WO1996010179A1 - Diagnostic direct d'haptenes - Google Patents

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WO1996010179A1
WO1996010179A1 PCT/FR1995/001259 FR9501259W WO9610179A1 WO 1996010179 A1 WO1996010179 A1 WO 1996010179A1 FR 9501259 W FR9501259 W FR 9501259W WO 9610179 A1 WO9610179 A1 WO 9610179A1
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WO
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conjugate
sample
hapten
reading
molecule
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Application number
PCT/FR1995/001259
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Jean Kadouche
Hamidou Samake
Philippe Goumard
Original Assignee
Gks Technologies
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
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Definitions

  • the present invention relates to a solid phase method for characterizing and assaying molecules with a molecular weight of less than 10,000 daltons in a liquid sample, by using a system combining dry chemistry and chromatography, the use of pairs antigen-antibody or streptavidin-biotin affinities, a simple labeling system, all allowing direct reading of the presence or absence of the molecule sought in the sample and making it possible to directly link the signal observed to the concentration of the desired substance.
  • Haptens are small molecules, of diverse chemical nature and of molecular weight less than 10,000 daltons. They have the distinction of not being immunogenic. Thus, to have anti-hapten antibodies, it is necessary to couple them beforehand to a macromolecule called carrier protein which is usually chosen from the following proteins: serum albumin, thyroglobulin, ovalbumin, fibrinogen and Keyhole Lympet Hemocyanin (KLH).
  • carrier protein which is usually chosen from the following proteins: serum albumin, thyroglobulin, ovalbumin, fibrinogen and Keyhole Lympet Hemocyanin (KLH).
  • Haptens are substances with a wide variety of reactive groups. These groups constitute not only the elements serving as a basis for their coupling but also their immunodeterminants which distinguish them from molecules which are structurally analogous to them.
  • This objective of optimizing the specificity of anti-hapten antibodies is achieved from a process including:
  • haptens in a sample and in particular in biological fluids requires obtaining antibodies of very specific quality.
  • the "haptenation" of macromolecules is a crucial step that it should be well mastered; in particular, the trap of anti-carrier protein antibody formation should be avoided.
  • Van Weemans and Schuurs (1), (2), (3) have long demonstrated the existence of three types of heterology: - the use of different coupling agents allows to distinguish a bridge heterology,
  • a third heterology concerns the case where different structurally close haptens are coupled from the same site using the same coupling agent.
  • the protein-hapten bond which determines the quality of the immunogen and, subsequently, that of the antibody, takes place at the level of the most reactive groups.
  • amino ⁇ and ⁇ groups (pKa between 8 and 10), hydrogen sulfides, phenolics (pKa from 9), imidazoles (pKa from 7) and carboxylic groups (pKa from 2 to 4) are generally used for these protein-hapten bonds.
  • the pKa that is to say the pH at which half of the groups is protonated, determines the change in reactivity as a function of the pH; the non-protonated forms of the nucleophilic groups are those which are reactive. Finally, the reactivity of the hapten linkage groups also depends on the micro-environment of the residue to be coupled.
  • the dosage of haptens requires at least several elements:
  • the haptens are preferably dosed by a competition system. It is in reality the competition between the hapten to be assayed and the labeled hapten for limited sites of anti-hapten antibodies. The signal observed is therefore, by definition, inversely proportional to the concentration of hapten in the fluid to be assayed: the more hapten to be assayed, the weaker the measured signal and vice versa, the higher the measured signal, the weaker is the concentration of the hapten to be measured. As in all competition systems, the measurement of the substance to be dosed is made indirectly. This poses problems in particular in so-called rapid direct reading tests without special instrumentation, and whose interpretation must therefore be very easy.
  • Patent application WO 91/12528 relates to a rapid diagnostic device using the principle of chromatography combined with dry chemistry and in which a capture system of avidin-biotin or streptavidin-biotin type makes it possible to retain during the chromatographic migration of a ligand previously coupled to biotin.
  • the device described in this patent application makes it possible to implement sandwich type reactions between two immunologically reactive substances of antigen-antibody type or even reactions of competition type.
  • the strip thus described comprises three zones: the first is impregnated with iodine, the second is treated with a mixture of iodine and potassium iodide; after application of a fuel sample on the strip there is migration by capillarity through the two zones to a third zone where an indicator is added; the presence of lead is revealed by a coloration in the third zone by the formation of a complex.
  • the principle of this method is the formation of a mercury-barbiturate complex and the determination of mercury in the complex.
  • the strip comprises a hydrophilic paper having three zones: the first is impregnated with an acid to globally acidify the sample, the second is impregnated with a buffered mercury acetate capable of reacting to form a mercury barbiturate complex; the third zone is impregnated with a compound indicating the presence of mercury such as diphenyl carbazone.
  • Patent EP 262 328 also describes a strip for the analysis of an analyte in a biological sample by means of a sequential series of reactions, the strip being made up of a capillary material for chromatography and capable of rapidly transporting reagents from the sample not immobilized at the start with a solvent chromatographic; this strip consists of three parts: a starting reservoir, a reservoir on arrival and between the two a series of zones impregnated with mobile or immobilized reagents allowing specific reactions with the analyte.
  • This system is however incapable of functioning in dry chemistry (without addition of solvent) and in addition it involves a series of manipulations to possibly modify the chromatography buffers, manipulation incompatible with a rapid and inexpensive test.
  • the system proposed by the present invention and which makes it possible to carry out a direct reading making it possible to link the concentration of the substance to be dosed to the signal observed, consists of a device consisting of a hydrophilic support in which a liquid is liable to migrate by capillarity , having a plurality of distinct regions in which the reagents are deposited and / or dried, and allowing rapid analysis and characterization of the presence of a molecule with a molecular weight of less than 10,000 daltons, (or hapten), and present in a sample, this device being characterized in that it consists at least of the following zones: a) a zone for receiving the sample to be tested, b) a reservoir zone containing a conjugate having the double characteristic of being marked with a marker allowing its direct detection and to be a ligand for the molecule to be analyzed, these two zones a) and b) being superimposed or sequential, c) of two successive barriers made up of halves of affinity pairs, one of which retains said conjugate
  • the reservoir consists of a material chosen from glass fiber, cellulose, cellulose derivatives, nylon, fibrous or microporous polymers of high density polyester type, fibers of vegetable origin, animal or synthetic in the form of tablet or multi-layer powders or cellulose wadding.
  • the zones a) and b) form a single zone, and the sample is deposited in a receptacle directly above the reservoir.
  • the labeling of the conjugate must be a simple labeling of direct reading and in which the intensity of the revelation is directly linked to the amount of product present in the sample.
  • the conjugate is marked either with colloidal particles containing a metal, preferably gold, or with an organometallic marker.
  • a metal preferably gold
  • an organometallic marker preferably gold
  • the labeling of a reagent with colloidal gold particles has been described and used in numerous diagnostic tests, in particular patent applications WO / 9112528 or US patent 4,859,612 or patent applications EP 291 194 and EP 560 411. Finally, the EP patents must be mentioned
  • the invention does not consist in using labeling with colloidal particles but in using this labeling in a combination involving a reservoir zone containing a dehydrated conjugate, the two successive de-capture barriers making it possible to have a signal that the response is positive or negative, and great stability of the product by the fact that all of the constituent elements of the device are dehydrated after their deposition allowing storage of said devices at room temperature for a period of several weeks to several months.
  • One of the capture systems used which is particularly effective is the avidin-biotin or streptavidin-biotin system.
  • Avidin has an exceptionally high affinity for biotin ( 10'15 M).
  • Biotin is easily coupled to macromolecules, in particular proteins, without loss of activity.
  • Avidin is very stable and has several binding sites and could serve as a bridging molecule between other biotinylated molecules. These properties allow it a considerable increase in detectability
  • Biotin is one of the twelve water-soluble factors of the vitamin B complex and also constitutes a coenzyme for the enzymes involved in carboxylation. Avidin is very stable over a wide range of pH and temperature and the avidin-biotin complex itself has great stability with respect to heat and proteolytic enzymes.
  • Avidin is a basic glycoprotein with a pI of 10.5; it can be crystallized from saline solutions with a pH between 5 and 7. It has four subunits of 15,600 KD each and is also sensitive to strong light.
  • Each avidin subunit is capable of binding to biotin in a pH range between 2 and 13
  • biotin binding sites by avidin are very deep. Each atom of biotin strongly contributes to this interaction. Thus, several analogs or small fragments of biotin (urea, glycol, tetrahydrofuran, caproic acid) are capable of inhibiting l avidin-biotin interaction
  • the relatively deep burial of biotin is responsible for the very strong affinity
  • the four binding sites are not distributed in the same way • two sites are found very close to each other and, thus each pair of binding sites would only bind a biotmylated protein.
  • avidin with its pairs of binding sites would behave more as a bridging agent between two biotinylated proteins rather than as a binding agent. amplification
  • a protein similar to avidin, streptavidme from Streptomyces aviduni is used with a big advantage which is that of having a lower background noise
  • Streptavidme is an extracellular protein of Streptomyces aviduni and its functional part has a PM of 47 KD and has 4 subunits, each having a biotin binding site The binding of avidin to biotin is not disturbed by extreme pH, salts or even chaotropic agents like guanidine hydrochloride (up to 3M), urea, guanidine chloride, etc.
  • affinity pair systems Apart from the antigen / antibody affinity pairs, or avidin, or streptavidin / biotin, other affinity pair systems can be recalled here and used in the device of the invention.
  • Protein A is extracted from the cell wall of Staphylococcus aureus It has a strong affinity for the Fc fragment of most Ig Its PM is between 42 and 56 KD and its pi is 5 1
  • the equilibrium constant of Protein A with IgG varies considerably according to species and pH, but the binding of the antigen to Fab increases the affinity between the Fc fragment of Ig and Protein A
  • the Protein A-Ig complex is not affected by EDTA or by low concentrations of detergents (Tween, Triton X-100, Brij) often used in immunological tests.
  • Con A concanavalin A
  • lectins and carbohydrates consists of 26 KD subunits which would form a tetramer. Each subunit contains a Mn 2 * and a Ca 2 * which are necessary for the activity of Con A. Likewise, each subunit has a carbohydrate binding site. However, excess metal prevents this activity.
  • the conjugate can be marked by colloidal particles and in particular by particles of colloidal gold, it can be marked by an organometallic marker making it possible to reveal the presence of the product by infrared detection, the wavelength of observation being dependent on the marker used; the advantage of using this type of organometallic marker is that by the simultaneous use of several different markers, namely those which can be revealed at different wavelengths in infrared, it is possible on the same device to carry out research and characterization of different molecules present in the same sample or in different samples.
