CN107167614A - 一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法 - Google Patents

一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，通过对己烯雌酚进行结构修饰，衍生出一个羟基，再与蛋白质载体上的氨基连接将己烯雌酚连接到大分子蛋白质载体上，形成完全抗原后诱导机体产生免疫反应，合成己烯雌酚人工抗原、抗体、己烯雌酚酶标抗原，从而进行ELISA检测。该方法以价廉的牛血红蛋白(Hb)作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶，制备出Hb标记的DES，大大降低了检测成本。

Description

一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法。
背景技术
随着现代社会的迅猛发展，人们的物质生活水平显著提高，随之食品安全问题也越来越频发。随着现代的畜牧业逐步向集约化和规模化的方向发展，养殖户为了降低动物的发病率和死亡率、提高饲料利用率、促进动物生长、缩短动物饲养周期等，兽药及饲料添加剂在畜牧业生产中得到了广泛的应用。然而过量使用的兽药通过食物链对人体产生危害，如产生毒性反应、耐药菌株产生、过敏反应、肠道菌群失调、影响生态环境和畜牧业健康发展等，所以必须严格控制兽药的用量。
己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是人工合成的非甾体类雌激素，于1938年首次在英国一家实验室人工合成，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。DES在兽医临床上主要用于发情不明显动物的催情，还可用来治疗胎衣不下、排出死胎，治疗子宫炎等。另外，DES在促进动物蛋白质的合成代谢，提高动物日增重和减少脂肪等方面的效果明显，因此被广泛用于猪、牛、羊、鸡和水产品等的饲料中。
20世纪70年代末，大量的调查和研究报告表明DES是一种致癌物质，会对人体健康产生严重危害，甚至可诱发人体产生癌变，而且在环境中降解慢，能够在生物体中富集形成严重残留，并通过食物链引发动物和人的癌变，引起少儿的发育早熟以及男性女性化。
随着人们逐渐认识到高度残留的雌激素会对人体产生潜在的致畸、致癌等危害，欧盟、美国、中国等国家从20世纪70年代末开始重视雌激素的残留及危害问题，并先后颁布禁令，将DES等合成性激素列为禁用兽药。1999年我国开始实施残留监控计划，计划中规定DES为禁用兽药。2002年中华人民共和国农业部公告修订的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，对DES及盐、酯在在所有可食组织中要求不得检出。然而，由于强大经济利益的驱使，违法使用合成雌激素的现象依然存在，仍有不少养殖用户违禁使用DES，生产的动物及动物性食品严重危害消费者的身心健康。因此对动物及动物性食品进行DES残留监控是保证动物性食品安全的关键手段。
在DES残留检测方法中，最早采用的是生物测定法和分光光度比色测定法。目前国外文献报道用于检测DES残留检测的方法很多，其主要有气相色谱法、气-质联用、高效液相色谱法、液-质联用、毛细管电泳法、放射免疫法和酶联免疫吸附法(ELISA)等。酶联免疫吸附法(ELISA)以酶或辅酶为标记物标记抗原或抗体，在合适的载体上，与相应的抗体或抗原进行特异性吸附，形成抗体抗原复合物，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。ELISA法是目前检测动物性食品中DES残留的首选方法，它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行定量测定，是目前灵敏度高、适应性强、最有希望在生产和临床中推广应用的免疫测定技术。该方法已用于水产品中DES的残留检测，目前已有多家公司的DES检测试剂盒上市，如德国拜发公司、荷兰ED公司、英国Randox公司等。化学发光免疫分析法集灵敏的化学发光分析和特异的免疫测定于一体，其以快速、敏感、特异等优势可与放射免疫测定相媲美，又以其试剂无毒、安全稳定而优于后者，是一种很有发展前途的检测技术。
已经上市的化学发光免疫分析法试剂盒通常选择辣根过氧化物酶来标记抗原或抗体。该酶价格高且多数不稳定，所以有必要开发一种新物质，来模拟酶的天然结构的生物特性，以达到廉价、稳定、高催化活性检测DES的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，模拟酶的天然结构的生物特性，可以廉价、稳定、高催化活性检测DES含量。
本发明提供了一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，包括以下步骤：
S1，己烯雌酚人工抗原的合成
S11，己烯雌酚单羧基丙基醚的制备
将己烯雌酚溶于二甲基亚砜中，氮气保护下加入碘化钾和4-氯丁酸乙酯，其中，己烯雌酚：二甲基亚砜：碘化钾：4-氯丁酸乙酯的比例为50mg：3mL：1-2mg：1-2mL，避光、70-80℃加热回流，反应24h后，用乙酸乙酯萃取，收集上层溶液，干燥后得到固态物质；向固态物质中加入乙醇使之完全溶解，然后滴加2.0mol/L氢氧化钠溶液，其中，乙醇与氢氧化钠溶液的体积比例是2:1，反应3h后，调节pH至3-4；加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与乙醇的体积比例是10:1，收集上层溶液，经冷冻干燥后得到己烯雌酚单羧基丙基醚，备用；
