CN101473043A - 使用横向流动方法的核酸检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测样品中的靶核酸的方法和试剂盒。在一个具体的应用中，所述方法和试剂盒允许检测食品中或存在于食物制品表面上的不良微生物(如李斯特菌属、沙门氏菌属或肠杆菌科)。

Description

使用横向流动方法的核酸检测

技术领域

本发明涉及用于检测样品中靶核酸的方法和试剂盒。在一个具体的应用中，本发明允许检测食品中或存在于食物制品表面上的不良微生物(例如李斯特菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)或肠杆菌属(Enterobacter))。

优先权文献

本申请要求来自以下临时专利申请的优先权：

于2006年4月10日提交的篇名为“核酸检测方法”的澳大利亚临时专利申请No.2006901847；于2006年4月10日提交的篇名为“核酸检测方法”的美国临时专利申请No.60/790,536。将这两篇文献的全部内容均以引用的方式并入本文。

背景技术

近年来，已报告的由微生物造成食物中毒的爆发的数量在世界范围内增加。这些食源病原体可以作为污染物存在于在类型多样的食品中以及食品加工环境中(如食物制品表面)，其中所述的食品包括肉制品(如红肉、禽肉和海产品)、蛋产品、乳产品(如乳酪、乳和冰淇凌)、糖果和水果及蔬菜。沙门氏菌属(Salmonella)和李斯特菌属(Listeria)尤其被多数国家的食品安全机构视为重大食品污染的原因，并且许多这些食品安全机构要求针对这些细菌进行环境检验和终末检验。因此，对食品和食品加工环境两者进行常规检查由此类微生物所致的污染是惯例。

也在其它工业例如医药和化妆品制造工业中进行相似的检验。对微生物的检验通常包括获得样品例如食物样品、来自待检测区域的拭子或取自地板扫除物、废水及生产用水或滤过空气的样品，转移该样品至预富集或富集培养基以增加受损微生物的恢复和修复，随后进行一个或两个额外的选择性富集步骤以增加目的微生物数，并且此后使用传统培养方法或诸如免疫测定法之类的快速方法测检特定微生物在培养基中的存在。

检验李斯特菌属和沙门氏菌属的快速方法已经并入本发明申请人提供的系统内。在如澳大利亚专利说明书No 610925中所述的称作UNIQUE^TM系统的一个实例中，该系统包括首先转移样品至预富集培养基16小时，并随后转移预富集培养物的小等分试样至第一试管内，将包被有对抗所关注微生物的抗体(例如抗沙门氏菌抗体)的检测试纸条(dipstick)插入其中检测试纸条20分钟，在此期间存在于该第一试管中的任何任何微生物均被捕获至检测试纸条表面上。此后，该系统包括在第二试管内洗涤检测试纸条，此后转移该检测试纸条至装有生长培养基的第三试管内，并且培养与检测试纸条结合的任何微生物以便在检测试纸条表面上繁殖直至存在足以允许检测的数目。对于沙门氏菌属，该培养期通常花费约4小时。在该培养期后，UNIQUE^TM系统则涉及在含有用酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗所关注微生物抗体的第四试管中孵育此检测试纸条30分钟，该抗体与检测试纸条上存在的任何微生物结合，随后在第五试管中洗涤该检测试纸条(即用以除去过量的或未结合的标记抗体)，并且最后，将该检测试纸条转移至含有酶标记的色原体前体的第六管内。若所关注的微生物存在，则从该前体中产生色素原(通常颜色上呈紫色)并且这表现为在检测试纸条上的有色区。

这种UNIQUE^TM系统已经证明对众多微生物如李斯特菌属和沙门氏菌属是极为可靠的。然而，本申请人认识到改进以实现更为便利并涉及更少用户时耗的系统将通过改善(例如)与用于多种孵育/培养期的最佳时间及条件(如温度)的符合性而增加可靠性。为此目的，UNIQUE^TM系统已经加以自动化，并且这种自动UNIQUE PLUS^TM系统已在本申请人的共同未决的澳大利亚专利申请No.2002333050中描述。

因样品中微生物的“阳性”检验结果往往导致严重的后果或退货，常常希望在相同或相似的样品上进行确证检验。目前，对于UNIQUE^TM和UNIQUE PLUS^TM系统而言，此类确证检验通过简单地将来自上述第一试管或第三试管的样品等分试样在琼脂上接种并检验任何生长的微生物的生物化学特征和形态学特征而进行。该方法可能容易出错并且还可能是费力的并引起明显的时间拖延(例如使用该方法，确证结果可能花费至多到48至72小时)。此外，对于某些微生物检测系统，阳性检验结果可以仅指示源自具体属的微生物的存在，而可能优选的是或希望的是鉴定具体物种(例如对于受李斯特菌属污染的食品，产品召回可能仅在污染由人病原体即单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)所致的情况下才强制进行)。本申请人在下文描述了用于检测诸如食源病原体之类的微生物的简单、迅速(例如约1至4小时)且可靠的方法，该方法可以容易地用于从UNIQUE^TM或UNIQUEPLUS^TM检验系统获得的样品(例如来自上述第一试管或第三试管的样品等分试样)或其它合适样品以提供确证结果，并且还可以由此可揭示特定微生物物种的方式进行。所述方法还适用于筛选测定法。

本发明内容

因此，在第一方面，本发明提供用于检测样品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，以使得对靶序列的任意扩增产生了第一和第二标签双标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的组分朝该横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置处，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；和

(v)检测缓冲产物的组分在所述检测区以及在所述对照区的任意结合。

检测检测区处的结合提供了显示样品中存在旨在被检测的微生物的结果。

对照试剂可用特异性结合至第一试剂，在此情况下，检测检测区处的结合提供了显示微粒已经成功流过基底并且微粒结合的第一试剂能够被对照试剂结合的结果。

在检测区和对照区处的结合容易通过观察(如可以由微粒提供的)颜色出现而方便地检测。优选地，对照区位于横向流动装置的检测区和远端之间。

该方法可以轻易地进行变化，以使得将第一引物序列的第一标签省略并用经标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)替换。

因此，在第二方面，本发明提供用于检测样品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，其中靶序列的扩增利用了用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)并且所述第二引物序列用第二标签标记，以使得对靶序列的任意扩增产生了第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一标签之一的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的组分朝该横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置内，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

附图简述

图1提供适用于本发明方法的横向流动装置的示意图。该示意图显示装置(1)包括样品垫(2)、膜(3)、吸附垫(4)和支持卡(5)。据显示检测区(6)和对照区(7)邻近吸附垫(4)。检测区(6)提供检验结果而对照区(7)提供阳性对照结果。

具体实施方式

本发明提供用于检测样品中存在的微生物的方法。具体而言，所述方法旨在检测食品中存在的微生物如细菌(例如李斯特菌属、沙门氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希杆菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和螺杆菌属(Helicobacter))，然而，该方法也适合用于检测可能在食物、水或其它环境样品中存在的其它类型微生物例如病毒、酵母、霉菌和原虫(如隐孢子虫(Cryptosporidium))。

