抗原92和生物对照95的表位951)过量存在也是重要的，以便防止在检测和/或量化区96中，生物对照95的表位951与捕获抗体90的特异性结合妨碍在所述检测和/或量化区96中形成夹心型复合物。出于相同的理由，对于生物对照的表位951来说不以过量的量存在也是重要的。如果分析物在待测定的样品中以低量存在，这是特别重要的。

根据此实施例，并且在此情况下，生物对照95的表位951不仅可以与捕获抗体生物对照区97中的捕获抗体90结合而且还可以与分析物检测和/或量化区96中的捕获抗体90结合，对于与生物对照95缔合的磁粒子93来说直接地或间接地与标记物932缔合是重要的，或甚至是必要的，从而可以检测在区96和97中哪些复合物是由于生物对照95与捕获抗体90结合形成的，并因此间接地推论出哪些复合物实际上显示了测试样品中存在分析物92。

各区也可以使用不同颜色的粒子或不同直径的粒子来区分。

根据一个替代实施方式，仅将与检测抗体91缔合的磁粒子93用标记物931标记，从而直接鉴别分析物检测和/或量化区96中的夹心型复合物。

根据一个具体的实施方式，与生物对照95缔合的磁粒子93和与检测抗体91缔合的磁粒子93分别用标记物932和931标记，所述标记物932和931彼此不同。

如上所述，本发明发现了在各种类型的夹心型免疫测定、特别是快速单元试验(也被称为侧流试验/测定)中的应用。如上所述，本申请人的专利申请WO2012/066235公开了一种装置，其可以实施快速单元试验，所述装置包含阳性对照。这一现有技术装置的操作在图10A-10D中示出。

概括地说，WO2012/066235的装置是包括支持体(未示出)、基质1001的盒，基质1001包括液体样品施加区域1002、标记区域1003、结果观察区域1005、阳性对照区域1006、任选的迁移对照区域1007和任选的样品吸收区域1008。

如图10A-10D所示，以矩形条的形式示出基质1001，其长轴处于水平位置。区域1002、1003、1005、1006、1007和1008处于流体连通。区域1003包括可见标记物标记的检测伴侣(例如有色乳胶粒子、金粒子等)。该标记的抗体可以自由穿过基质1001迁移，如果该分析物存在于测试样品中，则与寻找的分析物(在本情况中为抗原)反应。在基质1001的结果观察区域1005，对与检测抗体识别的抗原表位不同的抗原表位具有特异性的捕获抗体被固定(例如通过共价键合或吸附)。在基质1001的阳性对照区域1006中，抗原类似物被直接地或间接地固定，或者其可以在区域1006中在流体流的存在下自由迁移直到其被阳性对照区域1006中的捕获抗体固定。

图10A、10B和10C概括了专利申请WO2012/066235的试验的操作。

图10D，初看与图10A相当，如下所解释，也例示了使用上述盒获得的假阴性结果。

更具体地说，如果样品是阴性对照(即寻找的分析物在所述样品中不存在)，如图10A所示，在结果观察区域1005中没有可检测的信号发射。相反地，在阳性对照区1006以及在迁移对照区1007(信号10071；也被称为“迁移对照线”)中可以检测到信号10061(“阳性对照线”)的存在。根据专利申请WO2012/066235，这意味着一方面阴性对照样品已迁移至区域1006，另一方面装置是具有功能的。装置的功能性由被阳性对照区1006中的信号10061(“阳性对照线”)显示的检测抗体的功能特性推导出。换句话说，试验是这样的试验：其表明样品不包含任何分析物，并且根据专利申请WO2012/066235被视为无法解释的。

图10B说明采用阳性对照样品获得的结果。如此图10B中所示，在结果观察区域1005中信号10051(“测试线”)的发射是可检测的。该可检测的信号10051是由于在结果观察区域1005中在捕获抗体、抗原和检测抗体之间形成了夹心型复合物。严格来说，可检测的信号10051是由于与检测抗体缔合的标记物。在阳性对照区域1006中也具有可检测的信号10061的发射，专利申请WO2012/066235得出结论：这意味着一方面样品已发生迁移，另一方面装置是具有功能的。换句话说，试验是这样的试验：其表明样品包含分析物，并根据专利申请WO2012/066235被视为可解释的。