  • the device of the invention in which the conjugate is marked with an organometallic type marker requires the use of a simple reader in which said device is arranged after deposit and migration of the sample.
  • the absorbent means which makes it possible to drain the liquid from the sample deposited at the receptacle provided for this purpose consists of a hygroscopic material, in particular cellulose derivatives or cellulose wadding, nylon, fibrous or microporous polymers of high density polyester type, fibers of vegetable, animal or synthetic origin in the form of powders of tablets or of multiple layers.
  • the invention also relates to a method for rapid analysis and characterization of the presence of a molecule with a molecular weight of less than 10,000 daltons, or hapten, in a liquid sample, said method being characterized in that it uses a device as described in its various embodiments above and in the examples below and consisting of a hydrophilic support in which a liquid is capable of migrating by capillarity, having a plurality of regions distinct in which the reagents are deposited by impregnation and dried, this device consisting at least of the following zones: a) a zone for receiving the sample to be tested, b) a reservoir zone containing a conjugate having the double characteristic of being marked by a marker allowing its direct detection and to be a ligand for the molecule to be analyzed, these two zones being superimposed or sequential, c) two successive barriers made up of halves of affinity pairs, one of which retains said conjugate during of its migration on the support in the absence of the molecule sought in the sample, called a negative reading
  • a device as described above for detecting and characterizing the presence of a hapten in a liquid sample is an integral part of the invention. Any type of molecule having its weight less than 10,000 daltons can be analyzed and assayed by a device as described above; but the invention is particularly advantageous when hapten is a drug which it is sought to detect in a biological fluid, this fluid possibly being blood, urine or saliva. The existence of a rapid diagnosis seems particularly advantageous when the use of a drug (“drug abuse”) is suspected in a patient or during drug treatment with drugs with side effects. Drugs whose characterization or monitoring of their presence in a biological fluid can be particularly valuable are, without limitation, but to be the most important, included in one of the following classes:
  • opiates or alkaloids including morphine, heroin, codeine, dextromethorpha ⁇ e, or their derivatives and metabolites
  • - synthetic opiates including methadone, propoxyphene, phenylcyclidine, derivatives and metabolites, - cannabinoids including 9-tetrahydrocannabiol (or cannabis), cocaine, LSD, ecgonine benzo ⁇ l, marijuana, their derivatives and metabolites,
  • - steroids including estrogens, androgens, adrenocortical steroids, their derivatives and metabolites, - glycosides and aglycones including digoxin, digoxigenin, saponins and sapogenins, their derivatives and metabolites,
  • FIGS. 1 to 4 represent the different devices as described in examples 1 to 4.
  • the reservoir (11) contains a conjugate consisting of a labeled anti-hapten antibody and coupled to biotin with downstream, a negative reading barrier (21) consisting of haptens fixed on the support , capable of fixing the anti-hapten of (11) when the latter has not reacted with the hapten of the sample, and downstream a positive reading barrier consists of streptavidin (31) capable of capturing the anti-hapten labeled and coupled on the one hand to biotin and on the other hand to the hapten of the sample.
  • FIG. 1a shows the device in its housing, which housing is provided with a receptacle (5) allowing the deposit of the sample
  • FIG. 1b represents a longitudinal sectional profile view of the various elements of the device comprising a filter (6), the reservoir (11), the nitrocellulose membrane (40), the hydroscopic blotting zone (50), all placed on a “Mylar” type plastic support (60);
  • Figure 1c shows the principle of the test. The arrow indicates the direction of migration.
  • FIG. 2 represents a device in which the reservoir (12) is filled with labeled anti-hapten antibodies, upstream is present a sample of haptens coupled to biotin (15), deposited and dehydrated; the first reading barrier (22) consists of streptavidin and the second reading barrier consists of an antibody directed against the anti-hapten antibody present in the reservoir (12).
  • FIG. 2a represents the device in its housing, which housing is provided with a receptacle (5) allowing the deposit of the sample
  • FIG. 2b represents a longitudinal sectional profile view of the various elements of the device comprising a filter (6), the reservoir (12), the nitrocellulose membrane (40), the hydroscopic blotting area (50), all placed on a “Mylar” type plastic support (60);
  • Figure 2c shows the principle of the test. The arrow indicates the direction of migration.
  • FIG. 3 represents an embodiment in which the reservoir (13) contains a specific protein of the hapten to be assayed, the first barrier (23) consists of an anti-hapten antibody and the second barrier (33) consists an antibody against the specific protein as deposited in the reservoir (13);
  • FIG. 3a shows the device in its case, which case is provided with a receptacle (5) allowing the deposit of the sample;
  • FIG. 3b represents a longitudinal sectional profile view of the various elements of the device comprising a filter (6), the reservoir (13), the nitrocellulose membrane (40), the hydroscopic blotting area (50), all placed on a “Mylar” type plastic support (60);
  • Figure 3c shows the principle of the test. The arrow indicates the direction of migration.
  • FIG. 4 represents an embodiment in which the reservoir (14) is filled with labeled haptens, the first negative reading barrier (24) consists of a first anti-hapten antibody and the second reading barrier (34) consisting of a second anti-hapten antibody, both of which have a difference in affinities of 1 to 3 logs.
  • FIG. 4a represents the device in its housing, which housing is provided with a receptacle (5) allowing the deposit of the sample
  • FIG. 4b represents a longitudinal sectional profile view of the various elements of the device comprising the filter (6), the reservoir (14), the nitrocellulose membrane (40), the hydroscopic blotting area (50), all placed on a “Mylar” type plastic support (60);
  • Figure 4c shows the principle of the test. The arrow indicates the direction of migration.
  • the biological material contained in the tank is either plumb, or slightly offset downstream of the sample receptacle (5).
  • EXAMPLE 1 dosage of amphetamine according to a first embodiment. This first embodiment uses the streptavidin-biotin system as a positive reading reaction barrier.
  • Figure 1 shows schematically the device of this embodiment, the reservoir zone containing a conjugate consisting of an anti-hapten antibody labeled with colloidal gold, the anti-hapten being covalently coupled to biotin.
  • a first negative reading barrier of the reaction consists of amphetamine fixed on the support.
  • the sample whose presence of hapten is sought contains amphetamine, the latter will then form an affinity complex with the anti-haptè ⁇ e-biotin-colloidal gold conjugate and, during migration by capillarity along the support not to be retained by the hapten barrier (fixed amphetamine), the paratopes of the conjugate then being saturated by the corresponding epitopes of the hapten; on the contrary, it will be captured at the streptavidin barrier by the formation of the streptavidin / biotin-conjugate complex; if, on the contrary, the sample does not contain amphetamine, then the migration of the conjugate will, at the level of the first fixed amphetamine barrier, lead to the formation of an amphetamine / conjugate complex and the coloring then will be revealed at the level of this first barrier.
  • the hapten barrier fixed amphetamine
  • the marking at the level of the first window corresponding to the hapten barrier indicates the absence of hapten in the sample;
  • the coloring at the second reading window, at the level of fixed streptavidin indicates the presence of hapten in the sample.
  • NHS biotin is used for coupling to the anti-amphetamine antibody.
  • the N-hydroxysuccinimide esters react with primary amines to form amide bonds.
  • the reaction generally consists of a nucleophilic attack on an amine ( ⁇ for most cases). The result is the formation of a stable amide bond with production of N-hydroxysuccinimide.
  • Biotinylation reagents Material Antibody solution at 10 mg / ml in PBS Biotin NHS (CALBIOCHEM Ref 203188) Carbonate-bicarbonate buffer 0.1 M pH 9.5 Dimethysulfoxide (DMSO) (Prolabo Ref 23486297)
  • the tracer has a capital role it allows the reading of the test result
  • the antibody is dialyzed for 2 hours at room temperature against a 2 mM sodium borate solution buffered to a pH greater than 0.5 unit at the isoelectric point of the antibody considered.
  • the concentration of the antibody solution is adjusted to 0.1 mg / ml with the 2 mM sodium borate solution buffered to pH9.
  • the mixture is stirred for 5 minutes at room temperature. It is centrifuged at 15,000 g for 30 minutes and at 4 ° C.
  • the reaction mixture is at. again centrifuged 2 times under the same conditions. After the third centrifugation, the pellet is taken up in 1 ml of a 20 mM Tris solution buffered to pH 7.4 and containing 1% albumin serum, 0.1% Tween 20 and 0.5% of polyethylene glycol 3000.
  • the optical density of the solution is measured at 595 nm.
  • BSA was chosen as the model.
  • the mixed anhydride method can be used to couple amphetamine to BSA (Erlanger et al 1959), (4).
  • BSA 1125 (200,000 dpm, 300pg) is added at the start of the reaction to serve as a marker.
  • This signal corresponds to the stopping of the Amphetamine-Anti-Amphetamine-Colloidal Gold-Biotin complex by streptavidin.
  • FIG. 2 is a schematic representation of this embodiment in which the conjugate consists of an anti-amphetamine antibody bound to the deposited colloidal gold in the tank and dried, and upstream of said conjugate or contiguous in the tank but not mixed with the conjugate, a sample of amphetamine coupled to biotin is also deposited and then dehydrated.
  • the strip consists downstream of the reservoir of a negative reading barrier consisting of fixed streptavidin then of a positive reading barrier consisting of an antibody directed against the anti-amphetamine antibody; the latter being a mouse antibody, it is therefore a mouse anti-immunoglobulin antibody.
  • the Amphetamine-Biotin complex is prepared according to the method described above.
  • Biotin-X-NHS is used for coupling to the amine function of amphetamine.
  • the amphetamine contained in the sample competes with amphetamine coupled to biotin (and deposited on its trajectory) for limited sites of anti-amphetamine labeled with colloidal gold (tracer)
  • the tracer is complexed by the amphetamine to be measured.
  • the complex migrates, it is then stopped by the anti-mouse Ig antibody barrier.
  • Embodiment No. 3 Determination of amphetamine by embodiment n ° 3.
  • Embodiment No. 3 is shown diagrammatically in FIG. 3:
  • the conjugate consists of a specific protein capable of coupling with amphetamine, in this case alphafoetoprotein or AFP, marked with colloidal gold. Downstream of the reservoir in the direction of liquid migration is the first positive reading barrier made up of a fixed anti-amphetamine antibody, then downstream the negative reading barrier made up of an antibody directed against AFP.