S12，己烯雌酚人工抗原的合成
将己烯雌酚单羧基丙基醚溶解在二甲基亚砜中，加入N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，其中，己烯雌酚单羧基丙基醚：二甲基亚砜：N-羟基丁二酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐＝50mg：2mL：35mg：40mg，30℃条件下搅拌反应10h，得到抗原溶液；
将牛血清蛋白溶解于pH 7.4的0.01mol/LPBS缓冲液中，其中，牛血清蛋白：PBS缓冲液的比例为30mg：1mL，得到血清蛋白溶液；
将所述血清蛋白溶液加入到所述抗原溶液中，血清蛋白溶液中血清蛋白和抗原溶液中己烯雌酚单羧基丙基醚的质量比例为3:1，反应12h，然后调pH至8.5，4℃搅拌过夜，然后将得到的反应液在0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量为15000Da，透析结束后，透析袋内透析液冷冻干燥，得到己烯雌酚人工抗原，备用；
S2，己烯雌酚抗体的制备
利用细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，通过扩大培养杂交瘤细胞，制备己烯雌酚抗体；
S3，己烯雌酚酶标抗原的合成
向二甲基亚砜中分别加入己烯雌酚人工抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后离心弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；
将牛血红蛋白溶解于0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原；
S4，己烯雌酚ELISA分析
利用所述己烯雌酚抗体、己烯雌酚酶标抗原对待测样品进行酶联免疫检测，获得测试样品中的己烯雌酚含量。
优选的，上述己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，S11中，己烯雌酚：二甲基亚砜：碘化钾：4-氯丁酸乙酯的比例为50mg：3mL：1mg：1mL。
优选的，上述己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，S11、S12、S3中，所述冷冻干燥的条件均是-20℃、真空度30Pa。
优选的，上述己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，S3中，向3mL二甲基亚砜中分别加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二环己基碳二亚胺和30mgN-羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后1200r/min离心5min弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；
将100mg牛血红蛋白溶解于5mL 0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原。
优选的，上述己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，所述己烯雌酚ELISA分析具体包括：
(1)包被：将己烯雌酚抗体用0.04mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至浓度为5μg/mL，加到酶标板上，每孔100μL，在37℃孵育2.0h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次；
(2)封闭：每孔加入100μL的封闭液，25℃孵育2.5h后，然后用洗涤液清洗酶标板3次；
(3)加标准品：在步骤(2)的酶标板中，选取若干孔作为标准对照孔，其中1孔为空白对照，加入100μL超纯水，其余每孔均加入己烯雌酚标准溶液50μL和己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次，其中不同的标准对照孔加入不同浓度的己烯雌酚标准溶液；
(4)加实际样品：在步骤(2)的酶标板中，选取另外的若干孔作为样品孔，其中1孔为空白样品，加入100μL超纯水，其余每孔均加入待测样品溶液50μL、己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次；
(5)发光：每孔加入显色剂，37℃孵育40min；
(6)终止：加终止液终止反应；
(7)测定：在420nm波长测定各孔发光值，记录不同标准对照孔的发光值，并绘制标准曲线，最后根据标准曲线计算待测样品溶液中己烯雌酚的浓度。
本发明还提供了一种上述方法使用的试剂盒，其特征在于，包括己烯雌酚抗体、0.04mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、己烯雌酚酶标抗原、显色剂和终止液。