在第一方面，本发明的方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置内，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；和

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

样品可以是任意合适的样品，包括(例如)食物样品、从食物制品表面的拭子制备的样品、废水或生产用水样品和微生物培养物或富集样品(如来自UNIQUE^TM系统检验的第一试管或第三试管中的样品等分试样)。

已经发现含准备用于检测的微生物的样品并不总是需要在步骤(ii)的扩增之前从该微生物中分离核酸的任意步骤。而是，该样品可能仅需要进行处理，优选通过加热(如在85-100℃范围的温度下)进行处理，以引起微生物核酸(例如通过裂解)释放，并且，优选的是，使任意双链核酸(如dsDNA)变性(即“解链”)成单链核酸(例如ssDNA)。步骤(i)可能实际上不由实施剩余方法步骤的同一方实施(如样品收集者可以在将样品送递至实验室之前加热样品以使核酸从存在的任何微生物中释放)。

扩增步骤(ii)可以使用本领域技术人员熟知的任意方法进行。优选的是，使用标准聚合酶链反应(PCR)扩增方法，利用限定靶核苷酸序列5’和3’端的一对引物序列(即第一和第二引物序列)实施扩增。然而，在一些情况下，可能优选的是使用“嵌套式”PCR扩增方法，利用另外的“外侧”引物序列对(即第一外侧引物序列和第二外侧引物序列)实施扩增步骤。

通过选择物种特异性引物序列，该方法可以由此揭示样品中存在的具体微生物物种的身份的方式进行。

优选对第一和第二引物序列加以选择，以使得在扩增步骤(ii)期间产生的扩增子具有40-3000个核苷酸长度、更优选50-1500个核苷酸长度。通常，扩增子越短，则可以越迅速地完成扩增步骤(ii)。本领域技术人员将充分理解，如果合适，第一引物和第二引物可以是简并引物或者，以别的方式，可以据需要包括多种引物以确保靶核苷酸序列的检测。

在第一方面的方法中，第一和第二引物序列分别用第一和第二标签标记。优选地，第一和第二标签选自半抗原，例如生物素、荧光素衍生物(如FITC)、若丹明衍生物(如TAMRA)、级联蓝(CascadeBlue)、荧光黄、5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)、二硝基苯酚(DNP)、地高辛(DIG)和短肽标签序列(即可以针对其而产生特异性抗体的短肽)。更优选地，第一标签是生物素而第二标签是DNP，在这种情况下，扩增步骤(ii)期间产生的扩增子由生物素和DNP两者标记。

在扩增步骤(ii)后，将一定量的扩增产物在合适的缓冲液中稀释。该缓冲液包含用特异性结合至第一标签的第一试剂标记的微粒。该步骤(iii)可以简单地涉及将扩增产物直接稀释进已制备的包含所述微粒的缓冲液，或另外它可以涉及逐步稀释过程，其中扩增产物最终稀释于所述包含微粒的合适缓冲液中。此种逐步稀释过程的具体实施例涉及，首先添加一定量的扩增产物至缺少包含所述微粒的所述合适缓冲液，并且此后添加所述微粒至扩增产物-缓冲液组合物。方便的是，可以通过这样的方式实现将微粒加至扩增产物缓溶液组合物，即让扩增产物-缓冲液组合物与已经在其上干燥了所述微粒的收集容器或表面接触，以使得微粒悬浮在扩增产物-缓冲液组合物中，由此形成所需的包含所述微粒的合适缓冲液。

步骤(iii)进行足以允许第一试剂结合至扩增产物中存在的所述第一标签的时间。优选地，步骤(iii)进行的持续时间范围为0.1-5分钟、更优选0.2-1分钟。

微粒可以由各种物质组成，不过优选由一种或多种基本上惰性的物质例如金、硅、硒、聚苯乙烯、三聚氰胺树脂、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和聚乙烯基甲苯组成。微粒优选是无孔的。微粒可以包含允许横向流动装置上的检测区和对照区处的结果可视化的物质。便利的是，此种物质将是允许以肉眼观察的染料或其它有色物质，然而，这种物质可以是(例如)允许因产生有色物质(例如酶或其它催化性标签)或因荧光、发光或磁力相互作用(如使用荧光计、光度计或磁感应)而观察到的标签物质。微粒可以具有范围为0.002至5/μm的直径大小。优选的是，微粒是具有范围为0.002至0.25/μm(即2至250nm)、更优选0.01至0.06μm(即10至60nm)的直径大小的金微粒，并且最优选的是具有0.04μm(即40nm)的平均直径大小的金微粒。合适的聚苯乙烯微粒包括具有范围为0.1至5/μm的直径大小的聚苯乙烯微粒。

第一试剂选自能够与第一标签特异性结合或与之反应的试剂。因而，第一试剂可以是抗体、抗体片段(如Fab、F(ab′)₂和scfv片段)、受体或其它结合伴侣。第一试剂本身可以缀合至允许因在添加合适底物后产生可检测产物而可视的酶或催化性物质。在第一标签是生物素的情况下，第一试剂可以是链霉亲和素或抗生物素蛋白，不过更优选地是抗生物素抗体。

步骤(iii)的缓冲产物在横向流动装置的近端处或邻近该近端施加。该横向流动装置包括允许缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动的基底。通常，横向流动装置是条状基底形式(例如尺度4-8mm×40-80mm)。优选的是，基底由硝化纤维素膜、聚偏氟乙烯(PVDF)、尼龙或单一多孔材料基底(如Fusion 5(Whatman，Middlesex，UK)组成，并如美国专利说明书No2006/0040408中所述)。

该横向流动装置在远端处或邻近该远端设有检测区和对照区。检测区设有特异性结合至第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂。试剂可以缀合或吸附至蛋白质、微粒或其它物质，以使得试剂固定至检验基底上。

检测区提供检验结果。也就是说，检测区结合并固定扩增子(其中每种扩增子应当与微粒结合)并由此提供显示样品中存在或不存在旨在检测的微生物的结果。A“阳性”检验结果(即指示样品中存在微生物的检验结果)优选由检测区处出现(如微粒所提供的)可视颜色信号而指示。在微粒是金微粒的情况下，可视颜色信号将是粉红色-红色。

对照区是横向流动装置上与检测区隔开的区域。优选地，对照区位于横向流动装置的检测区与远端之间。对照区提供阳性对照结果。如下文所述，该阳性对照结果可以显示微粒已经成功地流过基底，或以别的方式，指示步骤(ii)扩增是成功的。任选地，对照区可以包含第一亚区和第二亚区，第一亚区能够提供显示微粒已经成功流过基底的阳性对照结果，而第二亚区能够指示步骤(ii)扩增是成功的。