图10C举例说明被视为“无法解释”的结果，在此情况下在结果观察区域1005或阳性对照区1006中均未检测到信号。

通过用阳性对照样品(即包含寻找的分析物)放大试验，申请人惊讶地以极小比例更新了图10D中所示的谱图，图10D与图10A中所描绘的谱图相同，即在结果观察区域1005中不显示任何信号，但在阳性对照区域1006中显示信号10061以及在迁移对照区域1007中显示信号10071。

鉴于按照定义在进行该试验中使用的阳性对照样品包括寻找的分析物，申请人因此得到结论：根据申请WO2012/066235的教导，仍可能获得假阴性结果。意想不到地，申请人发现，通过向盒加入捕获抗体对照，该盒显示出的检测灵敏度大于申请WO2012/066235中描述的盒。

图11A、11B、11C、11D、11E和11F显示类似于WO2012/066235所述的盒但具有增加的检测灵敏度的盒的操作。图11A-11F示出本发明的第二方面的侧流测定装置的顶视图。

如图11A中所示，该装置包括支持体(未示出)、基质1101(以矩形条的形式示出，其长轴处于水平位置)，所述基质包括样品施加区域1102、标记区域1103和反应区域1800。该反应区域包括分析物检测区(在此情况中为抗原)1105、捕获结合伴侣阳性对照区1109(例如抗体)、检测结合伴侣阳性对照区1106(例如抗体)和任选的迁移对照区1107。基质1101还可以任选地包括样品吸收区域1108。

为了防止在分析物检测区1105中待测定的样品的分析物和第一分析物类似物CTRL1之间的竞争现象，将第一分析物类似物CTRL1(包括例如与标记物或标记前体偶联的P1的表位肽)放置在此分析物检测区1105的下游(在液体迁移的方向上)，且在其中固定有P1的捕获抗体阳性对照线的上游，即在区1104(位于区1105和1109之间)中，或者在位于所述捕获抗体阳性对照线上游的捕获抗体阳性对照区1109的子区域中，在此固定有捕获抗体P1。

检测抗体P2阳性对照区1106就其本身而言包括固定在检测抗体P2阳性对照线中的第二分析物类似物CTRL2。标记区域1103包括过量的检测抗体P2。

适用时包括如上所述的捕获抗体阳性对照线上游的所述子区域的捕获伴侣P1阳性对照区1109也可以在检测伴侣P2阳性对照区1106(未示出)之后发现。反应区域1800因此按顺序包括分析物检测区(在此情况中为抗原)1105、检测抗体阳性对照区1106、捕获抗体阳性对照区1109和任选的迁移对照区1107。基质1101还可以任选地包括样品吸收区域1108。

如何通过固定或其它方式使各组件包括在装置中是本领域技术人员已知的，并被记载在例如专利申请WO2012/066235中。

图11B举例说明在采用所谓的“阴性对照”样品(即不含有寻找的分析物)后利用本发明的装置获得的结果。因为样品为阴性对照，根据定义，在分析物检测区1105(更具体地说在测试线中)中没有可检测信号的发射。相反，在捕获抗体阳性对照区1109(在捕获抗体阳性对照线中的信号11091)、在检测抗体阳性对照区1106(在检测抗体阳性对照线中的信号11061)以及在迁移对照区域1107(在迁移对照线中的信号11071)(如果其存在)中存在可检测信号的发射。这意味着一方面阴性对照样品已迁移至少远至区域1106，或甚至远至迁移区域1107(如果其存在)，另一方面捕获抗体和检测抗体都存在且为功能性的。

图11C举例说明在使用对预定分析物呈阳性的样品后采用本发明的装置获得的结果。如图11C中所示，因为样品对于预定分析物(抗原)呈阳性，在分析物检测区1105(在测试线中的信号11051)、在捕获抗体阳性对照区1109(在捕获抗体阳性对照线中的信号11091)、在检测抗体阳性对照区1106(在检测抗体阳性对照线中的信号11061)以及在迁移区域1107(信号11071)(如果其存在)中具有可检测信号的发射。这意味着一方面样品已迁移至少远至区域1106，或甚至远至区域1107(如果其存在)，另一方面捕获抗体和结合抗体都存在且为功能性的。