优选的，上述试剂盒中，每100mL洗涤液中有99.95mL的0.01mol/LpH9.6PBS缓冲液和0.05mL的吐温20；
所述封闭液为0.04mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液；
所述显色剂为0.04mol/LpH9.6鲁米诺；
所述终止液为2mol/L硫酸。
与现有技术相比，本发明提供的一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，具有以下有益效果：
1、血红蛋白(Hb)是人和动物体内含量最多的蛋白质之一，Hb分子中每一条肽链与一个亚铁血红素结合，血红素位于肽链折叠所形成的介电常数较低的疏水环境中。Hb的三维空间结构为底物的参与提供了特异结合空间与识别位点，这是Hb体现高催化活性的重要原因之一。
2、本发明首次以价廉的牛血红蛋白(Hb)作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶，制备出Hb标记的DES；在DES与载体蛋白之间插入不同的间隔臂，合成不同的DES人工抗原，探讨间隔臂对ELISA灵敏度的影响，确定最佳DES人工抗原；通过合成并选择各种类型底物，筛选出高效化学发光增强剂；通过免疫试验，制备抗DES单克隆抗体，优化ELISA反应条件，建立DES的化学发光酶联免疫分析方法，进而研制出DES残留检测试剂盒，用于食品安全快速检测。
3、以价廉的牛血红蛋白(Hb)作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶，制备出Hb标记的DES，大大降低了检测成本。辣根过氧化物酶的价格大概是250元/100mg，牛血红蛋白的价格大概是4元/100mg，成本降低60多倍。
附图说明
图1是测定DES的标准曲线；
图2是DES、Hb、DES-Hb的紫外检测图谱，
其中，图2中a线条为己烯雌酚，图2中b线条为BSA，图2中c线条为己烯雌酚人工抗原。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下述方法中，6-8周龄BALB/C雌性小鼠，8周龄雌性ICR小鼠，SP/0骨髓瘤细胞，由扬州大学兽医学院比较医学中心提供。
本发明提供了一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，包括以下步骤：
S1，己烯雌酚(DES)人工抗原的合成及鉴定
己烯雌酚(DES)属于人工合成的雌激素，其分子量小于1000Da。由于分子量小而且不具有免疫原性，属于半抗原，它必须连接到大分子蛋白质载体上形成完全抗原后才能诱导机体产生免疫反应。为了与蛋白质载体偶联，化合物必须具有一定的功能基团，因为DES不具有这样的基团，因此需要对其进行衍生反应合成具有功能基团且与DES结构相似的化合物，DES结构中的－OH(羟基)是己烯雌酚的重要基团，也是其结构中的活泼基团，通过－OH对DES进行结构修饰，衍生出一个羟基，再与蛋白质载体上的氨基连接。
S11，己烯雌酚单羧基丙基醚(DES-CPE)的制备
将50mg的己烯雌酚(DES)溶于3mL二甲基亚砜中，氮气保护下加入1-2mg催化剂碘化钾和1-2mL4-氯丁酸乙酯，避光、70-80℃加热回流，反应24h后，用3mL乙酸乙酯萃取，收集上层溶液，干燥后得到固态物质；向固态物质中加入2mL乙醇使之完全溶解，然后滴加1mL2.0mol/L氢氧化钠溶液，反应3h后，加入5.0mol/L盐酸溶液调节pH至3-4；加入20mL乙酸乙酯萃取，收集上层溶液，经干燥后得到己烯雌酚单羧基丙基醚，保存在干燥器中备用。
S12，己烯雌酚人工抗原的合成
将50mg的己烯雌酚单羧基丙基醚溶解在2mL的二甲基亚砜中，加入35mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，40mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，30℃条件下搅拌反应10h，得到抗原溶液；
将150mg的牛血清蛋白(BSA)溶解5mL的pH 7.4的0.01mol/LPBS缓冲液中，得到血清蛋白溶液；
将上述的血清蛋白溶液加入到上述的抗原溶液中，反应12h，然后用5mol/L NaOH调pH至8.5，4℃搅拌过夜(搅拌12h)，然后将得到的反应液在0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量为15000Da，透析结束后，透析袋内透析液冷冻干燥，得到己烯雌酚人工抗原，-20℃保存备用；
S13，人工抗原的分析鉴定
使用紫外可见分光光度计己烯雌酚人工抗原进行鉴定、偶联比及浓度测定。包括：
将上述己烯雌酚单羧基丙基醚、己烯雌酚人工抗原、BSA分别用20％甲醇(溶剂为PBS)溶液稀释成适当浓度的溶液，以20％甲醇(溶剂为PBS)溶液作为对照，用紫外可见光分光光度计进行扫描，结果如图2所示，
己烯雌酚在240nm处有吸收峰(图2中a线条)，BSA在280nm处有吸收峰(图2中b线条)，己烯雌酚人工抗原(图2中c线条)吸收峰值响应度有所变化，说明己烯雌酚人工抗原以成功构建。
分别测定在260nm处的紫外吸收光值为0.213，在280nm处的紫外吸收光值为0.167，按照下面公式计算：蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45×OD280-0.74×OD260得到己烯雌酚人工抗原蛋白质浓度为6.41mg/mL。