因此，在最简单的情况下，对照区设有特异性结合至第一试剂的对照试剂，在这种情况下，对照区结合并固定微粒并且由此提供指示微粒是否已经成功流过基底的结果。步骤(ii)的缓冲液中存在的微粒量可以因此足以提供用于结合至该对照区的未结合微粒(和/或与未掺入的第一引物结合的微粒)的量。然而，缓冲液中存在的微粒量可能也是足够的，若除未结合的微粒量之外或作为其替代，该微粒量还提供相对于可以为检测区所结合的量为过量的(即与双标记扩增子结合的)结合微粒量(即因而提供可以流经过检测区进入对照区的结合微粒的量)。如果对照区包含与第一标签相同或功能等价的对照试剂时，则阳性对照结果指示第一试剂与第一标签之间的结合应当已经是成功的。

如果扩增可能是在潜在抑制性分子(如可能在样品中找到的抑制性分子)存在下进行，则用于步骤(ii)扩增的阳性对照可能是特别有价值的。可以通过这样的方式在单独的扩增容器中开展用于步骤(ii)扩增的阳性对照，即与步骤(ii)扩增平行地扩增在对照核酸上所提供的对照核苷酸序列(如与靶核苷酸序列大约相等长度的序列)，并随后在步骤(iii)之前合并单独扩增的产物。然而，优选的是，用于扩增的阳性对照涉及在步骤(ii)中包括提供对照核苷酸序列的对照核酸，和限定该对照核苷酸序列5’和3’端的一对第三引物序列和第四引物序列。因此，对照核酸可以在步骤(i)处理之前或之后添加至步骤(ii)的扩增混合物内或导入所述的样品中。优选的是，第三引物和第四引物将优选具有与第一引物和第二引物相似的解链温度(Tm)和引发特征，以便允许能使用相同的退火温度和扩增时间。第三引物序列和第四引物序列分别用第三标签和第四标签标记(如生物素、DNP、FITC和DIG均可以使用)，其中第三标签和第四标签优选均异于第一和第二标签，尽管第一标签和第三标签有可能是相同的(或者说是功能等价的)，在这种情况下，在步骤(iii)中第一试剂标记的微粒应当结合至从第一和第二引物序列产生的扩增子以及从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子。然而，如果第一标签和第三标签不同，包含扩增的阳性对照必需向步骤(iii)中使用的缓冲液添加特异性结合至第三标签的第三试剂标记的微粒。在这种情况下，横向流动装置上的对照区将包含特异性结合至第四标签的对照试剂。

因此，第一方面方法的步骤(ii)可以包括：提供对照核酸，并共扩增所述微生物核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，并且其中对靶序列的所述扩增包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；以及^TM

所述对照核酸上存在的对照核苷酸序列，其中对照序列的所述扩增包括使用限定所述对照序列的5’和3’端的一对第三引物序列和第四引物序列，所述第三引物序列用第三标签标记(该标签可以与第一标签相同或与其功能等价)而所述第四引物序列用第四标签标记，以使得对照序列的任意扩增产生第三标签和第四标签两者标记的扩增子。

阳性对照结果优选由检测区处出现(如微粒所提供的)可见颜色信号指示。如果微粒是金微粒，则可件颜色信号是粉红色-红色。

横向流动装置还可以包括在近端处的样品垫和/或位于远端处的吸附垫，以辅助步骤(iii)的缓冲产物的成分流过基底。此外，横向流动装置可以设有用于基底的支持手段，例如，一张卡纸板或硬质聚合物，基底可以附连至其上。另外，横向流动装置可以设有用于容纳多重阵列或甚至巨型阵列用途中的装置的任何合适容器(如托盘)中的两个或更多个相同或相似装置。

检测在检测区和对照区处步骤(iii)缓冲产物的成分的任意结合的步骤最优选是通过简单地用肉眼观察(如由微粒提供的)可见颜色信号的出现而进行。然而，颜色的出现或颜色的强度可以使用光学或反射检测器(如电荷耦合器件(CCD)或明视传感器)测量。在检测区内的颜色强度可以用作样品中存在的微生物量的半定量性度量。某些微粒也可以用作吸收或发射可检测辐射(例如特定波长的光)的标签。

如上所述，扩增步骤(ii)可以使用嵌套式PCR扩增方法进行。在这种实施例中，嵌套式PCR扩增优选在含有“内侧”和“外侧”引物序列对的单个扩增容器(如试管)内进行。内侧引物序列对与第一和第二引物序列相对应，而外侧引物序列对由第一外侧引物序列和第二外侧引物序列提供。选择第一外侧引物序列和第二外侧引物序列以使得能够扩增靶核苷酸序列旁侧的序列；它们通常将未经标记。嵌套式PCR扩增提供增加特异性和敏感度的可能性，因为更有可能避免检测由错误引发所致的扩增子(即从不同于所准备检测的微生物的核酸的核酸中产生的扩增子)。此外，扩增步骤(ii)可以采用多重PCR，或另外，使用简并引物以确保特异性检测靶微生物。

第一方面的方法可以容易进行变化，以使得能同时检测属于具体科的微生物(如李斯特菌科(Listeriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)和螺杆菌科(Helicobacteraceae))，以及更特别是，同时检测所述科内的具体属(如李斯特菌属、沙门氏菌属、肠杆菌属、埃希杆菌属、军团菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、弯曲杆菌属和螺杆菌属的微生物；或类似地，同时检测属于特定属的微生物，以及更具体地，同时检测所述属的具体物种的微生物。例如，使用属特异性引物对(如李斯特菌属物种特异性引物对)和物种特异性引物对(如单核细胞增多性李斯特菌特异性引物对)。在该实施例中，第一和第二引物序列(包含物种特异性引物)分别用第一和第二标签标记，而第三引物序列和第四引物序列(包含属特异性引物)分别用第三标签和第四标签标记(如生物素、DNP、FITC和DIG均可以使用)，其中第三标签和第四标签优选均异于第一和第二标签，虽然第一标签和第三标签有可能是相同的或功能等价的(即以使得第一标签和第三标签均能为第一试剂结合)。扩增将优选在单个扩增容器内进行(即多重反应)，并因而，第三引物序列和第四引物序列将优选具有相似的解链温度(Tm)和引发特征，以致允许使用相同的退火温度和扩增时间。然而，扩增也可以另外在独立的扩增容器中进行，同时将独立扩增的产物在步骤(iii)之前合并。第一标签和第三标签可以是相同的(或否则是功能等价的)，在这种情况下，第一试剂标记的微粒在步骤(iii)中应当结合至从第一和第二引物序列产生的扩增子以及从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子。然而，在第一标签和第三标签不同的情况下，该方法必需向步骤(iii)中使用的缓冲液添加用特异性结合至第三标签的第三试剂标记的微粒。该方法还必需在横向流动装置上提供附加的检测区，该附加检测区具有特异性结合至第四标签的第四试剂。该附加检测区由此结合并固定从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子。