  • This system is a sandwich type assay because if the amphetamine is in the sample it will find itself sandwiched between AFP on the one hand and the anti-amphetamine antibody fixed at the level of the positive reading barrier d 'somewhere else.
  • the conjugate will migrate to the negative reading barrier where it will be captured by the anti-AFP antibody.
  • Preparation of the migration support Simultaneously deposit 3 ⁇ l of anti-amphetamine antibody and 1 ⁇ l of anti-AFP antibody. These two solutions are 10 mg / ml in PBS. Wait 15 minutes at room temperature. Immerse in PBS Sucrose 5% buffer, Milk 0.5%. Leave to stir for 30 minutes at room temperature. Wash with PBS, shaking for 15 minutes. Remove the PBS.
  • Amphetamine-colloidal gold conjugate is made from BSA-amphetamine, but it can also be prepared directly without the use of a carrier protein.
  • BSA-amphetamine is labeled with colloidal gold following the antibody coupling protocol.
  • the amphetamine in the sample competes with the labeled amphetamine for attachment to the sites of the anti-amphetamine antibody 1.
  • This first barrier which has more affinity for free amphetamine, fixes it and lets through the amphetamine-colloidal gold conjugate.
  • the anti-amphetamine 2 antibody stops the conjugate and gives rise to a signal at the level of the window marked Positive.
  • example 1 for example if the amount of conjugate is such that it can only fix 50% of the amphetamine present in the sample the result will be an equivalent coloration at the level of the positive reading barrier or the negative reading barrier; if the conjugate can only bind 75% of the amphetamine present in the sample, the color will be present at the two reading barriers but will be three times more intense at the positive reading barrier (streptavidin) than level of the negative reading barrier (fixed amphetamine).
  • the production of such types of charts allowing quantitative dosing is therefore easy to carry out for those skilled in the art.
  • the two positive and negative reading barriers can, depending on the case, be achieved by using a substance having affinity either for the conjugate or for the conjugate-hapten complex, either for the hapten whatever its affinity partner; for example if we repeat the embodiment of Example 2 in which the positive reading barrier consisted of an anti-mouse antibody so as to capture the anti-amphetamine labeled with colloidal gold from the conjugate, it is extremely easy to imagine that this anti-mouse Ig antibody could be replaced by a protein A also capable of forming an affinity complex with the immunoglobulins, fixed on the support. The common point and the originality of all these tests is:

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Abstract

Dispositif d'analyse rapide et de caractérisation de la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, ou haptène, dans un échantillon liquide, ledit dispositif étant constitué d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par capillarité, ayant une pluralité de régions distinctes dans lesquelles les réactifs sont déposés et/ou séchés, ce dispositif étant caractérisé par le fait qu'il est constitué au moins des zones suivantes: (a) une zone de réception de l'échantillon à tester; (b) une zone réservoir contenant un conjugué possédant la double caractéristique d'être marqué par un marqueur permettant sa détection directe et d'être un ligand pour la molécule à analyser, les zones en (a) et (b) pouvant être superposées ou séquentielles; (c) de deux barrières successives constituées de moitiés de paires d'affinité dont l'une retient ledit conjugué lors de sa migration sur le support en l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon, appelée barrière de lecture négative et l'autre retient ledit conjugué en présence de la molécule recherchée, cette dernière étant alors liée directement ou indirectement audit conjugué, cette deuxième barrière étant alors une zone de lecture positive de la réaction; (d) un moyen absorbant et contigu au support hydrophile permettant de favoriser le flux de liquide depuis la zone (a) de réception de l'échantillon à travers les autres zones constitutives dudit dispositif.

Description

DIAGNOSTIC DIRECT D'HAPTENES
La présente invention est relative à une méthode en phase solide de caractérisation et de dosage de molécules de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons dans un échantillon liquide, par utilisation d'un système alliant la chimie sèche et la chromatographie, l'utilisation de paires d'affinités de type antigène-anticorps ou streptavidine-biotine, un système simple de marquage, le tout permettant une lecture directe de la présence ou de l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon et permettant de lier directement le signal observé à la concentration de la substance recherchée.
Les haptenes sont de petites molécules, de nature chimique diverse et de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons. Ils ont la particularité de ne pas être immunogènes. Ainsi, pour avoir des anticorps anti-haptènes, il est nécessaire de les coupler au préalable à une macromolécule dite protéine porteuse qui est choisie habituellement parmi les protéines suivantes : sérum albumine, thyroglobuline, ovalbumine, fibrinogène et Keyhole Lympet Hémocyanine (KLH).
Les haptenes sont des substances ayant une grande diversité de groupes réactifs. Ces groupes constituent non seulement les éléments servant de base à leur couplage mais aussi leurs immunodeterminants qui les distinguent des molécules qui leur sont analogues sur le plan structural.
Généralement, l'utilisation de ces groupes dans les couplages fait décroître la spécificité des anticorps anti-haptènes.
Même si dans certaines situations (en particulier «l'abus de drogue») la reconnaissance d'une large gamme d'haptènes est recommandée, la recherche d'une excellente spécificité reste cependant de rigueur.
Cet objectif d'optimisation de la spécificité des anticorps anti-haptènes est atteint à partir d'une démarche incluant :
- la choix d'un groupe réactif commun aux molécules proches sur le plan structural (analogues structuraux),
- l'utilisation d'un espaceur entre l'haptène et la protéine porteuse.
Le dosage des haptenes dans un échantillon et notamment dans les fluides biologiques nécessite l'obtention d' anticorps de qualité très spécifique. L'« hapténation » des macromolécules constitue une étape cruciale qu'il convient de bien maîtriser ; il faut éviter en particulier le piège de la formation d'anticorps anti-protéine porteuse. Dans l'obtention des anticorps anti-haptènes, Van Weemans et Schuurs (1 ), (2), (3), ont depuis longtemps démontré l'existence de trois types d'hétérologie : - l'utilisation de différents agents de couplage permet de distinguer une hétérologie de liaison (« bridge heterology »),
- le choix de différents sites de couplage sur les molécules d'haptènes permet le développement d'une hétérologie de sites,
- une troisième hétérologie concerne le cas où différents haptenes proches structurellement sont couplés à partir d'un même site en utilisant le même agent de couplage.
La liaison protéine-haptène qui détermine la qualité de l'immunogène et, par la suite celle de l'anticorps, a lieu au niveau des groupes les plus réactifs.
Les groupes ε et α aminés (pKa compris entre 8 et 10), sulfhydriques, phénoliques (pKa de 9), imidazoles (pKa de 7) et carboxyliques (pKa compris entre 2 et 4) sont généralement utilisés pour ces liaisons protéine-haptène.
Le pKa, c'est-à-dire le pH auquel la moitié des groupes est protonée, détermine le changement de la réactivité en fonction du pH; les formes non protonées des groupes nucléophiles sont celles qui sont réactives. Enfin, la réactivité des groupes de liaison des haptenes dépend aussi du micro-environnement du résidu à coupler.
Le dosage des haptenes nécessite au minimum plusieurs éléments :
- un anticorps d'excellente qualité,
- un système de dosage performant comprenant une phase solide et un système de révélation très sensible.
En tant que petites molécules, les haptenes sont dosés préférentiellement par un système de compétition. Il s'agit en réalité de la compétition entre l'haptène à doser et l'haptène marqué pour des sites limités d'anticorps anti- haptène. Le signal observé est donc, par définition, inversement proportionnel à la concentration d'haptène dans le fluide à doser : plus il y a d'haptène à doser plus le signal mesuré sera faible et réciproquement, plus le signal mesuré est élevé, plus faible est la concentration de l'haptène à doser. Comme dans tous les systèmes de compétition, la mesure de la substance à doser est faite de façon indirecte. Ce qui pose des problèmes notamment dans les tests dits rapides à lecture directe sans instrumentation particulière, et dont l'interprétation doit être par conséquent très aisée. De nombreux tests de diagnostic rapide de type bandelette ou apparenté utilisant la migration par chromatographie ou par capillarité de substances susceptibles de former des paires d'affinité avec des ligands et l'observation de la réaction ou de la non réaction avec ledit ligand ont été décrits. Aussi bien des méthodes par compétition ou des méthodes sandwich ont été développées extensivement et de nombreux brevets ou demandes de brevets décrivent de tels systèmes ; parmi les plus proches du système de l'invention nous pouvons citer le brevet EP 306 772 décrivant un dispositif pour analyse rapide basé sur un système de chromatographie et dans lequel un moyen d'absorption des liquides en aval permet d'absorber les liquides réactionnels ; ce système comporte au niveau d'une fenêtre de lecture un réactif permettant de détecter la présence de l'échantillon. Cependant ce système est adapté à la détermination directe d'une grosse molécule de type protéine.
La demande de brevet WO 91/12528 est relative à un dispositif de diagnostic rapide utilisant le principe de la chromatographie allié à la chimie sèche et dans lequel un système de capture de type avidine-biotine ou streptavidine-biotine permet de retenir au cours de la migration chromatographique un ligand préalablement couplé à la biotine. Le dispositif décrit dans cette demande de brevet permet de mettre en oeuvre des réactions de type sandwich entre deux substances immunologiquement réactives de type antigène-anticorps ou encore des réactions de type compétition. Rien n'est dit dans cette demande de brevet sur la façon dont on pourrait de façon directe soit simple soit par une méthode sandwich doser des petites molécules de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons.
Dans l'ensemble des différentes publications décrivant des tests de diagnostic, peu sont consacrées à la détection de petites molécules. Parmi celles-ci on peut citer le brevet US 4 358 535, dans lequel Falkow et al; décrivent une méthodologie pour la détection, de séquence d'ADN associée à des maladies et dans lequel la séquence d'ADN est fixée sous forme dénaturée, simple chaîne sur un support de type nitrocellulose. Une sonde polynucléotidique marquée spécifique d'une séquence d'ADN particulière est alors mise en contact avec l'échantillon dans des conditions d'hybridation ; ce dispositif nécessite une étape de lavage pour enlever les sondes non hybridées. Dans le brevet US 3 893 808, Campbell décrit un test de type bandelette pour la détection de contamination en plomb dans les carburants d'automobile. La bandelette ainsi décrite comprend trois zones : la première est imprégnée d'iode, la seconde est traitée avec un mélange d'iode et d'iodure de potassium; après application d'un échantillon du carburant sur la bandelette il y a migration par capillarité à travers les deux zones jusqu'à une troisième zone où un indicateur est ajouté ; la présence de plomb est révélée par une coloration au niveau de la troisième zone par formation d'un complexe.