图11D、11E和11F举例说明了在应用对于待测定的分析物显然为阴性的样品之后获得的结果。

如图11D中所示，在捕获抗体阳性对照区1109中信号11091的存在表明捕获抗体是功能性的。相反，在检测抗体阳性对照区1106中不存在信号表明此检测抗体的功能特性至少部分地发生改变。不能得出样品是阴性的结论。只能得出试验是无法解释的结论。

关于在图11E中示出的结果，这是相反的情况，但是相当的。事实上，虽然在检测抗体阳性对照区1106中存在可检测的信号11061表明此检测抗体的功能特性，但在捕获抗体阳性对照区1109中不存在可检测的信号表明捕获抗体至少部分地发生改变。相对于图10D中所示的现有技术装置，捕获抗体阳性对照区1109的存在可以将获得的结果视为潜在假阴性的，而不是视为似乎表明在测试样品中不存在分析物。如上所述，这可以显著增加此侧流测定的灵敏度。

最后，如图11F中所示，在捕获抗体阳性对照区域1109和检测抗体阳性对照区域1106中未检测到任何信号表明，这两种类型抗体的功能特性均至少部分地发生改变，测试结果当然是无法解释的。

根据另一实施方式(未示出)，装置可以包括两段S1和S2，每段均包括样品施加区域。这两段在物理上是分开的，在下文进行定义：

-第一段S1除样品施加区域之外还包括标记区域和反应区域，反应区域包括分析物检测区和检测结合伴侣P2阳性对照区，和

-第二段S2除样品施加区域之外还包括捕获结合伴侣P1阳性对照区，捕获结合伴侣P1阳性对照区包括捕获伴侣P1被固定在其中的子区域(例如以P1阳性对照线的形式)，并且如上所述，对照CTRL1被放置在所述子区域的上游(在液体迁移的方向上)。

该实施方式证明是特别有益的，因为如果第一段的读数最初表明在测试样品中不存在分析物，但是检测结合伴侣P2对照CTRL2是阳性的，则使用者可以仅使用该第二段S2。在这种情况下，使用者不知道获得的结果是否是真阴性，即寻找的分析物是否不存在于测试样品中，或者捕获结合伴侣P1是否是有缺陷的。由于第二段S2(例如通过视觉或光学读取第二段S2)，使用者可以容易地在这两种假设之间作出决定。而且，这能够使第二段S2的样品被替换成适当的缓冲剂，其与该段中的样品是可互换的。

以举例但非限制性的方式使用以下给出的实施例将更好地理解本发明。

实施例1：制备用于结合伴侣的生物对照的表位肽

1.1.肽合成

通过化学合成根据本领域技术人员熟知的步骤如Merrifield,1962(Merrifield,1962,J.Am.Chem.Soc.85:2149)和Fieldsetal,1990(FieldsGB,NobleRL.,1990,IntJPeptProteinRes.,35(3):161-214)所述的固相肽合成，使用含有0.1-1.0mMol胺/g聚合物的聚苯乙烯型聚合物，来制备含有被抗-肌钙蛋白I抗体19C7(SASRKLQLK)和560(ELTGLGFAELQ)(Hytest，Turku，芬兰)识别的表位的肽。在化学合成之后，在三氟乙酸-乙二硫醇-三异丙基硅烷-水(94/2.5/1/2.5V/V/V/V)混合物的存在下使肽脱保护并从聚合物裂解大约2小时。在除去聚合物后，通过在0℃下在二乙醚中沉淀来提取肽。通过诸如高效液相色谱法等技术使其纯化。冻干适当的纯化级份得到均质肽，其通过标准物理化学技术如质谱法、高效液相色谱法和氨基酸来表征。

1.2.偶联表位肽与牛血清白蛋白

通过sulfo-SMCC(25mg/ml，ThermoFischerScientificInc.，Rockford，IL，USA)使每种表位肽与牛血清白蛋白(BSA，Proliant，Ankeny，IA，USA)偶联。以1/10的BSA/SMCC比在30℃+/-1℃下孵育1小时来进行这一化学修饰，之后用50mMPO4、150mMNaCl缓冲液pH6.8透析。将每种表位肽在50mMPO4、150mMNaCl、5mMEDTA缓冲液pH6.8中稀释至5g/L，然后使其以每分子BSA3分子表位肽的比率与BSA-SMMC接触。在2-8℃下孵育18h后，通过加入2-氨基乙硫醇(2MEA，ThermoFischerScientificInc.，Rockford，IL，USA)并在搅拌下孵育20分钟来阻断偶联反应，2MEA的浓度符合2MEA和SMCC分子之间的等摩尔浓度。每种BSA-表位肽对照用PBS、0.9g/L叠氮化物缓冲液透析并保持在2-8℃。