S2，己烯雌酚抗体的制备及鉴定
利用己烯雌酚人工抗原制备己烯雌酚抗体，利用细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出分泌特异性抗体的单个杂交瘤细胞，通过扩大培养分裂增殖的细胞群，制备己烯雌酚抗体。包括以下步骤：
S21，使用以下试剂：
不完全DMEM培养基的配制方法为：DMEM粉剂1袋，NaHCO33.7g，溶于超纯水1L，1mol/L盐酸调节pH值到7.0-7.2，过滤除菌，4℃保存备用。
100×HT贮存液：称取136.1mg次黄嘌呤和38.8mg胸腺嘧啶核苷，加超纯水到100mL，置50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，-20℃冻存。
100×A贮存液：称取1.76mg氨基喋呤溶于90mL超纯水中，滴加1mol/L NaOH 0.5mL中和，再补超纯水到100mL，过滤除菌，分装小瓶，-20℃冻存。
20％完全DMEM培养基：小牛血清50mL，加不完全DMEM培养基至250mL，4℃保存备用。
HT培养基：20％完全DMEM培养基99mL，加100×HT贮存液1mL，无菌条件下配制。
HAT培养基：20％完全DMEM培养基98mL，加100×HT贮存液1mL，100×A贮存液1mL，无菌条件下配制。
S22，小鼠免疫；
利用己烯雌酚人工抗原、选择6-8周龄BALB/C雌性小鼠进行免疫。按免疫原、免疫剂量进行分组，每组三只。第3次免疫后一周，自小鼠断尾采血，利用间接竞争酶联免疫吸附法检测小鼠血清内抗体效价及药物抑制情况，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠，五免后两周，以双倍蛋白量的免疫原(己烯雌酚人工抗原)直接腹腔注射加强免疫，3-5d后取小鼠脾脏中的B淋巴细胞，备用。
S23，骨髓瘤细胞的准备；
融合前10d复苏SP/0骨髓瘤细胞，用20％小牛血清(v/v)的培养基培养。当细胞呈对数生长，此时细胞生长状态良好，浑圆透亮，性状规则，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。此时，按照1:3的体积比例稀释传代，一般每2-3d进行一次传代或扩大培养。最后选取生长旺盛、状态良好、处于对数生长期的SP/0骨髓瘤细胞，备用。
S24，饲养细胞的准备；
融合前1d，取8周龄雌性ICR小鼠1-2只，断颈处死，置于75％酒精中浸泡5min，腹部朝上固定，移至超净工作台上操作。使用10mL无菌注射器吸取不完全DMEM培养基缓慢注入小鼠腹腔内，然后右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部两侧1min，然后再抽回，1200r/min离心5min，弃上清HAT培养基重悬，细胞计数，依据计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105个/mL。
S25，细胞融合；
用10mL不完全DMEM培养基将SP/0骨髓瘤细胞轻轻吹下，收集于细胞瓶内，加入S22中的小鼠脾脏(小鼠脾脏中含有大量的B淋巴细胞)，混匀，1200r/min离心5min后弃尽上清，打散细胞，然后将融合管置于37℃水浴中，先慢后快地1min内加完1mL PEG溶液，边加边搅拌，静止90s后先慢后快地加入30mL不完全DMEM培养基终止反应。37℃水浴静置10min，500r/min离心10min后弃尽上清，细胞重悬至80mL HAT培养基中。将细胞悬液滴加到铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔两滴，置于培养箱中培养。
S26，细胞培养
培养箱中培养24h后可观察有无污染，48-72h后初步判断B淋巴细胞与SP/0骨髓瘤细胞融合是否成功，4-5d后可补加HAT培养基，9-10d后可换用HT培养基，15d后可用20％完全DMEM培养基。观测细胞生长情况，待细胞克隆长至1/3-1/2培养孔面积时，可进行阳性细胞株的筛选。
S27，阳性杂交瘤细胞的筛选；
采用iELISA联合CiELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞，然后采用有限稀释法进行亚克隆，最后转移到细胞培养瓶中扩大培养，收集培养上清液中的己烯雌酚抗体，并即时冻存。传代培养30代后，上清液中的己烯雌酚抗体一直保持1:256000，效果稳定。
S28，己烯雌酚抗体鉴定；
采用动物体内诱生单克隆抗体的方法大量制备腹水。选择8周龄ICR雌性小鼠，每只腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL，7-10d后，将处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞以不完全DMEM培养基稀释后接种至小鼠腹腔内，3×105/只。每天观察小鼠腹水产生状况，7-9d后，用12号针头采集腹水，3000r/min离心10min，弃去油脂、细胞以及其他沉淀物质，纯化后小管分装，-20℃保存备用。
然后分别测定S27中细胞上清液抗体效价和S28中腹水的抗体效价。
S3，己烯雌酚酶标抗原的合成与鉴定