Dans le brevet US 3 895 914, Alberty et al. décrivent un test bandelette pour la détection de l'acide barbiturique et de leurs dérivés dans des fluides biologiques. Le principe de cette méthode est la formation d'un complexe mercure-barbiturate et la détermination du mercure dans le complexe. La bandelette comprend un papier hydrophile ayant trois zones : la première est imprégnée avec un acide pour acidifier globalement l'échantillon, la deuxième est imprégnée avec un acétate de mercure tamponné capable de réagir pour former un complexe mercure barbiturate ; la troisième zone est imprégnée avec un composé indicateur de la présence de mercure tel le diphenyl carbazone. Ce système qui semble être l'état de la technique le plus proche pour le dosage de petites molécules est malgré tout très éloigné du système proposé de l'invention dans lequel la lecture directe peut se faire par marαuage d'un conjugué susceptible de se lier avec la molécule recherchée lorsqu'elle est présente, le complexe étant alors capable d'être capturé par un ligand spécifique du complexe formé entre le conjugué et la molécule à rechercher. D'autres systèmes existent et forment l'arrière-plan technologique.
Le brevet EP 262 328 décrit également une bandelette pour l'analyse d'un analyte dans un échantillon biologique au moyen d'une série séquentielle de réactions la bandelette étant constituée d'un matériau capillaire pour chromatographie et capable de transporter rapidement des réactifs de l'échantillon non immobilisé au départ au moyen d'un solvant chromatographique ; cette bandelette est constituée de trois parties : un réservoir de départ , un réservoir à l'arrivée et entre les deux une série de zones imprégnées avec des réactifs mobiles ou immobilisés permettant des réactions spécifiques avec l'analyte. Ce système est cependant incapable de fonctionner en chimie sèche (sans addition de solvant) et en outre il implique une série de manipulations pour éventuellement modifier les tampons de chromatographie, manipulation incompatible avec un test rapide et peu onéreux.
A notre connaissance aucun test de diagnostic rapide n'a été décrit en vue d'une application simple qui est l'analyse et le dosage d'un haptène dans un échantillon par lecture directe et sans manipulation autre que la mise en contact du dispositif avec l'échantillon à analyser, ce qui est l'objet de la présente invention. Elle permet de pallier aux difficultés d'interprétation inhérentes aux tests par compétition qui existent aujourd'hui pour doser les haptenes, et de proposer aux usagers un moyen simple de détecter la présence d'un haptène, par exemple d'une drogue dans un échantillon biologique. Une application particulièrement attendue est celle d'un dosage rapide de l'existence d'une drogue dans le sang ou l'urine d'un individu dans un service d'urgence, où une information précise sur la drogue utilisée est nécessaire. D'autres types d'applications peuvent être envisagées notamment le suivi d'un traitement médicamenteux par exemple par des opiacés, des utilisations de type « médecine légale » permettant éventuellement de faire des tests sur sites etc..
Le système proposé par la présente invention et qui permet d'effectuer une lecture directe permettant de relier la concentration de la substance à doser au signal observé, consiste en un dispositif constitué d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par capillarité, ayant une pluralité de régions distinctes dans lesquelles les réactifs sont déposés et/ou séchés, et permettant l'analyse rapide et la caractérisation de la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, (ou haptène), et présent dans un échantillon, ce dispositif étant caractérisé par le fait qu'il est constitué au moins des zones suivantes : a) une zone de réception de l'échantillon à tester, b) une zone réservoir contenant un conjugué possédant la double caractéristique d'être marqué par un marqueur permettant sa détection directe et d'être un ligand pour la molécule à analyser, ces deux zones a) et b) étant superposées ou séquentielles, c) de deux barrières successives constituées de moitiés de paires d'affinité dont l'une retient ledit conjugué lors de sa migration sur le support en l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon, appelée barrière de lecture négative et l'autre retient ledit conjugué en présence de la molécule recherchée, cette dernière étant alors liée directement ou indirectement audit conjugué, cette deuxième barrière étant alors une zone de lecture positive de la réaction, d) un moyen absorbant et contigu au support hydrophile permettant de favoriser le flux de liquide depuis la zone a) de réception de l'échantillon à travers les autres zones constitutives dudit dispositif, le support hydrophile et le moyen absorbant étant fixés sur un film de polyéthylène de type « Mylar », l'ensemble étant positionné dans un boîtier muni d'un réceptacle à l'aplomb de la zone a) acceptant 0,05 à 0,5 ml de liquide à tester et de deux fenêtres à l'aplomb des deux barrières successives, permettant la lecture du résultat positif ou négatif de la réaction par l'observation du marquage lié au conjugué.
Dans le dispositif ainsi décrit, le réservoir est constitué d'un matériau choisi parmi la fibre de verre, la cellulose, les dérivés de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale ou synthétique sous forme de poudres de comprimés ou de couches multiples ou de ouate de cellulose.
Dans un mode de réalisation simplifié, les zones a) et b) ne forment qu'une seule zone, et l'échantillon est déposé dans un réceptacle à l'aplomb du réservoir.
Le marquage du conjugué doit être un marquage simple de lecture directe et dans lequel l'intensité de la révélation est liée directement à la quantité de produit se trouvant dans l'échantillon.
Dans le dispositif de l'invention le conjugué est marqué soit par des particules colloïdales contenant un métal, de préférence de l'or, soit par un marqueur organo-métallique. Le marquage d'un réactif par des particules d'or colloïdal a été décrit et utilisé dans de nombreux tests de diagnostic notamment les demandes de brevet WO/9112528 ou le brevet US 4 859 612 ou les demandes de brevet EP 291 194 et EP 560 411. Il faut citer enfin les brevets EP
250 137 et EP 258 963.
L'invention consiste non pas à mettre en oeuvre un marquage par des particules colloïdales mais à utiliser ce marquage dans une combinaison mettant en jeu une zone réservoir contenant un conjugué déshydraté, les deux barrières de-capture successives permettant d'avoir un signal que la réponse soit positive ou négative, et une grande stabilité du produit par le fait que l'ensemble des éléments constitutifs du dispositif sont déshydratés après leur dépôt permettant une conservation desdits dispositifs à température ambiante pendant une durée de plusieurs semaines à plusieurs mois.
Un des systèmes de capture utilisé particulièrement performant est le système avidine-biotine ou streptavidine-biotine.
Il constitue l'un des systèmes les plus importants pour les tests de diagnostic. L'avidine a une affinité exceptionnellement élevée pour la biotine (10'15 M).
La biotine est facilement couplée aux macromolécules notamment les protéines, sans perte d'activité.
L'avidine est très stable et possède plusieurs sites de liaison et pourrait servir de molécule de pontage entre d'autres molécules biotinylées. Ces propriétés lui permettent une considérable augmentation de la détectabilité
(due à de faibles bruits de fond) dans les tests immunologiques.
La biotine est l'un des douze facteurs hydrosolubles du complexe vitaminique B et constitue également un coenzyme pour les enzymes impliqués dans la carboxylation. L'avidine est très stable sur une large gamme de pH et de température et le complexe avidine-biotine a lui-même une grande stabilité par rapport à la chaleur et les enzymes protéolytiques.
L'avidine est une glycoprotéine basique avec un pi de 10,5 ; elle peut être cristallisée à partir de solutions salines de pH compris entre 5 et 7. Elle a quatre sous-unités de 15 600 KD chacune et est également sensible à la lumière forte.
Elle est absorbée sur le verre, comme généralement tous les solutés basiques.
En revanche, une faible absorption sur le polyéthylène est aussi observée. Chaque sous-unité de l'avidine est capable de se lier à la biotine dans une gamme de pH comprise entre 2 et 13
Les sites de liaison de la biotine par l'avidine sont très profonds Chaque atome de la biotine contribue fortement à cette interaction Ainsi, plusieurs analogues ou de petits fragments de biotine (urée, glycol, tétrahydrofurane, acide caproique) sont susceptibles d'inhiber l'interaction avidine-biotine L'enfouissement relativement profond de la biotine est responsable de la très forte affinité Cependant les quatre sites de liaison ne sont pas distribués de la même façon • deux sites sont trouvés très proches l'un de l'autre et, ainsi chaque paire de sites de liaison fixerait uniquement une protéine biotmylée Ainsi, contrairement à ce qui est communément admis, l'avidine avec ses paires de sites de liaison, se comporterait plus comme un agent de pontage entre deux protéines biotinylées plutôt que comme agent d'amplification Une protéine proche de l'avidine, la streptavidme provenant de Streptomyces aviduni est utilisée avec un gros avantage qui est celui d'avoir un bruit de fond plus faible
La streptavidme est une protéine extra-cellulaire de Streptomyces aviduni et sa partie fonctionnelle a un PM de 47 KD et comporte 4 sous-unités, ayant chacune un site de liaison de la biotine La liaison de l'avidine à la biotine n'est pas perturbée par des pH extrêmes, des sels ou même des agents chaotropiques comme l'hydrochlorure de guanidine (jusqu'à 3 M), l'urée, le chlorure de guanidine, etc
En dehors des paires d'affinité antigènes/anticorps, ou avidine, ou streptavidine/biotine, d'autres systèmes de paires d'affinité peuvent être rappelés ici et utilisés dans le dispositif de l'invention
Il s'agit du système protéine A/immunoglobuline (Ig) La protéine A est extraite de la paroi cellulaire de Staphylococcus aureus Elle a une forte affinité pour le fragment Fc de la plupart des Ig Son PM est compris entre 42 et 56 KD et son pi est de 5 1 La constante d'équilibre de la Protéine A avec les IgG varie considérablement selon les espèces et le pH, mais la liaison de l'antigène au Fab augmente l'affinité entre le fragment Fc des Ig et la Protéine A Le complexe Protéine A-lg n'est pas affecté par l'EDTA ni par de faibles concentrations de détergents (Tween, Triton X-100, Brij) souvent utilisées dans les tests immunologiques.
Ce système peut être étendu à d'autres protéines spécifiques de liaison des immunoglobulines, par exemple, la protéine G. Un autre système d'affinité utilisable dans le dosage des haptenes est celui des lectines et carbohydrates ; la concanavaline A (Con A ) est constituée de sous-unités de 26 KD qui formeraient un tétramère. Chaque sous-unité contient un Mn2* et un Ca2* qui sont nécessaires pour l'activité de la Con A. De même, chaque sous-unité a un site de liaison de carbohydrate. Cependant, des excès de métal empêchent cette activité.