1.3.偶联表位肽与磁粒子

如JarrigeV等人，2011(5)和Dittmer等人，2010(3)所述，用羧基基团官能化直径为500nm的超顺磁性粒子(Ademtech,Pessac，法国)。对照--与单克隆抗体19C7的表位肽偶联的BSA--各以每mg磁粒子20μg/BSA-表位肽的浓度被固定到磁粒子上。

实施例2：具有表位肽CTRL2的结合伴侣P2的生物对照

该对照在检测作为分析物的肌钙蛋白I的试验中的原理如图12中所示，P11200和P21201分别是抗-TnI单克隆抗体19C7和560，如上所述P21201与磁粒子1203偶联，并且CTRL21204是如上所述与BSA12042偶联的P2表位肽12041。

2.1.制备盒

Magnotech盒(Philips，Eindhoven，荷兰)包括三个元件，即：光学部件1209、条带1210和其上设置样品的过滤单元(未示出)。

光学部件是该盒的下方部件。其包括过滤的样品进入点，该过滤的样品进入点经由微流体通道与两个反应室(室1和2)连接。

条带是生物相容性粘附膜，其构成盒的上方部件，并关闭反应室和蚀刻至光学部件中的流体通道。

如图13所示，如Dittmer等人[7](JournalofImmunologicalmethods,338:40-46)所述，通过印刷(sciFLEXARRAYER，S11，ScienionAG)以40μg/mL抗体的浓度将抗-肌钙蛋白I抗体19C7(结合伴侣P1)以点的形式设置在每个反应室(P1点1300)中。

在实施例1.2.中制备并用作结合伴侣P2的生物对照(如实施例1.3.中所述与官能化磁粒子偶联的抗-肌钙蛋白I抗体560，除了抗体的浓度为每mg磁粒子60μg抗体)的对照CTRL21204(与抗-肌钙蛋白I抗体560的表位肽偶联的BSA)也是以点的形式以0.1μg/mLCTRL2(CRTL2-1点13041)或1μg/mLCTRL2(CRTL2-2点13042)的浓度设置。

通过NanodropNS-2Stage(InnovadyneTechnologies,Inc.Carnforth,UK)使结合伴侣P2设置在每个反应室的条带1209的表面上。

然后将这三个元件组装起来，并在干燥剂的存在下于4℃保存。

2.2.测定样品

通过Magnotech技术(Philips,Eindhoven，荷兰)对三种类型的样品测定10次，即一个所谓的TnI-阴性样品，其包含肝素化血浆，并且肌钙蛋白I的浓度小于0.01μg/L；和两个TnI-阳性样品，它们也是用相同的肝素化血浆制备的，但过载纯化的人心肌肌钙蛋白(ITC复合物，Hytest，Turku，芬兰)以达到1.05μg/mL和2.43μg/mL的浓度。将结果平均化并以任意的所谓的“信号变化”单位表示，表示在检测区域中没有固定粒子(即没有分析物)的信号和具有固定粒子(即在分析物的存在下)的信号之间的差值。这种“信号变化”以百分比表示。结果在图14中描述。

图14中的图表明：

-在测定肌钙蛋白-阴性样品期间，在两个室中在P1点1300上观察到被视为阴性(小于0.4％)的信号，而结合伴侣P2的生物对照给出阳性信号(CTRL2-1点13041和CTRL2-2点13042)。这证实了与球偶联的抗体560是有功能的，以及样品是真阴性。此外，其还表明在与进行分析物检测的室不同的室中或者在相同的室中可以同样良好地进行阳性对照。

-对各自浓度为1.05μg/mL和2.43μg/mL的肌钙蛋白-阳性样品的测定表明在P1点1300上的信号增大(信号从14％增大到41％)。还观察到在CTRL2点13041和13042，在用肌钙蛋白I-阳性样品获得的信号和那些来自阴性样品的信号之间未检测到明显的改变。这也表明在样品中存在的肌钙蛋白I不影响生物对照，因为甚至在高浓度的肌钙蛋白I下观察到与CTRL2(CTRL2点13041和13042)上的抗-肌钙蛋白I抗体560(P2)偶联的磁球的固定。

