FR3109636A1 - Système et procédé pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un système pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques (E), destiné à la détection de la présence d’au moins un analyte d’intérêt (A) dans lesdits échantillons biologiques (E). Le système d’analyse rapide comprend au moins les composants suivants : - une microplaque (2) comportant N puits (21), avantageusement 96 puits (21), qui sont adaptés à recevoir lesdits échantillons biologiques (E), - une solution tampon (3) conditionnée dans un premier contenant (4), laquelle solution tampon (3) est destinée à être rapportée dans plusieurs puits (21) et à être mélangée avec un échantillon biologique (E) pour la mise en œuvre d’une technique chromatographique, - des bandelettes chromatographiques (5) conditionnées dans un second contenant (6), avantageusement des bandelettes immunochromatographiques, lesquelles bandelettes chromatographiques (5) présentent une largeur (L1) qui est inférieure à la largeur (P1) d’un puits (21), de sorte à autoriser leur insertion individuelle et érigée dans un puits (21), lesquelles bandelettes chromatographiques (5) sont réalisées dans un matériau apte à rester érigé dans ledit puits (21) suite à la migration de la solution tampon (3). Figure pour l’abrégé : 1
Description
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne le domaine technique des systèmes et procédés pour l’analyse rapide d’échantillons biologiques.
Elle concerne en particulier un système et procédé pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques (dits encore « high throughput testing »), destiné à la détection de la présence d’au moins un analyte d’intérêt dans lesdits échantillons biologiques.
Etat de la technique
Un test de diagnostic rapide, dit « test de dépistage rapide », est un test qui permet d'établir rapidement (en quelques minutes) la présence d’au moins un analyte d’intérêt dans un échantillon biologique.
Cette approche utilise classiquement les phénomènes de réactions chimiques par immunochromatographie sur bandelettes (dit encore « lateral flow test ») qui font apparaître une coloration particulière permettant d'interpréter immédiatement le résultat.
Cette technique a l’intérêt d’être simple, rapide et peu coûteuse. De tels tests sont en plus utilisables au cabinet du médecin mais aussi au chevet du patient ou sur le terrain.
Mais, en pratique, ces tests sont conçus pour une approche « individuelle » (dite encore test rapide d’orientation diagnostique ou TROD) : chaque bandelette est rapportée dans une cassette pour analyser un unique échantillon biologique.
Les tests rapides actuels ne sont malheureusement pas adaptés en vue d’une analyse rapide sur une multitude d’échantillons biologiques dans une approche « grande capacité » ou « haut débit » (dite encore « high throughput testing »).
Les solutions « grande capacité » actuelles impliquent la mise en œuvre d’automates dédiés. Or cette méthode oblige alors des investissements importants sur le plan matériel et humain.
Il existe ainsi un besoin de tests qui seraient utilisables dans le cadre d’une analyse massive d’échantillons biologiques, notamment pour déterminer le statut sérologique d’une population au cours d’une épidémie, cela tout en préservant notamment des coûts réduits de déploiement.
Présentation de l'invention
Afin de remédier à l’inconvénient précité de l’état de la technique, la présente invention propose un nouveau système pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques, destiné à la détection de la présence d’au moins un analyte d’intérêt dans lesdits échantillons biologiques.
Le système d’analyse rapide selon l’invention comprend au moins les composants suivants :
- une microplaque comportant N puits, avantageusement 96 puits, qui sont adaptés à recevoir lesdits échantillons biologiques,
- une solution tampon conditionnée dans un premier contenant,
laquelle solution tampon est destinée à être rapportée dans plusieurs puits et à être mélangée avec un échantillon biologique pour la mise en œuvre d’une technique chromatographique,
- des bandelettes chromatographiques conditionnées dans un second contenant, avantageusement des bandelettes immunochromatographiques,
lesquelles bandelettes chromatographiques présentent une largeur qui est inférieure à la largeur d’un puits, de sorte à autoriser leur insertion individuelle et érigée (dit encore « dressée » ou « élevée ») dans un puits,
lesquelles bandelettes chromatographiques sont réalisées dans un matériau apte à rester érigé dans ledit puits suite à la migration de la solution tampon,
lesquelles bandelettes chromatographiques comportent différentes zones successives, dans le sens de migration capillaire amont vers aval, à savoir au moins :
- une zone d’insertion dans un puits, destinée à être immergée dans le mélange échantillon biologique / solution tampon,
- une zone de libération qui comprend au moins un réactif de détection conjugué avec un marqueur visible et/ou mesurable, ledit réactif de détection étant apte à se déplacer en conséquence de la migration de la solution tampon le long de la bandelette chromatographique, et
- au moins une zone de capture qui comprend au moins un réactif de capture, immobilisé sur la bandelette chromatographique.
Le système d’analyse rapide selon l’invention, tout en étant de conception relativement simple, a l’intérêt d’offrir une solution technique en vue d’une analyse massive d’échantillons biologiques, notamment pour déterminer le statut sérologique d’une population au cours d’une épidémie, cela tout en préservant notamment des coûts réduits de déploiement.
Un tel système pourrait notamment être tout-à-fait pertinent dans des enquêtes épidémiologiques afin d’évaluer et de suivre la proportion de la population infectée lors d’une épidémie.
Ce système pourrait également être intéressant dans les usages vétérinaire, par exemple pour le suivi d’une épidémie chez les animaux, en particulier les animaux d’élevage.