第一方面的方法也可以容易地进行变化，以使得能同时检测多于一种类型的微生物(如李斯特菌属和沙门氏菌属)。在这种实施例中，扩增将优选在含有一对第一和第二引物序列和另一对第三引物序列和第四引物序列的单个扩增容器内进行。选择第一和第二引物序列以扩增第一微生物(如李斯特菌属)的靶核苷酸序列，而选择第三引物序列和第四引物序列以扩增第二微生物(例如沙门氏菌属)的靶核苷酸序列。第三引物序列和第四引物序列分别用第三标签和第四标签标记(如生物素、DNP、FITC和DIG均可以使用)，其中第三标签和第四标签优选均不同于第一和第二标签，虽然第一标签和第三标签有可能是相同的(或否则是功能等价的)，在这种情况下，第一试剂标记的微粒在步骤(iii)中应当结合至从第一和第二引物序列产生的扩增子以及从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子。然而，如果第一标签和第三标签不同，则该方法必需向步骤(iii)中使用的缓冲液添加用特异性结合至第三标签的第三试剂标记的微粒。扩增将优选在单个扩增容器内进行(即多重反应)，并因而，第三引物序列和第四引物序列将优选具有相似的解链温度(Tm)和引发特征，以致允许采用相同的退火温度和扩增时间。然而，扩增也可以另外在独立的扩增容器中进行，同时将独立扩增的产物在步骤(iii)之前合并。该方法还必需在横向流动装置上提供附加检测区，其中该附加检测区设有特异性结合至第四标签的第四试剂。检测区结合并固定从第一和第二引物序列产生的扩增子(由此指示第一微生物的存在)，而附加检测区结合并固定从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子(由此指示第二微生物的存在)。

在第一方面方法的备选方法中，本发明可以容轻易地进行变化，以使得第一引物序列的第一标签被省略并用经标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(例如经标记的2′-脱氧腺苷5′-三磷酸(dATP)和/或经标记的2′-脱氧胸苷三磷酸(dTTP))替换。

因而，在第二方面，本发明提供用于检测样品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，其中靶序列的扩增利用了第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一和第二标签之一的第一试剂标记，并允许所述第一试剂与存在的所述第一和第二标签中的所述一种标签结合；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，其中所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第一和第二标签中不为所述第一试剂结合的另一种标签的第二试剂，而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

出于排除任何疑问的目的，应该理解，在整篇说明书内，对所述第一引物序列的指代可以被称为“正向”或“反向”引物序列。类似地，对所述第二引物序列的指代可以被称为“正向”或“反向”引物序列的称谓。然而，必要的是，所述第一和第二引物序列一起限定微生物中靶核苷酸序列的5’和3’端。

第二方面的方法的对照区优选提供关于步骤(ii)的扩增的阳性对照。因而，第三引物序列用与第一标签相同的(或否则是功能等价的)第三标签标记而第四引物用不同于第一(和第三)以及第二标签的第四标签标记，在这种情况下，第一试剂标记的微粒在步骤(iii)应当结合至从第一和第二引物序列产生的扩增子以及从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子。在这种情况下，横向流动装置上的对照区将包含特异性结合至第四标签的对照试剂。该对照区结合并固定从第三引物序列和第四引物序列产生的扩增子，由此指示步骤(ii)的扩增是成功的。对照区也可以指示微粒已经成功流过基底并且微粒结合的第三试剂已经能够结合至第三标签。若第一标签和第三标签是相同的(或否则是功能等价的)，则对照区也可以指示微粒结合的第一试剂是否已经能够结合至第一标签。

因此，第二方面的方法的步骤(ii)可以包括：

提供对照核酸，并共扩增所述微生物核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，并且其中所述靶序列的扩增包括利用限定所述靶序列的5’和3’端的一对第一和第二引物序列，其中靶序列的扩增利用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)并且所述第二引物序列用第二标签标记，以使得对靶序列的任意扩增产生了第一和第二标签两者标记的扩增子，以及所述对照核酸上存在的对照核苷酸序列，其中对照序列的所述扩增包括使用限定所述对照序列的5’和3’端的一对第三引物序列和第四引物序列，其中对照序列的扩增利用了用第一标签标记的dNTP而所述第四引物序列用第四标签标记，以使得对照序列的任意扩增产生了用第三标签和第四标签两者标记的扩增子。

在第三方面，本发明提供用于检测样品中存在的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：

一对第一和第二引物序列，其限定所述微生物独有的或者说是特征性的靶核苷酸序列的5′和3′端，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记；

缓冲液，其包含用特异性结合至第一标签的第一试剂标记的微粒；和

横向流动装置，其包括设有检测区和对照区的基底，所述检测区设有

特异性结合至第二标签的第二试剂而所述对照区设有特异性结合至第一试剂的对照试剂。

在第四方面，本发明提供用于检测样品中存在的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：

用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(如包括经标记的dATP的dNTP混合物)；

一对第一和第二引物序列，其限定所述微生物独有的或者说是特征性的靶核苷酸序列的5′和3′端，所述第二引物序列用第二标签标记；

缓冲液，其包含用特异性结合至第一标签的第一试剂标记的微粒；以及

横向流动装置，其包括设有检测区和对照区的基底，所述检测区设有特异性结合至第二标签的第二试剂而所述对照区设有特异性结合至第一试剂的对照试剂。

第三方面或第四方面的试剂盒还可以包括其它组分，例如洗涤溶液和阻断试剂、对照核酸(如寡核苷酸)和限定对照核苷酸序列的5’和3’端的一对引物序列以及合适的聚合酶(如Taq聚合酶)。

本发明的方法可以容易适用于检测来自可能被怀疑存在于具体样品中的非微生物来源的核酸，例如血液样品中的人核酸(如以使得能(例如)对个体进行基因分型)和来自植物或其它动物的核酸(如用以检测食物变应原如花生、蛋和贝类食物变应原)。

因此，在第五方面，本发明提供用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意细胞(如哺乳动物、昆虫或植物细胞)或其它含核酸的结构(如病毒衣壳)释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

因此，在第六方面，本发明提供用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意细胞或其它含核酸的结构释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶序列5’和3’端的一对第一和第二引物序列，其中靶序列的扩增利用了第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)并且所述第二引物用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，其中所述微粒用特异性结合至所述第一和第二标签中的一种标签的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一和第二标签中的所述一种标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第一和第二标签中不为所述第一试剂结合的另一种标签的第二试剂，而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

就第一方面和第二方面的方法而言，第五和第六方面的方法利用了一个对照区。对照区是横向流动装置上与检测区隔开的区域。优选的是，对照区位于横向流动装置的检测区和远端之间。对照区提供阳性对照结果。以与上面第一方面和第二方面方法中所描述的方式等效的方式，该阳性对照结果可以显示微粒已经成功地流过基底，或以别的方式，指示步骤(ii)扩增是成功的。任选地，对照区可以包括第一亚区和第二亚区，第一亚区能够提供显示微粒已经成功流过基底的阳性对照结果，而第二亚区能够显示步骤(ii)扩增是成功的。