De la même façon que le conjugué peut être marqué par des particules colloïdales et notamment par des particules d'or colloïdal, il peut être marqué par un marqueur organométallique permettant de révéler la présence du produit par détection infrarouge, la longueur d'onde d'observation étant dépendante du marqueur utilisé ; l'avantage d'utiliser ce type de marqueur organométallique est que par une utilisation simultanée de plusieurs marqueurs différents à savoir révélables à des longueurs d'ondes différentes en infrarouge, il est possible sur le même dispositif de procéder à des recherches et des caractérisations de différentes molécules présentes dans le même échantillon ou dans des échantillons différents. Pour être lu, le dispositif de l'invention dans lequel le conjugué est marqué par un marqueur de type organométallique, nécessite l'utilisation d'un lecteur simple dans lequel ledit dispositif est disposé après dépôt et migration de l'échantillon. Dans le dispositif de l'invention, le moyen absorbant qui permet de drainer le liquide de l'échantillon déposé au niveau du réceptacle prévu à cet effet est constitué d'un matériau hygroscopique, notamment des dérivés de cellulose ou la ouate de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétale, animale ou synthétique sous forme de poudres de comprimés ou de couches multiples.
L'invention est relative également à un procédé d'analyse rapide et de caractérisation de la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, ou haptène, dans un échantillon liquide , ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il utilise un dispositif tel que décrit dans ses différents modes réalisation ci-dessus et dans les exemples ci-après et constitué d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par capillarité, ayant une pluralité de régions distinctes dans lesquelles les réactifs sont déposés par imprégnation et séchés, ce dispositif étant constitué au moins des zones suivantes: a) une zone de réception de l'échantillon à tester, b) une zone réservoir contenant un conjugué possédant la double caractéristique d'être marqué par un marqueur permettant sa détection directe et d'être un ligand pour la molécule à analyser, ces deux zones étant superposées ou séquentielles, c) de deux barrières successives constituées de moitiés de paires d'affinité dont l'une retient ledit conjugué lors de sa migration sur le support en l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon, appelée barrière de lecture négative et l'autre retient ledit conjugué en présence de la molécule recherchée, cette dernière étant alors liée directement ou indirectement audit conjugué, cette deuxième barrière étant alors une zone de lecture positive de la réaction d) d'un moyen absorbant et contigu au support hydrophile permettant de favoriser le flux de liquide depuis la zone a) de réception de l'échantillon à travers les autres zones constitutives dudit dispositif, le support hydrophile et le moyen absorbant étant fixés sur un film de polyéthylène de type « Mylar », l'ensemble étant positionné dans un boîtier muni d'un réceptacle à l'aplomb de la zone a) acceptant 0,05 à 0,5 ml de liquide à tester et de deux fenêtres à l'aplomb des deux barrières successives , permettant la lecture du résultat positif ou négatif de la réaction par l'observation du marquage lié au conjugué, ledit procédé comprenant le dépôt de 0,05 à 0,5 ml d'échantillon à tester dans la zone de réception prévue à cet effet, suivi de l'observation directe ou indirecte par tout moyen optique approprié du résultat obtenu au niveau des barrières de lecture positive et négative .
L'utilisation d'un dispositif tel que décrit ci-dessus pour détecter et caractériser la présence d'un haptène dans un échantillon liquide est partie intégrante de l'invention. Tout type de molécule ayant son poids inférieur à 10 000 daltons peut être analysé et dosé par un dispositif tel que décrit plus haut; mais l'invention est particulièrement avantageuse quand l'haptène est une drogue que l'on cherche à détecter dans un fluide biologique, ce fluide pouvant être le sang, l'urine ou la salive. L'existence d'un diagnostic rapide paraît particulièrement avantageuse lorsque l'on suspecte l'utilisation chez un patient d'une drogue (« drug abuse ») ou lors d'un traitement médicamenteux par des drogues à effets secondaires. Les drogues dont la caractérisation ou le suivi de leur présence dans un fluide biologique peuvent être particulièrement précieux sont, sans caractère limitatif mais pour être les plus importantes, incluses dans l'une des classes suivantes :
- les opiacés, ou alcaloïdes dont la morphine, l'héroïne, la codéine, le dextromethorphaπe, ou leurs dérivés et métabolites
- les opiacés de synthèse, dont la méthadone, le propoxyphène, la phénylcyclidine, dérivés et métabolites, - les cannabinoîdes dont le 9-tétrahydrocannabiol (ou cannabis), la cocaïne , le L.S.D., le benzoïl d'ecgonine, la marijuana, leurs dérivés et métabolites,
- les amphétamines, le MDM(ecstazy), le 2,5 imethyoxy-4Methamphétamine , les catécholamines incluant l'ephédrine, la L-Dopa, l'épinéphrine, la narcine, la papavérine ou leurs dérivés et métabolites, - les dérivés ou métabolites de l'acide barbiturique dont le phénobarbital, le secobarbital, la primidone, l'ethosuccimide, la diphenylhydantoïne,
- les benzodiazépines, leurs dérivés et métabolites,
- les stéroïdes incluant les oestrogènes, les androgènes, les stéroïdes adrénocorticaux, leurs dérivés et métabolites, - les glycosides et aglycones incluant la digoxine, la digoxigénine, les saponines et sapogénines, leurs dérivés et métabolites,
- les substances mimant les stéroïdes, tel le diethylsilbestrol.
L'homme du métier saura bien entendu adapter le principe du dispositif et du procédé de dosage à la molécule qu'il souhaite doser en respectant les principes mêmes de ce dispositif tels que décrits sommairement ci-dessus et détaillés ci-après dans les exemples. Ce test de diagnostic permet donc en une seule étape, sans étape de lavage ni de révélation enzymatique, ni utilisation d'appareillage complexe, ni de connaissances techniques particulières de détecter et doser la présence d'un haptène dans un échantillon : le manipulateur applique directement l'échantillon à doser dans le réceptacle prévu à cet effet par exemple à l'aplomb du réservoir contenant le conjugué et laisse la migration se poursuivre pendant quelques minutes. Que les échantillons contiennent ou ne contiennent pas la molécule recherchée, l'une ou l'autre des deux bandes de capture va capturer le conjugué marqué ; l'existence de ces deux bandes de capture positive et négative confère au dispositif un contrôle interne de bon fonctionnement de la réaction. En outre le fait d'avoir une zone de capture aussi bien pour une réaction positive que pour une réaction négative permet de concentrer les réactifs au niveau d'une bande quel que soit le résultat, et par conséquent de doser de faibles quantités de molécules recherchées avec une grande fiabilité. En outre ce test peut être quantitatif grâce aux caractéristiques intrinsèques des réactifs : en effet une coloration apparaît à partir d'une concentration prédéterminée de l'haptène à doser, liée à un équilibre entre le conjugué et le marquage de ce conjugué. Enfin ce type de test présente un coût unitaire très faible et permet donc de l'utiliser de façon extensive sur un site soit à titre de diagnostic soit à titre de prédiagnostic et d'orientation d'un traitement éventuel.
Enfin l'homme du métier saura extrapoler les principes de fonctionnement de ce dispositif à tout test permettant de doser simultanément plusieurs molécules soit sous forme de bandelettes « multistrip » soit en forme de disques comprenant des quartiers dont les barrières sont imprégnées de réactifs spécifiques d'un haptène donné et différents d'un quartier à l'autre soit toute autre géométrie permettant de façon simple de discriminer entre les différentes molécules recherchées au sein d'un même échantillon ou d'un mélange d'échantillons.
Les exemples ci-après qui sont relatifs à des réalisation de dispositifs possibles pour le dosage de l'amphétamine permettront aux lecteurs de bien saisir tous les avantages de ce test quant à sa facilité de mise en oeuvre et sa fiabilité. Ils ne sont bien évidemment pas limitatifs et ne sont là qu'à titre d'illustration. Les figures 1 à 4 représentent les différents dispositifs tels que décrits dans les exemples 1 à 4. La figure 1 représente un dispositif dans lequel le réservoir (11 ) contient un conjugué constitué d'un anticorps anti-haptène marqué et couplé à la biotine avec en aval, une barrière de lecture négative (21 ) constituée d'haptènes fixés sur le support, susceptibles de fixer l'anti-haptène de (11 ) lorsque celui-ci n'a pas réagi avec l'haptène de l'échantillon, et en aval une barrière de lecture positive est constituée de streptavidine (31 ) susceptible de capturer l'anti- haptène marqué et couplé d'une part à la biotine et d'autre part à l'haptène de l'échantillon.
La figure 1a représente le dispositif dans son boîtier, lequel boîtier est muni d'un réceptacle (5) permettant le dépôt de l'échantillon ; la figure 1b représente une vue en coupe longitudinale de profil des différents éléments du dispositif comprenant un filtre (6), le réservoir (11 ), la membrane de nitrocellulose (40), la zone buvard hydroscopique (50), le tout posé sur un support plastique de type « Mylar » (60) ; la figure 1c shématise le principe du test. La flèche indique le sens de la migration.
La figure 2 représente un dispositif dans lequel le réservoir (12) est rempli d'anticorps anti-haptène marqués, en amont est présent un échantillon d'haptènes couplés à la biotine (15), déposé et déshydraté ; la première barrière de lecture (22) est constituée de streptavidine et la deuxième barrière de lecture est constituée d'un anticorps dirigé contre l'anticorps anti-haptène présent dans le réservoir (12).
La figure 2a représente le dispositif dans son boîtier, lequel boîtier est muni d'un réceptacle (5) permettant le dépôt de l'échantillon ; la figure 2b représente une vue en coupe longitudinale de profil des différents éléments du dispositif comprenant un filtre (6), le réservoir (12), la membrane de nitrocellulose (40), la zone buvard hydroscopique (50), le tout posé sur un support plastique de type « Mylar » (60) ; la figure 2c shématise le principe du test. La flèche indique le sens de la migration.
La figure 3 représente un mode de réalisation dans lequel le réservoir (13) contient une protéine spécifique de l'haptène à doser, la première barrière (23) est constituée d'un anticorps anti-haptène et la deuxième barrière (33) est constituée d'un anticorps dirigé contre la protéine spécifique telle que déposée dans le réservoir (13) ; La figure 3a représente le dispositif dans son boîtier, lequel boîtier est muni d'un réceptacle (5) permettant le dépôt de l'échantillon ; la figure 3b représente une vue en coupe longitudinale de profil des différents éléments du dispositif comprenant un filtre (6), le réservoir (13), la membrane de nitrocellulose (40), la zone buvard hydroscopique (50), le tout posé sur un support plastique de type « Mylar » (60) ; la figure 3c shématise le principe du test. La flèche indique le sens de la migration.