D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du produit/procédé conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- ledit système d’analyse rapide comprend N à N+10 bandelettes chromatographiques, de préférence conditionnées dans un second contenant consistant en un tube fermé hermétiquement ;
- une bandelette chromatographique comporte les dimensions suivantes : la largeur est de 2 à 6 mm, préférablement de 3 à 5 mm, la longueur est de 5 à 10 cm, préférablement de 6 à 8 cm ;
- les réactifs de détection et les réactifs de capture sont choisis parmi les réactifs adaptés à déterminer la sérologie d’un échantillon biologique, en particulier les anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et IgM anti-SRAS-Cov-2, à savoir de préférence des anticorps, avantageusement des anticorps choisis parmi les anticorps anti-IgG et les anticorps anti-IgM, et des antigènes spécifiques d’un microorganisme, avantageusement d’un virus, de préférence du SRAS-Cov-2 ;
- le premier contenant comporte un compte-goutte ;
- le système comprend encore des moyens de prélèvement d’échantillons biologiques, avantageusement un auto-piqueur pour le prélèvement de sang capillaire ;
- le système comprend des moyens témoins positif / négatif ;
- l’un au moins des puits de la microplaque comporte des moyens de guidage qui sont conçus pour recevoir une bandelette chromatographique et pour participer au maintien érigé de ladite bandelette chromatographique ;
- les composants sont regroupés dans un emballage pour former un kit.
La présente invention concerne également un procédé pour l’analyse rapide grande capacité de plusieurs échantillons biologiques, en vue de la détection de la présence d’au moins un analyte dans lesdits échantillons biologiques, par la mise en œuvre d’un système selon l’invention.
Le procédé comprend les étapes successives suivantes :
- le dépôt d’un volume de solution tampon dans certains au moins des puits, par exemple de 50 µL à 200 µL (de préférence encore de 100 à 150 µL),
- le dépôt d’un volume d’échantillons biologiques dans certains au moins des puits, par exemple de 2 µL à 40 µL (de préférence de 5 à 20 µL),
- le dépôt d’une bandelette chromatographique dans les puits contenant le mélange solution tampon / échantillon biologique, et éventuellement
- la lecture des bandelettes chromatographiques, après migration de la solution tampon, pour déterminer les échantillons biologiques contenant ledit au moins un analyte d’intérêt.
Les échantillons biologiques consistent en des échantillons de sang capillaire, de préférence humains.
Les bandelettes chromatographiques sont choisies parmi les bandelettes immunochromatographiques adaptées à analyser la sérologie d’un échantillon biologique, en particulier les anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et IgM anti-SRAS-Cov-2.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
Description détaillée de l'invention
De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :
Il est à noter que, sur ces figures, les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références.
La présente invention concerne, tel que représentée sur la figure 1, un système 1 pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques E (dite encore «high throughput testing»).
Un tel système d’analyse 1 est adapté à la détection de la présence d’au moins un analyte d’intérêt dans un pluralité (ou un groupe) d’échantillons biologiques.
Ce système d’analyse 1 serait utile notamment dans le cadre d’un dépistage massif de la population au cours et/ou à l’issue d’une épidémie.
Par « détecter », on entend ainsi avantageusement la détermination qualitative (avantageusement la présence ou l'absence), voire quantitative, d’un ou plusieurs analytes dans un échantillon biologique E.
Par « analyte d’intérêt », on entend toute entité chimique, biochimique, ou biologique, que l'on souhaite détecter dans un échantillon biologique.
Cette entité chimique consiste avantageusement en une entité issue du monde vivant, de préférence du monde végétal ou du monde animal, de préférence encore présent chez l’être humain.
Parmi les analytes détectés par le système et le procédé selon la présente invention, on citera notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques.
Ledit au moins un analyte d’intérêt est de préférence encore choisi parmi les anticorps développés par un être humain qui témoigne d’une réponse immunitaire à l’infection par un agent infectieux.
Les anticorps recherchés sont avantageusement choisis parmi les anticorps sériques IgM (immunoglobulines M) de préférence sur une ligne IgM ou « IgM line » et/ou IgG (immunoglobulines G) de préférence sur une ligne IgG ou « IgG line ».
Par « agent infectieux », on entend de préférence les virus, notamment les virus responsables de pneumopathies, avantageusement lesCoronaviridae, de préférence encoreOrthocoronavirinaeou coronavirus.
Par « coronavirus », on englobe le SARS-CoV, le MERS-CoV ou le SARS-CoV-2.
Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon prélevé sur un individu (humain ou animal notamment) et dans lequel l’analyte est recherché.
L’échantillon biologique consiste de préférence en un échantillon liquide dans lequel l'analyte recherché est en solution ou en suspension.
Cet échantillon liquide peut notamment être tout fluide biologique ou corporel.
L'échantillon liquide peut également avoir été obtenu directement ou indirectement à partir d'un fluide biologique ou corporel.
L'échantillon peut également être un extrait liquide d'un échantillon solide.
De préférence, l'échantillon biologique est de l'urine, du sang total, du plasma ou du sérum.
Par « sang total », on entend en particulier du sang capillaire obtenu avantageusement au moyen d’un auto-piqueur au niveau de la pulpe du doigt, ou du talon, d’un individu humain.
