CN103698519A - 一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呋喃它酮代谢物（AMOZ）的化学发光检测试剂盒（CLEIA），包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；所述化学发光板的各孔包被有AMOZ偶联抗原；所述试剂包括：酶标抗体浓缩液，酶标抗体稀释液，AMOZ系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液，衍生化试剂；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测畜禽组织（肌肉、肝脏）和水产品中AMOZ残留检测。

Description

一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测呋喃它酮代谢物（AMOZ）的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测畜禽组织（肌肉、肝脏）和水产品中的AMOZ含量或残留量。属于免疫学检测领域。
背景技术
呋喃它酮属于硝基呋喃类抗菌药，在临床上主要用于鸡白痢、鸡大肠杆菌病、鸡球虫病等各种肠道感染性疾病的治疗及用作猪、禽类和水产促生长的添加剂。但有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症。
欧盟早在1990年就颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢物列为A类禁用药，规定其在动物源性食品中的最高残留量为1.0μg/kg。1995年起欧盟、日本、美国等开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼、虾及禽类进行残留检测。中国农业部2002年2月发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中，明文禁止在所有食品动物的所有用途中使用硝基呋喃类药物。但是，由于其价格便宜，药效好，在很多国家还在继续违规使用。为了保障人民健康及扩大与世界各国动物源性食品贸易往来，必须对动物源性食品中呋喃它酮进行检测。
由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物(AMOZ)则能存留较长的一段时间，所以药残监测部门经常以检测其代谢产物-AMOZ为手段达到检测呋喃唑酮残留的目的。目前，呋喃它酮检测方法主要有微生物法、色谱法、免疫分析法等。微生物法是测定抗生素残留的经典方法，具有前处理简单、经济、批量大等优点，但精确度、准确度和特异性不高。色谱法应用较普遍，精确度和灵敏度高，但因其流程繁琐、设备昂贵、检测速度慢等原因，很难实现现场检测和普及推广。酶联免疫检测法具有简单、快速、处理样本量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，被广泛应用于残留检测，但在实践中很容易出现各种各样的问题，如加样时间是否一致，洗板是否彻底，加样量是否一致等，导致易出现假阳性结果等缺点。
基于化学发光强度和被测物含量之问的关系建立的分析方法叫化学发光分析法。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6~18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级。本研究旨在建立AMOZ残留化学发光酶联免疫检测试剂盒，为拥有自主知识产权检测产品技术的开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种AMOZ的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于畜禽组织、肝脏和水产品中AMOZ的残留量检测。
为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中AMOZ含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中AMOZ含量越少，发光强度越高。
本发明的检测AMOZ的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂。 具体含有以下成分：
包被有AMOZ偶联抗原的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板。
应用pH=7.4 0.05 mol/L的PBS溶液稀释AMOZ纯品得到的AMOZ系列标准品溶液，浓度范围至少包含了0.05~4.05ng/mL的浓度区间。
酶标抗体浓缩液。是由AMOZ与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
酶标抗体稀释液。pH7.6的0.01M的磷酸钠、0.25M的NaCl溶液。
发光底物液。发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
浓缩复溶液。浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于样品前处理。
浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20（Tween-20）缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。
衍生化试剂。2-硝基苯甲醛。
本发明溶液的配制：
本发明试剂盒中涉及的AMOZ标准品溶液、酶标抗体溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：
1、AMOZ标准溶液：以常规方法将AMOZ纯品用0.05 mol/L，pH=7.4的PBS配制成浓度分别为0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL的AMOZ标准溶液。
2、酶标抗体溶液：用AMOZ与偶联蛋白偶联制备的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得的抗体与辣根过氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释成1:8000的工作浓度。
3、酶标抗体稀释液：为pH7.6的磷酸钠为0.01M、NaCl为0.25M的缓冲溶液。
4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。
5、浓缩复溶工作液：NaH2PO4·2H2O 5.74g、Na2HPO4·12H2O 32.6g溶于1L的去离子水中。
6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH=7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。
7、包被溶液：1.59 g碳酸钠和2.53 g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH=9.5。
8、封闭溶液配制：10 g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN3。
9、衍生化试剂：15mg 2-硝基苯甲醛溶于10mL甲醛中。
本发明化学发光板的包被：
本发明中包被化学发光板采用将AMOZ偶联抗原置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。
本发明采用的是pH=9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的AMOZ偶联抗原在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的偶联抗原包被浓度为2.5μg/mL。