在第二和第六方面的方法中，步骤(ii)的扩增可以利用2′-脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，其优选未经标记，因为dUTP掺入扩增子提供了通过使用特异性尿嘧啶降解酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)来降解所产生的扩增子的机制。本领域技术人员所熟知的这种酶的实例可以不可逆地被热灭活(如可从美国威斯康辛州麦迪逊的EpicentreBiotechnologies获得的HK^TMUNG)。因而，如果担心步骤(ii)的扩增混合物可能会受外来核酸(即非样品核酸)污染，其中所述外源核酸可能包括靶核苷酸序列并由此导致“假阳性”结果(例如来自早先扩增的可能保留在实验室设备或表面上的污染扩增子)，则在扩增步骤(ii)之前向样品中添加诸如HK^TMUNG之类的酶应当引起选择性降解包含dUTP的任意外来核酸。在足以使得任意的这种外来核酸被降解的孵育时间(例如37-50℃下约15分钟)后，可以加热该样品以不可逆地灭活HK^TMUNG(如通过加热样品至约95℃)。

为了可以更清晰地理解本发明的性质，现在将参考下列非限制性实例描述本发明的优选形式。

实例

实例1 使用经标记的引物序列检测李斯特菌属

材料和方法

样品

样品从

UNIQUE PLUS^TM李斯特菌属检测模块的第三试管(即澳大利亚专利申请NO.2002333050中所述的操作用于李斯特菌属检测的自动化系统中的第三试管)获得。

PCR引物

选择聚合酶链反应(PCR)引物以使得能从16s rRNA基因的区域扩增李斯特菌属中存在的核酸序列。引物的核苷酸序列是：

正向引物：5′-GCGTGCCTAATACATGCAAG-3′，(SEQ ID NO：1)

反向引物：5′-ACCTCGCGGCTTCGCGAC-3′(SEQ ID NO：2)

经标记且脱盐的引物从Sigma Proligo(Boulder，CO，USA)获得。正向引物用荧光素在5′端加以标记而反向引物用生物素在5′端加以标记。利用这些引物的PCR扩增产生长度大约1234个核苷酸(例如单核细胞增多性李斯特菌4b)的扩增子。

横向流动装置

使用维度为5mm×60mm的一条硝化纤维素薄膜(ImmunoporeFP，Whatman)制备如图1中所示的横向流动装置。将样品垫(AristaBiologicals，Allentown，PA，USA)施加至该薄膜带上以允许上样缓冲的分析样品。在该装置的远端，粘附包含棉纤维的吸附垫(AristaBiochemicals，Allentown，PA，USA)以汲取缓冲的分析样品流过该薄膜。在该薄膜上制备检测线和阳性对照线。检测线通过将2.3μg抗FITC单克隆抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)吸附至横跨膜宽度的细线中的薄膜上而制备。阳性对照线位于检测线和该装置的远端之间，并且通过在横跨膜宽度的细线内吸附与生物素缀合的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)而制备。整个横向流动装置通过将该薄膜和样品垫及吸附垫施加至粘性背衬卡(Millenia Diagnostics，San Diego，CA，USA)上而构建。

扩增

根据本领域技术人员熟知的方法实施PCR扩增。用上文所述的引物(即SEQ ID NO：1和2)，PCR扩增如下实施：

(i)使用无菌接种环将1μL样品接种至50μL PCR混合物(25℃下，包含1.5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl 50mMKCl pH8.3的缓冲液中的终浓度为0.5μM的各引物、20单位/mL Taq DNA聚合酶、200μMdATP、200μM dCTP、200μM dGTP和200μM dTTP)；

(ii)使用标准热循环PCR机，让接种的PCR混合物接受94℃的初始加热步骤5分钟；以及

(iii)35个如下循环：

a.解链步骤，94℃下15秒，

b.退火步骤，大约58℃下20秒，和

c.延伸步骤，72℃下2分钟。

PCR产物的制备

在正要施加至横向流动装置之前，将PCR产物的5μL等分试样与100μL流动缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.5和0.05％Tween-20)和20μL预吸附至特异性结合生物素的山羊抗生物素(OD530＝10.2)(Alchemy Laboratories，Dundee，UK)的金微粒混合。

横向流动装置上的测定

将缓冲的分析样品(其包含缓冲的PCR产物/金微粒混合物的全部132μL等分试样)上样至上述横向流动装置的样品垫上。让该混合物的成分流过该膜5分钟。包含抗FITC抗体的检测线“捕集”在混合物中存在的FITC标记的双标记扩增子。双标记的扩增子与金微粒结合，并因而在检测线处由抗FITC抗体捕集时，产生粉红色-红色线。另一方面，阳性对照线捕集了或者未结合至扩增子或者未被检测线的抗FITC抗体捕集的金微粒。阳性对照线确证金微粒流过该薄膜并且抗生物素金微粒能够捕生物素。在阳性对照线处捕集金微粒也产生粉红色-红色线。

结果与讨论

让样品接受上述扩增，并将扩增产物在流动缓冲液中稀释以在横向流动装置测定。由于样品源(即来自操作用于李斯特菌属检测的自动化UNIQUE PLUS^TM检测系统中的第三试管)产生指示李斯特菌的存在的阳性结果，因而预期该实例的测定法将提供确证性阳性结果。在上样至横向流动装置后，两条粉红色-红色线在约2分钟后出现在薄膜上，由此指示样品中存在李斯特菌属。从样品的初始加热至横向流动装置上出现两条粉红色-红色线，花费约220分钟(即少于4小时)。平行分析来自仅含有沙门氏菌属的纯培养物的比较样品，在检测线处未产生颜色，指示李斯特菌属的阴性结果。

实例2 利用经标记的dNTP检测李斯特菌属

材料和方法

样品

样品从

 UNIQUE PLUS^TM李斯特菌属检测模块的第三试管(即澳大利亚专利申请No 2002333050中所述的操作用于李斯特菌检测的自动化系统中的第三试管)获得。

PCR引物

使用的聚合酶链反应(PCR)引物与实例1中所用的引物相同，然而，在本例中，正向引物用荧光素在5′端进行标记而反向引物不作标记。再次，引物从Sigma Proligo获得。

横向流动装置

制备如实例1中所述的横向流动装置。检测线通过将抗FITC单克隆抗体(Sigma-Aldrich)吸附至细线中的薄膜上而制备。阳性对照线通过将与生物素缀合的BSA(Sigma-Aldrich)吸附至细线中的薄膜上而制备。