Pour cela, le système d’analyse rapide 1 selon l’invention, illustré schématiquement sur la figure 1, comprend au moins les composants suivants :
- une microplaque 2 comportant des puits 21 qui sont destinés à recevoir notamment les échantillons biologiques E,
- une solution tampon 3 conditionnée dans un premier contenant 4,
- des bandelettes chromatographiques 5, avantageusement des bandelettes immunochromatographiques, conditionnées dans un second contenant 6,
- de préférence, des moyens de prélèvement d’échantillons biologiques 7, avantageusement à usage unique,
- de préférence, des moyens témoins positif / négatif (non représentés), par exemple des biomarqueurs (notamment des protéines recombinantes ou des sérums témoin),
- éventuellement des moyens désinfectants (non représentés), par exemple des lingettes désinfectantes.
De manière générale, ces composants du système d’analyse rapide 1 sont avantageusement regroupés / conditionnés dans un emballage (non représenté) pour former un kit.
Ce kit peut alors comprendre également une notice d’instruction.
Microplaque
La microplaque 2 est avantageusement choisie parmi les microplaques utilisées dans les techniques de biologie moléculaire.
Une telle microplaque 2 est avantageusement réalisée en matériau plastique (par exemple polystyrène).
Cette microplaque 2 comporte « N » puits 21, dans laquelle N est un chiffre entier est avantageusement supérieur ou égal à 10.
De préférence, N est égal à 96, dans le cas d’une microplaque 96 puits.
Les puits 21 sont de préférence alignés en rangées et en colonnes, repérées avantageusement respectivement par des lettres et des chiffres.
Les puits 21 présentent par exemple les dimensions suivantes :
- un hauteur allant de 10 à 15 mm, et
- un diamètre P1 (ou largeur) allant de 5 à 10 mm.
L’un des puits 21 est illustré schématiquement sur la figure 4.
Ce puits 21 comporte en particulier une paroi latérale 211 (avantageusement cylindrique droite) terminée, d’un premier côté inférieur, par un fond 212 et, d’un second côté supérieur, par une ouverture supérieure d’accès 213.
La paroi latérale 211 et l’ouverture supérieure d’accès 213 peuvent être libres, circulaires, conformes à une microplaque classique.
Comme illustré schématiquement en traits discontinus sur les figures 4 et 8, l’un au moins des puits 21 de la microplaque 2 peut encore comporter des moyens de guidage 214 qui sont conçus pour guider le positionnement / l’agencement d’une bandelette chromatographique 5.
Ces moyens de guidage 214 définissent ainsi un plan d’agencement 214’ pour la bandelette chromatographique 5 associée.
Les moyens de guidage 214 se présentent par exemple sous la forme de structures latérales qui sont réalisées monoblocs avec la paroi latérale 211, par exemple en forme de glissières, de nervures, de gorges ou de profilés.
Ces moyens de guidage 214 comprennent avantageusement deux couples de nervures 2141 qui sont agencés de manière diamétralement opposée dans le puits 21.
Les nervures 2141 de chaque couple sont agencées à distance l’une de l’autre, pour définir une fente de guidage 2142 qui est destinée à recevoir une bandelette chromatographique 5. Les fentes de guidage 2142 s’ouvrent en regard l’une de l’autre et s’étendent dans le même plan d’agencement 214’.
Les nervures 2141 s’étendent avantageusement depuis l’ouverture supérieure d’accès 213 et se terminent à distance du fond 212.
Les moyens de guidage 214 participent à un maintien érigé de la bandelette chromatographique 5 rapportée dans un puits 21 (décrit par la suite en relation avec les figures 8 et 10).
Ces moyens de guidage 214 sont avantageusement conçus encore pour guider et pour ajuster notamment l’inclinaison (verticale) par rapport à l’axe 21’ de son puits 21 et, l’orientation angulaire autour de cet axe 21’, de la bandelette chromatographique 5.
De tels moyens de guidage 214 visent ainsi à faciliter la pose / dépose des bandelettes chromatographiques 5 et/ou la lecture des résultats sur ces bandelettes chromatographiques 5.
De préférence, ces moyens de guidage 214 visent à agencer / positionner régulièrement les bandelettes chromatographiques 5 dans des plans d’agencement 214’ parallèles (ou au moins approximativement parallèles) les uns par rapport aux autres.
En d’autres termes, les plans d’agencements 214’ des puits 214 sont de préférence parallèles entre eux (et de préférence parallèlement aux grands côtés de la microplaque 2 lorsqu’elle présente un contour rectangulaire).
De plus, ces moyens de guidage 214 visent à agencer / positionner régulièrement les bandelettes chromatographiques 5 :
- à la verticale (non représenté), de sorte que l’axe 21’ du puits 21 s’étend dans le plan d’agencement 214’, ou
- avec une inclinaison de quelques degrés (par exemple de 2° à 5°) par rapport à la verticale, de sorte que l’axe 21’ du puits 21 forme un angle par rapport au plan d’agencement 214’ (figure 10).
Solution tampon
La solution tampon 3 est destinée à être rapportée dans plusieurs puits 21 (tout ou partie desdits puits 21) et à être mélangée avec un échantillon biologique E.
Cette solution tampon 3 est choisie parmi les solutions tampon adaptées à la mise en œuvre de technique chromatographique : elle est en particulier destinée à migrer le long d’une bandelette chromatographique 5 de sorte à entraîner, ou au moins à faciliter, la migration de l'échantillon biologique 5 (et en particulier dudit au moins un analyte A).