包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN3防止变质。
酶标抗体溶液的制备：
本发明中酶标抗体溶液浓度是决定本发明中AMOZ酶联免疫检测试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
本发明中涉及的酶标抗体溶液可以用酶标抗体稀释液稀释成1:8000的工作浓度。
按照上述酶标抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0.05~4.05 ng/mL)和很好的灵敏度(IC50为0.198ng/mL)。
化学发光溶液的配制：
本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。
所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在畜禽组织（肌肉、肝脏）和水产品中的AMOZ残留检测中发挥重要作用。
附图说明
图1 为AMOZ半抗原合成反应式。
图2 为本发明化学发光反应式。
图3 为本发明化学发光试剂盒工作曲线。
具体实施方式
实施例1：半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
（1）AMOZ半抗原合成
取0.5 g AMOZ、0.50 g邻苯二甲酸酐和2 mL吡啶溶于20 mL DMSO中，在60℃下搅拌反应4小时，反应完成后，加热蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单AMOZ酯。
（2）免疫原（AMOZ-BSA）的合成
A，取6mg半抗原，溶解于1mL DMF中；
B，取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A；
C，称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS（PH 7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；
D，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
E，分装，于-20℃保存备用。
称取半抗原6mg和OVA 50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
（3）AMOZ单克隆抗体的制备
A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(AMOZ-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的AMOZ等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光板中。同时用PBS取代AMOZ作对照，其余步骤同上。若经AMOZ阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
实施例2：酶标抗体的制备
A，称取2 mg HRP溶解于0.5 mL双蒸水中；加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液，4℃避光作用30 min；
B，加入160 mmol/L的乙二醇0.5 mL，室温作用30 min；
C，加入AMOZ单克隆抗体2 mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000 mL的0.05 m mol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；
D，透析液吸至10 mL的离心管中，加0.25mL新配的5g/L NaBH4液，混匀后置4℃2 h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30 min，在4℃下3000 rpm离心25 min，弃上清；
E，将沉淀溶于1.5mL 0.02 mol/L pH 7.4 PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS 3次)；
F，将透析液中液体吸至微量离心管中，4℃下10000rpm离心30 min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。
实施例3：CLEIA检测方法的建立
(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)
纵向用每种包被抗原（AMOZ-OVA）按80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 μg/mL的系列稀释度包被化学发光板，100μL/孔，置于37℃恒温箱2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μL/孔一系列稀释的酶标AMOZ单克隆抗体(1:1000至1:512000)，室温（20~25℃）孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；分别加入50 μL/孔的化学发光A、B液，测定发光强度值。以发光强度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
(2)抗体灵敏度的测定
根据上述对AMOZ-OVA及酶标抗体浓度的优选实验，申请人选择并确定酶标抗体浓度为1:8000， AMOZ-OVA包被浓度为2.5μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
A，包被：用0.05 M pH=9.6的碳酸盐包被溶液将AMOZ-OVA配成2.5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板化学发光板反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。
B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一次，拍干。
C，加样：加不同浓度的AMOZ标准品溶液50μL/孔，再加入50μL/孔稀释的酶标AMOZ单克隆抗体(1:8000)于上述已封闭的反应孔中，室温（20~25℃）避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。
D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发光免疫分析仪检测。
E，检测结果以抑制率计算：
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
实施例4：检测AMOZ的化学发光酶联免疫试剂盒
(1)检测AMOZ的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
A，包被有AMOZ单克隆抗体的固相载体(化学发光板)；
B，AMOZ标准品溶液：0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL。
C，浓缩酶标AMOZ单克隆抗体溶液：用AMOZ单克隆抗体与辣根过氧化物酶偶联制备得到，使用时用稀释液稀释至工作浓度。
D，酶标AMOZ单克隆抗体稀释液：磷酸钠、NaCl缓冲溶液。
E，发光溶液：A液为鲁米诺、对甲苯酚溶液，B液过氧化氢脲溶液，使用时A液、B液等体积混匀，现配现用。
F，2倍浓缩复溶液，使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
G，20倍浓缩洗涤溶液：使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
H，衍生化试剂：15mg 2-硝基苯甲醛溶于10mL甲醛中。
 (2)化学发光板的制备