向3mL二甲基亚砜中分别加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二环己基碳二亚胺(DCC)和30mg N-羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后1200r/min离心5min弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；
将100mg牛血红蛋白溶解于5mL 0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原。
S4，己烯雌酚ELISA分析
利用所述己烯雌酚抗体、己烯雌酚酶标抗原对待测样品进行酶联免疫检测，获得测试样品中的己烯雌酚含量。
(1)包被：将己烯雌酚抗体用0.04mol/L pH9.6PBS缓冲液稀释至浓度为5μg/mL，加到酶标板上，每孔100μL，在37℃电热恒温培养箱中将酶标板孵育2.0h，取出后用洗涤液洗板3次。
(2)封闭：每孔加入100μL的封闭液，放入25℃恒温箱中2.5h后，然后用洗涤液洗板3次，其中，封闭液为0.04mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液。
(3)加标准品：在步骤(2)的酶标板(包被有抗体的酶标板)中，选取若干孔作为标准对照孔，其中1孔为空白对照，加入100μL超纯水，其余每孔均加入己烯雌酚标准溶液50μL和己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃电热恒温培养箱中孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次，其中不同的标准对照孔加入不同浓度的己烯雌酚标准溶液。
(4)加实际样品：在步骤(2)的酶标板中，选取另外的若干孔作为样品孔，其中1孔为空白样品，加入100μL超纯水，其余每孔均加入待测样品溶液50μL、己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃电热恒温培养箱中孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次。
(5)发光：每孔加入0.04mol/LpH9.6鲁米诺50μL，37℃电热恒温培养箱中孵育40min。
(6)终止：每孔50μL加入2mol/L硫酸终止反应。
(7)测定：在420nm波长测定各孔发光值，记录不同标准对照孔的发光值，并绘制标准曲线(图1所示)，标准曲线为y＝-0.4657x+0.7373，R2＝0.9925，其中y表示纵坐标Ln(1+B/B0)，B表示发光值，B0表示己烯雌酚浓度为0的发光值，x表示横坐标Lg(1+CDES),CDES表示己烯雌酚浓度，记录样品孔的发光值，最后根据标准曲线计算待测样品中己烯雌酚的浓度。
需要说明的是，S11、S11、S3中，所述冷冻干燥的条件均是-20℃、真空度30Pa。
需要说明的是，上述步骤，步骤(1)-(4)中，每100mL洗涤液中有99.95mL的0.01mol/LpH9.6PBS缓冲液和0.05mL的吐温20。
下述表1是己烯雌酚ELISA分析方法的稳定性试验，分别测定了空白对照和浓度为15ng/mL DES的标准样品的发光值，如表1所示。结果表明在3个月时间内，发光值变化不大，说明本方法所建立的体系具有较好的稳定性，制成的试剂盒可长期保存。
表1体系稳定性实验的发光值
另外，我们利用本发明的方法测定了鸡肉中的DES的含量，如表2所示。结果表明，当DES的含量大于5.0μg/kg时，回收率大于90％，结果满意。
表2鸡肉中DES的回收率实验结果(n＝6)
我们利用本发明的方法测定了鱼肉中的DES的含量，如表3所示。分别测定了0.5μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg的样品。结果表明，测定结果的RSD小于3.2％，回收率大于88％，结果满意。
表3鱼肉肉中DES的回收率实验结果(n＝6)
本发明首次以价廉的牛血红蛋白(Hb)作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶，制备出Hb标记的DES，大大降低了检测成本。辣根过氧化物酶的价格大概是250元/100mg，牛血红蛋白的价格大概是4元/100mg，成本降低60多倍。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，己烯雌酚人工抗原的合成
S11，己烯雌酚单羧基丙基醚的制备
将己烯雌酚溶于二甲基亚砜中，氮气保护下加入碘化钾和4-氯丁酸乙酯，其中，己烯雌酚：二甲基亚砜：碘化钾：4-氯丁酸乙酯的比例为50mg：3mL：1-2mg：1-2mL，避光、70-80℃加热回流，反应24h后，用乙酸乙酯萃取，收集上层溶液，干燥后得到固态物质；向固态物质中加入乙醇使之完全溶解，然后滴加2.0mol/L氢氧化钠溶液，其中，乙醇与氢氧化钠溶液的体积比例是2:1，反应3h后，调节pH至3-4；加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与乙醇的体积比例是10:1，收集上层溶液，经冷冻干燥后得到己烯雌酚单羧基丙基醚，备用；
S12，己烯雌酚人工抗原的合成