La solution tampon 3 est par exemple choisie parmi les diluants composés d'une solution saline tamponnée. Il peut également comprendre un détergent ou tout autre composant nécessaire notamment à la migration ou aux réactions sur les bandelettes chromatographiques 5.
Pour la répartition de cette solution tampon 3 dans les puits 21, le premier contenant 4 comporte avantageusement un compte-goutte (non représenté).
Le volume de solution tampon 3 dans ce premier contenant 4 est avantageusement adapté (de préférence supérieur) au volume total à répartir dans les différents puits 21 pour la mise en œuvre du système d’analyse 1.
Bandelettes chromatographiques
Les bandelettes chromatographiques 5, dites encore « moyens de diffusion capillaire », sont avantageusement choisies parmi les bandelettes chromatographiques portant les réactifs adaptés à la détection dudit au moins un analyte d’intérêt A qui est recherché dans l’échantillon biologique E testé.
Ces bandelettes chromatographiques 5 sont formées de tout moyen constituant ou agissant en tant qu'unité de diffusion capillaire continue, par migration latérale (c'est-à-dire perpendiculairement à l'épaisseur du ou des matériaux capillaires mis en œuvre pour la diffusion capillaire).
Ce moyen de diffusion capillaire consiste avantageusement en un support solide poreux permettant la migration d'un liquide par simple diffusion capillaire.
La porosité de ce support permet la diffusion capillaire (ou migration latérale) de l'échantillon et/ou des réactifs à l'état liquide ou humide.
De tels moyens de diffusion capillaire sont très largement utilisés, notamment dans toutes les techniques d'immunochromatographie à migration latérale.
Une telle bandelette chromatographique 5 consiste ici en un support allongé selon la direction et/ou le sens de la diffusion capillaire (migration latérale).
La bandelette chromatographique 5 peut être constituée par :
- un seul et même matériau capillaire ou poreux, ou
- plusieurs éléments ou matériaux capillaires ou poreux différents, convenablement agencés les uns par rapport aux autres (par exemple par chevauchement), pour obtenir une continuité d'écoulement capillaire d'un élément ou d'un matériau à un autre, selon la direction de diffusion capillaire.
Une telle bandelette chromatographique 5 détermine une direction et sens de diffusion capillaire de tout liquide qui est reçu ou déposé à une extrémité amont, et qui se déplace alors vers une extrémité aval de la bandelette chromatographique 5.
A titre d'exemple, la bandelette chromatographique 5 peut être constituée de divers supports immunochromatographiques, par exemple de cellulose, de nylon, de nitrocellulose, de polyéthylène ou de fibre de verre.
Encore selon l’invention, les bandelettes chromatographiques 5 sont réalisées dans un matériau apte à rester érigé / dressé dans leurs puits 21 suite à la migration de la solution tampon 3.
En d’autres termes, une bandelette chromatographique 5 est avantageusement adaptée à rester rectiligne / plane (en particulier dans le plan d’agencement 214’) lors de la migration de la solution tampon 3 (au moins pour la durée du test).
La bandelette chromatographique 5 peut pour cela comporter une couche de rigidification (avantageusement arrière).
Cette couche de rigidification peut être constituée de matériaux divers tels que du carton, du carton plastifié ou plus préférentiellement des matières plastiques. De préférence, la couche de rigidification est constituée de polystyrène.
De manière générale, tel qu’illustré en relation avec les figures 2 et 3, de telles bandelettes chromatographiques 5 comportent encore différentes zones successives, dans le sens de migration capillaire amont vers aval, à savoir au moins :
- une zone d’insertion 51 dans un puits 21, amont, destinée à être immergée dans le mélange échantillon biologique E / solution tampon 3 présent dans un puits 21,
- une zone de libération 52 qui comprend au moins un réactif de détection 521 conjugué avec un marqueur 522 visible et/ou mesurable, ledit réactif de détection 521 étant apte à se déplacer en conséquence de la migration de la solution tampon 3 le long de la bandelette chromatographique 5, et
- au moins une zone de capture 53 qui comprend au moins un réactif de capture 531, immobilisé sur la bandelette chromatographique 5.
En particulier, la zone d’insertion 51, dite encore « zone de dépôt », doit être suffisamment longue pour être immergée dans le mélange échantillon biologique E / solution tampon 3.
Par ailleurs, les zones de libération 52 et de capture 53 consistent avantageusement en une ligne ou bande transversale (s’étendant perpendiculairement à la direction de migration), présentant par exemple une largeur comprise entre 1 et 2 mm, et une surface comprise entre 3 et 5 mm².
De manière générale, le « réactif de détection » ou le « réactif de capture » consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement pour former un complexe permettant la détermination dudit analyte dans l’échantillon liquide.
Le réactif de détection et/ou le réactif de capture constituent encore des réactifs dits de « liaison ».
De tels réactifs de liaison, permettant la détection d’au moins un analyte dans l'échantillon liquide, sont bien connus et peuvent être choisis à façon pour la mise en œuvre de l’invention.
Ces réactifs de liaison sont choisis avantageusement parmi ceux qui sont aptes à se lier spécifiquement avec ledit analyte et/ou à se lier spécifiquement l’un avec l’autre.