扩增

根据标准方法，使用包含经生物素标记的dATP的dNTP混合物(NEBiolabs，Ipswich，MA，USA)实施PCR扩增。PCR扩增如下实施：

(i)使用无菌接种环将2μL样品接种至50μL PCR混合物(25℃下，包含1.5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl 50mMKCl pH8.3的缓冲液中的终浓度为0.5μM的每种引物、20单位/mL的Taq DNA聚合酶、32μM生物素化dATP、168μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP和200μM dTTP)；

(ii)使用标准热循环PCR机，让接种的PCR混合物接受94℃的初始加热步骤5分钟；以及

(iii)35个如下循环：

a.解链步骤，94℃下15秒，

b.退火步骤，大约58℃下20秒，和

c.延伸步骤，72℃下2分钟。

PCR产物的制备

按照如实例1中所述的相同方式制备用于上样至横向流动装置上的PCR产物。

横向流动装置上的测定

将缓冲的PCR产物/金微粒混合物的全部132μL等分试样上样至上述横向流动装置上。让该混合物的成分流过该膜5分钟。

结果与讨论

在含有李斯特菌属的样品中，在检测线处检测到双标记的扩增子。对照线指示金微粒完全流至膜的远端并指示抗生物素金微粒能够被生物素捕集。不含李斯特菌属的比较样品是阴性的。

生物素化dNTP与用于扩增特定核酸序列的一种标记引物和一种非标记引物的使用产生了容易检测到的双标记扩增子。这种方法可以起到增加测定法敏感度的作用，因为存在更多可被金微粒的抗生物素抗体结合的生物素分子。然而，如果发生错误引发，将经标记的引物并入扩增子中，则从该测定法中获得假阳性结果的可能性可能增加。

实例3 使用两种经标记的引物和单层多孔基质材料检测李斯特菌 属

材料和方法

样品

如实例1中所述获得含有李斯特菌属16s rRNA基因的经双标记的扩增子的PCR产物样品。

横向流动装置

将一条维度为5mm×60mm的Fusion 5薄膜(Whatman)粘附于相同大小的粘性背衬卡(Millenia Diagnostics)。检测线通过施加一列2.3μm聚苯乙烯珠(Bangs Laboratories，Fishers，IN，USA)而制备，在所述聚苯乙烯珠上已经根据由Bangs实验室提供的方案吸附了抗FITC单克隆抗体(Sigma-Aldrich)。简而言之，将1mg聚苯乙烯珠加至100μL吸附缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.4)中。在独立的试管内，将23μg抗FITC抗体在100μl吸附缓冲液中稀释。将聚苯乙烯珠溶液转移至含有抗体的试管内并将合并的溶液在室温下混合2小时，随后在4℃下混合过夜以使抗体吸附至聚苯乙烯珠上。在吸附后，将聚苯乙烯珠温和地离心(2000×g)并移除含有未吸附抗体的上清液。随后，将聚苯乙烯珠在施加至Fusion 5薄膜条带之前贮存于100μL贮存缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.4-0.05％ Tween20)中。聚苯乙烯珠防止抗FITC抗体迁移通过该薄膜。将薄膜条带在使用前于37℃下干燥30分钟。

横向流动装置上的测定

通过取出10μL等分试样并将其与160μL缓冲液(PBS-0.05％Tween20)和10μL金微粒(OD530＝10.1)混合而制备用于测定的PCR产物样品，其中山羊抗生物素抗体(AlchemyLaboratories)预吸附至金微粒表面。将该样品立即直接上样至横向流动条带的Fusion 5薄膜条带上。混合物横向地芯吸通过该薄膜并在大约10分钟后抵达检测线。

结果与讨论

样品在检测线处产生粉红色-红色线，指示李斯特菌属阳性结果。该结果表明在横向流动装置中使用诸如Fusion 5之类的单层多孔基质材料是其它薄膜类型例如硝化纤维素的可行替代品。使用单层多孔基质材料可以提供制造方面的优势。

实例4 使用提供PCR对照的多重PCR扩增检测单核细胞增多性 李斯特菌

材料和方法

样品

样品可以从

 UNIQUE PLUS^TM李斯特菌属检测模块的第三试管获得。

对照模版

可以根据本领域技术人员熟知的方法合成非相关核苷酸序列(即在核细胞增生性李斯特菌中不存在的核苷酸序列)的对照模板(和互补链)。从鸭嘴兽(platypus)甘露糖6-磷酸/类胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF-2R)基因的对照核酸制备的合适对照模板具有如下序列：

编码链：

5′-TTGAAAGACGATGAAGAAAGTAAGCCAGATTTCTGCAATGGCCATA

ATCCAGCAGTGACCATTACATTTATATGCCCGTCAGGGAGAATAGAAA

GCACAGCTCCCAAGCTCACGGCTAAATCCAACTGCCGGTATGAGGTGG

AGTGGATCACTGAGTACACCTGCCATAGAGATTATTTGGAAAGTAATT

CCTGCTATCTAAATAG-3′(SEQ ID NO：3)

非编码互补链：

5′-CTATTTAGATAGCAGGAATTACTTTCCAAATAATCTCTATGGCAGG

GTACTCAGTGATCCACTCCACCTCATACCGGCAGTTGGATTTAGCCGTG

AGCTTGGGAGCTGTGCTTTCTATTCTCCCTGACGGGCATATAAATGTAA

TGGTCACTGCTGGATTATGGCCATTGCAGAAATCTGGCTTACTTTCTTCA

TCGTCTTTCAA-3′(SEQ ID NO：4)

PCR引物

选择引物以使得能多重PCR扩增单核细胞增多性李斯特菌的区域，例如侵袭相关蛋白(IAP)基因的130bp区和对照核酸的206个碱基对区(即鸭嘴兽M6P/IGF-2R基因的938-1143bp区域；Genbank登录号AF151172)。合适的引物的核苷酸序列是：

第一引物对(IAP基因，单核细胞增多性李斯特菌)

正向引物：5′-ACAAGCTGCACCTGCTGCAG-3′(SEQ ID NO：5)

反向引物：5′-TAACAGCGTGTGTAGTAGCA-3′(SEQ ID NO：6)

在第一引物对的引物的5′端，对正向引物用生物素标记，而对反向引物用荧光素标记。

第二引物对(M6P/IGF-2R基因)

正向引物：5′-TTGAAAGACGATGAAGAAAGTAAG-3(SEQ IDNO：7)

反向引物：5′-CTATTTAGATAGCAGGAATTACTTTC-3′(SEQ IDNO：8)

在第二引物对的引物的5′端，对正向引物用生物素标记，而对反向引物用二硝基苯酚(DNP)标记。

横向流动装置

制备如实例1中所述的横向流动装置。检测线通过将抗FITC抗体吸附至检测区内横跨膜宽度的细线中的薄膜上而制备。PCR对照线优选位于检测线和该装置的远端之间。PCR对照线通过将抗DNP抗体吸附至横跨膜宽度的细线中的薄膜上而制备。