实施例3：具有表位肽CTRL1的结合伴侣P1的生物对照

在检测作为分析物的肌钙蛋白I的试验中该对照的原理在图15中示出，P11500是抗-TnI单克隆抗体19C7，CTRL11505是如上所述与磁球1503偶联的P1表位肽15051。

3.1.制备盒

如2.1.中所述制备盒，不同之处在于将在上文1.3.中制备的对照CTRL11505(与抗-肌钙蛋白I单克隆抗体19C715051的表位肽偶联的磁球1503)设置在反应室中的条带1510上，与结合伴侣P11500(固定到光学部件(P1点；未示出)上的单克隆抗体19C7)相对。

3.2.测定样品

通过Magnotech技术(Philips，Eindhoven，荷兰)对两种类型的样品测定5次，即一种所谓的TnI-阴性样品，其包含肝素化血浆，并且肌钙蛋白I浓度小于0.01μg/L；以及一种TnI阳性样品，其也是用相同的肝素化血浆制备的，但过载纯化的人心肌肌钙蛋白(ITC复合物)以达到20μg/L的浓度。结果为平均值，并作为信号变化(％)表示。其在图16中描述。

图16中的图表明：

-在测定肌钙蛋白I-阴性样品期间，获得59％的平均阳性信号(CTRL1点；未示出)，这证明结合伴侣P11500(抗体19C7)是具有功能的；

-在测定肌钙蛋白I-阳性样品期间，获得60％的平均阳性信号。这一信号水平类似于阴性样品的信号水平，表明结合伴侣P11500(抗体19C7)的生物对照，并且也证明了抗体19C7(P11500)对CTRL11505(BSA-P1表位肽对照)的识别不受样品中存在的肌钙蛋白I的影响。

参考文献

[1]BRULSetal.<<Rapidintegratedbiosensorformultiplexedimmunoassaysbasedonactuatedmagneticnanoparticles>>.TheRoyalSocietyofChemistry,(2009).3504,LdbChip,2009,9,3504-3510.

[2]DITTMERetal.<<Rapid,highsensitivity,point-of-caretestforacardiactroponinbasedonoptomagneticbiosensor>>.ClinicaChimicaAeta,(2010).411(2010)868-873.

[3]MORROWetal.Clin.Chem.(WashingtonD.C.J,(2007).53,552-574.

[4]JARRIGEetal.<<AfastintraoperativePTHpoint-of-careassayonthePhilipshandheldmagnotechsystem>>.LangenbecksArchSurg,(2011).396:337-343.

[5]YAGERetal.Nature,(2006).442,412-418.

[6]WILD，D.TheImmunoassayHandbook，Elsiever，Amsterdam，2005.

[7]DITTMERetal.UournalofImmunologicalmethods，338:40-46).

Claims

1.一种可在生物分析期间检测和/或量化液体样品中的至少一种分析物的装置，所述装置采用所述分析物的至少两个结合伴侣P1和P2，第一结合伴侣P1被固定在所述装置内，第二结合伴侣P2通过与分析物和第一结合伴侣P1形成夹心型复合物而是可固定的，所述装置包括处于液体连通的至少两个区域，即：

a)液体样品施加区域，和

b)用于检测和/或量化所述至少一种分析物的反应区域，所述装置包含所述分析物的至少第一类似物CTRL1和所述分析物的至少第二类似物CTRL2，所述第一类似物CTRL1通过与固定的第一结合伴侣P1结合而是可固定的，所述第二类似物CTRL2被固定在所述装置内以便与可固定的第二结合伴侣P2结合，并由此使可固定的第二结合伴侣P2固定，

所述反应区域b)包括至少以下三个区：

b.2)用于第一结合伴侣P1的第二生物对照区，其中固定有第一结合伴侣P1，并显示第一结合伴侣P1和第一分析物类似物CTRL1之间的结合，这表示第一结合伴侣P1的阳性对照，和

b.3)用于第二结合伴侣P2的第三生物对照区，其中固定有第二分析物类似物CTRL2，并显示第二结合伴侣P2和第二分析物类似物CTRL2之间的结合，这表示第二结合伴侣P2的阳性对照。