Selon le format de test mis en œuvre, les réactifs de liaison complémentaires sont destinés à former des complexes différents :
- les réactifs de liaison sont aptes à se fixer concomitamment à l’analyte, pour former un test au format sandwich (figures 2 et 3),
- l’un des réactifs de liaison (détection ou capture) est apte à se fixer à l’analyte mais aussi à l’autre réactif de liaison (respectivement capture ou détection), pour former un test au format compétition (non représenté).
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène / anticorps ou analyte / anti-analyte.
Par « anti-analyte », on entend toute entité chimique, biochimique, ou biologique, susceptible de se lier spécifiquement avec l'analyte, ou avec le réactif de capture en compétition avec l'analyte, par exemple un anticorps, un antigène ou un acide nucléique.
Par « analogue approprié de l'analyte », on entend avantageusement toute entité chimique, biochimique ou biologique, apte à se lier de manière spécifique au réactif de capture ou au réactif de détection, selon le cas, en compétition avec l'analyte.
Les réactifs de liaison sont avantageusement choisis parmi les anticorps, les antigènes ou les acides nucléiques.
L'analyte et le réactif de liaison forment ainsi typiquement un couple apte à se lier spécifiquement l’un avec l’autre, comme par exemple un coupe ligand / anti-ligand, un couple antigène / anticorps, un couple ADN / ARN ou un couple ADN / ADN.
Ainsi, si l'analyte est un antigène ou un haptène, l’un au moins des réactifs de liaison (le réactif de détection et/ou le réactif de capture) est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte.
Par « anticorps spécifique de l'analyte », on entend un anticorps capable de se lier spécifiquement avec l'analyte dans une liaison de type antigène / anticorps.
Il s'agit typiquement d'un anticorps polyclonal ou d’un anticorps monoclonal, ayant une forte affinité pour l'analyte. De préférence, il s'agit d'un anticorps monoclonal.
Si l'analyte est un anticorps, l’un au moins des réactifs de liaison est avantageusement l'antigène reconnu par l'anticorps.
Si l'analyte est un acide nucléique, l’un au moins des réactifs de liaison est avantageusement une sonde ADN complémentaire.
Le ou les réactifs de détection 521 sont avantageusement conjugués à un marqueur 522 visible et/ou mesurable, avantageusement un marqueur particulaire.
Par « marqueur visible et/ou mesurable », on entend tout marquage permettant une détection directe ou indirecte à l'œil nu, ou à l'aide d'un appareil, en raison de l'émission d'un signal au niveau de ladite au moins une zone de capture 53.
Le signal est par exemple une fluorescence, une coloration, une présence d'isotope ou un signal magnétique.
On citera par exemple les marqueurs particulaires colorés comme l'or colloïdal, ou fluorescents, les particules de latex colorées, les particules de latex fluorescentes et les particules conjuguées à l'avidine et à la streptavidine.
Les marqueurs particulaires, colorés ou fluorescents, consistent ainsi en des particules de petite taille insolubles dans l'eau et qui forment donc des suspensions, dispersions ou solutions, en phase liquide.
Parmi les marqueurs permettant une observation directe à l'œil nu, on citera aussi les marqueurs de type dextran (Hansen T.M., IVD Technology 4, 35-40, 2003). Le réactif de liaison est alors conjugué à une chaîne de dextran (dérivé de polysaccharide) portant des fluorophores.
Les marqueurs peuvent également consister en des enzymes (la phosphatase alcaline ou AP, la peroxydase de raifort ou HRP, notamment), en des colorants (ou « dyes ») ou en des composés chimiluminescents (notamment l’isothiocyanate de fluorescéine ou FITC).
Pour augmenter la sensibilité, on peut avoir recours par exemple, à un anticorps marqué selon des techniques connues de l'homme de l'art pour une détection indirecte, comme par exemple un anticorps biotinylé, permettant indirectement une détection par la formation des entités avidine-biotine et streptavidine-biotine.
Cet anticorps marqué et biotinylé peut également, soit être directement déjà déposé sur une ligne-test, dans la zone de capture, pour augmenter la sensibilité, soit être déposé avec l’anticorps de détection spécifique, pour augmenter le temps de contact et encore la sensibilité notamment, par exemple, en raison du nombre de sites de fixation.
De son côté, dans la zone de capture 53, le réactif de capture 531 spécifique de l'analyte est immobilisé sur le support solide selon des techniques connues de l'homme du métier.
Ce réactif de capture est immobilisé de telle façon qu'il ne soit pas mobile à l'état humide.
Cette immobilisation peut s'effectuer par exemple par absorption ou par un couplage covalent.
Dans un test de type sandwich, les zones de libération 52 et de capture 53 successives comprennent avantageusement :
(i) un réactif de détection marqué 521 sous la forme d’un anti-analyte conjugué à un marqueur 522 visible et/ou mesurable, se liant de façon spécifique à l'analyte A, et
(ii) un réactif de capture 531 immobilisé se liant de façon spécifique à l'analyte A, avantageusement également un anti-analyte.
Les réactifs de détection 521 et de capture 522 sont avantageusement adaptés à détecter au moins un antigène A consistant en un anticorps.