将己烯雌酚单羧基丙基醚溶解在二甲基亚砜中，加入N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，其中，己烯雌酚单羧基丙基醚：二甲基亚砜：N-羟基丁二酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐＝50mg：2mL：35mg：40mg，30℃条件下搅拌反应10h，得到抗原溶液；
将牛血清蛋白溶解于pH 7.4的0.01mol/LPBS缓冲液中，其中，牛血清蛋白：PBS缓冲液的比例为30mg：1mL，得到血清蛋白溶液；
将所述血清蛋白溶液加入到所述抗原溶液中，血清蛋白溶液中血清蛋白和抗原溶液中己烯雌酚单羧基丙基醚的质量比例为3:1，反应12h，然后调pH至8.5，4℃搅拌过夜，然后将得到的反应液在0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量为15000Da，透析结束后，透析袋内透析液冷冻干燥，得到己烯雌酚人工抗原，备用；
S2，己烯雌酚抗体的制备
利用细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，通过扩大培养杂交瘤细胞，制备己烯雌酚抗体；
S3，己烯雌酚酶标抗原的合成
向二甲基亚砜中分别加入己烯雌酚人工抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后离心弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；
将牛血红蛋白溶解于0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原；
S4，己烯雌酚ELISA分析
利用所述己烯雌酚抗体、己烯雌酚酶标抗原对待测样品进行酶联免疫检测，获得测试样品中的己烯雌酚含量。
2.根据权利要求1所述的己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，S11中，己烯雌酚：二甲基亚砜：碘化钾：4-氯丁酸乙酯的比例为50mg：3mL：1mg：1mL。
3.根据权利要求1所述的己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，S11、S12、S3中，所述冷冻干燥的条件均是-20℃、真空度30Pa。
4.根据权利要求1所述的己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，S3中，向3mL二甲基亚砜中分别加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二环己基碳二亚胺和30mg N-羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后1200r/min离心5min弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；
将100mg牛血红蛋白溶解于5mL 0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原。
5.根据权利要求1所述的己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，所述己烯雌酚ELISA分析具体包括：
(1)包被：将己烯雌酚抗体用0.04mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至浓度为5μg/mL，加到酶标板上，每孔100μL，在37℃孵育2.0h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次；
(2)封闭：每孔加入100μL的封闭液，25℃孵育2.5h后，然后用洗涤液清洗酶标板3次；
(3)加标准品：在步骤(2)的酶标板中，选取若干孔作为标准对照孔，其中1孔为空白对照，加入100μL超纯水，其余每孔均加入己烯雌酚标准溶液50μL和己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次，其中不同的标准对照孔加入不同浓度的己烯雌酚标准溶液；
(4)加实际样品：在步骤(2)的酶标板中，选取另外的若干孔作为样品孔，其中1孔为空白样品，加入100μL超纯水，其余每孔均加入待测样品溶液50μL、己烯雌酚酶标抗原50μL，37℃孵育2h，取出后用洗涤液清洗酶标板3次；
(5)发光：每孔加入显色剂，37℃孵育40min；
(6)终止：加终止液终止反应；
(7)测定：在420nm波长测定各孔发光值，记录不同标准对照孔的发光值，并绘制标准曲线，最后根据标准曲线计算待测样品溶液中己烯雌酚的浓度。
6.一种权利要求5所述的方法使用的试剂盒，其特征在于，包括己烯雌酚抗体、0.04mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、己烯雌酚酶标抗原、显色剂和终止液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，每100mL洗涤液中有99.95mL的0.01mol/LpH 9.6PBS缓冲液和0.05mL的吐温20；
所述封闭液为0.04mol/LpH 9.6的碳酸盐缓冲液；
所述显色剂为0.04mol/LpH 9.6鲁米诺；
所述终止液为2mol/L硫酸。
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