2.根据权利要求1所述的装置，所述装置包括液体样品迁移区域c)，其使液体样品从液体样品施加区域a)向反应区域b)迁移。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其中第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2由抗体组成，第一分析物类似物CRTL1和第二分析物类似物CRTL2至少包含分别被第一抗体P1和第二抗体P2识别的表位，优选地，第一分析物类似物CRTL1和第二分析物类似物CRTL2是至少含有分别被第一抗体P1和第二抗体P2识别的表位的肽。

4.根据权利要求1至3中的一项所述的装置，其中第二结合伴侣P2和第一分析物类似物CTRL1最初被设置在装置内，并适合在液体样品的存在下再悬浮。

5.根据权利要求1至4中的一项所述的装置，其中反应区域b)包括至少两个不同的部分，例如两个不同的反应室，在这两个部分之间没有直接的流体连通，第一部分包括第一区b.1)，第二部分包括第二区b.2)和第三区b.3)。

6.根据权利要求5所述的装置，其中第一部分除固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除均被固定的第一结合伴侣P1和第二分析物类似物CRTL2之外还包含均为可固定的第一分析物类似物CTRL1和第二结合伴侣P2。

7.根据权利要求1至4中的一项所述的装置，其中反应区域b)包括至少两个不同的部分，例如两个不同的反应室，在这两个部分之间没有直接的流体连通，第一部分包括第一区b.1)和第三区b.3)，第二部分包括第二区b.2)。

8.根据权利要求7所述的装置，其中第一部分除均被固定的第一结合伴侣P1和第二分析物类似物CRTL2外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除固定的第一结合伴侣P1之外还包含可固定的第一分析物类似物CTRL1、可固定的第二结合伴侣P2，优选地，所述可固定的第二结合伴侣P2过量存在于所述第一部分中。

9.根据权利要求1至4中的一项所述的装置，其中反应区域b)包括至少三个不同的部分，例如三个反应室，在这三个不同的部分之间没有直接的流体连通，第一部分包括区b.1)，第二部分包括区b.2)，第三部分包括区b.3)。

10.根据权利要求9所述的装置，其中第一部分除固定的第一结合伴侣P1外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第二部分除固定的第二分析物类似物CTRL2外还包含可固定的第二结合伴侣P2，第三部分除固定的第一结合伴侣P1外还包含可固定的第一分析物类似物CTRL1。

11.根据权利要求5至10中的一项所述的装置，其中所述部分平行或串联地设置在液体样品路径上，优选平行地。

12.根据权利要求1至4中的一项所述的装置，其中反应区域b)包括至少一个部分，例如一个反应室，所述部分包括：

-三个区b.1)、b.2)和b.3)，

-第二结合伴侣P2和第一分析物类似物CTRL1，二者均为可固定的，

第一结合伴侣P1和第二结合伴侣P2过量存在，并且其中：

-第一分析物类似物CTRL1直接地或间接地与标记物M1缔合，使其可显示在区b.1)和b.2)中第一分析物类似物CTRL1与第一结合伴侣P1的结合，和/或

-第二结合伴侣P2直接地或间接地与不同于标记物M1的标记物M2缔合，使其可显示在区b.1)和b.2)中在第二结合伴侣P2、分析物和第一结合伴侣P1之间形成夹心型复合物。

13.根据权利要求2至12中的一项所述的装置，其中液体样品迁移区域c)包含基质。

14.根据权利要求1至13中的一项所述的装置，其中液体样品施加区域a)包括过滤器。

15.一种在生物分析期间检测和/或量化液体样品中的至少一种分析物的方法，所述方法采用至少两个分析物结合伴侣P1和P2，所述方法包括以下步骤：

(i)使液体样品与权利要求1至14中任一项所述的装置接触，

(ii)如果在区b.2)中结合伴侣P1的生物对照和在区b.3)中结合伴侣P2的生物对照是阳性的，则解释从所述装置获得的结果，以及

(iii)否则，获得的结果被视为无法解释的。

16.至少两个分析物类似物CTRL1和CTRL2分别用于至少两个结合伴侣P1和P2的生物对照的用途，所述结合伴侣P1和P2可通过显示在第二结合伴侣P2、分析物和第一结合伴侣P1之间形成夹心型复合物来检测和/或量化所述分析物。