用包被液将AMOZ-OVA稀释成2.5 μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例5：检测AMOZ的化学发光酶联免疫试剂盒的应用
(1)试剂的配制
A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1:19倍稀释后使用。
B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1:1倍稀释后使用。
C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1:1混匀。
D，酶标抗体工作液：用酶标抗体稀释液将酶标抗体浓缩液按9:1稀释（9份酶标抗体稀释液+1酶标抗体浓缩液）。
E，衍生化试剂：向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加10mL甲醇溶解混匀。
F，0.1mol/L磷酸氢二钾溶液：称取22.8g三水合磷酸氢二钾加入1L去离子水溶解混匀。
G，1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL浓盐酸加入去离子水定容至100mL。
H，1mol/L 氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠加100mL去离子水溶解混匀。
 (2) 组织、水产样品前处理
用均质器均质样本；称取1.0±0.05g均质后的样本，加入4mL去离子水、0.5mL 1mol/L盐酸溶液和100μL衍生化试剂，用涡旋仪涡动2min；在37℃过夜孵育16h；分别加入5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液、0.4mL 1mol/L 氢氧化钠溶液和5mL乙酸乙酯，用涡旋仪涡动30s；3000 rpm以上，室温（20~25℃）离心5min；取2.5mL乙酸乙酯相至10mL干燥玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干；加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加入1mL复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀；3000 rpm以上，室温（20~25℃）离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μL用于分析。
(3)检测步骤
A，加样：加标准品/样本50μL到对应的微孔中，再加入酶标抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。
B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤7次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；
C，加发光溶液：每孔加入新配制的发光底物100μL，震荡约30秒左右，用盖板膜盖板后室温放置3min。
D，检测：直接放入微孔板发光分析仪内测量读数。
(4)结果判断
所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光强度值再乘以100，以抑制率为纵坐标，AMOZ浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
实施例6：试剂盒特异性试验
以AMOZ作为标准，设AMOZ的交叉反应率为100%，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与AMOZ结构或者功能相似的硝基呋喃类药物：AMOZ、AOZ、AHD、SEM、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的AMOZ类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC50)。交叉反应率(％CR)即为抗体对AMOZ的IC50与抗体对AMOZ竞争物的IC50之比的百分数，按下式进行计算：
Figure BDA0000220230011
结果列于表1：
表1     AMOZ试剂盒特异性试验
竞争物 IC50（ng/mL） 交叉反应率（%）
AMOZ 0.198 100.0
AOZ 203.158 <0.1
AHD 258.164 <0.1
SEM 303.100 <0.1
呋喃唑酮 22.119 <1
呋喃它酮 1.784 11.1
呋喃妥因 27.347 <1
呋喃西林 32.115 <1
实施例7：试剂盒精密度和准确度试验
分别以不同浓度的AMOZ添加猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝、鱼肉、虾肉样本进行添加回收试验，计算AMOZ在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加3个浓度，每个浓度添加5个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。
根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。
表2    AMOZ试剂盒准确度试验
Figure BDA0000220230012
Figure BDA0000220230013
从上述测定结果看，畜禽组织（肌肉、肝脏）和水产品样本的回收率在70.3~99.3%之间。总体批内变异系数在5.6~13.5%之间，批间变异系数在7.3~14.1之间。表明本试剂盒有很好的精密度和准确度。

Claims (9)

1.一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；所述化学发光板的各孔包被有呋喃它酮代谢物偶联抗原；所述试剂包括：酶标抗体浓缩液，酶标抗体稀释液，呋喃它酮代谢物系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液、衍生化试剂。
2.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板。
3.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述偶联抗原包被浓度为2.5 μg/mL。
4.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体的工作浓度为1:8000。
5.根据权利要求1和权利要求4所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述抗体是由呋喃它酮代谢物与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
6.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述呋喃它酮代谢物系列标准品溶液浓度分别为：0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL。
7.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含NaH2PO4·2H2O 5.74 g、Na2HPO4·12H2O 32.6 g的水溶液。
8.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH=7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液.
9.根据权利要求1所述呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。
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