Selon une forme de réalisation préférée de ce mode de réalisation au format sandwich, illustrée sur la figure 2, la zone de libération 52 comprend au moins un anticorps 521 spécifique d’un analyte A, conjugué à un marqueur 522 visible et/ou mesurable, qui sont déposés à l'état sec dans ou sur la bandelette chromatographique 5, mais qui sont libres de migrer par diffusion capillaire à l'état humide.
La zone de libération 52 comporte ici deux anticorps 5211, 5212 spécifiques chacun d’un analyte A1, A2 (par exemple un anticorps 5211 anti-IgM et un anticorps 5112 anti-IgG).
Dans ce cas, la zone de capture 53 comprend avantageusement un antigène 531 spécifique du ou des anticorps A recherché, qui est immobilisé selon des techniques connues. Ces antigènes sont immobilisés de telle façon qu'ils ne soient pas mobiles à l'état humide.
Selon une autre forme de réalisation préférée de ce mode de réalisation au format sandwich, illustrée sur la figure 3, la zone de libération 52 comprend au moins un antigène 521 spécifique d’un analyte A, conjugué à un marqueur 522 visible et/ou mesurable, qui sont déposés à l'état sec dans ou sur la bandelette chromatographique 5, mais qui sont libres de migrer par diffusion capillaire à l'état humide.
La zone de libération 52 comporte ici un unique antigène 521 spécifique des deux analytes A1, A2.
Dans ce cas, la zone de capture 53 comprend avantageusement au moins un anticorps 531 spécifique de l’anticorps A recherché, qui est immobilisé selon des techniques connues. Ces anticorps 531 sont immobilisés de telle façon qu'ils ne soient pas mobiles à l'état humide.
La zone de capture 53 comporte ici deux anticorps 5311, 5312 différents qui sont chacun spécifiques d’un analyte A1, A2 (par exemple un anticorps 5311 anti-IgM et un anticorps 5312 anti-IgG).
D’une manière générale, les anticorps de la zone de libération 52 et de la zone de capture 53 complémentaires se lient respectivement et spécifiquement avec l'analyte A, par exemple sur deux sites épitopiques, identiques ou différents de l'analyte A.
Les complexes analyte / anticorps obtenus sont immobilisés au niveau de la zone de capture 53. Ces complexes immobilisés génèrent ainsi un signal visible et/ou mesurable tel que défini ci-dessus.
La zone de capture 53 peut comporter un seul réactif de capture 531 ou au moins deux réactifs de capture 531 différents.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de détection 521 et les réactifs de capture 531 sont choisis parmi les réactifs adaptés à analyser la sérologie d’un échantillon biologique E, de préférence pour détecter la présence éventuelle des anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et/ou IgM anti-SRAS-Cov-2.
Les réactifs de détection 521 et les réactifs de capture 531 sont avantageusement choisis, sans aucunement être limitatif, parmi :
- des anticorps, avantageusement choisis parmi les anticorps anti-IgG (humain) et les anticorps anti-IgM (humain),
- des antigènes spécifiques d’un microorganisme, avantageusement d’un virus, de préférence du SRAS-Cov-2, et
- des protéines recombinantes adaptées.
De tels réactifs de détection 521 et réactifs de capture 531 sont par exemple proposés par la société Real-Gene (US).
En lien avec la figure 2 :
- les réactifs de détection 521 comprennent un anticorps 5211 anti-IgM et un anticorps 5112 anti-IgG, et
- le réactif de capture 531 comprend un antigène spécifique du SRAS-Cov-2 531.
En lien avec la figure 3 :
- le réactif de de détection 521 comprend un antigène spécifique du SRAS-Cov-2, et
- les réactifs de capture 531 comprennent un anticorps 5311 anti-IgM et un anticorps 5312 anti-IgG.
Dans un mode de réalisation préféré, la zone de capture 53 peut encore comprendre un réactif de capture témoin 532.
Ce réactif de capture témoin 532 permet de disposer d'un contrôle positif afin de s'assurer de la diffusion capillaire effective de l'échantillon liquide depuis la zone d’insertion 51 jusqu'à la zone de capture 53.
Ce réactif de capture témoin 532 est immobilisé de façon permanente en aval des réactifs de capture 531 « analyte » (« Control line » ou ligne contrôle).
Il peut s'agir par exemple d'un anticorps se liant au(x) réactif(s) de détection 521.
Alternativement, ce réactif de capture témoin 532 est indépendant de l'analyte A et permet simplement de vérifier la diffusion de l'échantillon liquide le long de la bandelette chromatographique 5 (par exemple par la capture d’un réactif témoin marqué 5321).
De manière générale, les bandelettes chromatographiques 5 sont destinées à être insérées individuellement et à être érigées dans les puits 21.
Pour cela, les bandelettes chromatographiques 5 présentent des cotes adaptées à autoriser cette insertion individuelle dans un puits 21.
Par « insertion », on entend en particulier une introduction d’une partie inférieure 55 de la longueur d’une bandelette chromatographique 5 dans un puits 21 ; cette partie inférieure 55 (au niveau de sa bordure transversale 59) est avantageusement destinée à prendre appui sur le fond 212 (voir en particulier les figures 8 à 10).
Cette partie inférieure 55 peut être :
- libre, notamment dans le cas d’un puits dépourvu des moyens de guidage 214 précités (figure 9), ou
- guidée, en présence des moyens de guidage 214 précités (figures 8 et 10).