扩增

PCR扩增可以根据标准方法实施，然而，将全部四种引物和少量(例如10-100个拷贝)的对照模板加至混合物中。使用如上所述的引物(即SEQ ID NO：5、6、7和8)，PCR扩增可以如下实施：

(i)使用包含终浓度为250nM的每种引物(SEQ ID NO：5、6、7和8)和10-100个拷贝的双链阳性对照模板DNA(SEQ ID NO：3和4)的20μL分子级别H₂O，使干燥的PCR混合物(Accupower，Bioneer，Korea)再水化；

(ii)使用无菌接种环将1μL样品接种至再水化的干燥PCR混合物；

(iii)使用标准热循环PCR机，让接种的PCR混合物接受94℃的初始加热步骤5分钟；随后

(iv)进行如下40个循环：

a.解链步骤，94℃下15秒，

b.退火步骤，大约58℃下20秒，以及

c.延伸步骤，72℃下30秒。

PCR产物的制备

将PCR产物的10μL等分试样与包含磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH7.5)和Tween-20(0.05％)和10μL金微粒(OD530＝10.2)的120μL流动缓冲液混合，其中山羊抗生物素抗体(Alchemy Laboratories)已经预吸附至所述金微粒上。

横向流动装置上的测定

将缓冲的PCR产物混合物的140μL等分试样上样至横向流动装置上。让该混合物的成分流过该薄膜1至10分钟。包含抗生物素抗体的检测线捕集混合物中存在的生物素和FITC双标记的任意单核细胞增多性李斯特菌扩增子。抗DNP的PCR对照线捕集从对照模板产生的生物素和DNP双标记的扩增子。

实例5 利用双试管对照PCR扩增检测单核细胞增多性李斯特菌 材料和方法

样品

样品可以从

UNIQUE PLUS^TM李斯特菌属检测模块的第三试管获得。

PCR引物

选择引物以使得能多重PCR扩增单核细胞增多性李斯特菌的区域，例如侵袭相关蛋白(IAP)基因的130bp区和对照核酸的206个碱基对区(即鸭嘴兽M6P/IGF-2R基因的938-1143bp区域；Genbank登录号为AF151172)。合适的经标记的引物如实例4中所描述。

横向流动装置

制备如实例1中所述的横向流动装置。检测线和PCR对照线如实例4中所述制备。

扩增

PCR扩增在两个独立的反应试管中实施。检测反应(即使用样品的反应)如实例4中所述实施，除了反应在两个独立的试管进行外，以使得：

(i)两管干燥的PCR混合物(Accupower，Bioneer，Korea)被再水化。一个试管装有包含终浓度为250nM的第一引物对(SEQ ID NO：5和6)的20μL分子级别H₂O，而第二试管装有包含终浓度为250nM的第二引物对(SEQ ID NO：7和8)和10-100个拷贝的双链阳性对照模板DNA(SEQ ID NO：3和4)的20μL分子级别H₂O；

(ii)使用无菌接种环将1μL样品接种至装有再水化的干燥PCR混合物的每一试管内；

(iii)使用标准热循环PCR机，让接种的PCR混合物接受94℃的初始加热步骤5分钟；随后

(iv)进行如下40个循环：

a.解链步骤，94℃下15秒，

b.退火步骤，大约58℃下20秒，以及

c.延伸步骤，72℃下30秒。

PCR产物的制备

将每种PCR产物的5μL等分试样与120μL流动缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.5和0.05％ Tween-20)和10μL金微粒(OD530＝10.2)混合在一起，其中山羊抗生物素抗体(Alchemy Laboratories)已经预吸附至所述金微粒上。

横向流动装置上的测定

将缓冲的PCR产物混合物的140μL等分试样上样至横向流动装置上。让该混合物的成分流过该薄膜1至10分钟。包含抗生物素抗体的检测线截获混合物中存在的以生物素和FITC双标记的任意试验单核细胞增多性李斯特菌扩增子。另一方面，PCR对照线捕集对照扩增子。

在整篇本说明书内，单词“包含”(comprise)或变型例如“包括”或“包含着”将理解为表示包括所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但是不排除任意其它的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

在本说明书中提及的全部出版物通过参考而并入在本文中。对本说明书中所包括的文献、动作、材料、装置、物品或其它等的任何讨论，其目的仅是为本发明提供上下文环境。将不视为承认任何或全部这些事物因为在本申请的每项权利要求的优先权日之前存在于澳大利亚或其它地方而形成现有技术基础的部分或是与本发明相关的领域中的常见一般性知识。

本领域技术人员将理解可以对如具体实施例中所示的本发明进行众多改变和/或修改而不脱离广义描述的本发明的精神或范围。因此，本发明实施例将在所有方面均被视为是示例性的而非限制性的。

序列表

<110>3M创新有限公司

<I20>使用横向流动方法的核酸检测

<130>SCT084536-00

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1.

<211>20

<212>DNA

<213>Listeria monocytogenes

<400>1

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Listeria monocytogenes

<400>2

<210>3

<211>206

<212>DNA

<213>Ornithorhynchus anatinus

<400>3

<210>4

<211>206

<212>DNA

<213>ornithorhynchus anatinus

<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Listeria monocytogenes

<400>5

<210>6

<211>20

<21Z>DNA

<213>Listeria monocytogenes

<400>6

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>ornithorhynchus anatinus

<400>7

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>ornithorhynchus anatinus

<400>8

Claims (62)

1.一种用于检测样品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意所述微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5′和3′端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，所述微粒用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

2.一种用于检测样品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述的样品以致使样品中存在的任意所述微生物释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物独有的或者说是特征性的，包括使用限定所述靶序列5′和3′端的一对第一和第二引物序列，其中靶序列的扩增利用了用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量的步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，所述微粒用特异性结合至所述第一和第二标签中的一种标签的第一试剂标记，并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一和第二标签中的所述一种标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第一和第二标签中不为所述第一试剂结合的另一种标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中样品是食物样品、从食物制品表面的拭子制备的样品、废水或生产用水样品、或微生物培养或富集样品。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述处理步骤(i)包括在85-100℃的温度下加热样品。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤(ii)包括聚合酶链反应(PCR)扩增。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤(ii)包括嵌套式聚合酶链反应(PCR)扩增。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中第一和第二引物序列分别用第一和第二半抗原标签标记。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一标签是生物素而第二标签是二硝基苯酚(DNP)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列中至少一种是简并引物序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中微粒是金微粒。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微粒具有的直径大小为0.002-0.25μm。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述微粒具有的平均直径大小为0.04μm。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述对照区位于所述横向流动装置的检测区和远端之间。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述检测步骤(v)包括观察可见的颜色信号在所述检测区和对照区之一或二者处出现。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是科特异性的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对于选自李斯特菌科(Listeriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)和螺杆菌科(Helicobacteraceae)的科是特异性的。

17.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是属特异性的。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对于选自李斯特菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希杆菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弯曲菌属(Campylobacter)和螺杆菌属(Helicobacter)的属是特异性的。