La figure 4 représente un modèle de réalisation dans lequel le réservoir (14) est rempli d'haptènes marqués, la première barrière de lecture négative (24) est constituée d'un premier anticorps anti-haptène et la deuxième barrière de lecture (34) étant constituée d'un deuxième anticorps anti-haptène, l'un et et l'autre des deux anticorps ayant une différence d'affinités de 1 à 3 logs.
La figure 4a représente le dispositif dans son boîtier, lequel boîtier est muni d'un réceptacle (5) permettant le dépôt de l'échantillon ; la figure 4b représente une vue en coupe longitudinale de profil des différents éléments du dispositif comprenant le filtre (6), le réservoir (14), la membrane de nitrocellulose (40), la zone buvard hydroscopique (50), le tout posé sur un support plastique de type « Mylar » (60) ; la figure 4c shématise le principe du test. La flèche indique le sens de la migration. Dans les figures 1 à 4, le matériel biologique contenu dans le réservoir est soit à l'aplomb, soit légèrement décalé vers l'aval du réceptacle d'échantillon (5). EXEMPLE 1 : dosage de l'amphétamine selon un premier mode de réalisation. Ce premier mode de réalisation utilise le système streptavidine-biotine à titre de barrière de lecture positive de réaction.
La figure 1 schématise le dispositif de ce mode de réalisation, la zone réservoir contenant un conjugué constitué d'un anticorps anti-haptène marqué à l'or colloïdal, l'anti-haptène étant couplé de façon covalente à la biotine.
Un première barrière de lecture négative de la réaction est constituée d'amphétamine fixée sur le support.
Si l'échantillon dont la présence d'haptène est recherchée contient l'amphétamine, cette dernière va alors former un complexe d'affinité avec le conjugué anti-haptèπe-biotine-or colloïdal et, au cours de la migration par capillarité le long du support ne pas être retenue par la barrière d'haptène (amphétamine fixée), les paratopes du conjugué étant alors saturés par les épitopes correspondants de l'haptène ; il sera au contraire capté au niveau de la barrière streptavidine par formation du complexe streptavidine/biotine-conjugué ; si au contraire l'échantillon ne contient pas d'amphétamine, alors la migration du conjugué va, au niveau de la première barrière d'amphétamine fixée, conduire à la formation d'un complexe amphétamine/conjugué et la coloration alors va se révéler au niveau de cette première barrière.
Autrement dit le marquage au niveau de la première fenêtre correspondant à la barrière d'haptènes indique l'absence d'haptène dans l'échantillon ; la coloration au niveau de la deuxième fenêtre de lecture, au niveau de la streptavidine fixée, indique la présence d'haptène dans l'échantillon.
Mais en tout état de cause, une coloration doit apparaître au niveau de l'une ou l'autre barrière.
Préparation du dispositif. a) Préparation du conjugué anti-amphétamine-biotine.
La biotine NHS est utilisée pour le couplage à l'anticorps anti-amphétamine. Les esters N-hydroxysuccinimide réagissent avec des aminés primaires pour former des liaisons amides. La réaction consiste généralement en une attaque nucléophile d'une aminé (ε pour la plupart des cas). Le résultat en est la formation d'une liaison amide stable avec production de N-hydroxysuccinimide.
Cette réaction est favorisée par les pH alcalins favorables à l'état non protoné des amides. Certaines précautions doivent être prises pour l'utilisation de ce type d'esters qui sont peu solubles dans l'eau ; ainsi une présolubilisation dans du dimethyl sulfoxyde (DMSO) ou dans du dimethyl formamide (DMF) est souvent recommandée L'utilisation de tampons contenant des aminés comme les Tris et les azides est formellement déconseillée. L'hydrolyse de l'ester NHS est habituellement la seule réaction qui pourrait interférer avec le couplage lui- même. Cette réaction d'hydrolyse est favorisée par les solutions de protéines très diluées ; elle n'a pas lieu avec des solutions de protéines concentrées.
Réactifs de biotinylation Matériel Solution d'anticorps à 10mg/ml dans du PBS Biotine NHS (CALBIOCHEM Réf 203188) Tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M pH 9,5 Dimethysulfoxide (DMSO) (Prolabo Réf 23486297)
- Protocole
1 Dialyser la solution d'anticorps contre du tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M pH 9,5
2 Préparer une solution de biotine à 100 mM en DMSO 3 Mélanger la biotine à la solution d'anticorps afin d'être à 10 mM final en biotine
4 Amener la concentration en protéine à 4 mg/ml en ajoutant du tampon carbonate-bicarbonate 100 mM pH 9,5
5 Incuber 1 heure, à température ambiante, sous agitation 6 Dialyser la solution contre Tampon borate 2 mM pH 9,0
7 Stocker à 4°C Ne pas congeler b) Préparation du traceur anti-amphétamine-biotine-Or colloïdal
La traceur a un rôle capital il permet la lecture du résultat du test
De plus, le choix des conditions de fabrication des particules d'or est très important dans la mesure où leur taille conditionne les performances de migration du test b1 ) Protocole de fabrication des particules d'or colloïdal
1 Les récipients utilisés devront être lavés soigneusement, rincés à l'eau déminéralisée et siliconés 2 Préparer une solution d'acide chloroauπque à 0,01 % dans de l'eau déminéralisée
3 Préparer une solution de citrate de sodium à 1 % dans de l'eau déminéralisée
4 Porter à ébullition le volume nécessaire de solution d'acide chloroauπque
5 Laisser bouillir pendant 10 minutes 6 Ajouter la solution de citrate de sodium de façon à obtenir une concentration finale en citrate de sodium de 0,7% 7. Laisser sous agitation pendant 20 minutes (la solution vire au bleu en 10 minutes puis au rouge en 15 minutes après addition de la solution de citrate de sodium). b2) Protocole de fabrication du conjugué Dans le cas où un anticorps monoclonal est utilisé, le point isoélectrique est préalablement déterminé par électrophorèse en isoélectrofocalisation (IEF).
L'anticorps est dialyse pendant 2 heures à température ambiante contre une solution de borate de sodium à 2 mM tamponnée à un pH supérieur de 0,5 unité au point isoélectrique de l'anticorps considéré. La concentration de la solution d'anticorps est ajustée à 0,1 mg/ml avec la solution borate de sodium à 2 mM tamponnée à pH9.
A 2 ml de la solution d'anticorps sont ajoutés 20 ml d'une suspension de micro particules d'or colloïdal dont le diamètre moyen est compris entre 10 et 30 nm.
Le mélange est mis sous agitation pendant 5 minutes à température ambiante. II est centrifugé à 15 000g pendant 30 minutes et à 4°C.
Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 5 ml d'une solution de Tris
20 mM tamponnée à pH 7,4 et contenant 1 % de sérum albumine bovine 0,1 % de
Tween 20 0,5% de polyéthylène glycol 3000.
Le mélange réactionnel est à. nouveau centrifugé 2 fois dans les mêmes conditions. A l'issue de la troisième centrifugation, le culot est repris dans 1 ml d'une solution de Tris 20 mM tamponnée à pH 7,4 et contenant 1% de sérum albumine, 0,1 % de Tween 20 et 0,5% de polyéthylène glycol 3000.
La densité optique de la solution est mesurée à 595 nm.
La solution de traceur ainsi obtenue est stable 6 mois à 4°C. c) Préparation du support de migration
Ci) Préparation de l'amphétamine BSA
En tant que petite molécule, l'amphétamine ne peut pas être directement fixée sur un support solide. Un couplage préalable à une macromolécule porteuse est nécessaire. La BSA a été choisie comme modèle. La méthode de l'anhydride mixte peut être utilisée pour coupler l'amphétamine à la BSA (Erlanger et al 1959), (4). A 7,94 μmoles de BSA, ajouter 15,9 μmoles de tri-n-butylamine et 8 μmoles d'isobutylchlorocarbonate. La BSA 1125 (200 000 dpm, 300pg) est ajoutée au début de la réaction pour servir de marqueur.
Après 30 mn d'agitation à 10°C, ajouter 0,3 moles d'amphétamine. Le mélange dont le pH est ajusté à 9,5 par la soude est conservé pendant 3 heures à 4°C. Il est ensuite dialyse contre de l'eau distillée pendant une nuit à 4°C. Le pH du dialysat ajusté à 4,5 par de l'HCI 10 1 N et après une nuit à 4°C la suspension obtenue est centrifugée pendant 20 mn à 3000 tr/mn. Le précipité est dissout dans un volume minimum d'eau (<1 ml) puis il est lyophilisé et gardé à -20°C. Par cette méthode, on arrive à coupler 25 +3 moles d'amphétamine par mole de
BSA
Coatinq de la streptavidine, de l'amphétamine et de 1 anticorps anti-souris
Déposer 1 μl de streptavidine à 10mg/ml dans du PBS
Déposer 1 μl de BSA-amphétamine à 4mg/ml dans du PBS Déposer 1 μl d'anticorps anti-lg de souris à 10mg/ml dans le tampon Acétate
0,1M pH 4,7
Attendre 15 mn à température ambiante
Immerger dans PBS Sucrose 5% Lait 0,5%
Laisser sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante (T.A). Laver avec du PBS en agitant pendant 15 minutes
Eliminer le PBS
Immerger dans une solution de PVA (Polyvinyl-alcool) à 2%
Laisser 30 minutes sous agitation
Eliminer la solution de PVA et faire sécher le support à température ambiante. Avant utilisation, garder le support sous vide dans du papier aluminium, à température ambiante
Préparation du réservoir de coniuqué
Immerger la feuille de fibre de verre (GF) (200X250 mm) dans la solution de saturation (PBS/Lait 1 % Sucrose 5%) Laisser 15 minutes à température ambiante
Laisser sécher 1 nuit à 37°C
Dépôt du conjugué par spot de 10 μl
Laisser sécher au moins une heure à température ambiante Protocole du test
Déposer 200 μl d'échantillon au niveau du réceptacle. Attendre 5 minutes de migration à température ambiante.
Lire le résultat au niveau des fenêtres de lecture. Echantillon positif
Apparition de signal au niveau de la seconde fenêtre de lecture marquée Positif.
Ce signal correspond à l'arrêt du complexe Amphétamine-Anti-Amphétamine-Or colloïdal-Biotine par la streptavidine.