Et une partie supérieure 56 de la longueur de cette bandelette chromatographique 5 fait alors saillie par rapport à ce puits 21, à partir de son ouverture supérieure d’accès 213 (voir en particulier les figures 8 à 10).
La partie inférieure 55 comporte avantageusement la zone d’insertion 51 ; la partie supérieure 56 comporte quant à elle la zone de capture 53 (et de préférence la zone de libération 52 qui se situe avantageusement au-dessus du mélange contenu dans le puits 21).
Pour autoriser cette insertion, la bandelette chromatographique 5 présente une largeur L1 qui est inférieure à la largeur P1 d’un puits 21 (au moins au niveau de sa partie inférieure 55).
En pratique, les bandelettes chromatographiques 5 présentent un contour rectangulaire avec :
- deux bordures longitudinales 58 définissant sa largeur L1, et
- deux bordures transversales 59 définissant sa longueur L2.
Par exemple, une bandelette chromatographique 5 comporte les dimensions suivantes :
- la largeur L1 est de 2 à 6 mm, préférablement de 3 à 5 mm, et
- la longueur L2 est de 5 à 10 cm, préférablement de 6 à 8 cm.
Avant mise en œuvre, les bandelettes chromatographiques 5 sont avantageusement regroupées dans le second contenant 6, de préférence un tube fermé hermétiquement.
De préférence, le système d’analyse rapide 1 selon l’invention (et en particulier le second contenant 6) comprend de N à N+10 bandelettes chromatographiques 5 qui sont destinées à être réparties dans les N puits 21 de la microplaque 2.
Moyens de prélèvement d’échantillons biologiques
Le système d’analyse rapide 1 peut éventuellement comprendre également des moyens de prélèvement d’échantillons biologiques 7.
De tels moyens de prélèvement 7 comprennent par exemple :
- un auto-piqueur 71, classique en soi et à usage unique, adapté à générer un écoulement d’un goutte de sang capillaire, et
- un organe de prélèvement 72 du sang capillaire, à usage unique, par exemple sous la forme d’une pipette souple classique en soi.
De préférence, le système d’analyse rapide 1 selon l’invention comprend N à N+10 moyens de prélèvement 7 (pour le prélèvement d’autant d’échantillons biologiques E).
Témoin positif / négatif
Les moyens témoins positif / négatif sont destinés à être rapportés dans au moins un puits 21.
De tels témoins positif / négatif sont par exemple choisis parmi le sérum humain dilué qui provient de patient confirmé (par exemple confirmé au Covid-19 par une méthode PCR ou autre).
Procédé pour l’analyse rapide
grande capacité
La mise en œuvre du système selon l’invention est particulièrement intéressante pour exécuter un procédé d’analyse rapide grande capacité de plusieurs échantillons biologiques E, en vue de la détection de la présence d’au moins un analyte A dans lesdits échantillons biologiques E.
Pour cela, ce procédé comprend les étapes successives suivantes (illustrées au travers des figures 5 à 10) :
- le dépôt d’un volume de solution tampon 3 dans certains au moins des puits 21, par exemple de 50 µL à 200 µL (de préférence encore de 100 à 150 µL) (voir la figure 5),
- le dépôt d’un volume d’échantillons biologiques E (provenant avantageusement de différents patients) dans certains au moins des puits 21 (contenant la solution tampon 3), par exemple de 2 µL à 40 µL (de préférence de 5 à 20 µL) (voir la figure 6),
- le dépôt d’une bandelette chromatographique 5 dans les puits 21 contenant le mélange solution tampon 3 / échantillon biologique E (figures 7 à 10), et éventuellement
- la lecture des bandelette chromatographique 5, après migration de la solution tampon 3, pour déterminer les échantillons biologiques E contenant ledit au moins un analyte d’intérêt A.
De préférence, les échantillons biologiques E consistent en des échantillons de sang capillaire, de préférence prélevés sur des êtres humains.
A titre d’exemple, les échantillons biologiques E, du type sang capillaire, peuvent être obtenus par les étapes suivantes :
- le génération d’une goutte de sang à l’aide de l’auto-piqueur 71, par exemple au niveau de la pulpe du doigt d’un individu,
- le prélèvement de la goutte de sang capillaire à l’aide de l’organe de prélèvement 72 prévu à cet effet.
Au sein de la microplaque 2, les différents échantillons biologiques E sont avantageusement repérés grâce aux coordonnées des puits 21.
Tel que abordé précédemment, les bandelettes chromatographiques 5 sont insérées individuellement et érigées dans chacun des puits (figures 7 à 10).
Pour cela, chaque bandelette chromatographique 5 est introduite au travers d’une ouverture supérieure d’accès 213 jusqu’à reposer sur le fond 212.
La bandelette chromatographique 5 est orientée de sorte à introduire sa zone d’insertion 51 dans le puits 21.
En position, chaque bandelette chromatographique 5 comporte avantageusement une partie inférieure 55 dans le puits 21 et une partie supérieure 56 hors du puits 21 (avantageusement proche de la verticale).
Cette bandelette chromatographique 5 peut être :
- libre, notamment dans le cas d’un puits 21 dépourvu des moyens de guidage 214 précités (figures 7 et 9), ou
- guidée, en présence des moyens de guidage 214 précités (figures 8 et 10).
Dans la forme « libre » (figure 9), la partie inférieure 55 repose avantageusement sur le fond 212 et sur l’ouverture supérieure d’accès 213 (au niveau de sa couche arrière).