19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是种特异性的。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是特异性的。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是特异性的。

22.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对物种是特异性的，并且其中所述扩增步骤(ii)还包括通过使用限定其它靶核苷酸序列的5′和3′端的一对第三和第四引物序列来扩增所述其它靶序列，所述第三和第四引物序列对于所述物种所属的属是特异性的并且以第三和第四标签分别标记，使得所述靶序列和其它靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的种特异性扩增子和/或第三和第四标签两者标记的属特异性扩增子，其中所述第三和第四标签或者两者均不同于第一和第二标签，或者备选地，所述第三标签与第一标签相同或功能等价而所述第四标签不同于第一和第二标签。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对单核细胞增多性李斯特菌是特异性的。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述第三和第四引物序列的序列对李斯特菌属是特异性的。

25.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对第一属是特异性的，并且其中所述扩增步骤(ii)还包括通过使用限定其它靶核苷酸序列的5′和3′端的一对第三和第四引物序列来扩增所述其它靶序列，所述第三和第四引物序列对第二属是特异性的并且分别用第三和第四标签标记，使得所述靶序列和其它靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子和/或第三和第四标签两者标记的扩增子，其中所述第三和第四标签或者两者均不同于第一和第二标签，或者备选地，所述第三标签与第一标签相同或功能等价而所述第四标签不同于第一和第二标签。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列对李斯特菌属是特异性的。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述第三和第四引物序列的序列对沙门氏菌属是特异性的。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述第三和第四引物序列中至少一种是简并引物序列。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，其中对所述靶序列和其它靶序列的扩增在单个扩增容器内进行。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述对照区包含与所述第一标签相同或功能等价的对照试剂。

31.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中扩增步骤(ii)还包括通过使用限定对照核苷酸序列的5′和3′端的一对第三和第四引物序列来扩增所述对照序列，所述第三和第四引物序列分别用第三和第四标签标记，使得所述靶序列和对照序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子和/或第三和第四标签两者标记的扩增子，其中所述第三和第四标签或者两者均不同于第一和第二标签，或者备选地，所述第三标签与第一标签相同或功能等价而所述第四标签不同于第一和第二标签，并且其中所述横向流动装置上的对照区设有特异性结合至所述第四标签的对照试剂。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述对照核苷酸序列存在于所述处理步骤(i)之前或之后加至样品的对照核酸上。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述对照核酸包含SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述靶序列和对照序列的扩增在单个扩增容器内进行。

35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中使用的所述缓冲液还包含用特异性结合至所述第三标签的第三试剂标记的微粒。

36.一种用于检测样品中存在的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：

一对第一和第二引物序列，其限定所述微生物独有的或者说是特征性的靶核苷酸序列的5′和3′端，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记；

缓冲液，其包含用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记的微粒；和

横向流动装置，其包括具有检测区和对照区的基底，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂。

37.一种用于检测样品中存在的微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：

用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；

一对第一和第二引物序列，其限定所述微生物独有的或者说是特征性的靶核苷酸序列的5′和3′端，所述第二引物序列用第二标签标记；

缓冲液，其包含用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记的微粒；和

横向流动装置，其包括具有检测区和对照区的基底，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂。

38.根据权利要求所述36或37的试剂盒，还包括对照核酸和限定对照核苷酸序列的5′和3′端的一对引物序列。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述对照核酸包含SEQID NO：3和/或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

40.一种用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意细胞或其它含核酸的结构释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶序列的5′和3′端的一对第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一标签标记而所述第二引物序列用第二标签标记，使得靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量所述步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，所述微粒用特异性结合至所述第一标签的第一试剂标记并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物的至少一部分，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第二标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测所述缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

41.一种用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)处理所述样品以致使样品中存在的任意细胞或其它含核酸的结构释放核酸；

(ii)扩增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶序列5′和3′端的一对第一和第二引物序列，其中所述靶序列的扩增利用了用第一标签标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物用第二标签标记，使得所述靶序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子；

(iii)将一定量所述步骤(ii)的扩增产物在包含微粒的合适缓冲液中稀释，所述微粒用特异性结合至所述第一和第二标签中的一种标签的第一试剂标记并允许所述第一试剂结合至存在的所述第一和第二标签中的所述一种标签；

(iv)在包括基底的横向流动装置的近端处或邻近该近端施加步骤(iii)的缓冲产物，所述基底允许所述缓冲产物的成分朝横向流动装置的远端横向地芯吸或流动，其中在所述远端处或邻近该远端的位置，该横向流动装置设有检测区和对照区，所述检测区设有特异性结合至所述第一和第二标签中不为所述第一试剂结合的另一种标签的第二试剂而所述对照区设有对照试剂；以及

(v)检测所述缓冲产物的成分在所述检测区和在所述对照区的任意结合。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述样品是血液样品。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述处理步骤(i)包括在温度85-100℃下加热样品。

44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤(ii)包括聚合酶链反应(PCR)扩增。

45.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤(ii)包括嵌套式聚合酶链反应(PCR)扩增。

46.根据权利要求40至45中任一项所述的方法，其中第一和第二引物序列分别用第一和第二半抗原标签标记。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一标签是生物素而第二标签是二硝基苯酚(DNP)。

48.根据权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列中至少一种是简并引物序列。

49.根据权利要求40至48中任一项所述的方法，其中所述微粒是金微粒。

50.根据权利要求40至49中任一项所述的方法，其中所述微粒具有的直径大小范围为0.002至0.25μm。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述微粒具有的平均直径大小为0.04μm。

52.根据权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述对照区位于所述横向流动装置的检测区和远端之间。

53.根据权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述检测步骤(v)包括观察可见的颜色信号在所述检测区和对照区之一或二者处出现。

54.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是科特异性的。

55.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是属特异性的。

56.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述第一和第二引物序列的序列是种特异性的。

57.根据权利要求40至56中任一项所述的方法，其中所述对照区包含与所述第一标签相同或功能等价的对照试剂。

58.权利要求40至56中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤(ii)还包括通过使用限定对照核苷酸序列的5′和3′端的一对第三和第四引物序列来扩增所述对照序列，所述第三和第四引物序列分别用第三和第四标签标记，使得靶序列和对照序列的任意扩增都产生第一和第二标签两者标记的扩增子和/或第三和第四标签两者标记的扩增子，其中所述第三和第四标签或者均不同于第一和第二标签，或者备选地，所述第三标签与第一标签相同或功能等价而所述第四标签不同于第一和第二标签，并且其中所述横向流动装置上的对照区设有特异性结合至第四标签的对照试剂。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述对照核苷酸序列存在于所述处理步骤(i)之前或之后加至样品的对照核酸上。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述对照核酸包含SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述靶序列和对照序列的扩增在单个扩增容器内进行。

62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中在所述步骤(iii)中使用的缓冲液还包含用特异性结合至所述第三标签的第三试剂标记的微粒。

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