Echantillon négatif Apparition de signal au niveau de la première fenêtre de lecture marquée
Négatif. Ce signal correspond à l'arrêt du conjugué par la barrière d'amphétamine.
EXEMPLE 2 : Dosage de l'amphétamine en utilisant le mode de réalisation n° 2. La figure 2 est une représentation schématique de ce mode de réalisation dans lequel le conjugué est constitué d'un anticorps anti-amphétamine lié à l'or colloïdal déposé dans le réservoir et séché, et en amont dudit conjugué ou contigu dans le réservoir mais non mélangé au conjugué, un échantillon d'amphétamine couplée à la biotine est également déposé puis déshydraté. La bandelette est constituée en aval du réservoir d'une barrière de lecture négative constituée par de la streptavidine fixée puis d'une barrière de lecture positive constituée d'un anticorps dirigé contre l'anticorps anti-amphétamine ; ce dernier étant un anticorps de souris il s'agit donc d'un anticorps antiimmunoglobuline de souris. Préparation de la bandelette
Déposer 1 μl de streptavidine à 10 mg/ml dans du PBS.
Déposer 1 μl d'anticorps anti-lg de souris à 10mg/ml dans le tampon Acétate
0,1 M pH 4,7.
Attendre 15 mn à température ambiante. Immerger dans un mélange PBS, Sucrose 5% Lait 0,5%.
Laisser sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante.
Laver avec du PBS en agitant pendant 15 minutes.
Eliminer le PBS. Immerger dans une solution de PVA (Polyvinyl-alcool) 0,2%
Laisser 30 minutes sous agitation.
Eliminer la solution de PVA et faire sécher le support à température ambiante.
Avant utilisation, garder le support sous vide dans du papier aluminium, à température ambiante
Préparation du réservoir coniugué
Immerger la feuille de fibre de verre (GF) (200X250mm) dans la solution de saturation 2 (PBS/Lait 1 %/Sucrose 5%),
Laisser 15 minutes à température ambiante, Laisser sécher 1 nuit à 37°C,
Dépôt du conjugué par spot de 10 μl,
Laisser sécher au moins une heure à température ambiante
Dépôt du complexe Amphétamine-Biotine.
Le complexe Amphétamine-Biotine est préparé selon la méthode exposée plus haut La Biotine-X-NHS est utilisée pour le couplage à la fonction amine de l'amphétamine.
10 μl d'amphétamine-biotine sont déposés sur le réservoir du conjugué
Protocole du test
Déposer 200 μl d'échantillon Attendre 5 minutes de migration à température ambiante
Lire le résultat au niveau des fenêtres de lecture
Echantillon positif
L'amphétamine contenue dans l'échantillon entre en compétition avec l'amphétamine couplée à la biotine (et déposée sur sa trajectoire) pour des sites limités d'anti-amphétamine marqué à l'or colloïdal (traceur)
Le traceur est complexé par l'amphétamine à doser Le complexe migre , il est ensuite arrêté par la barrière anticorps anti-lg de souris
Echantillon négatif
Déposer 200μl d'échantillon au niveau du puits-échantillon L'amphétamine- biotine complexe tout le traceur anti-amphétamine-or colloïdal. Ce complexe moléculaire est entièrement arrêté au niveau de la fenêtre streptavidine. La seconde fenêtre doit rester incolore.
EXEMPLE 3 dosage de l'amphétamine par le mode de réalisation n°3. Le mode de réalisation n° 3 est représenté schématiquement sur la figure 3 : Le conjugué est constitué d'une protéine spécifique susceptible de se coupler avec l'amphétamine en l'occurrence l'alphafoetoprotéine ou AFP, marquée à l'or colloïdal. En aval du réservoir dans le sens de la migration du liquide se trouve la première barrière de lecture positive constituée d'un anticorps anti¬ amphétamine fixé, puis en aval la barrière de lecture négative constituée d'un anticorps dirigé contre l'AFP. Ce système est un dosage de type sandwich car si l'amphétamine se trouve dans l'échantillon elle se retrouvera prise en sandwich entre l'AFP d'une part et l'anticorps anti-amphétamine fixé au niveau de la barrière de lecture positive d'autre part.
Au contraire en l'absence d'amphétamine dans l'échantillon le conjugué va migrer jusqu'à la barrière de lecture négative où il sera capturé par l'anticorps anti-AFP.
Préparation du support de migration Déposer simultanément 3 μl d'anticorps anti-amphétamine et 1 μl d'anticorps anti-AFP. Ces deux solutions sont à 10 mg/ml dans du PBS. Attendre 15 mn à température ambiante. Immerger dans le tampon PBS Sucrose 5%, Lait 0,5%. Laisser sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. Laver avec du PBS en agitant pendant 15 minutes. Eliminer le PBS.
Immerger dans une solution de PVA (Polyvinyl-alcool) à 2%. Laisser 30 minutes sous agitation. Eliminer la solution de PVA et faire sécher le support à température ambiante. Avant utilisation, garder le support sous vide dans du papier d'aluminium, à température ambiante. Préparation du réservoir de conjugué
Immerger la feuille de fibre de verre (GF) (200X250 mm) dans la solution de saturation 2 (PBS /Lait 1 % /Sucrose 5%). Laisser 15 minutes à température ambiante. Laisser sécher 1 nuit à 37°C. Dépôt du conjugué par spot de 10μl. Laisser sécher au moins une heure à température ambiante. Protocole du test
Déposer 200μl d'échantillon Attendre 5 minutes de migration à température ambiante
Lire le résultat au niveau des fenêtres de lecture Echantillon positif
Déposer 200 μl d'échantillon au niveau du réceptacle L'amphétamine contenue dans l'échantillon est complexée par le traceur qui est de l'AFP marquée à l'or colloïdal Ce complexe est arrêté par l'anticorps anti-amphétamine il y a apparition de signal au niveau de la fenêtre de lecture Echantillon négatif
Déposer 200 μl d'échantillon au niveau du réceptacle Le traceur ne s'arrête qu'au niveau de la seconde fenêtre de lecture où est immobilisé par l'anti-AFP EXEMPLE 4 dosage d'amphétamine utilisant à titre de conjugué l'amphétamine marguée à l'or colloïdal et à titre de barrière de lecture positive ou négative de la réaction, deux anticorps anti-amphétamine avant des affinités différentes pour l'amphétamine comme cela est expligué ci- dessous.
Choix des anticorps anti-amphétamine Il s'agit d'une étape cruciale L'affinité des anticorps pour l'amphétamine est au moins de 10"9 M Le calcul de l'affinité et le choix des anticorps sont faits à partir d'expériences de compétition entre les différentes formes de l'haptène Dans le cas de l'amphétamine, l'anticorps 1 est choisi pour avoir une affinité pour l'amphétamine libre de 10 10 M En revanche, sa capacité de fixation du complexe amphétamine-or colloïdal est plus faible L'anticorps 2 est choisi pour avoir une affinité pour l'amphétamine de l'ordre de 10"8 à 10"9 M II lie de la même façon l'amphétamine complexée à l'or colloïdal Préparation du support de migration Coatinq des anti-amphétamine Déposer 1 μl d'anti-amphetamine 1 à 10 mg/ml dans du PBS Déposer 1 μl d'anti-amphétamine 2 à 5 mg/ml dans du PBS Attendre 15 mn à température ambiante Immerger dans PBS Sucrose 5% Lait 0,5% Laisser sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante Laver avec du PBS en agitant pendant 15 minutes.
Eliminer le PBS.
Immerger dans une solution de PVA (Polyvinyl-alcool) à 2%.
Laisser 30 minutes sous agitation. Eliminer la solution de PVA et faire sécher le support à température ambiante.
Avant utilisation, garder le support sous vide dans du papier aluminium, à température ambiante.
Protocole de fabrication du conjugué
Le conjugué Amphétamine-or colloïdal est fabriqué à partir de la BSA- amphétamine, mais il peut également être préparé de façon directe sans recours à une protéine porteuse.
Le protocole de préparation de la BSA-amphétamine est le même que celui qui a été exposé dans l'exemple 1.
La BSA-amphétamine est marquée à l'or colloïdal en suivant le protocole de couplage des anticorps.
Préparation du réservoir de conjugué
Immerger la feuille de fibre de verre (GF) (200X250 mm) dans la solution de saturation (PBS / Lait 1 % / Sucrose 5%).
Laisser 15 minutes à Température Ambiante. Laisser sécher 1 nuit à 37°C.
Dépôt du conjugué par spot de 10 μl.
Laisser sécher au moins une heure à température ambiante.
Protocole du test
Déposer 200 μl d'échantillon. Attendre 5 minutes de migration à température ambiante.
Lire le résultat au niveau des fenêtres de lecture.
Echantillon positif
L'amphétamine de l'échantillon rentre en compétition avec l'amphétamine marquée pour la fixation sur les sites de l'anticorps anti-amphétamine 1. Cette première barrière qui a plus d'affinité pour l'amphétamine libre, fixe celle-ci et laisse passer le conjugué amphétamine-or colloïdal. L'anticorps anti¬ amphétamine 2 arrête le conjugué et fait apparaître un signal au niveau de la fenêtre marquée Positif. Echantillon négatif
En l'absence d'amphétamine dans l'échantillon, le traceur est arrêté par la barrière anticorps anti-amphétamine 1. Il apparaît un signal au niveau de la fenêtre marquée Négatif. Le mode de réalisation de ce dosage est représenté dans la figure 4.
Ces 4 modes de réalisation sont des exemples permettant à l'homme du métier de choisir au cas par cas les conditions expérimentales de préparation et de préparation du dispositif et de son utilisation en fonction de l'haptène qu'il souhaite doser. Dans tous les modes de réalisation proposés ici le conjugué doit toujours être en excès par rapport aux quantités suspectées d'haptènes dans l'échantillon si l'on souhaite avoir une réponse de type Oui/Non au niveau de la barrière de lecture positive ou de la barrière de lecture négative. Néanmoins si l'homme du métier souhaite avoir une quantification de l'haptène recherché dans l'échantillon il sera alors facile pour lui de préparer plusieurs dispositifs, dans la géométrie qu'il préfère, que ce soit en parallèle de type « multistrip » ou en étoile ou toute géométrie qu'il souhaite, et dans laquelle la quantité de conjugué pourra être croissante selon une courbe préalablement établie, ayant permis de préparer des abaques corrélant la quantité d'haptène à la quantité de conjugué.