Dans la forme « guidée », la partie inférieure 55 repose avantageusement sur le fond 212 et coopère avec les moyens de guidage 214.
De préférence, les bandelettes chromatographiques 5 sont tournées dans un même sens, de sorte à pouvoir effectuer une lecture depuis un même côté de la microplaque 2 (figure 7).
De préférence, les bandelettes chromatographiques 5 sont choisies parmi les bandelettes immunochromatographiques adaptées à analyser la sérologie d’un échantillon biologique (de préférence un échantillon de sang capillaire d’un être humain), en particulier pour détecter les anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et/ou IgM anti-SRAS-Cov-2.
Le système 1 selon l’invention, et le procédé qui en découle, permettent ainsi une détection de la présence éventuelle d’au moins un analyte d’intérêt A dans une pluralité d’échantillons biologiques E, cela de manière rapide, simultanée et à coût réduit.
Une telle approche est donc particulièrement intéressante pour la mise en œuvre d’un dépistage massif au cours notamment d’une épidémie.
Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l’invention dans le cadre des revendications annexées.
Claims (11)
- Système pour l’analyse rapide grande capacité d’échantillons biologiques (E), destiné à la détection de la présence d’au moins un analyte d’intérêt (A) dans lesdits échantillons biologiques (E),
lequel système d’analyse rapide comprend au moins les composants suivants :
- une microplaque (2) comportant N puits (21), avantageusement 96 puits (21), qui sont adaptés à recevoir lesdits échantillons biologiques (E),
- une solution tampon (3) conditionnée dans un premier contenant (4),
laquelle solution tampon (3) est destinée à être rapportée dans plusieurs puits (21) et à être mélangée avec un échantillon biologique (E) pour la mise en œuvre d’une technique chromatographique,
- des bandelettes chromatographiques (5) conditionnées dans un second contenant (6), avantageusement des bandelettes immunochromatographiques,
lesquelles bandelettes chromatographiques (5) présentent une largeur (L1) qui est inférieure à la largeur (P1) d’un puits (21), de sorte à autoriser leur insertion individuelle et érigée dans un puits (21),
lesquelles bandelettes chromatographiques (5) sont réalisées dans un matériau apte à rester érigé dans ledit puits (21) suite à la migration de la solution tampon (3),
lesquelles bandelettes chromatographiques (5) comportent différentes zones successives, dans le sens de migration capillaire amont vers aval, à savoir au moins :
- une zone d’insertion (51) dans un puits (21), destinée à être immergée dans le mélange échantillon biologique (E) / solution tampon (3),
- une zone de libération (52) qui comprend au moins un réactif de détection (521) conjugué avec un marqueur visible et/ou mesurable, ledit réactif de détection (521) étant apte à se déplacer en conséquence de la migration de la solution tampon (3) le long de la bandelette chromatographique (5), et
- au moins une zone de capture (53) qui comprend au moins un réactif de capture (531), immobilisé sur la bandelette chromatographique (5). - Système d’analyse rapide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit système d’analyse rapide (1) comprend N à N+10 bandelettes chromatographiques (5),
de préférence conditionnées dans un second contenant (6) consistant en un tube fermé hermétiquement. - Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu’une bandelette chromatographique (5) comporte les dimensions suivantes :
- la largeur est de 2 à 6 mm,
- la longueur est de 5 à 10 cm. - Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les réactifs de détection (521) et les réactifs de capture (531) sont choisis parmi les réactifs adaptés à analyser la sérologie d’un échantillon biologique (E), en particulier les anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et IgM anti-SRAS-Cov-2.
- Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le premier contenant (4) comporte un compte-goutte.
- Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend encore des moyens de prélèvement (7) d’échantillons biologiques (E), avantageusement un auto-piqueur (71) pour le prélèvement de sang capillaire.
- Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l’un au moins des puits (21) de la microplaque (2) comporte des moyens de guidage (214) qui sont conçus pour recevoir une bandelette chromatographique (5) et pour participer au maintien érigé de ladite bandelette chromatographique (5).
- Système d’analyse rapide, selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les composants sont regroupés dans un emballage pour former un kit.
- Procédé pour l’analyse rapide grande capacité de plusieurs échantillons biologiques (E), en vue de la détection de la présence d’au moins un analyte (A) dans lesdits échantillons biologiques (E), par la mise en œuvre d’un système selon l’une quelconque des revendications 1 à 8,
caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes successives suivantes :
- le dépôt d’un volume de solution tampon (3) dans certains au moins des puits (21),
- le dépôt d’un volume d’échantillons biologiques (E) dans certains au moins des puits (21),
- le dépôt d’une bandelette chromatographique dans les puits (21) contenant le mélange solution tampon (3) / échantillon biologique (E), et éventuellement
- la lecture des bandelettes chromatographiques (5), après migration de la solution tampon (3), pour déterminer les échantillons biologiques (E) contenant ledit au moins un analyte d’intérêt (A). - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les échantillons biologiques (E) consistent en des échantillons de sang capillaire.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que les bandelettes chromatographiques (5) sont choisies parmi les bandelettes immunochromatographiques adaptées à analyser la sérologie d’un échantillon biologique (E), en particulier les anticorps IgG anti-SRAS-Cov-2 et IgM anti-SRAS-Cov-2.
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-
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