Il est clair que dans l'exemple 1 par exemple si la quantité de conjugué est telle qu'il ne peut fixer que 50% de l'amphétamine présente dans l'échantillon le résultat sera une coloration équivalente au niveau de la barrière de lecture positive ou de la barrière de lecture négative ; si le conjugué ne peut lier que 75% de l'amphétamine présente dans l'échantillon, la coloration sera présente au niveau des deux barrières de lecture mais sera trois fois plus intense au niveau de la barrière de lecture positive (streptavidine) qu'au niveau de la barrière de lecture négative (amphétamine fixée). La réalisation de tels types d'abaques permettant un dosage quantitatif est donc d'une réalisation aisée pour l'homme du métier.
Est également clair pour l'homme du métier le fait que les deux barrières de lecture positive et négative peuvent selon les cas être réalisées par utilisation d'une substance présentant de l'affinité soit pour le conjugué, soit pour le complexe conjugué-haptène, soit pour l'haptène quelque soit son partenaire d'affinité ; par exemple si on reprend le mode de réalisation de l'exemple 2 dans lequel la barrière de lecture positive était constituée par un anticorps anti-lg de souris de telle façon à capter l'anti-amphétamine marquée à l'or colloïdal du conjugué, il est extrêmement facile d'imaginer que cet anticorps anti-lg de souris puisse être remplacé par une protéine A également susceptible de former un complexe d'affinité avec les immunoglobulines, fixée sur le support. Le point commun et l'originalité de tous ces tests est :
- le principe d'avoir une double lecture positive et négative c'est-à-dire d'avoir systématiquement un contrôle de bon fonctionnement de la réaction par l'existence d'une coloration quel que soit le résultat du test,
- d'être très simple dans sa réalisation et de ne nécessiter aucun solvant complémentaire à ajouter au moment de la réalisation du test, ni aucun lavage postérieur, - de mettre à la disposition des praticiens un dispositif stable dans le temps à température ambiante puisque l'ensemble des composés constitutifs du dispositif sont préalablement déshydratés.

Claims

Revendications
1. Dispositif d'analyse rapide et de caractérisation de la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, ou haptène, dans un échantillon liquide , ledit dispositif étant constitué d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par capillarité, ayant une pluralité de régions distinctes dans lesquelles les réactifs sont déposés et/ou séchés, ce dispositif étant caractérisé par le fait qu'il est constitué au moins des zones suivantes: a) une zone de réception de l'échantillon à tester, b) une zone réservoir contenant un conjugué possédant la double caractéristique d'être marqué par un marqueur permettant sa détection directe et d'être un ligand pour la molécule à analyser, les zones en a) et b) pouvant être superposées ou séquentielles. c) de deux barrières successives constituées de moitiés de paires d'affinité dont l'une retient ledit conjugué lors de sa migration sur le support en l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon, appelée barrière de lecture négative et l'autre retient ledit conjugué en présence de la molécule recherchée, cette dernière étant alors liée directement ou indirectement audit conjugué, cette deuxième barrière étant alors une zone de lecture positive de la réaction, d) un moyen absorbant et contigu au support hydrophile permettant de favoriser le flux de liquide depuis la zone a) de réception de l'échantillon à travers les autres zones constitutives dudit dispositif, le support hydrophile et le moyen absorbant étant fixés sur un film de polyéthylène de type « Mylar », l'ensemble étant positionné dans un boîtier muni d'un réceptacle à l'aplomb de la zone a) acceptant 0,05 à 0,5 ml de liquide à tester et de deux fenêtres à l'aplomb des deux barrières successives, permettant la lecture du résultat positif ou négatif de la réaction par l'observation du marquage lié au conjugué.
2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réservoir est constitué d'un matériau choisi parmi la fibre de verre , la cellulose, les dérivés de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétales, animale ou synthétiques sous forme de poudres de comprimés ou de couches multiples, ou de ouate de cellulose.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le marqueur du conjugué est constitué de particules colloïdales contenant un métal, de préférence de l'or.
4. Dispositif selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le marqueur du conjugué est un marqueur organo-métallique.
5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'ensemble des éléments qui lui sont constitutifs sont déshydratés.
6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les paires d'affinité sont choisies parmi les groupes constitués par la biotine avec l'avidine ou la streptavidine, les anticorps avec les antigènes, les immoglobulines avec une protéine affine telles la protéine A ou la protéine G, les carbohydrates avec les lectines.
7. Dispositif selon la revendication 1 à 6 caractérisé en ce que le conjugué marqué contenu dans le réservoir est constitué d'un anticorps anti-haptène marqué notamment à l'or colloïdal et couplé à la biotine, et en ce que la barrière de lecture de réaction négative est constituée d'une quantité déterminée d'haptène fixé et en ce que la barrière de lecture positive est constituée d'avidine ou de streptavidine fixée.
8. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réservoir contient en amont du conjugué marqué par rapport au sens de migration du liquide par capillarité, un autre conjugué constitué d'une quantité déterminée de la molécule dont la présence est recherchée couplée directement ou indirectement à un ligand de la substance constitutive de la barrière de lecture de réaction négative.
9. Dispositif selon la revendication 8 caractérisé en ce que le conjugué marqué est constitué d'un anticorps anti-haptène marqué notamment à l'or colloïdal, en ce que le deuxième conjugué est constitué de I' haptène recherché couplé à la biotine, en ce que la barrière de lecture négative est constituée de streptavidine et en ce que la barrière de lecture positive est constituée d'un anticorps dirigé contre le conjugué marqué.
10. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le conjugué marqué contenu dans le réservoir est constitué d'une substance spécifique présentant un affinité pour l'haptène marquée notamment à l'or colloïdal, et en ce que la barrière de lecture de réaction positive est constituée d'une quantité déterminée d'anticorps anti-haptène fixé et en ce que la barrière de lecture négative est constituée d'une substance fixée ayant une affinité pour ladite substance spécifique, notamment un anticorps.
11. Dispositif selon la revendication 10 caractérisé en ce que la substance spécifique présentant un affinité pour l'haptène est l'alpha-foetoprotéine .
12. Dispositif la revendication 1 caractérisé en ce que le moyen absorbant est constitué d'un matériau hygroscopique, notamment des dérivés de cellulose ou la ouate de cellulose, le nylon, des polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité, des fibres d'origine végétales, animale ou synthétiques sous forme de poudres de comprimés ou de couches multiples.
13. Ensemble de dispositifs selon les revendications 1 à 12 caractérisé en ce que chaque dispositif contient une quantité de conjugué croissante permettant un dosage quantitatif de l'haptène par corrélation avec une abaque pré-établie.
14. Procédé d'analyse rapide et de caractérisation de la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, ou haptène, dans un échantillon liquide , ledit procédé caractérisé en ce qu'il utilise un dispositif ou un ensemble de dispositifs selon l'une des revendications 1 à 11 et constitués d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par ensemble de dispositifs selon l'une des revendications 1 à 11 et constitués d'un support hydrophile dans lequel un liquide est susceptible de migrer par capillarité, ayant une pluralité de régions distinctes dans lesquelles les réactifs sont déposés par imprégnation et séchés, ce dispositif étant caractérisé étant constitué au moins des zones suivantes: a) une zone de réception de l'échantillon à tester, b) une zone réservoir contenant un conjugué possédant la double caractéristique d'être marqué par un marqueur permettant sa détection directe et d'être un ligand pour la molécule à analyser, c) de deux barrières successives constituées de moitiés de paires d'affinité dont l'une retient ledit conjugué lors de sa migration sur le support en l'absence de la molécule recherchée dans l'échantillon, appelée barrière de lecture négative et l'autre retient ledit conjugué en présence de la molécule recherchée, cette dernière étant alors liée directement ou indirectement audit conjugué, cette deuxième barrière étant alors une zone de lecture positive de la réaction d) d'un moyen absorbant et contigu au support hydrophile permettant de favoriser le flux de liquide depuis la zone a) de réception de l'échantillon à travers les autres zones constitutives dudit dispositif, le support hydrophile et le moyen absorbant étant fixés sur un film de polyéthylène de type « Mylar », l'ensemble étant positionné dans un boîtier muni d'un réceptacle à l'aplomb de la zone a) acceptant 0,05 à 0,5 ml de liquide à tester et de deux fenêtres à l'aplomb des deux barrières successives , permettant la lecture du résultat positif ou négatif de la réaction par l'observation du marquage lié au conjugué, ledit procédé comprenant le dépôt de 0,05 à 0,5 ml d'échantillon à tester dans la zone de réception prévue à cet effet, suivi de l'observation directe ou indirecte par tout moyen optique approprié du résultat obtenu au niveau des barrières de lecture positive et négative .
15. Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 pour détecter et caractériser la présence d'une molécule de poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, ou haptène, dans un échantillon liquide.
16. Utilisation selon la revendication 15 associant des dispositifs selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'ils contiennent des quantités de conjugué croissante, permettant un dosage quantitatif de l'haptène par corrélation avec une abaque pré-établie.
17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16 caractérisée en ce que l'haptène est une drogue que l'on cherche à détecter dans un fluide biologique.
18. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisée en ce que la drogue est notamment incluse dans l'une des classes suivantes:
- les opiacés, ou alcaloïdes dont la morphine, l'héroïne, la codéine, le dextromethorphane, ou leurs dérivés et métabolites
- les opiacés de synthèse, dont la méthadone, le propoxyphène, la phénylcyclidine, - les cannabinoides dont le 9-tétrahydrocanabιnol (ou cannabis), la cocaïne , le LSD, le benzoïl d'ecgonine, leurs dérivés et métabolites
- les amphétamines, le MDM(ecstazy), le 2,5 imethyoxy-4Methamphétamine , les catécholamines incluant l'ephédrine, la L-Dopa, l'épinéphrine, la narcine, la papavéπne ou leurs dérivés et métabolites - les dérivés ou métabolites de l'acide barbiturique dont le phénobarbital, le sécobarbital, la pπmidone, l'ethosuccimide, la diphénylhydantoïne
- les benzodiazépines, leurs dérivés et métabolites.
19. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisée en ce que la drogue est notamment incluse dans l'une des classes suivantes:
- les stéroïdes incluant les oestrogènes, les androgènes, ,les stéroïdes adrénocorticaux, leurs dérivés et métabolites
- les glycosides et aglycones incluant la digoxine, la digoxigénine, les saponines et sapogénines, leurs dérivés et métabolites - les substances mimant les stéroïdes, tel le diéthylsilbestrol
PCT/FR1995/001259 1994-09-28 1995-09-28 Diagnostic direct d'haptenes WO1996010179A1 (fr)

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